CN115044680B - 一种与肉兔屠宰性状相关的snp分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用，一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记，SNP分子标记位于16号染色体上第68098515位点，位点上存在C/T碱基突变；一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记能在肉兔屠宰性状辅助选择中应用。屠宰性状包括宰前活重、全净膛重、半净膛重、全净膛率和半净膛率。本发明能够为肉兔开展持续选育和分子标记辅助选择提供参考依据，利于培育屠宰性状优良的肉兔，利于促进养兔产业长期稳定持续发展；通过本发明技术方案筛选育种，能够获得屠宰性状优良的蜀兴1号肉兔。

Description

一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记及其检测引物组、检 测试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及分子标记与遗传育种技术领域，具体涉及兔的分子标记与遗传育种技术领域，更具体涉及一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用。

背景技术

兔肉作为高蛋白、低脂肪、低胆固醇的食物，既有营养，又不会令人发胖，是理想的“美容食品”，越来越受到人们的青睐。因此，提高兔的产肉量和品质，是养兔业的核心任务。在一些肉兔的饲养体系下，优异生产性能不能完全发挥，商品兔的屠体欠丰满，屠宰性能差，严重影响了兔产业的长期稳定可持续发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：目前，一些饲养体系下，兔的屠体欠丰满，屠宰性能差，严重影响了兔产业的长期稳定可持续发展，本发明提供了解决上述问题的一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用，能够为肉兔开展持续选育和分子标记辅助选择提供参考依据。

本发明通过下述技术方案实现：

一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记， SNP分子标记位于16号染色体上第68098515位点，位点上存在C/T碱基突变。

进一步地，所述SNP分子标记为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列自5’端起第35位碱基存在C/T突变。

一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记的应用，在肉兔屠宰性状辅助选择中的应用。屠宰性状包括宰前活重、全净膛重、半净膛重、全净膛率和半净膛率。

进一步地，基于SNP分子标记的基因型，当SNP分子标记的基因型为TT时，判定肉兔的屠宰性状较好。

当SNP分子标记的基因型为CT时，判定肉兔的屠宰性状次之；当SNP分子标记的基因型为CC时，判定肉兔的屠宰性状最差，即基因型为TT型的兔其屠宰性状明显优于CC型和CT型，可以作为遗传标记应用到优质肉兔新品种的筛选与育种中。

一种SNP分子标记的检测引物组，用于检测上述的一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记，其特征在于，包括PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步地，包括延伸引物，所述延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

一种SNP分子标记的检测引物组的应用，在肉兔屠宰性状辅助选择中的应用。

一种SNP分子标记的检测试剂盒，包括所述SNP分子标记的检测引物组。

进一步地，还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。

一种SNP分子标记的检测试剂盒的应用，在肉兔屠宰性状辅助选择中的应用。

一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记的检测方法，包括以下步骤：

以待测肉兔的基因组DNA为模板，用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的PCR扩增引物进行PCR反应，获得PCR产物；

用SAP酶消化所述PCR产物，去除PCR产物中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，获得消化产物；

以所述消化产物为模板，使用SEQ ID No.4所示的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基，从而确定基因型。

具体地：

1)提取待测肉兔的基因组DNA，利用实施例3提供的试剂盒进行后续检测；

2)以所述待测肉兔的基因组DNA为模板，用所述引物组中的PCR扩增引物进行PCR反应，获得PCR产物；

3)用SAP酶消化所述PCR产物，去除PCR产物中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，获得消化产物；

4)以所述消化产物为模板，使用所述引物组中的单碱基延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

5)利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基，从而确定基因型。

本发明具有如下的优点和有益效果：

本发明提供了一种与肉兔屠宰性状显著相关的SNP分子标记，基于家兔基因组序列信息版本号OryCun2.0，位于家兔16号染色体上第68098515bp位点，所述位点上存在C/T碱基突变。本发明提供的SNP分子标记与肉兔屠宰性状显著相关。实验证明，由肉兔屠宰性状的统计数据表明，家兔16号染色体上第68098515bp位点的野生纯合CC型屠宰性能显著低于突变纯合TT型(P<0.05)，这说明该位点的突变在一定程度上提高了肉兔屠宰性能。因此，后续通过对所述SNP位点进行基因分型即可确定肉兔屠宰性状，为优良屠宰性状肉兔品种的选育提供可靠的手段。

本发明提供的所述的引物组或所述试剂盒在检测与肉兔屠宰性状显著相关的SNP分子标记中的应用。基于Sequenom SNP技术检测肉兔所述SNP位点分子标记的基因型，具有灵敏度高、准确性好、性价比高的特点，可同时对数百至数千份样本进行检测，操作便捷，检测结果真实可靠。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为实施例4中延伸产物的质谱检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、材料或方法。

在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。

实施例1

本实施例提供了一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记，SNP分子标记位于16号染色体上第68098515位点，位点上存在C/T碱基突变。所述SNP分子标记为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列自5’端起第35位碱基存在C/T突变。上述SNP分子标记是基于兔的国际参考基因组OryCun2.0版本。SNP分子标记具体如下所示，对突变位点做出了标注（黑色加粗）：

acacactcat cctctccacg ccaggctcgg ctcgcgggtc taccactccg gctggcgtgcagggcctgtc ctccggcttc tacggcggtc agattc

上述一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记能够用于肉兔屠宰性状的辅助选择，以培育优良屠宰性状的肉兔品种（配套系）。

基于SNP分子标记的基因型，当SNP分子标记的基因型为TT时，判定肉兔的屠宰性状较好。

实施例2

本实施例提供了一种SNP分子标记的检测引物组，用于检测实施例1提供的一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记，包括PCR扩增引物和延伸引物。

PCR扩增引物包括上游引物F和下游引物R，上游引物F的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述的一种SNP分子标记的检测引物组能够在肉兔屠宰性状辅助选择中应用，具体能够在检测与肉兔屠宰性状显著相关的SNP分子标记中的应用。

实施例3

本实施例提供了一种SNP分子标记的检测试剂盒，包括PCR扩增引物、延伸引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板

PCR扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述的一种SNP分子标记的检测试剂盒能在肉兔屠宰性状辅助选择中的应用，具体能够在检测与肉兔屠宰性状显著相关的SNP分子标记中应用。

实施例4

本实施例提供了一种检测与肉兔屠宰性状显著相关的SNP分子标记的方法，具体步骤如下所示：

1、提取待测肉兔的基因组DNA，利用实施例3提供的试剂盒进行后续检测；

（1）样品采集：

381只蜀兴1号F86系兔来源于四川省畜牧科学研究院种兔场，相同日龄、相同饲养管理条件下饲养。在84 日龄时，耳静脉采血 2 mL，EDTA 抗凝，-20 ℃ 冰箱保存备用。自由饮水，禁食12 h 后屠宰，测定宰前活重、全净膛重、半净膛重等屠宰性状指标。

（2）DNA提取

使用成品化试剂盒，提取血样中的基因组DNA。使用NanoDrop2000仪器进行OD值检测，1.25%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA质检合格，转移至96孔板，-20℃储存备用。

2、以所述待测肉兔的基因组DNA为模板，用所述引物组中的PCR扩增引物进行PCR反应，获得PCR产物；

关于PCR扩增反应设计如下：

（1）PCR反应的反应体系为5μL，包括20ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.625μL，25mmol/L MgCl₂0.325μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，0.5μmol/L正向引物F和反向引物R共1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.1μL，去离子水1.85μL；

（2）PCR反应的反应程序为：预变性94℃2min；变性94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持3min。

3、用SAP酶消化所述PCR产物，去除PCR产物中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，获得消化产物；

关于SAP酶消反应设计如下：

（1）SAP反应的反应体系为7μL，10×SAP Buffer 0.17μL，1U/μL SAP Enzyme 0.30μL，去离子水1.53μL，PCR产物 5μL；

（2）SAP反应的反应程序为：37℃ 20min； 85℃ 5min。

4、以所述消化产物为模板，使用所述引物组中的单碱基延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

关于延伸反应设计如下：

（1）延伸反应的反应体系为9μL，包括iplex Buffer Plus 0.2μL，iplexTermination mix 0.2μL，0.625～1.25μmol/L primer mix0.94μL，iplex Enzyme0.041μL，去离子水0.619μL，SAP+PCR reaction 7μL；

（2）延伸反应的反应程序为：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。

延伸产物的质谱检测结果如图1所示，381个样本中只有3个没有分型成功，分型成功率在99 %以上，说明该Sequenom技术分型准确率高。

5、将上述产物委托上海欧易生物医学科技有限公司通过利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基，从而确定基因型，基因型为CC、CT或TT。

不同基因型及等位基因在所有肉兔中的分布频率如表1所示。

表1兔ZBED6基因多态位点的基因型和等位基因频率

对381只肉兔的血液DNA样品采用Sequenom SNP技术分型发现，肉兔ZBED6基因C68098515T位点存在三种基因型，分别为野生纯合型CC、杂合型CT、突变纯合型TT。三种基因型频率为0.223(CC)、0.436(CT)和0.341(TT)，哈代-温伯格平衡检验结果表明该位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），可以针对该突变位点开展进一步的选育。

实施例5

基于实施例4的基础上，进行关联性分析，具体如下所示：

（1）关联分析方法

利用SAS 9.4 的 GLM 程序对该多态位点的各个基因型与屠宰性状进行关联分析，分析模型为:Y= μ + G + e。式中: Y 为屠宰性状观测值，μ 为群体均值，G 为基因型效应，e 为随机残差效应。数据以“平均值±标准差”表示。

（2）关联分析结果

表2 兔ZBED6基因多态性与屠宰性状的关联性分析

分析显示，蜀兴1号肉兔ZBED6基因TT纯合型的宰前活重、半净膛重、全净膛重、半净膛率、全净膛率显著高于CC纯合型和CT杂合型(P<0.05)，而头重在不同基因型间差异不显著(P>0.05)。统计结果从数值上直观地反应出基因型为TT型的兔其屠宰性状明显优于CC型和CT型，可以作为遗传标记应用到优质肉兔新品种（配套系）的筛选与育种中。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川省畜牧科学研究院

<120> 一种与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)(1)

<400> 1

acacactcat cctctccacg ccaggctcgg ctcgcgggtc taccactccg gctggcgtgc 60

agggcctgtc ctccggcttc tacggcggtc agattc 96

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)(2)

<400> 2

acgttggatg acacactcat cctctccacg 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)(3)

<400> 3

acgttggatg gaatctgacc gccgtagaag 30

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)(4)

<400> 4

agccaggctc ggctcg 16

Claims (6)

1.一种检测与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记的试剂在肉兔屠宰性状辅助选择中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列自5’端起第35位碱基存在C/T突变；基于SNP分子标记的基因型，当SNP分子标记的基因型为TT时，判定肉兔的屠宰性状较好。

2.一种SNP分子标记的检测引物组，用于检测权利要求1与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记，其特征在于，包括PCR扩增引物和延伸引物，所述PCR扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.一种SNP分子标记的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所示的一种SNP分子标记的检测引物组。

4.根据权利要求3所述的一种SNP分子标记的检测试剂盒，其特征在于，还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺ 、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。

5.一种权利要求2所述SNP分子标记的检测引物组或一种权利要求3所述SNP分子标记的检测试剂盒的应用，其特征在于，在肉兔屠宰性状辅助选择中的应用。

6.一种权利要求1所述与肉兔屠宰性状相关的SNP分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测肉兔的基因组DNA为模板，用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的PCR扩增引物进行PCR反应，获得PCR产物；

用SAP酶消化所述PCR产物，去除PCR产物中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，获得消化产物；

以所述消化产物为模板，使用SEQ ID No.4所示的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定突变位点处碱基，从而确定基因型。

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