CN104946776A - 一种与鸡优良屠宰性状相关的鸡fabp4基因分子遗传标记及其应用 - Google Patents

一种与鸡优良屠宰性状相关的鸡fabp4基因分子遗传标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与肉食鸡优良屠宰性状相关的鸡FABP4基因分子遗传标记是鸡FABP4基因单核苷酸多态性序列上的多态性位点，该位点是在FABP4基因序列第一外显子的第51位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中CC型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记标。本发明还公开了所述标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。实验证实：特异型酶切位点的多态性与生产性能之间具备相关性，基因型为CC的个体多项测量指标均高于基因型为TT个体，提示基因型为CC的个体可以作为种鸡来培育具有优良屠宰性状的品种鸡。

Description

一种与鸡优良屠宰性状相关的鸡FABP4基因分子遗传标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及一种与肉食鸡优良屠宰性状相关的鸡FABP4基因分子遗传标记及其在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。
背景技术
分子遗传标记是以物种突变造成DNA片段长度多态性为基础的，具有许多优点；(1)直接探测DNA水平的差异，不受时间空间的限制；(2)标记数量丰富、多态性高；(3)共显性标识，可以区分纯合子与杂合子；(4)可以解释家系内某些个体的遗传变异；(5)可以鉴定不同性别、不同年龄的个体。单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism,SNP)是DNA遗传标记中的一种类型，是同一物种不同个体基因组DNA等位序列上单个核苷酸存在差别的现象，其比较的是同序列长度里单个碱基的差别。在基因组中，SNPs既可存在于基因序列中，也可存在于基因以外的非编码序列中。存在于编码序列中的SNPs虽然较少，但是在遗传学研究中却具有重要意义。
SNPs自身的特性决定了它在生物学诸多领域的研究中具有特殊的应用价值，主要在于：(1)SNPs数量多，分布广泛，几乎遍布于整个群体基因组中；(2)SNPs适于快速、规模化筛查；(3)SNPs等位基因的频率容易估计，同时也易于基因分型。目前SNPs的检测和筛选方法大致可以分为两类：一类是直接查找法，即运用现代生物信息学手段，从已有的核苷酸数据库中寻找SNPs；另一种是实验法，又可分为四种类型，即直接测序法、DNA分子构象法、基因芯片技术以及限制性酶切法。其中使用限制性酶切检测SNPs具备了简便、快速、灵敏和经济的特点，非常适用于大批量样品的分析。该方法的核心在于选择合适的内切酶，使得基因中的单碱基改变通过琼脂糖凝胶电泳中的片段差异体现出来，就可以初步获悉基因的单核苷酸多态性特征。
脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein，FABP)广泛存在于脊椎动物和费脊椎动物的细胞质中，属于脂质结合蛋白超家族成员，迄今为止已经发现了9种类型的FABP。各种不同类型的脂肪酸结合蛋白分布具有组织特异性，但都是对脂肪酸具有高亲和力的可溶性蛋白质。FABP的基本功能是在细胞内进行脂肪酸短暂的贮存与运输，并广泛参与脂肪酸的转运代谢，可将脂肪酸从细胞膜运送到脂肪酸氧化、甘油三酯和磷脂合成的位置，并在细胞内与脂肪酸结合，造成细胞内外脂肪酸浓度差，从而促进细胞摄取脂肪酸。FABP4指的是脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白，是哺乳动物甘油三酯的贮存库，在脂肪细胞分化过程中FABP4表达与活性显著增强，在甘油三酯形成及脂解过程中，FABP4除存货释放大量脂肪酸，参与调控甘油三酯生成及溶解的生化循环。作为分子标记，FABP4表现出高遗传的多态性。
脂肪性状是评价鸡肉品质的重要指标，特别是肌内脂肪含量，此类性状的发育会直接影响其商品性能。因此，对于调控脂肪性状发育基因的SNPs的表征对于通过肉鸡的分子育种和辅助选择提高其生产性能具有十分重要的作用。在申请人相关实验所涉及鸡的群体中，FABP4单核苷酸未突变的个体其产肉率以及肉质均优于纯合突变个体以及杂合突变个体，从数据上直观地体现了FABP4基因SNPs对鸡生产性状的影响。这一发现若应用到优质家禽的育种等研究工作中，有望为培育出高产优质肉性状的优良品种提供帮助。经检索，目前FABP4基因SNPs作为遗传标记，特别是作为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记应用于筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种与肉食鸡优良屠宰性状相关的鸡FABP4基因分子遗传标记及其在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。
本发明所述的与肉食鸡优良屠宰性状相关的鸡FABP4基因分子遗传标记是鸡FABP4基因单核苷酸多态性序列上的多态性位点，其特征在于：所述鸡FABP4基因单核苷酸多态性序列的多态性位点是在FABP4基因序列第一外显子的第51位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中CC型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记。
本发明所述与肉食鸡优良屠宰性状相关的鸡FABP4基因分子遗传标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。
上述应用的具体方法是：以待检测鸡FABP4基因组DNA为模板，以引物对FABP4E1F/E1R进行PCR扩增，扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用特定的限制性核酸内切酶对扩增出的目的片段进行酶切；之后对酶切产物再一次进行琼脂糖凝胶电泳，来检测酶切产物的片段大小，分析确定鸡FABP4基因的碱基多态性位点，当FABP4基因序列第一外显子的第51位为C或T，且基因型为CC型时，即可判定待检测鸡品种为具有优良屠宰性状的品种鸡；
其中：
所述引物对FABP4E1F/E1R的核苷酸序列为：
FABP4E1F：CCCTCTTTATTGGTCATCCTA；
FABP4E1R：AGGAATGTGACAACGCTAATC；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4-5min；94℃变性30-35s，55-61℃退火30-35s，72℃延伸1min,28-35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存；
所述特定的限制性核酸内切酶为：PpaAII、TaqI、Tsp32I、Tsp32II或TthHB8I，其酶切作用位点为扩增出目的基因中的以下序列：5’…T↓CGA…3’或3’…T↑CGA…5’。
上述方法优选的实施方式是：对于FABP4E1F/E1R引物对来说，PCR扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min,35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存。所述特定的限制性核酸内切酶为：TaqI。
本发明利用限制性核酸内酶切的方法快速筛查鸡FABP4基因第一外显子位点上单核苷酸多态性进行检测，通过对鸡品种的SNP进行基因分型和基因频率分析，同时对酶切多态位点与鸡生长性状之间进行关联分析，寻找与鸡生长性状相关的SNPs作为分子标记，并以该功能SNPs作为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记，在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中广泛应用，加快了良种鸡的选育速度和提高种群品质。
本发明通过以SNP位点为酶切位点，选择合适的特异性核酸内切酶，然后根据SNP突变后酶切出的DNA片段大小不同来确定鸡FABP4基因单核苷酸多态性特征。
根据鸡FABP4基因单核苷酸多态性特征，本发明确定鸡FABP4基因单核苷酸多态性序列的多态性位点是在FABP4基因序列第一外显子的第51位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中CC型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记标的。实验发现：CC、CT或TT三种基因型的鸡在产肉率以及肉质优化等方面都有很大差别，CC型鸡屠宰性状(产肉率以及肉质)明显优于TT、CT两种类型，所以该基因型的雏鸡可以作为具备优良屠宰性状的种鸡来培育，这也肯定了基因型为CC的鸡可以作为种鸡来培育具有优良屠宰性状的品种鸡的可实施性。本发明应用方法简单、快速、低成本、便于推广应用，可广泛应用于鸡的辅助选择和分子育种中，将为培育出高产优质肉性状的优良品种提供支持。
附图说明
图1为本发明所述肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记的实际应用流程示意图。
图2为本发明扩增的鸡的FABP4编码基因结构示意图与第一外显子序列。
其中，第一外显子的51位核苷酸用下划线及黑体放大字母示意。在野生基因中，第51位核苷酸为C，突变基因中为T。
图3为本发明中部分样品PCR产物经特异性酶切筛查到的鸡FABP4基因序列琼脂糖凝胶电泳结果图。其中，CC为未突变型，CT为杂合突变型，TT为纯合突变型。
具体实施方式
本发明首先根据鸡FABP4基因的保守序列设计引物，以不同品种鸡基因组DNA为模板，进行PCR扩增，测序。然后，进行特异性酶切，并将酶切结果的琼脂糖凝胶电泳图和序列比对筛查出不同品种鸡FABP4基因SNP位点。然后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与鸡生长性状密切相关的分子标记。最后，利用获得的分子遗传标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中应用，将筛选到的拥有与鸡优异屠宰性状相关分子标记的鸡作为种鸡进行培养，以期繁殖更多的优质鸡。下面对本发明做详细说明，所述内容是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：不同品种鸡FABP4基因部分DNA序列的克隆
1、鸡血的采集及处理：随机抽取无病健康鸡，包括670只鲁禽3号鸡以及60只琅琊鸡，由翅下静脉采血，EDTA做抗凝处理。
2、基因组DNA的提取：利用Tiangen血液DNA提取试剂盒提取DNA。使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；然后加入200μL缓冲液GB，混匀后70℃放置10分钟；加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀，此时会出现絮状沉淀；将所得溶液和絮状沉淀全部转移到放入收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒并弃废液；加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒并弃废液；加入700μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒并弃废液，并重复该步骤两次；彻底除尽吸附材料中的漂洗液之后，使用水或洗脱液TE将所得DNA产物尽可能的洗脱下来。
3、扩增引物设计：根据NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)鸡的GenBank登录号为：NM_204290.1的FABP4基因的外显子序列，以该基因序列保守区序列为参考设计PCR引物对，其引物对序列如下：
上游引物(FABP4E8F)：CCCTCTTTATTGGTCATCCTA；
下游引物(FABP4E8R)：AGGAATGTGACAACGCTAATC；
该引物扩增了FABP4基因第一外显子389bp序列。
4、PCR扩增鸡FABP4基因外显子：以鸡的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为30μL，见表1；PCR总反应程序，见表2。
表1 PCR反应体系
表2 在适用范围内最佳的PCR反应程序
实施例2：使用TaqI酶对实施例1中PCR产物进行特异性酶切
1.使用TaqI酶对目的基因进行特异性酶切。这类特异性酶的作用位点是：5’…T↓CGA…3’或3’…AGC↑T…5’。
2.酶切反应体系见表3。
表3 TaqI酶切反应体系
按照上述体系将反应体系各溶液混匀后，每个反应体系中都加入25μL石蜡油封住，然后放置于65℃恒温水浴中反应3-5h，使酶切反应充分进行，之后进行后续试验。
3.对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。然后根据不同的酶切结果将所有的样品进行分类总结，归纳出不同的类型。
酶切结果有三种，分别是SNP位点完全突变、杂合突变以及完全没有突变的。在这三种情况下，第一种完全不能被TaqI酶切，所对应的琼脂糖凝胶电泳图，每个泳道只有单一条带，其大小与PCR获得的目的基因大小一致；第二种则是部分能被酶切，琼脂糖凝胶电泳能够得到三条条带，其中最长的一条大小与目的基因一致，另外两条则稍短，但由于较短的这两条片段大小相差无几，在琼脂糖凝胶电泳下并不能完全区分开，故而在视野中呈现出的是一条较粗的条带；第三种能够被完全酶切，得到两条条带，在视野中呈现出一条较粗的条带，其大小与第二种类型中稍短的一致。即在下面序列中用方框标出的核苷酸位点是多态位点，该位点存在C/T两种基因型，当基因型为T时，内切酶不起作用，当基因型为C时，内切酶可以将PCR产物切成较短的片段。
GAAAACTTGAGGACTA
实施例3：本发明制备的分子遗传标记在不同鸡群体多态性中的诊断应用
1、群体多态性中的诊断：利用上述SNP多态性检测方法对670份鲁禽3号鸡以及60份琅琊鸡FABP4基因进行特异性酶切检测。
2、SNP位点的频率统计分析：
基因型频率是指一个群体中某特定基因型个体的数目占个体总数目的比率。Paa＝Aaa/N，其中Paa代表某一位点的AA基因型频率，Aaa表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NM+NAal+NAa2+......+NAan)/2N。式中，PA表示等位基因A频率，NM表示群体中具有AA基因型的个体数量，Aal-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表6和表7。
表6 鲁禽3号鸡FABP4基因多态位点的基因型和等位基因频率
表7 琅琊鸡FABP4基因多态位点的基因型和等位基因频率
3、基因效应的关联分析
采用PASW(18.0)统计软件，对鲁禽3号鸡及琅琊鸡不同基因型个体与体尺数据进行了显著性检验。
(1)测定的主要性状包括：宰前活重、屠体重、屠宰率、半净膛重、全净膛重、半净膛率、全净膛率、胸肌重、胸肌率、腿肌重、腿肌率、腹脂重、腹脂率、皮脂厚、肌脂宽等。
(2)测定的群体：随机抽取健康无病鲁禽3号鸡670只及琅琊鸡60只分别进行分析。
统计结果见表8和表9
表8 鲁禽3号鸡FABP4E1多态性与屠宰性状的关联分析
表9 琅琊鸡FABP4E1多态性与屠宰性状的关联分析
FABP4SNP位点 C/C(31)Mean±SD C/T(21)Mean±SD T/T(8)Mean±SD
宰前活重 1399.47±48.26 1298.32±59.36 1279.25±98.54
屠体重 1262.61±44.95 1159.15±48.98 1147.32±87.91
屠体率 90.14±0.33 89.65±1.00 89.70±0.95
半净膛重 1158.33±42.03 1064.88±44.47 1039.94±75.11
半净膛率 82.66±0.38 82.45±1.07 81.50±0.80
全净膛重 1056.61±40.30 958.42±40.43 943.16±70.25
全净膛率 75.26±0.49 74.20±0.94 73.83±0.73
胸肌重 143.92±6.03 171.82±33.99 146.36±15.76
胸肌率 13.67±0.26 19.03±4.71 15.43±0.78
腿肌重 189.83±8.20 178.44±9.12 174.80±11.14
腿肌率 17.92±0.25 18.52±0.28 18.68±0.58
腹脂重 22.01±2.76 16.56±2.23 17.04±3.91
腹脂率 2.04±0.27 1.70±0.23 1.87±0.45
皮脂厚 4.60±0.33 4.67±0.30 4.02±0.53
肌脂宽 6.14±0.33 5.35±0.38 5.46±0.59
翅重 100.30±6.90a 76.10±7.57ab 52.91±4.99b
翅膀率 10.90±0.28 11.46±0.16 11.12±0.36
腿重 274.80±21.19 238.91±41.87 143.61±12.60
腿比率 29.12±0.96 39.99±10.34 30.30±0.81
注：基因型上标中的字母显示不同基因型之间的差异，具有相同字母表示两种基因型之间差异不显著(P>0.05)，字母不同表示两种基因型之间差异显著(P<0.05)，没有标记的表明该基因型与其他基因型之间没有显著差异。
分析显示，在鲁禽3号鸡中基因型为CC和CT的个体其宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、全净膛率、胸肌重及腿肌重等测量指标均与TT型个体差异显著，且CC型测量数值最大，同时因为CC型为纯合型，较CT型更适于鸡的育种。同样的，在琅琊鸡中，也是CC型个体生产性状的测量数据更为理想，更适于优异品种鸡的筛选与育种。

Claims (5)

1.一种与肉食鸡优良屠宰性状相关的鸡FABP4基因分子遗传标记，该标记是鸡FABP4基因单核苷酸多态性序列上的多态性位点，其特征在于：所述鸡FABP4基因单核苷酸多态性序列的多态性位点是在FABP4基因序列第一外显子的第51位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC、CT或TT三种基因型，其中CC型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记。
2.权利要求1所述与肉食鸡优良屠宰性状相关的鸡FABP4基因分子遗传标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，方法是：以待检测鸡FABP4基因组DNA为模板，以引物对FABP4E1F/E1R进行PCR扩增，扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用特定的限制性核酸内切酶对扩增出的目的片段进行酶切；之后对酶切产物再一次进行琼脂糖凝胶电泳，来检测酶切产物的片段大小，分析确定鸡FABP4基因的碱基多态性位点，当FABP4基因序列第一外显子的第51位为C或T，且基因型为CC型时，即可判定待检测鸡品种为具有优良屠宰性状的品种鸡；
其特征在于：
所述引物对FABP4E1F/E1R的核苷酸序列为：
FABP4E8F：CCCTCTTTATTGGTCATCCTA；
FABP4E8R：AGGAATGTGACAACGCTAATC；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4-5min；94℃变性30-35s，55-61℃退火30-35s，72℃延伸1min,28-35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存；
所述特定的限制性核酸内切酶为：PpaAII、TaqI、Tsp32I、Tsp32II或TthHB8I，其酶切作用位点为扩增出目的基因中的以下序列：5’…T↓CGA…3’或3’…AGC↑T…5’。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：对于FABP4E1F/E1R引物对来说，PCR扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min,35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述特定的限制性核酸内切酶为：TaqI。
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