CN1483081A - 新的prkag3等位基因及其作为生殖和肉质性状的遗传标记的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了针对动物肉质和生殖效率的遗传标记，鉴别这种标记的方法，及筛选动物以确定更可能产生较多胎仔数和/或更好肉质的动物的方法，及优选地，选择用于进一步育种目的的动物的方法。所述标记是基于PRKAG3基因中某些多态性的存在与否。
Description
资金参考条款
本发明至少部分由第IOWO 3600号计划(Hatch Funds，USDA)的支持而完成。美国政府在本发明中有一定权利。
相关申请的交叉参考
本申请是同一申请人的下述共同在审美国临时申请的继续申请：申请日为2000年9月8日的60/231,045；申请日为2001年1月8目的60/260,239；和申请日为2001年6月18日的60/299,111。根据35 U.S.C.第120款要求优先权。
发明领域
本发明一般地涉及动物之间遗传差异的检测。更具体地，本发明涉及是与动物的改良的肉质、幼仔大小和其它经济性状相关的可遗传表型的指征的遗传标记。本发明还揭示了用这些标记对动物进行基因分型和选择的方法和组合物。
发明背景
个体动物之间和品种之间存在遗传差异，这些遗传差异可以由育种技术开发用于产生具有所需特征的动物。例如，中国品种以初情期较早，胎仔数较多而著称，而美国品种以较快的生长速度和瘦肉著称。然而，通常所需性状的可遗传性较低，而基于表型变异选择个体的标准育种方法没有充分考虑遗传变异或所存在的复杂基因相互作用。
限制片段长度多态性(RFLP)分析已被一些研究小组用于研究猪DNA。引入本文作参考的Jung et al.，
Theor.Appl.Genet.，77：271-274(1989)，公开了使用RFLP技术以显示两个猪品种之间的遗传变异性。在这些品种中证实了猪白细胞抗原(SLA)I类基因的多态性。引入本文作参考的Hoganson et al
Abstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science，1990年3月26-28日报道了中国猪的猪主要组织相容性复合物(MHC)基因的多态性，其也由RFLP分析证实。引入本文作参考的Jung et al.，
Theor.Appl.Genet.，77：271-274(1989)，报道了在一些公猪中的SLA I类基因的RFLP分析。作者指出结果提示在猪SLA/MHC I类基因和生产及行为性状之间可能有一相关性。他们进一步指出使用SLA I类限制片段作为遗传标记可能在将来改良猪生长行为方面有潜力。
追踪一特异的有利遗传等位基因的能力涉及鉴别主要效应基因的DNA分子标记的新的冗长的过程。标记可能与具有主要效应的一个单基因连锁，或者与具有加成效应的多个基因连锁。DNA标记具有若干优势，如分离易于测量并且明确，DNA标记是共显性的，即杂合和纯合动物可以明显区分。一旦建立标记系统，就可以很容易地做出选择决定，因为DNA标记可以在从个体初生动物或甚至胚胎中收集组织或血液样品后的任何时间来分析。
受体基因中基因差异的使用已经成为用于选择的一有价值的标记系统。例如，授予Rothschild等人的美国专利5,550,024和5,374,526公开了猪雌激素基因中的一多态性，其与较多胎仔数相关，这些专利引入本文作参考。美国专利5,935,784公开了猪泌乳素受体基因中的一些多态性标记，它们与较多胎仔数和整体生殖效率相关。
胎仔数当然对于育种者有直接的经济影响，其对于肉用动物的肉质也很重要。肉质是一种很难评价的特征，因为许多不同的主观和客观方面构成了这一整体性状。决定肉质的因素与决定其它食品的因素一样非常多(Wood et al.，Proceedings of The Nutrition Society(1999)58：363-70).其包括不含微生物有害物(食品安全)和防止对动的自私利用(动物福利)。其也包括肉的感官诉求，即它的味道或食用品质，以及特别是与脂肪的量和类型相关的察觉到的健康性。
生猪的肉质由许多遗传因素和非遗传因素影响。非遗传因素包括饲养、运输、屠宰和加工条件。肉类研究科学家对这些因素已经进行了大量研究，这些研究导致品质大大改良。也有部分研究致力于动物的遗传背景，一些研究揭示了遗传因素的重要性。这使得业界意识到动物的选择性育种和基因技术的应用可以在改进猪肉品质方面起重要作用。
DNA水平的信息有助于着眼于一特异的主要基因，但是其也可有助于选择我们已经选择的定量性状。除了表型数据之外的分子学信息可以增加选择的精确性并且因此增加选择应答的精确性。在这种标记辅助选择(MAS)计划中额外应答的大小已被许多研究者从理论观点考虑到。一般而言，MAS对于具有低可遗传性并且进行表型测量较昂贵的性状更有利。肉质特别提供了利用MAS的一个绝好机会。例如，Meuwissen，T.H.E.和Goddard，M.E.(1996)“动物育种方案中标记单元型的应用，Genet.Sel.Evol.，28 161-176考虑了标记辅助选择对于诸如生殖和肉质等难于用传统方法取得进展的性状的影响。他们的结果非常令人鼓舞，表明对于在屠宰后测量的诸如肉质的性状，可以达到高达64％的额外响应。
实际上，遗传改良经济性状如肉质或胎仔数的最佳途径是在进行选择的群体中直接寻找相关的DNA标记。肉质测量可以在来自育种机构的核心群体的一些动物上连续进行。由于肉质的完全评价仅能在屠宰后进行，所以只能在剔出作为次品的动物上收集数据，不能在有潜力的育种动物上获得数据。类似地，对于胎仔数，雌性动物仅能在它们出生后进行鉴别以确定胎仔数。鉴别这些性状的遗传素因将使得可以在基因水平进行选择。
收集这一表型数据以便能检测相关DNA标记，并验证用实验群体鉴别的标记或测试候选基因。显著的标记或基因然后可以直接包括在选择方法中。分子学信息的一个优势是我们可以在育种动物非常幼小时即可获得这一信息，这意味着可以在生长行为测试完成之前基于DNA标记预选择动物。这对于整体测试和选择系统是一极大的优势。
由以上所述可以看出仍需要鉴别可以用于通过在基因水平鉴别和选择具有改进的特征的动物而改良动物的肉质和生殖特征的标记。
本发明的一个目的在于提供基于或位于PRKAG3基因之内的遗传标记，其是诸如通过pH、夹花肉、色泽和沥干(drip)损失和/或较多胎仔数而证实的有利肉特征的指征。
本发明的另一目的在于提供用于确定这种遗传标记的存在的分析法。
本发明的再一目的在于提供评价动物的方法，其能增加针对所需性状的选择和育种方法的精确性。
本发明的又一目的在于提供一种能大大加速测定所述标记的存在的PCR扩增测试法。
本发明的其它目的和优点部分在下文描述，部分通过说明书的描述而明了，或者可通过实施本发明而了解。本发明的目的和优点通过所附权利要求书特别指出的手段和组合而实现。
发明概述
本发明涉及PRKAG3基因的交替基因形式的发现，它们可用作与动物肉质性状和生殖性状相关的遗传标记。PRKAG3基因在物种和动物之间高度保守，预期本文公开的这些不同等位基因也与诸如牛、羊、鸡等其它经济动物或肉用动物中这一基因的可变性相关。
为实现本发明的目的，以及根据本文所述具体实施的本发明目的，本发明提供了交替基因型的发现，其提供了筛选动物以确定很可能携带有利的肉质性状的动物或者选择去除具有指示不利肉质性状的等位基因的猪的方法。本文所用术语“有利的肉质性状”是指高于给定群体平均值之上的许多可测量肉质性状中的一种性状的明显改良(增加或降低)，从而这一信息可用在育种中以获得肉质优化的均一群体，根据所需肉特征，这可包括一些性状的增加或者其它一些性状的降低。这些可以考虑的因素包括但不限于下述：
里脊肉Minolta光泽度(L*)：43-47单位范围(从深色至浅色)是可接受的，但是L*为43更好，即通常这一范围具有更高的经济价值(这可取决于市场，例如在日本深色猪肉受欢迎)。
里脊肉日本色泽分(JCS)：2.5-5.0单位范围(从浅色至深色)是可接受的，但是JCS为3-4更好。
里脊肉夹花肉(肌肉内脂肪水平)：通常，较高的夹花肉更好，因为它与改良的肉食用品质特征相关。
里脊肉pH：(屠宰后(post-mortem)24小时测量的最终肉的酸度；这一品质是唯一最重要的猪肉品质的性状)；--5.50-5.80是所需的，但是5.80更好，因为它正影响肉的颜色和(低)purge。
后腿肉Minolta光泽度(L*)：43-52单位范围是可接受的，但是越低(43)越好。
后腿肉pH：越高越好；即5.80。
沥干损失或净化(purge)：1％-3％的范围是可接受的，但越低越好。
这些肉质的测量是本领域广泛接受的例子。对于肉质性状的综述可参照下列文学：Sosnicki，A.A.，E. R.Wilson，E.B.Sheiss，A.deVries，1998″存在生产高品质猪肉的低成本方法吗？″，
Reciprocal Meat Conference Proceedings， Vol.51。
因此，本发明提供了筛选猪以鉴别更可能产生有利的肉质和/或更不可能产生有利肉质的猪的方法，从而优化育种和选择技术得到最佳肉质。
另外，本发明还包括筛选猪以鉴别当育种时更可能产生较多胎仔数的猪或者选择去除具有指示较小胎仔数的等位基因的猪的方法。本文所用术语“较多胎仔数(larger litter size)”是指胎仔数明显高于给定群体平均值。因此，本发明提供了筛选猪以确定更可能产生较多胎仔数的猪和/或更不可能产生较多胎仔数的猪的方法。
分析这些性状的方法通常包括如下步骤：1)从猪中获得一生物学样品；和2)分析步骤1)中获得的基因组DNA或蛋白质以确定存在哪个或哪些PRKAG3等位基因。本文还包括单元型数据，其使得可以在选择或鉴别方案中组合一系列PRKAG3基因多态性，以使每一个这些标记的优点得以最大化。
由于一些多态性涉及PRKAG3蛋白的氨基酸组成的变化，分析方法也可包括确定PRKAG3蛋白的氨基酸组成。这种类型纯化和分析方法典型地涉及通过包括抗体荧光标记在内的手段分离蛋白质，分离和纯化蛋白质(即通过反相HPLC系统)，用自动蛋白质测序仪鉴别所存在的氨基酸序列。这一分析方案是标准化的和本领域已知的并在Ausubel等人编辑的Short Protocols in Molecular Biology，第4版，JohnWiley and Sons 1999中所述。
在一个优选的实施方案中，分析一种基因样品。简要地，从动物获得遗传材料样品，分析样品，以确定在AMP激活的蛋白激酶调节γ亚基(PRKAG3)基因中根据基因形式与增加的胎仔数或改良的肉质或两者相关的多态性的存在与否。
本领域技术人员熟知可以利用许多技术比较核酸分子的序列差异，这些技术包括，例如，限制片段长度多态性分析、异源双链分析、单链构象多态性分析、变性梯度电泳和温度梯度电泳。
在一优选的方案中，多态性是限制片段长度多态性，所述分析包括从分离的遗传材料鉴别猪PRKAG3基因；将该基因与一种限制酶接触，产生各种长度的该基因的限制片段；分离所述限制片段以例如通过电泳或HPLC分离而形成限制模式；比较从已知具有或不具有所需标记的PRKAG3基因所产生的限制片段模式。如果动物测得这些标记是阳性的，则这一动物可被考虑包括在育种计划中。如果测得动物不呈该标记基因型阳性，可将此动物剔除该组或用作其它用途。在筛选肉质和/或胎仔数的多个等位基因时也可使用单元型数据。
在一最优选的实施方案中，通过用引物和DNA聚合酶扩增基因中含有多态性的特异区域来分离基因。接着，用限制酶消化扩增的区域，再次分离片段。用片段的简单染色或者标记扩增中使用的引物或核苷三磷酸而观察RFLP模式。
在另一个实施方案中，本发明包括在一特定群体中鉴别代表肉质和/或胎仔数的遗传标记的方法。培育相同品种或杂交品种或类似遗传谱系的雄猪和雌猪，确定每一个猪产生的后代数(对于雌性而言)和/或肉质。鉴别每一个猪的PRKAG3基因中的多态性，并与后代数或肉质相联系。优选地，RFLP分析用于确定多态性。
在另一实施方案中，本发明包括一种鉴别任何除猪之外的特定经济动物中代表肉质和/或胎仔数(出生数)的遗传标记的方法。基于这一基因在不同动物中高度保守的性质，预计基于本文教导，利用本文所述常规测试，这一标记可以适用于不同动物物种以选择肉质或胎仔数(出生数)。培育相同品种或杂交品种或类似遗传谱系的雄性和雌性动物，确定每一动物产生的后代数或肉质并相联系。对于序列可获得的其它动物，可使用BLAST序列比较以确定是否特定的等位基因与本文所公开的等位基因类似。类似的多态性存在于其它动物和其它密切相关基因中。术语“类似多态性”是这样的多态性，由BLAST比较确定其与本文所公开的任何多态性均相同。
下述术语用于描述两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参照序列”，(b)″比较窗″，(c)″序列相同性″，(d)″序列相同性百分比″，和(e)“实质相同性”。
(a)如本文所用，“参照序列”是一种用作序列比较的基础的已知序列。在此例中是参照PRKAG3序列。参照序列可以是一特定序列的亚序列或完整序列，例如全长cDNA或基因序列的一个区段，或者完整的cDNA或基因序列。
(b)如本文所用，“比较窗”是指一多核苷酸序列的一连续特定区段，其中所述多核苷酸序列可以与一参照序列比较，且其中在比较窗中的多核苷酸序列部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)以使两个序列呈最佳排列。通常，比较窗长度至少为20个连续核苷酸，并任选地可以是30、40、50、100个核苷酸或更长。本领域技术人员明白为避免由于在多核苷酸序列中包括缺口而导致的与参照序列的高相似性，典型地导入缺口罚分并从匹配数中减去缺口罚分。
用于序列比较的序列对比方法是本领域熟知的。用于序列比较的优化对比可以通过如下方法进行：Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性序列对比算法；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现，包括但不限于：Intelligenetics，Mountain View，California；GAP的CLUSTAL于PC/Gene程序中；Wisconsin遗传学软件包，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wisconsin，USA中的BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA；CLUSTAL程序由Higgins andSharp，Gene 73：237-244(1988)；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)；Corpet，et al.，Nucleic Acids Research 16：10881-90(1988)；Huang，et al.，Computer Applications in the Biosciences 8：155-65(1992)，和Pearson，et al.，Methods in Molecular Biology 24：307-331(1994)描述。可用于数据库相似性检索的BLAST家族程序包括：用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的BLASTN；用于核苷酸查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTX；用于蛋白质查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTP；用于蛋白质查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTN和用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTX。参见CurrentProtocols in Molecular Biology，第19章，Ausubel等人编辑，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
除非另有说明，本文提供的序列相同性/相似性值是指用BLAST2.0程序使用默认参数获得的值。Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997).用于进行BLAST分析的程序是公众可获得的，例如通过国家生物技术信息中心获得(
http：//www.hcbi.nlm.nih.gov/)。
这一算法涉及首先通过鉴别查询序列中的短字长W而鉴别高得分序列对(high scoring sequence pairs，HSPs)当与数据库序列中相同字长对比时其或者匹配或者符合一些正值阈值分T。T是指相邻字得分阈值(Altschul et al.，supra)。这些初始相邻字采样数用作起始检索寻找含有其的更长HSP的种子。这些字采样数随后沿每个序列的两个方向延伸直至累积对比分可以增加。对于核苷酸序列，累积分值用参数M(对于一对匹配残基的奖励分；总是＞0)和N(对于错配残基的罚分；总是＜0)计算。对于氨基酸序列，用一得分矩阵计算累积分。出现下述情况时停止字采样数向每个方向的延伸：累积对比分从其最高值下降X数量时；由于积累了一个或多个负分残基对比使累积分为0或0以下时；或者到达序列的末端时。BLAST算法参数W，T，和X决定该算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)为11，预期值(E)为10，截断值为100，M＝5，N＝-4，对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认参数：字长(W)为3，预期值(E)为10，并使用BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915).
除了计算序列相同性百分比之外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量方法是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列发生匹配的概率。
BLAST检索假定蛋白质可以被模拟为随机序列，然而，许多真蛋白质包含非随机序列区，这些区域可以是同源聚合区、短周期重复或富含一或多种氨基酸的区域。尽管蛋白质的其它区域完全不相似，这种低复杂性区域却可以在不相关蛋白质之间实现序列对比。可以采用一些低复杂性过滤程序以降低这种低复杂性序列对比。例如可以单独或组合采用SEG(Wooten and Federhen，Comput.Chem.，17：149-163(1993))和XNU(Claverie and States，Comput.Chem.，17：191-201(1993))低复杂性滤波器。
(c)如本文所用，两个核酸或多肽序列的“序列相同性”或“相同性”是指两个序列进行对比以在一指定比较窗有最大相应性时两个序列中相同的残基。当指出蛋白质的序列相同性百分比时，应理解不相同的残基位置通常由保守氨基酸取代而不同，保守氨基酸取代是氨基酸残基由具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，由此不改变分子的功能性质。当序列由于保守取代而不同时，序列相同性百分比可以根据取代的保守性质而校正。由于这种保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种校正的手段是本领域技术人员已知的，典型地包括将保守取代记为部分而非完全错配，从而增加序列相同性百分比。因此，例如，当一相同氨基酸记为1分，一非保守取代记为0分时，一保守取代的得分记为0-1之间。保守取代的得分例如根据Meyers and Miller，Computer Applic.Biol.Sci.，4：11-17(1988)的算法进行计算，该算法例如以程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)执行。
(d)如本文所用，“序列相同性百分比”是指在一比较窗中比较两个最佳对比的序列而确定的值，其中在比较窗中的多核苷酸序列部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)以实现两个序列的最佳对比。百分比的计算是通过确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得出匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的总位置数，再将结果乘以100而获得序列相同性百分比。
(e)术语多核苷酸序列“实质相同性”是指用所述对比程序使用标准参数与参照序列比较时，一种多核苷酸包含一种具有至少70％序列相同性、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％序列相同性的序列。本领域技术人员能理解这些值可以根据密码简并性、氨基酸相似性、读框位置等进行合适校正以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应相同性。氨基酸序列实质相同性通常是指至少60％、更优选至少70％、80％、90％、最优选至少95％的序列相同性。
这些程序和算法可以确定一靶基因中的一特定多态性与本文公开的多态性的类似性。如以前基于PRKAG3基因的高保守性所述(Jeon T.J.，V.Armeger，C.Rogel-Gaillard，A.Robic，E.Bongcam-Rudloff et al.，2001 Genomics 72：297-303)，预期这一多态性存在于其它动物中，在除本文所述之外的其它动物中使用这一多态性仅涉及根据本文教导常规优化参数。猪PRKAG3序列示于图1。
也可以在可变的DNA标记的特异等位基因和已知与一特定基因(例如本文讨论的PRKAG3基因)相关并且已知与一特定性状相关的DNA标记等位基因之间建立连锁。由此，在本发明中以PRKAG3基因为例，可以至少在短期选择可能产生较多胎仔数和/或更好肉质的猪，或者选择除去可能产生较小胎仔数和/或较差肉质的猪，这通过选择可变染色体15标记的特异等位基因而选择PRKAG3相关标记的某些等位基因而间接进行。已知与猪染色体15上的PRKAG3连锁的这种标记包括SW1683和SW1983。本文所用术语“遗传标记”不仅包括通过分析与多态性相关的蛋白质变化而揭示的多态性，它们也可以是连锁标记、微卫星的使用，或者甚至是分析由标记所指示的成因性蛋白质变化的其它手段以及利用其影响动物肉质的用途。
如本文所用，通常一特定多态性的命名是通过一特定限制酶的名称而定。这不意味着该位点仅可以用该限制酶鉴别。本领域技术人员可以从许多数据库和来源中鉴别可以用于鉴别特定多态性的其它限制酶，例如
http：//darwin.bio.geneseo.edu，其可以给出分析序列鉴别多态性时使用的限制酶。事实上，如本文所教导的，有许多方式可以鉴别特定的多态性或等位基因，一些方法甚至可不包括限制酶，但其分析相同的遗传或蛋白质组可变形式。
本文附图组成本说明书的一部分，它们示出了本发明的一个实施方案，它们与说明书一起用于解释本发明的原理。
附图说明
图1示出猪PRKAG3核苷酸序列，包括氨基酸、可变多态性基因座及其氨基酸变化。
图2A和2B示出PRKAG3基因的5′侧翼区序列，包括外显子1、外显子2和它们之间的新内含子序列。图2A具有SINE(11)，图2B不具有SINE(22)。这一序列可以用于形成额外的引物。粗体字表示SINE之间的直接重复；粗斜体字表示PRKAG3基因的外显子(外显子1和外显子2)。
图3a和3b示出针对SSC15的与肉质相关的QTL的F-比率曲线。X轴为连锁图上的相对位置，y轴代表F-比率。x轴上的箭头指示存在标记的位置。提供了三条曲线代表5％染色体规格(-----)，5％基因组规格(—)和1％基因组规格(----)的显著性。▲：平均糖原，□：平均乳酸盐，●：平均糖酵解潜力性状。图3b示出pH性状。
图4证实对后腿肉和里脊肉的pH和颜色分的PRKAG3单元型取代效应。单元型取代效应在5个品系之间(ALL)和每个品系内进行估算。这些品系基于长白猪(Landrace，LR)，大白猪(Large White，LW)或杜洛克猪(Duroc，DU)，基于杜洛克猪的合成品系(DS)和基于巴克夏猪的品系(BE)。对于BE品系使用一单独的度量。在一栏内具有相同上标的估算值显著不同，对于品系之间估算值p＜.005，对于品系内估算值p＜.005。
发明的详细描述
以下参照本发明的优选实施方案及下述实施例解释本发明的原理。
AMP-激活的蛋白激酶参与开启ATP产生途径并抑制ATP消耗途径。另外，其通过磷酸化失活糖原合酶。AMPK由3个亚基组成：一个催化α链和两个调控亚基β和γ。
Institut National De Le Recherche Agronomique的专利申请WO/01/20003公开了PRKAG3基因的一些变体。这些变体包括一R41Q(本例中相应于第200位氨基酸)取代，一个V40I(第199位氨基酸)取代，其与已知的PRKAG3的RN等位基因相关。该申请报道发现了PRKAG3基因的密码子200中的一个突变，其(在纯合或杂合状态)与称为RN-(200Q)表型的汉普夏猪中的高糖酵解潜力相关。具有这一表型的猪具有低最终pH，降低的保水性并且烟熏熟火腿产量降低。但是对不同品系猪的分析提示密码子200中的这一突变仅在汉普夏品种中出现，而在其它猪品种中出现的频率非常低或者完全不出现。另外，如该PCT申请的实施例5所述，200Q总是与199V一起存在，提示第199位的标记不具备不同于200Q标记的作为遗传标记的变异或独立值。
WO/01/2003鉴别出200Q标记与不利的RN-突变相关，该申请教导这一标记总是与199V一起发现，但是199V也与具有更好肉质的200R一起存在。申请人惊奇地发现第3种组合199I/200R具有平均优于199V/200R的肉质。另外，申请人还发现V199I多态性令人惊奇地与胎仔数变化相关。这一信息使得199标记可用作育种工具。
另外，申请人还鉴别了一新的多态性基因座G52S，其与改良的肉质相关。最后，进行了单元型分析以评价199I-52G-和已知的30T多态性(Milan et.al.，2000所述)之间的相互作用。根据这一实施方案，30T-52G-199I单元型(以下称为单元型3)对于肉质性状是最有利的。
图1示出了PRKAG3基因和本文讨论的所有多态性(SEQ IDNO：1是野生型)。在本申请描述的研究工作之前，没有证据表明这一基因影响其它品种中的经济性状。令人惊奇地，现已发现PRKAG3基因中的新标记PRKAG3-199，PRKAG-30，和PRKAG3-52与除汉普夏品种之外的许多猪品种中的肉质性状和生殖性状如胎仔数中的变化相关。这些新的标记现已示出与在色泽、pH水平、夹花肉和沥干损失方面的肉的最高技术品质相关，也与胎仔数性状相关。根据本发明，这些多态性与这些性状的相关性使得可以鉴别特异品种或遗传品系的遗传标记，以在动物生命早期就鉴别出具有有利肉特征和/或胎仔数的动物。
PRKAG3-199的不同标记基因型是PRKAG3基因内一种多态性的结果，该多态性产生在第595位核苷酸由鸟嘌呤至腺嘌呤的变换(SEQID NO：7)，导致缬氨酸至异亮氨酸的变化(第199位氨基酸)(SEQ IDNO：8)。这一变换接着在等位基因1中产生一与较低的糖原、乳酸盐和糖酵解潜力相关的限制位点。当以至少一个拷贝存在时，发现这一位点也与增加的胎仔数相关。
PRKAG3-52的不同标记基因型是PRKAG3基因内一种多态性的结果，该多态性产生在第154位核苷酸由鸟嘌呤至腺嘌呤的变换(SEQID NO：5)，导致甘氨酸至丝氨酸的变化(第52位氨基酸)(SEQ IDNO：6)。这一变换接着产生一限制位点，由此等位基因2中与较低的糖原、乳酸盐和糖酵解潜力相关。
PRKAG3-30的不同标记基因型是PRKAG3基因内一种多态性的结果，该多态性产生在第89位核苷酸由腺嘌呤至胞嘧啶的变换(SEQ IDNO：3)，导致天冬氨酸至苏氨酸的变化(第30位氨基酸)(SEQ ID NO：4)。这一多态性先前曾报道过，但是未发现其与任何肉质表型相关。苏氨酸与改良的肉质明显相关。
本发明涉及动物中有经济价值的性状的遗传标记。所述标记代表与肉质性状和/或胎仔数(一种生殖性状)明显相关的等位基因，因此提供了一种筛选动物以确定当生殖时更可能产生较多胎仔数或更好肉质(或两者)的动物的方法，这是通过鉴别与此相关的PRKAG3基因中的多态性的存在与否而进行。
因此，本发明涉及遗传标记和鉴别一特定品种、株系、群体或组中动物中的这些标记的方法，由此雌性动物更可能产生个数明显在该特定品种、株系、群体或组的平均值之上的仔畜。类似地，所述方法可以用于鉴别更可能产生具有优选的肉质的肉的动物。
任何鉴别这种标记的存在与否的方法均可使用，包括，例如，单链构象多态性(SSCP)分析、碱基切除序列扫描(BESS)、RFLP分析、异源双链分析、变性梯度凝胶电泳、温度梯度电泳、等位基因PCR、连接酶链反应、直接测序、微测序、核酸杂交、PRKAG3基因或PRKAG3基因的其它连锁序列的微阵列型检测。本发明还包括分析由于这一多态性存在所致的蛋白质构象或序列变化。该多态性可以是或可以不是成因性突变，但是指示这一变化的存在，可以分析表型差异的基因或蛋白质基础。
以下是可以用于分析本发明的多态性的技术的总结。
在本发明中，从一种动物获得遗传材料样品，样品可以得自血液、组织、精液等。通常，外周血细胞可以用作来源，且遗传材料是DNA。获得足够量的细胞以提供足够量的DNA用于分析。本领域技术人员熟悉或容易确定所述的量。通过本领域技术人员已知的技术从血细胞中分离DNA。核酸的分离和扩增
从任何方便的来源包括唾液、颊细胞、毛根、血液、脐带血、羊水、组织液、腹膜液、绒毛膜绒毛或任何其它具有完整间期细胞核或中期细胞的细胞或组织样品分离基因组DNA样品。细胞可以从固体组织中获得，如从新鲜或保存的器官或从组织样品或活检样品获得。样品可以含有与生物学材料不天然混合的化合物如防腐剂、抗凝剂、缓冲液、固定剂、营养物质、抗生素等。
从所述各种来源分离基因组DNA的方法例如在Kirby，DNAFingerprinting，An Introduction，W.H.Freeman & Co.New York(1992)中描述。基因组DNA也可以从培养的原代或次代细胞培养物中分离，或者从衍生自上述任何组织样品的转化细胞系中分离。
也可以使用动物的RNA样品。RNA可以根据Sambrook et al.所述从表达PRKAG3基因的组织中分离。RNA可以是总细胞RNA，mRNA，poly A+RNA，或其任何组合。为了获得最佳结果，需纯化RNA，但是也可以是未纯化的细胞质RNA。RNA可以逆转录成DNA，该DNA然后用作扩增模板，从而PCR间接扩增一特异的RNA转录物群体。例如参见，Sambrook，出处同上，Kawasaki et al.，PCR技术第8章，(1992)出处同上，和Berg et al.，Hum.Genet.85：655-658(1990).PCR扩增
最常见的扩增手段是聚合酶链反应(PCR)，如美国专利4,683,195，4,683,202，4,965,188所述，每一专利均引入本文作参考。如果用PCR扩增血细胞中的靶区域，则应将肝素化的全血导入一与其它样品分离的密封真空管中用清洁手套进行操作。为了获得最佳结果，应在采血后立即进行处理；如果这样不可能做到，则应将血在4℃保持在密封容器中直至使用。也可分析其它生理学液体中的细胞。当用这些液体时，液体中的细胞应通过离心与液体组分分离。
应该用一个无菌的一次性解剖刀和一个无菌针(或两个解剖刀)在一5mm皮氏培养皿中将组织初步切碎。从组织切片中除去石蜡的方法在本领域技术人员熟知的各种专业手册中有描述。
为了用PCR扩增样品中的靶核酸序列，需使扩增系统的组分能与该序列接触。分离靶DNA的一种方法是粗提，其可用于相对较大量的样品。简单地说，血样中的单核细胞、羊水中的羊膜细胞、培养的绒毛膜绒毛细胞等是通过标准程序在无菌Ficoll-Hypaque梯度上分层而分离的。收集间期细胞并在无菌磷酸盐缓冲盐水中洗三次，之后进行DNA提取。如果测试来自外周血淋巴细胞的DNA，则建议采取一渗压休克(用蒸馏水处理沉淀10秒)，之后如果在初次洗涤后仍可见残留红血细胞，则再洗涤二次。这将防止血色素携带的亚铁血红素基团对PCR反应的抑制作用。如果在收集样品后不立即进行PCR测试，则可以将106等份的细胞沉淀于一无菌Eppendorf管中并在-20℃冻干沉淀直至使用。
在补加100μg/ml蛋白酶K的由50mM Tris-HCl(pH8.3)，50mMKCl 1.5mM MgCl2，0.5％Tween 20，0.5％NP40组成的缓冲液中重悬细胞(106有核细胞/100μl)。在56℃保温2小时后，将细胞加热至95℃保持10分钟以失活蛋白酶K，立即转移至湿冰上(突然冷却)。如果存在大的聚集体，应在相同缓冲液中进行另一轮消化。用10μl这种提取物进行扩增。
当从组织例如绒毛膜绒毛细胞或铺满的培养细胞提取DNA时，上述具有蛋白酶K的缓冲液的量可以根据组织样品的大小进行调整。将提取物在50°-60℃保温4-10小时，之后在95℃保温10分钟以失活蛋白酶。在较长的保温过程中，应在约4小时后以原始浓度加入新鲜蛋白酶K。
当样品含有较少细胞数时，可用Higuchi，″Simple and RapidPreparation of Samples for PCR″，in PCR Technology，Ehrlich，H.A.(ed.)，Stockton Press，New York，所述方法完成提取，该文献引入本文作参考。可采用PCR扩增来自骨髓和外周血培养物各个集落的非常少数目的细胞(1000-5000个细胞)中的靶区域。将所述样品中的细胞悬浮于20μlPCR裂解缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，2.5mMMgCl2，0.1mg/ml明胶，0.45％NP40，0.45％Tween 20)中并冷冻直至使用。进行PCR时，向在PCR裂解缓冲液中的细胞中加入0.6μl蛋白酶K(2mg/ml)。然后加热样品至约60℃并保温1小时。通过加热样品至95℃保持10分钟而失活蛋白酶K，终止消化，然后在冰上冷却。
一种相对容易的提取DNA用于PCR的方法是盐析程序，其由Miller et al.，Nucleic Acids Res.16：1215(1988)的方法发展而来，该文献引入本文作参考。在Ficoll-Hypaque梯度上分离单核细胞。将细胞在3ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，400mM NaCl，2mM Na2 EDTA，pH8.2)中重悬。向细胞中加入50μl 20mg/ml蛋白酶K溶液和150μl 20％SDS溶液，然后在37℃保温过夜。在保温中摇动试管将促进样品的消化。如果过夜保温后蛋白酶K消化不完全(仍可见片段)，则在溶液中混合额外的50μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，并在轻轻摇动或旋转的平台上于37℃再保温一夜。合适地消化后，将1ml 6M NaCl溶液加入样品中并剧烈混合。在3000rpm离心所得溶液15分钟，沉淀物含有沉淀的细胞蛋白，而上清含有DNA。将上清移至一含有4ml异丙醇的15ml管中。轻轻混合管的内容物直至水和醇相混合并形成一白色DNA沉淀。将DNA沉淀取出浸入70％乙醇溶液中并轻轻混合。从乙醇中取出DNA沉淀并空气干燥。将沉淀置于蒸馏水中溶解。
用于提取进行PCR的高分子量DNA的试剂盒包括基因组分离试剂盒A.S.A.P.(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)，基因组DNA分离系统(GIBCO BRL，Gaithersburg，Md.)，Elu-Quik DNA纯化试剂盒(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)，DNA提取试剂盒(Stratagene，LaJolla，Calif)，TurboGen分离试剂盒(Invitrogen，San Diego，Calif.)等。根据厂商指导使用这些试剂盒在实施本发明方法之前进行DNA纯化是可接受的。
提取的DNA的浓度和纯度可以通过在260nm和280nm对稀释样品进行吸光度的分光光度分析而测定。提取DNA后可进行PCR扩增。每一循环的PCR的第一步涉及分离由引物延伸形成的核酸双链。链分离后，PCR的下一步是将分离的链与位于靶序列侧翼的引物杂交。随后延伸引物形成靶链的互补拷贝。为进行成功的PCR扩增，引物的设计需使得每一引物沿双链序列杂交的位置应该能够使从一个引物合成的延伸产物与模板(互补序列)分离后可用作另一引物的延伸模板。重复变性、杂交和延伸循环多次，直至获得所需量的扩增核酸。
在一特别有用的PCR扩增方案中，链分离通过将反应加热至足够高温度保持足够长时间以导致双链变性但不导致聚合酶的不可逆变性而实现(参见美国专利4,965,188，该文献引入本文作参考)。典型的加热变性涉及温度范围为约80℃至105℃，时间为几秒至几分钟。但是链分离也可通过任何合适的方法实现，包括物理、化学或酶学方法。链分离例如可通过解旋酶诱导，或者通过能显示解旋酶活性的酶诱导。例如，酶RecA在ATP存在下具有解旋酶活性。适于通过解旋酶进行链分离的反应条件是本领域已知的(参见KuhnHoffman-Berling，1978，CSH-Quantitative Biology，43：63-67；和Radding，1982，Ann.Rev.Genetics 16：405-436，该文献引入本文作参考)。
PCR中引物的模板依赖性延伸通过在合适量的四种脱氧核苷三磷酸(典型地为dATP，dGTP，dCTP，和dTTP)存在下，在由合适的盐、金属阳离子和pH缓冲系统组成的反应介质中由一聚合试剂催化。合适的聚合试剂为已知能催化模板依赖性DNA合成的酶。在某些情况中，靶区域可编码由细胞表达的蛋白质的至少一部分。在这种情况下，可使用mRNA扩增靶区域。或者，可使用PCR从RNA产生一cDNA文库用于进一步扩增，引物延伸的最初的模板是RNA。适于从RNA模板合成互补拷贝DNA(cDNA)的聚合试剂是逆转录酶(RT)，如禽成髓细胞血症病毒RT、Moloney鼠白血病病毒RT或Thermusthermophilus(Tth)DNA聚合酶，该酶是由Perkin Elmer Cetus，Inc.出售的具有逆转录酶活性的一种耐热DNA聚合酶。典型地，在初始逆转录步骤后在第一个变性步骤中加热降解基因组RNA模板，只留下DNA模板。DNA模板使用的合适的聚合酶包括例如E.coli DNA聚合酶I或其Klenow片段，T4 DNA聚合酶，Tth聚合酶，和Taq聚合酶，后者是从Thermus aquaticus分离的一种耐热DNA聚合酶并由Perkin ElmerCetus，Inc.在市场销售。后一种酶广泛用于核酸的扩增和测序中。使用Taq聚合酶的反应条件是本领域已知的并如Gelfand，1989，PCRTechnology，supra所述。等位基因特异性PCR
等位基因特异性PCR可以区分由于一种变异或多态性的存在与否而不同的靶区域。选择PCR扩增引物使得它们仅与靶序列的某些等位基因结合。这一方法如Gibbs，Nucleic Acid Res.17：12427-2448(1989)所述。等位基因特异性寡核苷酸扫描方法
进一步的诊断扫描方法采用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)扫描方法，如Saiki et al.，Nature 324：163-166(1986)所述。针对任一特定的等位基因产生具有一个或多个碱基对错配的寡核苷酸。ASO扫描方法检测变体靶基因组或PCR扩增的DNA与未突变的寡核苷酸之间的错配，示出相对于突变寡核苷酸而言降低的寡核苷酸结合。可以设计寡核苷酸探针使其在低严格条件下与两种多态性形式的等位基因结合，但是在高严格条件下与相应的等位基因结合。或者，可以设计严格条件使得可以获得一基本上二元应答，即相应于变体形式靶基因的ASO只与该等位基因杂交，而不与野生型等位基因杂交。连接酶介导的等位基因检测方法
测试个体的DNA的靶区域可以与未感染的和感染的家族成员的靶区域经连接酶介导的等位基因检测而比较。参见Landegren et al.，Science 241：107-1080(1988)。连接酶也可用于在连接扩增反应中检测点突变，如Wu et al.，Genomics 4：560-569(1989)所述。连接扩增反应(LAR)使用依次循环的模板依赖性连接进行特异DNA序列的扩增，如Wu，supra，和Barany，Proc.Nat.Acad.Sci.88：189-193(1990)所述。变性梯度凝胶电泳
用聚合酶链反应产生的扩增产物可以通过变性梯度凝胶电泳进行分析。基于不同的序列依赖性解链性质和DNA在溶液中的电泳迁移可以鉴别不同的等位基因。在增加温度或变性条件下，DNA分子解链成区段，称为解链结构域。每一解链结构域在一独特的碱基特异性解链温度(TM)下合作解链。解链结构域至少20个碱基长并且可多达几百个碱基。
基于序列特异性解链结构域差异的等位基因之间的区分可通过用聚丙烯酰胺凝胶电泳而评价，如Erlich编辑的PCR Technology，Principles and Applications for DNA Amplification，W.H.Freeman andCo.，New York(1992)的第7章所述，该内容引入本文作参考。
通常欲通过变性梯度凝胶电泳分析的靶区域用位于靶区域两侧的PCR引物进行扩增。扩增的PCR产物加至具有线性变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶，如Myers et al.，Meth.Enzymol.155：501-527(1986)，and Myerset al.，in Genomic Analysis，A Practical Approach，K.Davies Ed.IRLPress Limited，Oxford，pp.95-139(1988)所述，该内容引入本文作参考。电泳系统保持在略低于靶序列解链结构域的Tm的温度。
在另一种变性梯度凝胶电泳方法中，开始时靶序列可以附着于一段GC核苷酸序列，称作GC夹，如Erlich，supra的第7章所述。优选地，GC夹中至少80％序列为鸟嘌呤或胞嘧啶。优选地，GC夹至少30个碱基长。这一方法特别适用于具有高Tm的靶序列。
通常，靶区域通过如上所述的聚合酶链反应扩增。一个寡核苷酸PCR引物在其5’末端携带至少30个碱基的富含GC的序列即GC夹区域，该GC夹区域在扩增过程中掺入靶区域的5’末端。得到的扩增的靶区域在如上所述变性梯度条件下在电泳凝胶上电泳。具有一个单碱基不同的DNA片段将会迁移至凝胶的不同位置，通过溴化乙锭染色可见温度梯度凝胶电泳
温度梯度凝胶电泳(TGGE)基于与变性梯度凝胶电泳相同的原理，除了变性梯度是由温度差而非化学变性剂的浓度差产生。标准TGGE使用具有沿电泳通道设置的温度梯度的电泳装置。随着样品样品与均匀浓度的化学变性剂迁移经过凝胶，它们遇到越来越高的温度。另一种TGGE方法，时间温度梯度凝胶电泳(TTGE或tTGGE)利用稳定增加温度的完整凝胶电泳以实现相同结果。随着样品迁移经过凝胶，整个凝胶的温度升高，导致样品在迁移经过凝胶时遇到越来越高的温度。样品的扩增，包括掺入GC夹的PCR扩增和产物的观察均与变性梯度凝胶电泳一致。单链构象多态性分析
在PRKAG3基因座的序列或等位基因可以用单链构象多态性分析而区分，该分析通过单链PCR产物的电泳迁移的改变而鉴别碱基差异，如Orita et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.85：2766-2770(1989)所述。扩增的PCR产物可以如上所述产生，并加热或以其它方式变性，形成单链扩增产物。单链核酸可以再折叠或形成部分依赖于碱基序列的二级结构。由此，单链扩增产物的电泳迁移率可以检测等位基因或靶序列之间的碱基序列差异。错配的化学或酶裂解
靶序列之间的差异也可以通过错配碱基对的差示化学裂解而检测，如Grompe et al.，Am.J.Hum.Genet.48：212-222(1991)所述。在另一种方法种，靶序列之间的差异可以通过酶裂解错配碱基对而检测，如Nelson et al.，Nature Genetics 4：11-18(1993)所述。简单地说，来自动物或受影响的家族成员的遗传材料可以用于产生无错配的异源杂种DNA双链。如本文所用，“异源杂种”是指包含来自一个动物的一条DNA链和来自另一个动物的第二条DNA链的DNA双链，所述另一个动物对于感兴趣的性状通常有不同的表型。对无错配的异源杂种的阳性选择使得可以确定可能与PRKAG3多态性相关的小插入、缺失或其它多态性。非凝胶系统
其它可能的技术包括非凝胶系统如TaqManTM(Perkin Elmer)。在这一系统中，设计寡核苷酸PCR引物使之位于所研究突变的两侧，并对该区域进行PCR扩增。然后设计一第三个寡核苷酸探针以与含有在该基因不同等位基因之间变化的碱基的区域。这一探针用荧光染料在5’和3’末端均进行标记。这些染料的选择是使得当它们互相接近时，其中一个荧光被另一个猝灭，不能检测到。从在模板上位于探针的5’的PCR引物经Taq DNA聚合酶延伸导致由Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性对附着于退火的探针的5’末端的染料的裂解。这样除去了猝灭效应使得在探针3’末端染料的荧光得以检测。通过如下事实辨别不同DNA序列，即如果探针与模板分子的杂交不完全，即有某种形式的错配，则不发生染料的裂解。因此，仅寡核苷酸的核苷酸序列与所结合的模板分子完全互补时才会除去猝灭效应。一种反应混合物可以含有两种不同的探针序列，每种探针针对可能存在的不同等位基因而设计，由此使得在一个反应中检测两个等位基因。
另一种技术包括侵入者分析(Invader Assay)，其包括基于荧光的催化释放的等温扩增。参见Third Wave Technology，
www.twt.com。非PCR基础的DNA诊断
与PRKAG3连锁的DNA序列的鉴别可以无需扩增而进行，其基于动物及其家族成员中的多态性如限制片段长度多态性。杂交探针通常是通过互补碱基配对与靶核酸的全部或部分结合的寡核苷酸。根据杂交条件的严格程度，探针典型地与缺少与探针序列的完全互补性的靶序列结合。优选地探针直接或间接被标记，从而可以通过分析探针的存在与否而检测靶序列的存在与否。直接标记方法包括放射性同位素标记，如32P或35S。间接标记方法包括荧光标记、可与亲和素或链亲和素结合的生物素复合物，或者肽或蛋白质标记。目视检测方法包括光学发光、Texas红、罗丹明及其衍生物、red leuco染料e，e′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、荧光素及其衍生物、丹酰、繖型酮等，或者使用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。
杂交探针包括能与PRKAG3所在的猪染色体杂交并因此确定一与PRKAG3连锁的遗传标记的任何核苷酸序列，所述遗传标记包括限制片段长度多态性、超变区、重复元件、或可变数目串联重复。杂交探针可以是任一基因或合适的类似物。其它合适的杂交探针包括外显子片段或cDNA部分或已知定位于该染色体相关区域的基因。
本发明使用的优选的串连重复杂交探针是能在高严格杂交条件下识别一特异基因座的少量片段的探针，或者是当严格条件降低时在该基因座能识别更大量片段的探针。
可以使用一或多个额外的限制酶和/或探针和/或引物。额外的酶、构建的探针和引物可以由本领域技术人员经常规实验确定并包括在本发明范围内。
尽管本文所述方法可以利用单个限制酶和单套引物，但是所述方法不限于如此。如果需要，可以使用一或多个额外的限制酶和/或探针和/或引物。实际在某些情况中，优选的是利用给出特异单元型的标记的组合。可以通过组合本文的教导经常规实验确定额外的酶、构建的探针和引物。
根据本发明，已经鉴别了与肉质和胎仔数相关的PRKAG3基因中的一多态性。在一个实施方案中，标记的存在与否可以通过使用限制性核酸内切酶的PCR RFLP进行分析，扩增引物可以使用在该多态性附近区域中有高同源性的类似的人、猪或其它与PRKAG3相关基因进行设计，或者可以使用例如GenBank中的已知PRKAG3基因序列数据进行设计，或者甚至从得自紧密相邻基因的连锁数据的序列根据本文教导和参考文献设计。多态性附近的序列将促进不同PCR测试的开发，其中取自多态性紧邻序列的约4-30个连续碱基组成的引物与聚合酶链反应一起应用以在用所需限制酶处理之前大大扩增所述区域。引物无需精确互补，实质上等价的序列是可以接受的。用于PCR扩增的引物的设计是本领域技术人员已知的并且在Ausubel(ed.)，“ShortProtocols in Molecular Biology，Fouthh Edition”John Wiley and Sons1999中有详细描述。以下是引物设计的简要描述。引物设计策略
聚合酶链反应(PCR)方法的日益增加的应用刺激开发许多程序以助于设计和选择用作PCR引物的寡核苷酸。可从互联网免费获得的这类程序的4个例子是Whitehead Institute的Mark Daly和Steve Lincoln设计的PRIMER(UNIX，VMS，DOS，和Macintosh)，WashingtonUniversity in St.Louis的Phil Green和LaDeana Hiller设计的Oligonucleotide Selection Program(OSP)(UNIX，VMS，DOS，andMacintosh)，Yoshi设计的PGEN(仅适于DOS)，和University ofWisconsin的Bill Engels设计的Amplify(仅适于Macintosh)。一般这些程序通过检索已知的重复序列元件，然后通过分析潜在引物的长度和GC含量而优化Tm而帮助设计PCR引物。也有市售软件，引物选择程序正迅速被包括在最常用序列分析软件包中。测序和PCR引物
用于测序和PCR引物的寡核苷酸的设计需要选择特异地识别靶的合适序列，然后测试序列以消除寡核苷酸具有稳定二级结构这一可能性。序列中的反向重复可以用例如如上所述的鉴别重复或RNA折叠程序进行鉴别(参见核酸结构的预测)。如果观察到一可能的茎结构，可以在任一方向变换几个核苷酸以使预测的二级结构最小化。寡核苷酸的序列还应该与合适的载体和插入DNA序列的两条链的序列进行比较。显然测序引物应该仅具有与靶DNA的单匹配。另外还建议去除与非所需靶DNA序列仅有一个错配的引物。对于用于扩增基因组DNA的PCR引物，引物序列应与GenBank数据库中的序列进行比较以确定是否发生任何明显的匹配。如果该寡核苷酸序列存在于任何已知的DNA序列中，或者更重要地，存在于任何已知的重复元件中，则应改变引物序列。
本发明的方法和材料也可以更一般地用于评价猪DNA，对个体猪进行基因分型，以及检测猪中的遗传差异。特别地，猪基因组DNA样品可以参照一或多个对照进行评价以确定是否存在PRKAG3基因的多态性。优选地，进行猪PRKAG3基因的RFLP分析，并将结果与一对照相比较。对照是一已知其猪PRKAG3基因的多态性的不同猪的猪PRKAG3基因的RFLP分析的结果。类似地，猪的PRKAG3基因型可以如下确定：获得基因组DNA样品，在DNA中进行PRKAG3基因的RFLP分析，将结果与对照进行比较。同样，对照是一不同猪的PRKAG3基因的RFLP分析的结果。通过确定PRKAG3基因中多态性对猪进行基因分型。最后，猪之间的遗传差异可以通过如下方式检测：从至少两个猪中获得基因组DNA样品，鉴别PRKAG3基因中多态性的存在与否，并比较结果。
这些分析可用于鉴别如上所述与肉质相关的遗传标记，用于鉴别PRKAG3基因中与其它特征如胎仔数相关的其它多态性，以及用于进行猪的基因型和表型的普通科学分析。
本发明的遗传标记、方法和新等位基因也可用于育种计划，以改良猪的品种、品系或群体的肉质和/或生殖效率(胎仔数)。在某些情况中，持续选择和育种针对与有利的肉质相关多态性至少是杂合、优选是纯合的母猪也可以改良胎仔数。这适用于实施例2所研究的群体。
本文的实施例和方法公开了已经被鉴别具有与一有利性状阳性或阴性相关的多态性的一些基因，所述有利性状对于携带这一多态性的动物的肉质/胎仔数有作用。基因内存在多态性的鉴别通常根据在某些等位基因形式中产生一限制位点的单碱基替换进行。然而，如本文中所证实和讨论的，一个特定等位基因可以具有若干碱基变化，它们可以被分析以确定哪个代表相同多态性(等位基因)。另外，其它遗传标记和基因可能与本文公开的多态性连锁，从而所述分析可涉及鉴别其它基因和基因片段，但这最终取决于对动物中相同多态性的遗传鉴定。本文所公开的基于等位基因差异而选择鉴别动物的分析方法均包括在本发明范围内。
鉴别了多态性并且建立了与一特定性状的相关性之后，本领域技术人员能理解有许多方法可用于对动物针对该多态性进行基因分型。这种不同测试的设计仅代表本领域技术人员已知的参数的优化，它们包括在本发明范围内。实施例1
使用巴克夏猪与约克夏猪之间的三代杂交体，对猪染色体15进行影响肌糖原含量和相关性状的一些定量性状基因座进行作图。基于QTL位置，认为PRKAG3(蛋白激酶，AMP激活的，γ3亚单位)基因是观测作用的良好候选物。分析杂交建立者动物PRKAG3基因序列中的不同。先前报道的RN突变在杂交中不存在，但鉴别出三个错义取代和一个多态短散布元件(SINE)。为证实至少这些突变之一与肉质差异相关的假说，对来自一些不相关使用品系的1800多只动物针对候选取代确定基因型，并进行关联研究。结果表明存在影响肌中糖原含量和所得肉质的PRKAG3基因的新的经济学重要等位基因。单元型分析示出比单独多态性分析更清晰揭示了PRKAG3基因的作用。因为其在更普遍的商业品系中的优势，认为比最初揭示的RN突变对养猪业和消费者具有更大潜在影响。另外，这些结果例证了参与主要突变的基因的其它等位基因在定量性状变异中可以起重要作用
最近关于PRKAG3基因中非保守取代的揭示(Milan等，2000)解释了显性突变(用RN-表示)，其是汉普夏猪品系的肉质和加工产量中明显差异的原因(LeRoy等，1990；Monin和Sellier，1985)。PRKAG3基因中的这种取代(R200Q)使RN-纯合体和杂合体动物肌中糖原增加70％，然后导致观测到在屠宰后24小时肌pH较低，肌中保水性降低，及产生更少量的烹调火腿产品。200Q等位基因与所有RN-动物均关联，并在汉普夏猪中以非常高的百分率存在，但在具有m+表型的猪中或在其它品系猪中不存在(Milan等，2000及本研究)。
哺乳动物AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)，在调节真核细胞中能量稳态中起关键作用(Hardie等，1998)。其由一个催化亚单位(α)和两个调节亚单位(β和γ)组成。在一些哺乳动物中针对α和β亚单位已经鉴别两个同种型，及针对γ亚单位报道了三个同种型(Stapleton等，1996，1997；Gao等，1996；Milan等，2000)。由PRKAG3基因编码的γ3肽，是AMPK的γ调节亚单位的三种选项之一。当将真核细胞受到环境或营养应激因子影响及AMP/ATP比率明显提高时，诱导“AMPK级联效应”开始保守能量(Thorton等，1998)及诱导ATP合成途径(Hardie等，1998)。
在rn+资源群体PRKAG3基因区域中针对肉质性状QTL的鉴别(Malek等，2001)，提示在此基因中新等位基因变异可以是造成所观测效应的原因。在本说明书中，我们报道了影响猪肌肉中糖原含量和一般肉质性状的PRKAG3基因的新经济学重要等位基因的存在，包括最后pH测定和色泽测定及与保水性，沥干损失，嫩度，及烹饪损失相关的测定(Sellier，1998)。对等位基因和单元型作用的最初评估提示这些等位基因对养猪业和消费者(针对肉质改良)具有重要的经济学潜力。材料和方法
系谱，连锁和QTL作图：我们已经在巴克夏猪和约克夏猪(B×Y)之间产生一个杂种，得到了525个F2子代，使用该系谱对肉质QTL作图(Malek等，2001)，使用间隔作图方法(Haley等，1994)。在此杂种中，选择巴克夏猪品种，因为其具有好的肉质，特别是pH，色泽，保水性和嫩度。使用CRI-MAP(版本2.4)作图程序(Green等，1990)将PRKAG3基因在B×Y家族连锁图上进行定位。使用包括PRKAG3位点信息的间隔作图方法(Haley等，1994)，对猪染色体15(SSC 15)肉质QTL进行作图(图1)。评估所述QTL作用并表示出与平均约克夏猪等位基因效力相比平均巴克夏猪等位基因效力。
组织样品和DNA/RNA分离：收集血液样品和表型并记录在得自杂交家族的F0，F1和F2动物(Malek等，2001)上，同时收集一些F3动物的血液样品及后腿肉(ham)和里脊肉(loin)肌组织。我们还获得了从5种不同商业猪品系(长白猪，大白猪，杜洛克猪，杜洛克猪合成品系和巴克夏猪)收集的大量血液样品。通过标准盐析方法从全血中分离基因组DNA，并使用TRIzol试剂方法根据厂商指导从后腿肉和里脊肉肌组织中提取总RNA(GIBCO/BRL，Rockville，MD)。
PCR，RT-PCR，RACE及多态性揭示：基于在GenBank中获得的猪PRKAG3基因序列(AF214521)，我们设计引物以扩增PRKAG3基因的全部编码区域。使用以下物质进行PCR反应：12.5ng猪基因组DNA，1.5mM MgCl2，0.125mM dNTP，0.3μM每种引物和0.35U TaqDNA聚合酶(Promega，Madison，WI)及PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，和0.1％TritonX-100)，终体积10μl。通过随机六核苷酸引发和Superscript II(GIBCO/BRL，Rockville，MD)，根据厂商指导进行总RNA(3.5μg)逆转录(引物：A套，正向5’ATGAGCTTCCTAGAGCAAGGAG 3’及反向5’CAGGTCTCAATCTTATGTTCTTC 3’；B套，正向5’CGTCCGAGCGGCACCTTTGT 3’，及反向5’AAGGTTCCAAGGTTCTCAGGC 3’)。使用FirstChoice RLM-RACE试剂盒(Ambion，Austin，TX)根据厂商指导进行cDNA末端5’快速扩增(RACE)实验，随后对PCR产物测序(基因特异性引物：外部5’CCCACGAAGCTCTGCTTCTT 3’，及内部5’TCCTTGCTCTAGGAAGCTCAT 3’)。使用染料终止子(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)在ABI 377自动测序仪上对扩增子测序。我们使用Sequencher软件(Gene Codes Corporation，版本4.0.5，Ann Arbor，MI)装配所述序列并鉴别多态性。
基因分型和PCR-RFLP分析：针对T30N和G52S取代使用相同引物对(正向5’ATGAGCTTCCTAGAGCAAGGAG 3’和反向5’GGCTGCATGATGTTATGTGCCT 3’)，针对I199V使用一不同引物对(正向5’GGAGCAAATGTGCAGACAAG 3’和反向5’CCCACGAAGCTCTGCTTCTT 3’)，扩增每个分析的错义突变两侧的区域。在用BsaHI(针对I199V)，HphI(针对G52S)和StyI(针对T30N)限制酶消化后，将消化的PCR产物在4％NuSieve琼脂糖(FMC，Rockland，ME)凝胶上分离，并用溴化乙锭染色。针对SINE多态性，将所述产物在1％琼脂糖(AMRESCO，Solon，OH)凝胶上分离后，进行PCR扩增(引物：正向5’GAAACTCTTCTCCCCACAGAC 3’和反向5’GGCTGCATGATGTTATGTGCCT3’)。在对这些多态性确定基因型后，将具有单元型2(表6)的所有动物还针对R200Q取代确定基因型，以提高发现RN-或200Q等位基因的机会(见Milan等，2000)。发现200Q等位基因的两个纯合子和4个携带者，并将这些从进一步的统计学分析中除去，以便RN-突变不影响其它取代的分析。针对R200Q取代，我们使用与I199V突变相同的引物，并用限制酶消化。作为最后的检测，将具有不同单元型的大约100只动物的随机样品也针对R200Q取代进行记录，但无一动物携带200Q等位基因。
表型性状测定：使用典型工业技术对B×Y家族进行表型测定(Malek等，2001)，包括pH，色泽和糖酵解潜力。针对5种商业品系，在商业加工厂收集数据并获得个体肉色(里脊肉和后腿肉反射比—优选较低值)及屠宰后个体里脊肉和后腿肉pH值(优选较高值)。针对加工厂数据，未获得糖原或糖酵解潜力的测定值，色泽和pH表型性状的测定是肉质的普通工业测定，其与糖原和糖酵解潜力间接相关。
统计学分析
-巴克夏猪×约克夏猪F2群体分析：使用普通线性模型程序(SASprocedure GLM，SAS Institute Inc.，Caty，NC)测试B×Y F2群体中PRKAG3 I199V取代与糖原，乳酸盐，糖酵解潜力和肉质性状之间的联系，模型包括母猪，屠宰日期，性别和I199V表型。获得针对I199V取代的所有三个基因型的最小平方平均值。
-商业品系分析：使用混合模型程序(SASprocedure MIXED，SASInstitute Inc.，Cary，NC)测试PRKAG3多态性与肉质性状之间的联系，模型通常包括公猪作为随机效应，屠宰日期和标记基因型作为固定效应。品系也包括进来作为固定效应以进行品系间(across line)分析。不包括性别和农场，因为所有性状仅是针对雌性测定的，每一屠宰日代表的农场不超过一个。在此分析中不使用雄性动物，B×Y结果提示基因型无性别差异。包括三种取代位点的每一种的单独基因型效应的完全模型与5种商业品系相适合。通过后向消去法除去不显著的基因型效应(p＞.10)，以鉴别哪种取代与对肉质性状的效应相关。
在商业品系中获得针对每种单独分析的取代的三类基因型的最小平方(LS)平均值。未发现基因型相互作用品系，因此为改善等位基因效应估算值的可靠性，集合得自5个品系的数据以进行品系间分析。
评估三种取代的组合效应作为单元型取代效应。在模型中评估单元型之间的差异，包括公猪(随机)，屠宰日期及针对每个单元型的一个变量，变量值为-1，0和1，相当于具有提及单元型0，1或2个拷贝的动物。所述单元型取代效应以单元型平均值偏差表示，并反映最差与最好单元型之间的差异。关联分析中使用的动物数目基于测定的性状加以变化，并示于表3，4和5。结果
标记开发和连锁作图：在PRKAG3基因所在的位于标记SW1683和SW1983之间的区域中(Milan等，2000)在SSC15上(Malek等，2001)，检测到一些显著的QTL(图1)。这些QTL包括针对已经报道的受PRKAG3 200Q等位基因影响的平均糖原含量和糖酵解潜力(Milan等，2000)以及24小时后腿肉和里脊肉pH及24小时里脊肉Hunter L值(光反射比)的QTL。在这一QTL令人感兴趣地具有添加效应(RN-突变是显性的)的有利等位基因主要衍生自巴克夏猪品种(通常认为其具有非常好的肉质)(表1)。基于最近开发的猪RN区域的BAC重叠群(Milan等，2000)，在此区域猪的图谱与人转录物图谱的高度连锁顺序保守(Jeon等，2001)及新近揭示的人类基因组图谱(Lander等，2001)，PRKAG3基因是此区域唯一候选基因。针对公布的RN-取代(R200Q)，我们首先测试了建立者动物，即两只巴克夏猪公猪和九只约克夏猪母猪。所有建立者动物均具有rn+等位基因(200R)。通过测序B×Y家族建立者动物和具有极值肉质的4个F3个体中PRKAG3基因的完整编码区域，我们鉴别了三个错义突变。这些是先前阐述的T30N和I199V取代(Milan等，2000)和一个新的错义突变(G52S)。由Milan等(2000)发现的另一个非同义突变(P53L)在B×Y家族建立者动物中未发现分离，它们全是53P。由于5’UTR上信息的缺失，我们使用RACE以发现完整5’侧翼序列和该区域的基因结构。一个内含子SINE多态性发现起自起始密码子上游的79bp，但其只存在于三个约克夏猪祖代母猪中。基于这一杂交家族建立者动物之间每个位点的等位基因频率差异，我们认为G52S和I199V取代是先前报道的肉质QTL的最可能候选物。使用I199V取代，我们将B×Y连锁图中PRKAG3基因作图在针对糖原，乳酸盐和糖酵解潜力及24小时pH的QTL宽峰下面(图1)。在加入PRKAG3 I199V信息后，所述图谱长度和SSC15上标记顺序与Malek等(2001)所述相同。对包括PRKAG3 I199V的QTL的再分析(图1)导致当与Malek等(2001)所述相比较时，F值及SSC15上QTL峰位置(0-3cM)略微改变。
F2关联分析：使用一种关联分析，我们发现所有三种取代(T30N，G52S和I199V)对平均糖原和乳酸盐含量及对F2 B×Y群体糖酵解潜力的有效作用(仅示出I199V取代的数据—表2)。揭示了I199V取代对大多数分析性状、包括糖原和乳酸盐含量及糖酵解潜力测量值的最重要的作用，但也揭示了与这些测量值相关的一些肉质性状。从F2数据中，30T，52G和199I等位基因在肉质方面是有利的。给出杂种中大的预期连锁不平衡，必需研究及证实这些突变在商业品系猪的一些异型杂交体中的作用，以确定该基因是否可能直接参与所观测的肉质变化。
商业群体分析：针对所分析的取代的基因型频率示于表3。就所有三种取代位点而言，基于B×Y F2数据巴克夏猪品系具有较高频率的与骨骼肌中低糖原含量(高肉质)相关基因型。其它商业群体与巴克夏猪群体相比具有较低频率的有利等位基因，特别是对于I199V取代更是如此。
对5个商业品系的每一个及所有品系之间均测试PRKAG3突变及其与肉质的相关性。在品系间分析中，取代位点的后向消去法保留I199V在所有6个性状模型中，针对后腿肉pH，里脊肉pH，里脊肉Minolta L和里脊肉Minolta b保留G52S，针对后腿肉Minolta L，里脊肉Minolta L和后腿肉Minolta b保留T30N。
因为每种取代均示出与至少三种性状的独特相关性，独立评估每种取代的效应。品系间(表4)和品系内(表5)基因型平均值的最小平方估算值示出所分析的取代与肉质测定之间的显著效应，提示也许存在一些另外的(新的)rn+等位基因。
相关性研究表明针对所有分析性状品系间(表4)和品系内(表5，数据只针对I199V)最大效应是就I199V取代获得的。针对这种取代，当进行品系间分析时，所述相关性对该研究中使用的所有肉质性状均是高度显著的(p＜0.0005)。与至少一种性状的显著相关是在每个单独品系内针对相同取代揭示的，在杜洛克猪和杜洛克猪合成品系中对后腿肉Minolta b有高度显著效应，在杜洛克猪合成品系中对里脊肉pH有高度显著效应。用足量动物对每个基因型进行相关性分析，这两个品种(杜洛克猪合成品系，杜洛克猪)具有最佳频率分布(表5)。在品系间分析和大多数个体品系结果中，对所有性状均有同向效应，其中等位基因199是高等肉质的有利等位基因。
当进行品系间分析时，T30N取代在5种性状中显示显著效应，但比I199V作用小，(表4)。T30N的品系内分析显示几乎仅在杜洛克猪和杜洛克猪合成品系群体内有效应(数据未示出)。在大多数情况中，效应是同向的，其中等位基因30T与更好肉质相关
针对G52S取代，在品系间分析中只就两种性状(后腿肉pH和里脊肉Minolta L)鉴别了显著(p＜0.05)效应，一种不同的等位基因被鉴别为是这些性状的有利等位基因。品系内分析表明只对杜洛克猪合成品系群体的里脊肉Minolta色泽分有显著相关性(数据未示出)。
在测试的5个商业品系中，我们只发现四个单元型(表6)。巴克夏猪品种多态性最少，具有高频率(0.87)单元型3(30T-52G-199I)。在大白猪中单元型2(30T-52S-199V)频率最高，单元型1(30N-52G-199V)在长白猪，杜洛克猪和杜洛克猪合成品系群体中具有最高频率。单元型4(30T-52G-199V)在所有这些群体中频率均最低。
计算每个品系和品系间的单元型取代效应以及四个单元型平均值的偏差(图2)。品系间和品系内分析示出单元型之间后腿肉pH和色泽测定值与里脊肉的这些性状相比有较大差异。针对后腿肉pH，品系间和品系内分析示出单元型3具有最高效应，在品系间分析中其明显不同于每种其它单元型(p＜.0005)，在每个个体品系分析中不同于至少一种其它单元型(p＜.05)。单元型2对大多数性状的效应次之，单元型1和4对于肉质的效应最差。这种层次在巴克夏猪群中不明显，其中仅观察到针对单元型4的显著差异，其具有最低值，与品系间结果相应。在巴克夏猪中的不显著结果可能是部分由于在此品种中多态性水平低所致，而且伴随观测到单元型1和4数目极少。在杜洛克猪合成品系群体中对单元型4的估算值似乎与在其它品系中不同(尤其后腿肉pH，其明显高于单元型2(p＜.05)和单元型1(p＜.01)，但在该群体中单元型4的频率非常低(0.07)。该品系的合成性质(尽管其始祖是第6代以前的)也提供了存在延伸的连锁不平衡机会，提高了连锁基因座有助于单元型取代效应的机会。
针对Minolta分的单元型结果符合pH结果。通常发现单元型3具有有利作用(较低色泽分)。在得自各个品系的结果中有少量例外，这些也许是取样所致。唯一的显著偏离是单元型2，其与巴克夏猪中低Minolta b分(p＜.05)相关。在品系间分析中，在大多数情况中单元型2位于单元型3之后。讨论
本研究中报道的结果提供了存在影响肉质性状的PRKAG3基因新等位基因的重要证据。这个结论基于三点：1)PRKAG3等位基因rn+和RN-对肉质的已知作用。2)在B×Y家族中观测到在PRKAG3所处区域中在SSC15上发现的相关肉质性状的一些QTL。这些QTL在这种猪杂种中发现，其中最初的R200Q取代未发生分离，及3)本文提供的关于PRKAG3取代与B×Y F2群体的糖原和乳酸盐含量，糖酵解潜力及肉质性状之间的相关性，及与一些不相关商业猪品系中肉质性状的相关性的结果。
各个取代的相关性分析表明，在所进行的三项研究中，I199V取代在肉质性状中示出最明显的和最大差异。例如，B×Y F2分析示出I199V基因型类别之间在糖酵解潜力方面的明显差异，在糖原和乳酸盐含量方面也如此(表2)。针对大多数分析的肉质性状也显示重要作用。发现等位基因199I与较低水平糖原，乳酸盐和糖酵解潜力，较高后腿肉pH和里脊肉pH相关，并具有更好的色泽分。这个标记对在B×YF2中提供良好的等位基因作用评估是足以有启示的。
在商业群体分析中，I199V取代与纯合体类别之间后腿肉pH的LS平均值中的明显差异相关，在长白猪品系中接近0.14，在品系间为0.10(表4和5)。就一种肉色泽测量即后腿肉Minolta L而言，在纯合基因型间发现显著LS平均值差异，达3.5单位反射比(在长白猪中)，在品系间为2.0。这些作用在0.5-1表型标准偏差范围内。针对其它性状和品种也揭示了重要差异。在对整体肉质重要的性状中的这种程度的作用对动物育种业是非常令人感兴趣的。
除了I199V之外，从T30N的单取代分析中也测得大的效应。然而，如果分析中包括I199V，只有不大的T30N取代效应被保留。认为在第30和199位之间的强连锁不平衡大部分与在第30位检测的作用相关。对G52S的单位点分析观测到微小作用，其通常是不显著的。
单元型分析有助于仔细研究非同义取代的作用，并提供第199位以及52位的作用的额外证据。单元型3，唯一含有199I的单元型，是与pH和肉质色泽测定相关的最有利的单元型。在大多数测试情况中，单元型2，含有52S的唯一单元型，示出中等值，尤其针对后腿肉肉质，比对其它性状的作用更显著更大。单元型1和4的数值均接近最低值，而且在大多数情况中彼此没有明显不同。
在大多数评估中观测到这两种单元型(1和4)是相对相似的，使我们推断T30N取代只产生使肉质变化的边际作用。在长白猪和大白猪品系间分析中，单元型4的频率超过0.10，我们发现单元型1比单元型4对后腿肉Minolta分更具有有利作用(这个单元型与30N变体相关)。在其它群体中，由于单元型4的极低频率对这些单元型作用之间的差异很少评估。
单元型4和单元型2之间的不同只在G52S位点。在品系间分析中单元型4和2对后腿肉和里脊肉pH和Minolta L分的作用显著不同，对各个品系特别是大白猪的一些性状也明显不同。单元型2(其含有52S及编码丝氨酸)比单元型4(其含有52G及编码甘氨酸)有利。这与B×Y研究结果相反，该研究推测52G是有利的等位基因。由于有限的F2建立者动物数目，与I199V位点的强连锁不平衡可能掩蔽了G52S取代在此群体中的真实作用。令人感兴趣地，G52S的单独分析未示出对大多数性状和品系的任何作用。该分析将单元型2与其它3种单元型的组合进行了对比。从图2可以看出，根据单元型频率，其它3种单元型的混合物可以导致接近于单元型2的平均值，由此当单独分析G52S时检测不到差异，这指出了基于单元型的分析的价值。
存在于单元型4中的30T变体，基于单位点分析发现有利于肉质性状，在杜洛克猪和杜洛克猪合成品系中对大多数性状具有明显作用。在这两种品系中，单元型3具有中等频率(表6)，并含有30T及有利的199I变体。由于连锁不平衡，因此199I变体比30T位点变体提供更高作用。
我们总结出取代分析和单元型分析的结合表明在PRKAG3基因中存在三个非同义取代，其对猪的肉质测量度具有不同程度作用。这种令人感兴趣的“一个基因-一些多态性-不同表型”模型是基于对复杂表型性状的可区分的加和作用，并可以作为进一步研究其它性状的模型。最近已经提示在猪中存在由于在选择下进行基因连续突变所产生的多个等位基因(Jeon等，1999；Nezer等，1999)。
I199V取代是在一个胱硫醚β合酶(CBS)结构域内，这是该家族基因中一个非常保守区域(Milan等，2000)。CBS结构域的作用还不清楚，但提示其参与蛋白质活性的胞质定向(Pontig，1997)，蛋白质-蛋白质相互作用(Bateman，1997)和/或蛋白质活性调节(Bateman，1997)。PRKAG3基因中有4个CBS结构域(Milan等，2000)，I199V取代位于第一个也是最保守的结构域中。使用Pfam软件获得的CBS结构域和γ3肽之间的序列对比表明在此位优选的氨基酸是异亮氨酸(结果未示出)。在此研究中令人感兴趣地发现等位基因199I(编码在第199位的异亮氨酸)与在商业群体和B×Y F2家族中更好的肉质相关，及在后者中与较低水平糖原，乳酸盐和糖酵解潜力相关。
Milan等(2000)示出200Q变体(RN-)总是与199V一起被发现。然而，发现199V与200R和200Q一起且199I总是与200R一起。由于只有三个核苷酸分离这些取代位点，因此重组的可能性非常小。就此我们可以认为R200Q是最新近的取代，这种突变只存在于汉普夏猪品种中也支持这一假说。单元型199V-200R和199I-200R可以是祖传的，因为在目前分析的大多数品种(Milan等，2000)包括野猪和一些Suisformes亚目中均已经鉴别出它们(Ciobanu等，未公布结果)。
当与199I-200R单元型相比较时，199V-200R单元型与较高糖原含量和较低死后后腿肉/里脊肉pH相关(B×Y F2数据)。在第199位密码子的取代可能导致对葡萄糖代谢的作用，并从而提高肌糖原含量。第三种单元型199V-200Q授予RN-表型。199V-200Q对糖原含量的相关作用高于其它单元型的作用，199V-200Q单元型相对于其它单元型是显性的。针对这些原因，我们提示RN-表型可以是199V-200Q单元型的组合作用，而不只是唯一R200Q取代的结果。这种作用可以由这些取代对CBS结构域的修饰而引起
AMPK的β和γ调节亚单位的精确功能还不清楚。然而，已知这两个亚单位均是激酶活性所必需的(Hardie和Carling，1997)。体外实验示出β亚单位在AMPK异源三聚体结构形成中具有重要作用，因为β亚单位与不彼此直接相互作用的γ和α亚单位均相互作用(Woods等，1996)。近来有迹象提示变构的AMP-结合位点可以包含AMPK复合物的γ和α亚单位(Cheung等，2000)。Cheung等(2000)提出一种没有AMP的一流模型，其中所述异源三聚体复合物可以主要灭活而不用γ和α亚单位之间的相互作用。在这种情况中，α亚单位中Thr172位点的磷酸化及与底物的相互作用，被α亚单位的自身抑制区阻断。在AMPK的活性形式中，α自身抑制区与一或多个γCBS结构域之间的相互作用阻止所述自身抑制，及AMP结合在这两种亚单位上以稳定装配(Cheung等，2000)。序列排列信息，提议的AMPK复合物调节模型及附近存在R200Q位点，支持I199V取代有可能对AMPK活性起作用的假说。即使还未揭示AMPK复合物的分子结构，但我们假设氨基酸变化也可以影响所述酶的结构和活性，产生所观测到的G52S取代作用。
尽管γ3亚单位在骨骼肌中高度表达，但AMPK活性呈现与γ1和γ2同种型更相关(Cheung等，2000)。然而，机制尚未清楚，PRKAG3基因中R200Q取代(或I199V-R200Q组合)导致AMPK活性在汉普夏猪中明显不同(Milan等，2000)，这提示γ3同种型在骨骼肌葡萄糖代谢中具有重要作用。需要进行不同亚单位组合的详细功能研究以解释这种情况。基于与得自酵母的相关SNF1复合物相比较，AMPK在葡萄糖代谢中的作用产生生理学意义。另外，一些研究示出AMPK参与糖原代谢，这通过灭活糖原合酶(Carling和Hardie，1989；Poulter等，1988；Zhang等，1993)，激活氧化一氮合成酶(Fryer等，2000)及通过最佳葡萄糖转运蛋白4易位于浆膜(Hayashi等，1998；Kurth-Kraczek等，1999；Bergeron等，1999；Holmes等，1999)。
尽管本文报道的取代对肉质测量度的作用比那些显性RN-突变的作用的量值少，但它们是生物学和经济学均重要的。特别是这些等位基因在目前分析的所有商业品系和品种中均是分离的，与RN-突变相反，后者只与汉普夏品种相关并在大多数猪肉生产程序中仅有限使用。针对PRKAG3报道的结果还提示遗传学家应在已知在物种内和之间导致更激烈作用的基因中寻找具有经济影响的另外的突变。这个观点得到与在所研究物种和品种之外的其它基因相关的主要作用的报道的支持，例如MC4R突变在小鼠(Huszar等，1997)和人体(Yeo等，1998)中的大作用，在猪中程度较低(Kim等，2000)。
在动物物种中具有生物化学意义的新基因的鉴别，还为人类生物医学目标提供了有用信息。当揭示新的和感兴趣的等位基因时，这种知识得以增进。在PRKAG3情况中，已经提示(Milan等，2000)人体中这个基因及其它AMPK相关基因，基于其功能和QTL位置，是人II型糖尿病的令人感兴趣的候选物。为此，这些新等位基因的作用可以提供关于影响葡萄糖代谢的潜在因子的新见识，并应在对该疾病的进一步研究中加以重视。
本文所引用的参考文献均以其全文并入参考，包括但非限于以下文献：
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表1：在5％染色体水平猪染色体15对各种肉质性状的显著QTL的证据
a在5％染色体水平F统计学阈值，通过排列测试(permutation test)确定为5.02。b针对具有遗传获得的两个巴克夏猪等位基因的个体，杂合体和具有两个约克夏猪等位基因的个体，加和(a)和显性(d)QTL作用分别相当于基因型值+a，d和-a。阳性加和作用表示巴克夏猪等位基因提高所述性状，阴性表示巴克夏猪等位基因降低所述性状。显性作用是相对于两种纯合体的平均值c％方差＝基于评估的加和和显性作用及1/2等位基因频率的在QTL的遗传方差，以F2中的剩余方差百分率表示。d测量单位-μmol/g*在5％基因组水平显著(F＞8.22)**在1％基因组水平显著(F＞9.96)
| 位置 加和 显性 方差c性状 F-值a (cM) 作用b S.E. 作用 S.E. (％) |
| 平均糖原d 7.74 69 -0.70 0.21 0.65 0.031 3.52平均乳酸盐d 4.50 69 -2.24 0.79 -1.10 1.16 2.00平均糖酵解潜力d 6.37 69 -3.63 1.02 0.18 1.50 4.6924hr.后腿肉pH 8.42* 72 0.05 0.01 -0.02 0.02 4.0024hr.里脊肉pH 12.21** 78 0.05 0.01 -0.01 0.02 5.61 |
表2：巴克夏猪x约克夏猪F2动物中PRKAG3基因I199V取代位点基因型与肉质性状之间的相关性结果
I199V
性状 II
IV
VV
平均糖原 8.01(0.31)c 9.10(0.24)d 9.37(0.33)d
平均乳酸盐 84.83(1.17)e 86.83(0.91)a 90.54(1.27)f，b
平均糖酵解潜力 100.84(1.50)a，e 105.02(1.17)b 109.28(1.64)f，a
加工厂后腿肉pH 5.91(0.02)c 5.89(0.02) 5.84(0.02)d
加工厂里脊肉pH 5.80(0.02)c，e 5.75(0.01)d，a 5.71(0.02)f，b
实验室里脊肉pH 5.86(0.02)c，e 5.80(0.01)d，a 5.77(0.02)f，b
实验室里脊肉Minolta 21.54(0.29)c 22.11(0.22) 22.76(0.31d
加工厂里脊肉Hunter 44.17(0.41)a 45.07(0.32) 45.49(0.45)b
实验室里脊肉Hunter 46.56(0.30)a 47.07(0.23) 47.70(0.33)b
以下性状是不显著的，p＜.05：实验室后腿肉Minolta，实验室后腿肉Hunter，和加工厂里脊肉Minolta。最小平方平均值是针对每个性状估算的，并在括号内示出这些估算值的标准差。每类基因型中动物数是n＝131(II)，260-265(IV)，及111-113(VV)。估算值最小平方之间的显著差异用2字母上标表示：a-b代表p＜0.05，c-d代表p＜0.005，e-f代表p＜0.0005。具有上标“a”的估值与具有上标“b”的估值显著不同，c-d和e-f在其各自显著水平也是如此。
表3：5种商业猪品系中PRKAG3基因中T30N，G52S和I199V取代的基因型频率
| SNP | 基因型 | 长白猪 | 大白猪 | 巴克夏猪 | 杜洛克猪 | 杜洛克猪合成品系 |
| T30N | TTTNNN | 0.270.500.23 | 0.690.290.02 | 0.890.110.00 | 0.340.460.20 | 0.370.480.15 |
| n | 556 | 404 | 103 | 298 | 627 | |
| G52S | SSSGGG | 0.070.420.51 | 0.190.490.32 | 0.000.100.90 | 0.020.250.73 | 0.030.240.73 |
| n | 560 | 409 | 91 | 257 | 649 | |
| I199V | IIIVVV | 0.020.230.75 | 0.070.310.62 | 0.740.250.01 | 0.170.440.39 | 0.140.470.39 |
| n | 569 | 375 | 89 | 260 | 578 |
表4：5种商业猪品种之间在PRKAG3基因的T30N，G52S和I199V取代位点基因型与肉质性状之间的相关性结果
T30N G52S I199V性状
TT TN NN
SS SG GG
II IV VV后腿肉pH 5.76(.01)e 5.71(.01)f，a 5.69(.01)f，b 5.77(.02)a 5.74(.01) 5.74(.01)b 5.81(.01)e 5.74(.01)e，f 5.71(.01)f
n 461 506 176 76 378 659 128 376 559里脊肉pH 5.74(.01)c，e 5.73(.01)d 5.70(.01)c，f 5.74(.01) 5.73(.01) 5.73(.01) 5.78(.01)e 5.74(.01)e，f 5.71(.01)f
n 772 788 258 135 620 1054 199 614 922后腿肉Minolta L 45.9(.25)c，e 46.6(.26)d 47.2(.36)f 45.5(.49) 46.2(.29) 46.5(.25) 44.9(.38)e 46.5(.27)f 46.9(.26)f
n 462 509 176 76 379 662 128 376 561里脊肉Minolta L 44.8(.17)a 44.8(.18)a 45.3(.24)b 45.6(.30)a 45.0(.19)b 44.9(.16)b 44.2(.26)e 44.7(.18)c 45.2(.18)f，d
n 774 790 260 135 622 1060 200 615 925后腿肉Minolta b 4.18(.10)c，e 4.49(.10)d，a 4.79(.14)f，b 4.05(.19) 4.28(.11) 4.40(.10) 3.63(.15)e 4.31(.10)e，f 4.70(.10)f
n 459 504 175 75 376 656 128 373 554里脊肉Minolta b 3.34(.05) 3.43(.06) 3.49(.08) 3.45(.10) 3.42(.06) 3.34(.05) 3.15(.08)e 3.31(.06)c 3.49(.06)f，d
n 765 777 256 131 610 1050 198 609 906
最小平方平均值是针对每个取代位点各自估算的，并在括号内示出这些估算值的标准差。(一个性状和取代位点内)估算值最小平方之间的显著差异用2字母上标表示： a-b代表p＜0.05，c-d代表p＜0.005，e-f代表p＜0.0005。具有上标“a”的估值与具有上标“b”的估值显著不同，p＜.05，c-d和e-f在其各自显著水平也是如此。
表5：5种商业猪品种内PRKAG3基因I199V取代位点基因型与肉质性状之间的相关性结果
后腿肉pH 后腿肉Minolta L 后腿肉Minolta b基因型 II IV VV II IV VV II IV VV长白猪 5.82(.05)a，c 5.72(.01)b 5.68(.01)a，d 44.3(1.6)a 47.2(.48) 47.8(.34)b 3.74(.62) 4.27(.18) 4.57(.13)n 6 74 242 6 74 242 6 74 238大白猪 5.75(.05) 5.70(.02) 5.67(.02) 44.4(1.3) 46.3(.61) 45.8(.53) 3.23(.48)a，c 4.38(.22)b 4.65(.19)dn 9 56 109 9 56 111 9 55 109巴克夏猪 5.91(.03) 5.89(.06) 5.69(.15) 42.4(.65) 44.8(1.1) 45.0(3.0) 3.21(.26) 4.34(.50) 3.20(1.3)n 28 10 1 28 10 1 28 10 1杜洛克猪 5.77(.03)a，c 5.69(.02)b 5.66(.02)d 46.0(.73)a 47.9(.46)b 47.9(.53)b 3.29(.29)e 4.48(.18)f 4.58(.21)fn 33 88 78 33 88 78 33 87 78杜洛克猪合成品系 5.74(.02)a 5.70(.01) 5.67(.01)b 47.3(.60)a 48.0(.39) 49.0(.41)b 4.33(.23)c 4.42(.15)e 5.16(.16)d，fn 52 148 129 52 148 129 52 147 128
里脊肉pH 里脊肉Minolta L 里脊肉Minolta b基因型 II IV VV II IV VV II IV VV长白猪 5.76(.04)a 5.71(.01) 5.69(.01)b 41.5(.95)a 44.2(31)b 44.2(.23)b 2.52(.31) 2.98(.09) 3.04(.06)n 11 129 398 11 129 399 9 129 387大白猪 5.73(.03)a 5.69(.01) 5.66(.01)b 44.7(.71) 44.6(.36) 44.9(.30) 3.31(.23) 3.05(.12) 3.20(.10)n 22 110 224 22 110 224 22 105 217巴克夏猪 5.88(.02)a 5.80(.03)b 5.70(.13) 44.4(.46) 45.6(.86) 44.4(3.2) 3.49(.17) 3.81(.29) 2.55(1.1)n 55 20 1 56 20 1 56 20 1杜洛克猪 5.75(.02) 5.74(.01) 5.71(.02) 44.8(.63) 45.1(.39) 45.8(.45) 3.15(.20) 3.36(.12) 3.50(.14)n 36 104 90 36 103 90 36 103 90杜洛克猪合成品系 5.76(.02)a，e 5.72(.01)b，c 5.68(.01)f，d 45.6(.41)a 45.7(.24)c 46.8(.26)b，d 3.36(.13)c 3.52(.08)c 3.83(.08)dn 75 251 209 75 253 211 75 252 211
最小平方平均值是针对I199V取代位点各自评估的，并在括号内示出这些估算值的标准差。 (一个品系和取代位点内)的显著差异用2字母上标表示：a-b代表p＜0.05，c-d代表p＜0.005，e-f代表p＜0.0005。具有上标“a”的估值与具有上标“b”的估值显著不同，p＜.05，c-d和e-f在其各自显著水平也是如此。
表6：在5种商业猪品种中PRKAG3基因中T30N，G52S和I199V取代的单元型频率
a单元型1：30N-52G-199V；单元型2：30T-52S-199V；单元型3：30T-52G-199I；单元型4：30T-52G-199VbN-单元型相关性分析中使用的动物数目实施例2：
| 商业品系 | n | 单元型a频率 | Nb | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 后腿肉pH | 里脊肉pH | 后腿肉min L | 里脊肉min L | 后腿肉min b | 里脊肉min b | ||
| 长白猪大白猪巴克夏猪杜洛克猪杜洛克猪合成品系 | 51833783234511 | 0.480.170.050.430.39 | 0.290.450.050.150.17 | 0.130.220.870.380.37 | 0.100.160.030.040.07 | 27115137184299 | 48831971216472 | 28415337184299 | 48931972215474 | 28115037183297 | 47530872215474 |
根据本发明而且完全令人惊讶地，PRKAG3等位基因也示出与动物胎仔数明显相关。在本发明的这一特殊实施方案中涉及动物中针对胎仔数的遗传标记。本发明提供了一种筛选动物的方法，以确定当育种时更可能产生较多胎仔的那些动物，通过鉴别与胎仔数增加相关的PRKAG3基因中多态性的存在与否加以确定。本文所用术语“胎仔数增加”是指在给定群体平均值之上胎仔数生物学明显增加。
PRKAG3基因型与胎仔数之间的相关性
使用PRKAG3的第199位密码子多态性确定母猪胎仔数基因型。利用两个品系，长白猪品系(A)和杜洛克猪合成品系(B)，其预先已经发现具有这一多态性与肉质性状之间的相关性。
根据第一经产数记录(first parity records)和所有经产数分析数据(表7)。
表7
| 胎仔数 | |||
| 品系 | 第一经产数 | 所有经产数 | 等位基因1频率 |
| A | 224 | 468 | 0.15 |
| B | 311 | 670 | 0.46 |
在第一经产数中，品系B在基因型和胎仔数性状之间发现统计学显著相关性(p＜0.05)(表8)。发现杂合体具有最大胎仔数，另外11基因型比22纯合体具有较多的胎仔数(p＜0.3)，提示携带等位基因1的至少一个拷贝的母猪的优势。令人感兴趣地，在品系A见到相似作用，尽管该品系中的差异未达到统计学显著性，可能是因为观测的数目较少。然而，有更多观察值的杂合体和基因型22之间的出生存活数差异接近统计学显著性(p＜0.1)。
针对这两种品系在所有经产数之间见到相似作用。在这种情况中，品系A对总出生数的作用具有基因型显著性p＜0.08。
表8：生殖性状分析
LS平均值显著性水平：a-b p＜0.30；c-d p＜0.10；e-f p＜0.05；g-h p＜0.0 1；i-j p＜0.005.PCR测试方案：PRKAG3-30PCR-RFLP测试StyI多态性引物
| 胎仔数 | 基因型 | |||
| LS平均值(s.e.) | ||||
| 性状 | 11 | 12 | 22 | p |
| 品系A第一经产数 | 7 | 53 | 164 | |
| NBA | 11.10(1.4) | 11.05(0.63)c | 10.06(0.47)d | 0.21 |
| TNB | 12.25(1.5) | 11.78(0.68)a | 10.89(0.51)b | 0.29 |
| 品系B第一经产数 | 66 | 154 | 91 | |
| NBA | 8.04(0.43)a | 8.43(0.34)g | 7.34(0.39)b，h | 0.02 |
| TNB | 9.35(0.47)a | 9.76(0.38)i | 8.55(0.43)b，j | 0.02 |
| 品系A所有经产数 | 13 | 111 | 344 | |
| NBA | 11.44(1.09)a | 10.64(0.46)a | 10.01(0.34)b | 0.16 |
| TNB | 12.79(1.16)a，c | 11.42(0.49)b | 10.73(0.37)a，d | 0.08 |
| 品系B所有经产数 | 140 | 324 | 206 | |
| NBA | 8.66(0.37)a | 9.13(0.31)b，c | 8.65(0.34)d | 0.13 |
| TNB | 9.53(0.39)a | 10.02(0.33)b | 9.57(0.36)a | 0.18 |
RF1-5′ATG AGC TTC CTA GAG CAA GGA G 3′
RN52R2-5′GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3′PCR条件 混合物1
10×PCR buffer 1.0μl
MgCl2(15mM) 1.0μl
dNTPs(2mM) 1.0μl
Rf1引物 0.25μl
RN52R2引物 0.25μl
Taq聚合酶 0.07μl
ddH2O 5.43μl
基因组DNA 1μl
将混合物1和DNA在反应试管中组合。用矿物油覆盖。根据以下PCR程序运转：94℃4分钟；35次循环：94℃45秒，59℃45秒，及72℃45秒；随后在72℃最后延伸12分钟。
在2％琼脂糖凝胶上检测3μl所述PCR产物，以证实成功扩增并清除阴性对照物。产物大小为270bp。
可以根据以下程序进行消化：StyI消化反应
PCR产物 3μl
NE缓冲液3 1μl
BSA(10mg/ml) 0.1μl
StyI(10U/μl) 0.3μl
ddH2O 5.6μl
将PCR产物，缓冲液，酶和水混合。在37℃温育2小时。将消化的产物与加样染料混合(1∶6)并在4％琼脂糖凝胶上运转。基因型：
11-198和72bp -AAC/AAC
12-198，181，72和17bp -AAC/ACC
22-181，72和17bp -ACC/ACCPRKAG3-SINE(短散布元件)多态性测试 引物
RP1F-5′GAA ACT CTT CTC CCC ACA GAC 3′
RN52R2-5′GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3′PCR条件 混合物1
10×PCR缓冲液 1.0μl
MgCl2(15mM) 1.0μl
dNTPs(2mM) 1.0μl
RP1F引物 0.25μl
R52R2引物 0.25μl
Taq聚合酶 0.07μl
ddH2O 5.43μl
基因组DNA 1μl
将混合物1和DNA在反应试管中组合。用矿物油覆盖。进行以下PCR程序：
1次循环 95℃ 4分钟；
15次循环 95℃ 1′20″
64℃ 1′
74℃ 1′40″
30次循环 95℃ 1′20″
58℃ 1′
73℃ 1′40″
最后在73℃延伸12分钟。PRKAG3-52 PCR-RFLP测试HphI多态性引物
RF1-5′ATG AGC TTC CTA GAG CAA GGA G 3′
RN52R2-5′GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3′PCR条件 混合物1
10×PCR缓冲液 1.0μl
MgCl2(15mM) 1.0μl
dNTPs(2mM) 1.0μl
Rfl引物(10mp/μl) 0.25μl
RN52R2引物(10pM/μl) 0.25μl
Taq聚合酶(5U/μl) 0.07μl
ddH2O 5.43μl
基因组DNA 1μl
将混合物1与DNA在反应试管中组合。用矿物油覆盖。根据以下PCR程序运转：94℃ 4分钟；35次循环：94℃ 45秒，59℃45秒及72℃45秒；随后在72℃最后延伸12分钟。
在2％琼脂糖凝胶上检测3μl所述PCR产物，以证实成功扩增并清除阴性对照。产物大小为270bp。
通过以下程序进行消化：HphI消化反应
PCR产物 3μl
NE缓冲液4 1μl
HphI(5U/μl) 0.6μl
ddH2O 5.4μl
将PCR产物，缓冲液，酶和水混合。在37℃温育2小时。将消化产物与加样染料混合(1∶6)并在4％琼脂糖凝胶上运转。
基因型：
11-270bp
12-270bp，158bp和112bp
22-158bp和112bp.PRKAG3-199 PCR-RFLP测试BsaHI多态性
引物
RNF-5′GGA GCA AAT GTG CAG ACA AG 3′
RNR-5′CCC ACG AAG CTC TGC TTC TT 3′PCR条件 混合物1
10×PCR缓冲液 1.0μl
MgCl2(15mM) 1.0μl
dNTPs(2mM) 1.0μl
RNF引物(10pm/μl) 0.25μl
RFR引物(10pM/μl) 0.25μl
Taq聚合酶(5U/μl) 0.07μl
ddH2O 5.43μl
基因组DNA 1μl
将混合物1和DNA在反应试管中组合。用矿物油覆盖。根据以下PCR程序运转：94℃4分钟；35次循环：94℃4秒，61℃45秒，及72℃1分钟，随后在72℃最后延伸12分钟。
在2％琼脂糖凝胶上检测3μl所述PCR产物，以证实成功扩增并清除阴性对照物。产物大小为258bp。
可以根据以下程序进行消化：BsaHi消化反应
PCR产物 3μl
NE缓冲液4 1μl
BasHI(5U/μl) 0.6μl
BSA(10mg/ml) 0.1μl
ddH2O 5.3μl
将PCR产物，缓冲液，酶和水混合。在37℃温育2小时。将消化的产物与加样染料混合(1∶6)并在4％琼脂糖凝胶上运转。
基因型：
11-167bp和91bp12-167bp，119bp和91bp22-119bp和91bp
序列表
序列表<110>衣阿华州立大学研究基金公司<120>新的PRKAG3等位基因及其作为生殖和肉质性状的遗传标记的应用<130>P04668US3<150>60/231045<151>2000-09-08<150>60/260,239<151>2001-01-08<150>60/299,111<151>2001-06-18<160>17<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1873<212>DNA<213>Sus scrofa<220><221>CDS<222>(1)..(1392)<400>1atg agc ttc cta gag caa gga gag agc cgt tca tgg cca tcc cga gct 48Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala1 5 10 15gta acc acc agc tca gaa aga agc cat ggg gac cag ggg aac aag gcc 96Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala
20 25 30tct aga tgg aca agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg cct ccg ggc 144Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly
35 40 45ccg agg gaa ggt ccc cag tcc agg cca gtt gct gag tcc acc ggg cag 192Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln
50 55 60gag gcc aca ttc ccc aag gcc aca ccc ttg gcc caa gcc gct ccc ttg 240Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu65 70 75 80gcc gag gtg gac aac ccc cca aca gag cgg gac atc ctc ccc tct gac 288Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp
85 90 95tgt gca gcc tca gce tcc gac tcc aac aca gac cat ctg gat ctg ggc 336Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly
100 105 110ata gag ttc tca gcc tcg gcg gcg tcg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val
115 120 125gaa gag aag cca gcc ccg tgc cca tcc cca gag gtg ctg tta ccc agg 432Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg
130 135 140ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ccg ggg gcc cag gtc tac atg 480Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met145 150 155 160cac ttc atg cag gag cac acc tgc tac gat gcc atg gcg acc agc tcc 528His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser
165 170 175aaa ctg gtc atc ttc gac acc atg ctg gag atc aag aag gcc ttc ttt 576Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe
180 185 190gcc ctg gtg gcc aac ggc gtc cga gcg gca cct ttg tgg gac agc aag 624Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys
195 200 205aag cag agc ttc gtg ggg atg ctg acc atc aca gac ttc atc ttg gtg 672Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val
210 215 220ctg cac cgc tat tac agg tcc ccc ctg gtc cag atc tac gag att gaa 720Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu225 230 235 240gaa cat aag att gag acc tgg agg gag atc tac ctt caa ggc tgc ttc 768Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe
245 250 255aag cct ctg gtc tcc atc tct ccc aat gac agc ctg ttc gaa gct gtc 816Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val
260 265 270tac gcc ctc atc aag aac cgg atc cac cgc ctg ccg gtc ctg gac cct 864Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro
275 280 285gtc tcc ggg gct gtg ctc cac atc ctc aca cat aag cgg ctt ctc aag 912Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys
290 295 300ttc ctg cac atc ttt ggc acc ctg ctg ccc cgg ccc tcc ttc ctc tac 960Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr305 310 315 320cgc acc atc caa gat ttg ggc atc ggc aca ttc cga gac ttg gcc gtg 1008Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val
325 330 335gtg ctg gaa acg gcg ccc atc ctg acc gca ctg gac atc ttc gtg gac 1056Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp
340 345 350cgg cgt gtg tct gcg ctg cct gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg 1104Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val
355 360 365ggc ctc tac tct cgc ttt gat gtg atc cac ctg gct gcc caa caa aca 1152Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr
370 375 380tac aac cac ctg gac atg aat gtg gga gaa gcc ctg agg cag cgg aca 1200Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr385 390 395 400ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tcc tgc cag ccc cac gag acc ttg ggg 1248Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly
405 410 415gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa cag gtg cac cgc ctg gtg ctc 1296Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu
420 425 430gtg gat gag acc cag cac ctt ctg ggc gtg gtg tcc ctc tct gac atc 1344Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile
435 440 445ctt cag gct ctg gtg ctc agc cct gct gga att gat gcc ctc ggg gcc 1392Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala
450 455 460tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572atctcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692atgatggagg gcctcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct 1812gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872g 1873<210>2<211>464<212>PRT<213>Sus scrofa<400>2Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala1 5 10 15Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala
20 25 30Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly
35 40 45Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln
50 55 60Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu65 70 75 80Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp
85 90 95Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly
100 105 110Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val
115 120 125Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg
130 135 140Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met145 150 155 160His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser
165 170 175Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe
180 185 190Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys
195 200 205Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val
210 215 220Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu225 230 235 240Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe
245 250 255Lys Pro Leu Val Ser Ile Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val
260 265 270Tyr Ala Leu Ile Lys Asn Arg Ile His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro
275 280 285Val Ser Gly Ala Val Leu His Ile Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys
290 295 300Phe Leu His Ile Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr305 310 315 320Arg Thr Ile Gln Asp Leu Gly Ile Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val
325 330 335Val Leu Glu Thr Ala Pro Ile Leu Thr Ala Leu Asp Ile Phe Val Asp
340 345 350Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val
355 360 365Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr
370 375 380Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr385 390 395 400Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly
405 410 415Glu Val Ile Asp Arg Ile Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu
420 425 430Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile
435 440 445Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala
450 455 460<210>3<211>1873<212>DNA<213>Sus scrofa<220><221>CDS<222>(1)..(1392)<400>3atg agc ttc cta gag caa gga gag agc cgt tca tgg cca tcc cga gct 48Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala1 5 10 15gta acc acc agc tca gaa aga agc cat ggg gac cag ggg acc aag gcc 96Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Thr Lys Ala
20 25 30tct aga tgg aca agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg cct ccg ggc 144Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly
35 40 45ccg agg gaa ggt ccc cag tcc agg cca gtt gct gag tcc acc ggg cag 192Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln
50 55 60gag gcc aca ttc ccc aag gcc aca ccc ttg gcc caa gcc gct ccc ttg 240Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu65 70 75 80gcc gag gtg gac aac ccc cca aca gag cgg gac atc ctc ccc tct gac 288Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp
85 90 95tgt gca gcc tca gcc tcc gac tcc aac aca gac cat ctg gat ctg ggc 336Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly
100 105 110ata gag ttc tca gcc tcg gcg gcg tcg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val
115 120 125gaa gag aag cca gcc ccg tgc cca tcc cca gag gtg ctg tta ccc agg 432Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg
130 135 140ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ccg ggg gcc cag gtc tac atg 480Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met145 150 155 160cac ttc atg cag gag cac acc tgc tac gat gcc atg gcg acc agc tcc 528His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser
165 170 175aaa ctg gtc atc ttc gac acc atg ctg gag atc aag aag gcc ttc ttt 576Lys Leu Val Ile Phe Asp Thr Met Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Phe
180 185 190gcc ctg gtg gcc aac ggc gtc cga gcg gca cct ttg tgg gac agc aag 624Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys
195 200 205aag cag agc ttc gtg ggg atg ctg acc atc aca gac ttc atc ttg gtg 672Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr Ile Thr Asp Phe Ile Leu Val
210 215 220ctg cac cgc tat tac agg tcc ccc ctg gtc cag atc tac gag att gaa 720Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln Ile Tyr Glu Ile Glu225 230 235 240gaa cat aag att gag acc tgg agg gag atc tac ctt caa ggc tgc ttc 768Glu His Lys Ile Glu Thr Trp Arg Glu Ile Tyr Leu Gln Gly Cys Phe
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340 345 350cgg cgt gtg tct gcg ctg cct gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg 1104Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Ash Glu Thr Gly Gln Val Val
355 360 365ggc ctc tac tct cgc ttt gat gtg atc cac ctg gct gcc caa caa aca 1152Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val Ile His Leu Ala Ala Gln Gln Thr
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420 425 430gtg gat gag acc cag cac ctt ctg ggc gtg gtg tcc ctc tct gac atc 1344Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile
435 440 445ctt cag gct ctg gtg ctc agc cct gct gga att gat gcc ctc ggg gcc 1392Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala
450 455 460tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572atctcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692atgatggagg gcctcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct 1812gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872g 1873<210>4<211>464<212>PRT<213>Sus scrofa<400>4Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala1 5 10 15Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Thr Lys Ala
20 25 30Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly
35 40 45Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln
50 55 60Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu65 70 75 80Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp
85 90 95Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly
100 105 110Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val
115 120 125Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg
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420 425 430gtg gat gag acc cag cac ctt ctg ggc gtg gtg tcc ctc tct gac atc 1344Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp Ile
435 440 445ctt cag gct ctg gtg ctc agc cct gct gga att gat gcc ctc ggg gcc 1392Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Ala
450 455 460tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572atctcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692atgatggagg gcctcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct 1812gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872g 1873<210>10<21l>464<212>PRT<213>Sus scrofa<400>10Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala1 5 10 15Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala
20 25 30Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly
35 40 45Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln
50 55 60Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu65 70 75 80Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp Ile Leu Pro Ser Asp
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100 105 1l0Ile Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val
115 120 125Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg
130 135 140Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met145 150 155 160His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser
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450 455 460<210>11<211>1095<212>DNA<213>Sus scrofa<400>11gaaactcttc tccccacaga ctccctcctg gagcagcctc gggggaccta agcatcaagg 60taggtggggc tgcccctgct cgcgggccca ggctcttctc ccacctcctt ttcttccacg 120tcttcaggac cccaatctcc cccactccac tcgcctggct cttgtcttcc tctcctttgc 180cttctttgtt ccgctttgtt tcttcttcct ccctctccct cacctcctcc ctctttcaaa 240agagtagagg gggcatctat agagtctgga gattgggact ctcttgactt tctcgcttac 300tagctgtgtg atttgtggca aattgcttca cctctctgag ctcaggtctc tcgttagtaa 360aacagggctg atagccatgc ccttcggata agattgccgt gagggttgaa tgagaaattt 420gttggaggac aagccctttg aagcttccca atattaaata tttttattta tttatttatt 480ttttgtcttt ttgctattcc tttgggccgc tcccacggca tatggaggtt cccaggctag 540gggtcgaatc ggagctgtag ccactggcct acgccagagc cacagcaacg cgggatccga 600gccgcatctg caacctacac cacagctcac ggcaacgccg gatcgttaac ccactgagca 660ggggcaggca ccgaacctgc aacctcatgg ttcctagtgg gattcgttaa ccactgcgcc 720acgacgggaa ctccccaata ttaaatatta ttattagtaa cattttaatg gaatttattg 780tgttactccc cattaaccaa acaggtccca ttctcccttg cagagatgag cttcctagag 840caaggagaga gccgttcatg gccatcccga gctgtgacca ccagctcaga aagaagccat 900ggggaccagg ggaccaaggc ctctagatgg acaaggcagg aggatrtaga ggaagggggg 960cctccgggcc cgagggaarg tgagttcaag gccagttctg gggagctggg actgggggca 1020gtgggcagtc ctcaaacctg gggcccgtct ctggtctggt ccctccataa cacaggcaca 1080taacatcatg cagcc 1095<210>12<211>808<212>DNA<213>Sus scrofa<400>12gaaactcttc tccccacaga ctccctcctg gagcagcctc gggggaccta agcatcaagg 60taggtggggc tgcccctgct cgcgggccca ggctcttctc ccacctcctt ttcttccacg 120tcttcaggac cccaatctcc cccactccac tcgcctggct cttgtcttcc tctcctttgc 180cttctttgtt ccgctttgtt tcttcttcct ccctctccct cacctcctcc ctctttcaaa 240agagtagagg gggcatctat agagtctgga gattgggact ctcttgactt tctcgcttac 300tagctgtgtg atttgtggca aattgcttca cctctctgag ctcaggtctc tcgttagtaa 360aacagggctg atagccatgc ccttcggata agattgccgt gagggttgaa tgagaaattt 420gttggaggac aagccctttg aagcttccca atattaaata ttattattag taacatttta 480atggaattta ttgtgttact ccccattaac caaacaggtc ccattctccc ttgcagagat 540gagcttccta gagcaaggag agagccgttc atggccatcc cgagctgtga ccaccagctc 600agaaagaagc catggggacc aggggaccaa ggcctctaga tggacaaggc aggaggatat 660agaggaaggg gggcctccgg gcccgaggga argtgagttc aaggccagtt ctggggagct 720gggactgggg gcagtgggca gtcctcaaac ctggggcccg tctctggtct ggtccctcca 780taacacaggc acataacatc atgcagcc 808<210>13<211>21<212>DNA<213>Sus scrofa<400>13atgagcttcc tagagcaagg a 21<210>14<211>22<212>DNA<213>Sus scrofa<400>14ggctgcatga tgttatgtgc ct 22<210>15<211>21<212>DNA<213>Sus scrofa<400>15gaaactcttc tccccacaga c 21<210>16<211>20<212>DNA<213>Sus scrofa<400>16ggagcaaatg tgcagacaag 20<210>17<211>20<212>DNA<213>Sus scrofa<400>17cccacgaagc tctgcttctt 20
Claims (58)
1.一种筛选动物以确定更可能产生较多胎仔的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种遗传材料样品；分析所述动物中与胎仔数增加相关的基因型存在情况，所述基因型特征在于：a)PRKAG3基因中的多态性。
2.权利要求1的方法，其中所述多态性导致PRKAG3基因编码的第199位氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸或其等价物，这通过SEQ IDNO：2的BLAST对比确定。
3.权利要求1的方法，其中所述多态性是第595核苷酸位置由鸟嘌呤转换为腺嘌呤或其等价物。
4.权利要求1的方法，其中所述基因型是BsaHI多态性。
5.权利要求1的方法，其中所述分析步骤选自：限制片段长度多态性(RFLP)分析，微量测序，MALD-TOF，SINE，异源双链分析，单链构象多态性(SSCP)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)及温度梯度凝胶电泳(TGGE)。
6.权利要求1的方法，其中所述动物是猪。
7.权利要求1的方法，还包括扩增PRKAG3基因或其含有所述多态性的部分的量的步骤。
8.权利要求7的方法，其中所述扩增包括：选择能扩增PRKAG3基因的含有多态性BsaHI位点的区域的正向和反向序列引物的步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述正向和反向引物选自并基于引物RNF和RNR。
10.一种筛选动物以确定更可能呈现改良的肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种生物学样品；并分析所述动物中与改良的肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于：
a)PRKAG3基因中的多态性，所述多态性导致并特征在于在第199位为缬氨酸和在第200位为精氨酸，或者当精氨酸位于第200位时在第199位为异亮氨酸，这通过SEQ IDNO：2的BLAST对比确定。
11.权利要求10的方法，其中所述多态性是在第595核苷酸位置由鸟嘌呤转换为腺嘌呤或其等价物。
12.权利要求10的方法，其中所述分析步骤包括短散布元件多态性测试。
13.权利要求12的方法，其中所述分析包括使用选自及基于引物RP1F和PN52R2的引物扩增PRKAG3基因的步骤。
14.权利要求10的方法，其还包括扩增PRKAG3基因或其含有所述多态性的部分的量的步骤。
15.权利要求14的方法，其中所述扩增包括：选择能扩增PRKAG3基因的含有多态性BsaHI位点的区域的正向和反向序列引物的步骤。
16.权利要求14的方法，其中所述正向和反向引物选自及基于引物RNF和RNR。
17.一种筛选动物以确定更可能呈现改良的肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种生物学样品；并分析所述动物中与改良的肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于：
a)PRKAG3基因中的多态性，所述多态性导致并特征在于在第30位的天冬酰胺转换为苏氨酸或其等价物，这通过SEQ ID NO：1的BLAST对比确定。
18.权利要求17的方法，其中所述多态性是在第89核苷酸位置的腺嘌呤转换为胞嘧啶或其等价物，这通过SEQ ID NO：1的BLAST对比确定。
19.权利要求17的方法，其中所述基因型是StyI多态性。
20.权利要求17的方法，其中所述分析步骤选自：限制片段长度多态性(RFLP)分析，微量测序，MALD-TOF，SINE，异源双链分析，单链构象多态性(SSCP)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)。
21.权利要求20的方法，其中所述动物是猪。
22.权利要求20的方法，还包括扩增PRKAG3基因或其含有所述多态性的部分的量的步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述扩增包括：选择能扩增PRKAG3基因的含有多态性StyI位点的区域的正向和反向序列引物的步骤。
24.权利要求23的方法，其中所述正向和反向引物选自并基于引物RF1和RN52R2。
25.一种筛选动物以确定更可能呈现改良的肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种生物学样品；并分析所述动物中与改良的肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于：
a)PRKAG3基因中的多态性，所述多态性导致并特征在于在第52位的甘氨酸转换为丝氨酸或其等价物，这通过SEQ IDNO：1的BLAST对比确定。
26.权利要求25的方法，其中所述多态性是在第154核苷酸位置的鸟嘌呤转换为腺嘌呤或其等价物，这通过SEQ ID NO：1的BLAST对比确定。
27.权利要求25的方法，其中所述基因型是HphI多态性。
28.权利要求25的方法，其中所述分析步骤选自：限制片段长度多态性(RFLP)分析，微量测序，MALD-TOF，SINE，异源双链分析，单链构象多态性(SSCP)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)。
29.权利要求25的方法，其中所述动物是猪。
30.权利要求28的方法，还包括扩增PRKAG3基因或其含有所述多态性的部分的量的步骤。
31.权利要求30的方法，其中所述扩增包括：选择能扩增PRKAG3基因的含有多态性HphI位点的区域的正向和反向序列引物的步骤。
32.权利要求30的方法，其中所述正向和反向引物选自并基于引物RF1和RN52R2。
33.一种核苷酸序列，其在表达时编码PRKAG3蛋白，该蛋白第52位包含一个丝氨酸。
34.权利要求33的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5。
35.权利要求33的PRKAG3蛋白。
36.权利要求35的蛋白质，其包含SEQ ID NO：6。
37.一种核苷酸序列，其在表达时编码一种PRKAG3蛋白，其中所述蛋白质在第199位包含异亮氨酸和在第200位包含精氨酸，或其等价物。
38.权利要求37的PRKAG3蛋白质。
39.一种核苷酸序列，其在表达时编码一种PRKAG3蛋白，其中所述蛋白质在第199位包含异亮氨酸，在第30位包含苏氨酸，在第52位包含甘氨酸及在第200位包含精氨酸，或其等价物。
40.权利要求39的PRKAG3蛋白。
41.所述蛋白质的一种核苷酸序列，其在表达之上编码PRKAG3蛋白，其中所述蛋白质包含第199位缬氨酸和第200位精氨酸或其等价物。
42.权利要求41的PRKAG3蛋白质。
43.一种核苷酸序列，其在表达时编码一种PRKAG3蛋白，其中所述蛋白质在第199位包含异亮氨酸或缬氨酸和在第200位包含精氨酸，或其等价物。
44.权利要求43的PRKAG3蛋白。
45.一种筛选动物以确定更可能具有有利的肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种生物学样品；并分析所述动物中与有利的肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于：第30位为苏氨酸，第52位为甘氨酸和第199位为异亮氨酸。
46.一种筛选动物以确定那些更可能具有有利的肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种生物学样品；并分析所述动物中与有利的肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于：第199位为异亮氨酸和第200位为精氨酸。
47.一种鉴别针对动物肉质和/或胎仔数的遗传标记的方法，包括：确定每个雌性动物产生的子代数或所述动物的肉质；确定每个动物的PRKAG3或等价基因中的多态性；所述多态性包括权利要求1，7，17或11所述的多态性或其等价物，并将每个雌性动物产生的子代数或肉质与所述多态性相关联，从而鉴别针对动物肉质或胎仔数的多态性。
48.权利要求47的方法，其中还包括选择用于育种的通过所述标记而预计具有有利肉质或胎仔数的动物的步骤。
49.权利要求48的方法，其中所述分析包括用选自BsaHI，HphI和StyI的限制酶消化经PCR扩增的DNA。
50.一种筛选动物以确定具有有利组合的肉质和/或胎仔数性状的动物的方法，所述方法包括：确定动物中存在的PRKAG3等位基因，所述等位基因包括那些在PRKAG3基因中包括一或多个以下多态性BsaHI，HphI或StyI位点的基因；确定已知影响肉质和/或胎仔数的基因的其它标记的等位基因；选择具有有利等位基因组合的动物并去除携带不利组合的那些动物。
51.权利要求50的方法，其中PRKAG3等位基因的确定包括确定与直接或间接与PRKAG3连锁的至少一个DNA标记相关的至少一个等位基因的存在。
52.权利要求51的方法，其中所述DNA标记是卫星DNA。
53.一种筛选动物以确定具有有利肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种遗传材料物质样品；并分析所述动物中与有利肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于：
a)PRKAG3基因中的多态性，所述多态性是一种非第200位氨基酸RN-突变的多态性。
54.一种筛选动物以确定更可能具有有利肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种遗传材料样品；并分析所述动物中与有利肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于PRKAG3中至少两种多态性的组合。
55.一种筛选动物以确定更可能具有增加价值的胎仔数和/或肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种遗传物质样品；并分析所述动物中与有利胎仔数和/或肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于PRKAG3中至少两种多态性的组合。
56.一种筛选动物以确定更可能具有有利肉质性状的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种遗传材料样品；并分析所述动物中与有利肉质性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于：第30位为苏氨酸，第52位为丝氨酸和在第199位为缬氨酸。
57.一种筛选动物以确定更可能呈现改良的肉质性状和/或较多胎仔数的动物的方法，包括：从所述动物中获得一种生物学样品；并分析所述动物中与所述性状相关的基因型的存在情况，所述基因型特征在于：
a)PRKAG3基因中的短散布元件多态性。
58.权利要求57的方法，其中所述分析包含使用选自并基于引物RP1F和PN52R2的引物扩增所述PRKAG3基因的步骤。
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