CN114752686B - 一种与兔肌肉品质性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种与兔肌肉品质性状相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，公开了一种与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中存在一个G/A碱基突变的SNP位点，所述SNP位点对应于兔基因组序列OryCun2.0版本第12号染色体第149848215bp位点。本发明还提供一种用于鉴定上述SNP分子标记的引物组，通过该分子标记及引物组，可确定肉兔肌肉品质性状，为肉品质优良的肉兔新品种的选育提供可靠的工具；通过优选该SNP分子标记的优势等位基因，能够加快兔的育种遗传进展，节省育种成本，提高养殖经济效益。

Description

一种与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
兔肉作为高蛋白、低脂肪、低胆固醇的食物，既有营养，又不会令人发胖，是理想的“美容食品”，越来越受到人们的青睐。我国是世界第一的养兔大国，家兔饲养量和兔产品产量均居世界首位，但长期以来肉兔良种依赖进口，而引进的配套系虽然生长速度快，但是由于过度追求生长速度，其肌肉品质反而变得越来越差，不能满足人们对于优质兔肉的需求，严重影响了我国养兔产业的可持续发展。因此，提高兔的产肉量和品质，是养兔业的核心任务。
胰岛素样生长因子(Cinsulin-like growth factor，IGF)可以调节脂类代谢，影响脂肪组织的发育，其主要是通过与细胞表面2种类型的胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor，IGFR)结合后发挥生物学作用。IGFR是动物生长轴上的重要因子，包括胰岛素样生长因子I型受体(IGF1R)和胰岛素样生长因子II型受体(IGF2R)2种类型。IGF1R主要介导IGFs中IGF1的生物学作用，其与配体结合后经过一系列信号转导激活细胞内mRNA转录并调节蛋白质的合成,从而发挥促进细胞增殖等作用。据报道，IGFIR在大多数转化细胞中均有表达。有研究表明，IGF2R可与IGFs结合，但主要与IGF2结合，是IGF2的清除受体(Clearance receptor)，可降低IGF2的水平，抑制ICF2的功能，影响IGFIR的激活，从而起到生长抑制作用。
在畜禽育种研究中，IGF2R基因作为重要的经济性状候选基因在多种动物上已被广泛研究。然而，目前为止还没有关于兔IGF2R基因的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提高一种与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记及其应用，通过寻找与兔肌肉品质性状相关的SNP位点作为分子标记，为肉品质优良的肉兔新品种的选育提供可靠的工具，同时加快育种进程。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第三代分子标记，具有数量多、分布广、代表性强和遗传稳定性好等特点。目前已经在动植物的遗传多样性分析、基因作图、分子标记辅助育种和功能基因学的研究中得到了广泛的应用。为了加快兔的育种进程，本发明首先提供一种与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SNP位点对应于兔基因组序列OryCun2.0版本第12号染色体第149848215bp位点，该位点存在G/A碱基突变。
基于上述原理，发明人在实验前期设计了多种引物组，但大都存在检出效率不稳定、引物结合效果不佳、成功率不高的现象，在经过大量的失败引物验证后，发明人不断调整上下游引物以及延伸引物的搭配，终于找到了一套引物组，可以实现准确鉴别与兔肌肉品质性状相关的分子标记的目的，该引物组包含上游引物、下游引物以及延伸引物；
上游引物：5’-ACGTTGGATG ATTCAGGTGT GACGAGGATG-3’；
下游引物：5’-ACGTTGGATG TTTGGTCTTC CACTCGAAGG-3’；
延伸引物：5’-CCTCGCACCCGCGCAC-3’。
本发明的第二目的是提供一种用于鉴定前述的与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记的试剂盒，包括前述的引物组或前述SNP分子标记的标准阳性模板。
本发明的第三目的是提供一种前述SNP分子标记、前述引物组或前述试剂盒在鉴定兔肌肉品质、遗传育种中的应用。
进一步地，所述鉴定兔肌肉品质的方法包括如下步骤：
1)提取待测兔的基因组DNA；
2)以待测兔的基因组DNA为模板，用前述引物组中进行PCR扩增，获得PCR产物；
3)用酶消化所述PCR产物，去除PCR产物中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物；
4)以消化后的产物PCR为模板，使用前述引物组中的单碱基延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；
5)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基，从而确定基因型。
进一步地，所述基因型为GG、GA、AA型；
所述基因型为AA型的兔肌肉品质性状明显优于GG型和GA型。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为5μL，包括20ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.625μL，25mmol/L MgCl2 0.325μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，0.5μmol/L上游引物和下游引物共1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.1μL，去离子水1.85μL；
所述PCR扩增的反应程序为：预变性94℃2min；变性94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持3min。
进一步地，用SAP酶消化所述PCR产物；
所述SAP酶反应的反应体系为7μL，10×SAP Buffer 0.17μL，1U/μL SAP Enzyme0.30μL，去离子水1.53μL，PCR产物5μL；
所述SAP酶反应的反应程序为：37℃20min；85℃5min。
进一步地，所述延伸反应的反应体系为9μL，包括iplex Buffer Plus 0.2μL，iplex Termination mix 0.2μL，0.625～1.25μmol/L primer mix 0.94μL，iplexEnzyme0.041μL，去离子水0.619μL，SAP+PCR reaction 7μL；
所述延伸反应的反应程序为：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。
进一步地，所述兔遗传育种的改良方法包括如下步骤：确定兔的前述SNP分子标记，并根据SNP分子标记做出相应的选择：兔的继代选育参考兔基因组序列OryCun2.0版本第12号染色体第149848215bp位点的AA型个体，淘汰该点的GG型和GA型个体；以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代兔的肌肉品质。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明筛选并确定了与肉兔肌肉品质性状显著相关的SNP分子标记，由蜀兴1号肉兔肌肉品质性状的统计数据表明，野生纯合GG型兔的剪切力显著高于突变纯合AA型(P<0.05)，说明该位点的突变在一定程度上提高了蜀兴1号肉兔的肉品质，本发明通过对所述SNP位点进行基因分型确定肉兔肌肉品质性状，将其用于兔肌肉品质的遗传改良中，从而提高选择强度，缩短育种周期，进而提高育种效率，节省成本。
(2)本发明基于Sequenom SNP技术检测肉兔所述SNP位点分子标记的基因型，具有灵敏度高、准确性好、性价比高的特点，可同时对数百至数千份样本进行检测，操作便捷，检测结果真实可靠。
附图说明
图1为延伸产物的质谱检测结果；
图2为失败引物组延伸产物的质谱检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所应用的方法可以采用生物研究领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明表格中的数值均为平均值。
本发明的与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记，来自IGF2R基因，SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SNP位点对应于兔基因组序列OryCun2.0版本第12号染色体第149848215bp位点，该位点存在G/A碱基突变。
针对上述SNP分子标记，本发明公开了如下获取方法：
实验动物
381只相同日龄断奶的蜀兴1号F86系兔来源于四川省畜牧科学研究院种兔场，在相同饲养管理条件下饲养。在84日龄时，耳静脉采血2mL，EDTA 抗凝，-20℃冰箱保存备用。自由饮水，禁食12h后屠宰，测定肉色、PH值、滴水损失、剪切力等肉品质指标。
统计分析：
利用SPSS 17.0计算基因型频率和等位基因频率，并且检验Hardy-Weinberg平衡，通过SAS 9.4的GLM程序对该多态位点的各个基因型与肉品质性状进行关联分析，分析模型为:Y＝μ+G+e。式中:Y为肉品质性状观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，e为随机残差效应。
实施例1
(1)使用Invitrogen全血DNA提取试剂盒，提取待测肉兔的血液样本中的基因组DNA，然后利用NanoDrop2000仪器进行OD值检测，1.25％琼脂糖凝胶电泳检测，DNA质检合格后，转移至96孔板，-20℃储存备用。
(2)以所述待测肉兔的基因组DNA为模板，用所述引物组中的PCR扩增引物(SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3)进行PCR反应，获得PCR产物，反应结束后4℃保存；
PCR反应的反应体系为5μL，包括20ng/μL基因组DNA1μL，10×PCR反应缓冲液0.625μL，25mmol/L MgCl2 0.325μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，0.5μmol/L上游引物(SEQ ID NO：2)和下游引物(SEQ ID NO：3)共1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.1μL，去离子水1.85μL；
PCR反应的反应程序为：预变性94℃2min；变性94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持3min。
(3)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase,虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs；
SAP反应的反应体系为7μL，10×SAP Buffer 0.17μL，1U/μL SAP Enzyme0.30μL，去离子水1.53μL，PCR产物5μL；
SAP反应的反应程序为：37℃20min；85℃5min，4℃保存。
(4)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应：以所述的PCR消化产物为模板，使用所述引物组中单碱基延伸引物(SEQ ID NO：4)进行延伸反应，得到延伸产物，延伸产物的质谱检测结果如图1所示；
延伸反应的反应体系为9μL，包括iplex Buffer Plus 0.2μL，iplex Terminationmix 0.2μL，0.625～1.25μmol/L primer mix 0.94μL，iplex Enzyme0.041μL，去离子水0.619μL，SAP+PCR reaction 7μL；
延伸反应的反应程序为：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。
为了验证引物的特异性，本发明还采用了另外1组引物进行扩增，其他扩增条件同(2)、(3)，该组引物的序列分别如下：
上游引物：5’-ACGTTGGATGAGCCACCGGACATCCACAAT-3’；
下游引物：5’-ACGTTGGATGCTTCTCGGGAGGGCAGACCA-3’；
延伸引物：5’-TCACCTCGCACCCGCGCAC-3’。
结果如图2所示，造成这种结果的原因有：1.多重PCR引物竞争失败；2.基因组特殊结构导致引物结合效果不佳；3.引物所在结合序列存在高频突变导致引物结合效率低；4.扩增目的片段在基因组中存在高度同源序列等原因。
(5)将延伸产物采用树脂纯化后移至384-well SpectroCHIPbioarray上，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基，从而确定基因型，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。结果如表1。
表1蜀兴1号F86系兔IGF2R基因多态位点的基因型和等位基因频率
Figure GDA0004164727620000061
对381只蜀兴1号F86系兔血液DNA样品采用Sequenom SNP技术分型发现，蜀兴1号F86系兔IGF2R基因G149848215A位点存在三种基因型，分别为野生纯合型GG、杂合型GA、突变纯合型AA。三种基因型频率为0.239(GG)、0.476(GA)和0.285(AA)，哈代-温伯格平衡检验结果表明，该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。
按照《畜禽新品种配套系审定和畜禽遗传资源鉴定技术规范(试行)修订稿》的要求，并参照四川省地方标准《肉兔生产性能测定技术规范》(DB51/T159.9-2014)和《畜禽遗传资源调查技术规范第8部分：家兔》(GB/T 27534.8-2011)规定的方法测定L45min、a45min、b45min、pH45min、pH24h、滴水损失、熟肉率以及剪切力指标，其中肉色的测定的具体方法为：在兔宰后45min用便携式色度仪分别在左背最长肌第5腰椎处横断面各测3次，然后分别求平均值，得出L*值(Lightness，亮度)、a*值(redness，红色度)和b*值(yellowness，黄色度)值。对蜀兴1号F86系兔IGF2R基因多态性与肉品质性状进行关联性分析，结果如表2。
表2蜀兴1号F86系兔IGF2R基因多态性与肉品质性状的关联性分析
Figure GDA0004164727620000071
注：在同一行中小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
PSE肉的最大特点就是颜色与正常肉的差异，PSE肉的颜色苍白(肉色L值较高)。
pH是影响肉品质的重要因素之一，它不仅直接影响肉的适口性、嫩度、烹煮损失和货架时间还与肉的系水力和肉色等显著相关。活体禽肉pH值一般为中性偏碱状态(7.0～7.2)，动物屠宰后由于肌田糖原无氧氧化生成乳酸，肌肉的pH值会逐渐下降，这种下降的程度和速度都会对肉色、系水力、可溶性蛋白浓度、细菌繁殖速度、产品深加工和货架期长短等有明显的影响。下降速度越快，肌浆球蛋白越易变性，肌浆球蛋白的变性使肌肉苍白，系水力减弱，出现类似PSE肉的性状。
系水力是另一项重要的肉品质指标，它是指肌肉受到外力作用如加压、加热、冷冻、切碎时保持水分的能力系水力直接影响肉色、嫩度和营养价值。本试验用滴水损失率和熟肉率来衡量兔肉的系水力。失水率越低，熟肉率越高，肉的保水性能、品质就越好。
剪切力的变化主要反映的是肉嫩度的改变，剪切力越低，肉的嫩度越好。
表2结果分析显示，在蜀兴1号F86系兔IGF2R基因GG纯合型的滴水损失率显著高于AA纯合型和GA杂合型(P<0.05)，AA纯合型的剪切力显著低于GG纯合型和GA杂合型(P<0.05)，而L45min、a45min、b45min、pH45min、pH24h以及熟肉率指标在不同基因型间差异不显著(P>0.05)。统计结果从数值上能够直观地反应出基因型为AA型兔其肉品质性状明显优于GG型和GA型，在肉兔育种过程中，可将AA型个体选留下来，从而提高肉兔肌肉品质。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川省畜牧科学研究院
<120> 一种与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记及其应用
<130> 0425
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 91
<212> DNA
<213> 1
<400> 1
attcaggtgt gacgaggatg aggacatcgg gaagccacgg gtcctgagtg aggtgcgcgg 60
gtgcgaggtg accttcgagt ggaagaccaa a 91
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 2
<400> 2
acgttggatg attcaggtgt gacgaggatg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 3
<400> 3
acgttggatg tttggtcttc cactcgaagg 30
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 4
<400> 4
cctcgcaccc gcgcac 16

Claims (10)

1.一种与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中存在一个G/A碱基突变的SNP位点，所述SNP位点对应于兔基因组序列OryCun2.0版本第12号染色体第149848215bp位点。
2.一种用于鉴定权利要求1所述的与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记的引物组，其特征在于，包含上游引物、下游引物以及延伸引物；
上游引物：5’-ACGTTGGATG ATTCAGGTGT GACGAGGATG-3’；
下游引物：5’-ACGTTGGATG TTTGGTCTTC CACTCGAAGG-3’；
延伸引物：5’- CCTCGCACCCGCGCAC-3’。
3.一种用于鉴定权利要求1所述的与兔肌肉品质性状相关的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组。
4.权利要求1所述的SNP分子标记、权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒在鉴定兔肌肉品质中的应用，所述兔的品种为蜀兴1号F86系兔，所述肌肉品质为滴水损失率、剪切力。
5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述鉴定兔肌肉品质包括如下步骤：
1)提取待测兔的基因组DNA；
2)以待测兔的基因组DNA为模板，用权利要求2所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
3)用酶消化所述PCR产物，去除PCR产物中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物；
4)以消化后的PCR产物为模板，使用权利要求2所述引物组中的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；
5)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定突变位点处碱基，从而确定基因型。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述基因型为GG、GA、AA型；所述基因型为AA型的兔肌肉品质性状明显优于GG型。
7.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为5μL，包括20ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.625μL，25mmol/L MgCl20.325μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，0.5μmol/L上游引物和下游引物共1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.1μL，去离子水1.85μL；
所述PCR扩增的反应程序为：预变性94℃2min；变性94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持3min。
8.根据权利要求5的应用，其特征在于，用SAP酶消化所述PCR产物；
SAP酶反应的反应体系为7μL：10×SAP Buffer 0.17μL，1U/μL SAP Enzyme 0.30μL，去离子水1.53μL，PCR产物 5μL；
所述SAP酶反应的反应程序为：37℃ 20min； 85℃ 5min。
9.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述延伸反应的反应体系为9μL，包括iplexBuffer Plus 0.2μL，iplex Termination mix 0.2μL，0.625～1.25μmol/L primer mix0.94μL，iplex Enzyme0.041μL，去离子水0.619μL，SAP+PCR reaction 7μL。
10.权利要求1所述的SNP分子标记、权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒在兔遗传育种中的应用，其特征在于，所述兔遗传育种包括如下步骤：确定兔的权利要求1所述的SNP分子标记，并根据SNP分子标记做出相应的选择：兔的继代选育选择兔基因组序列OryCun2.0版本第12号染色体第149848215bp位点的AA型个体，淘汰该位点的GG型和GA型个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代兔的肌肉品质；所述兔的品种为蜀兴1号F86系兔，所述肌肉品质为滴水损失率、剪切力。
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