MXPA03002040A - Alelos prkag3 novedosos y uso de los mismos como marcadores geneticos para rasgos de la calidad de carne y de la reproduccion. - Google Patents

Abstract

Se divulgan marcadores genéticos para la calidad de la carne animal y eficiencia reproductiva, métodos para identificar tales marcadores y métodos para buscar animales para determinar a aquellos mas deseables para producir más litros y/o mejor calidad de carne y seleccionar preferiblemente a aquellos animales para futuros propósitos reproductivos. Los marcadores están basados en la presencia o ausencia de ciertos polimorfismos en el gen PRKA

Description

ALELOS PRKAG3 NOVEDOSOS Y USO DE LOS MISMOS COMO MARCADORES GENÉTICOS PARA RASGOS DE LA CALIDAD DE CARNE Y DE LA REPRODUCCIÓN DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona generalmente a la detección de diferencias genéticas entre animales. Más particularmente, la invención se relaciona a marcadores genéticos que son indicativos de fenotipos heredables asociados con la calidad de la carne mejorada, tamaño de la carnada y otros rasgos económicos en animales. Se describen también métodos y composiciones para usar estos marcadores en la genotipicación de animales y selección. Existen diferencias genéticas entre animales individuales asi como entre especies que pueden explotarse por técnicas de reproducción para lograr animales con características deseables. Por ejemplo, las especies chinas se conocen por alcanzar la pubertad en una edad temprana y por su tamaño de carnada grande, mientras las especies americanas se conocen por su mayor velocidad de crecimiento y escasez de carne. Con frecuencia, sin embargo, la heredabilidad para rasgos deseados es baja, y los métodos de reproducción estándares que seleccionan individuos basados en variaciones fenotípicas no toman totalmente en cuenta variabilidad genética o interacciones de gen complejas que existen .

Los análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) se han utilizado por diversos grupos para estudiar el ADN de puercos. Jung et al., Theor . Appl. Genet., 77:271-274 (1989), incorporada en la presente para referencia, describe el uso de técnicas RFLP para mostrar variabilidad genética entre dos especies de puercos. Se demostró el polimorfismo para genes de Clase I de antigeno de leucocito de puerco (SLA) en estas especies. Hoganson et al . , Abstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science, marzo 26-28, 1990, incorporada en la presente para referencia, reporta el polimorfismo de genes del complejo de histocompatibilidad principal de puerco (MHC) para puercos chinos, también demostrado por análisis RFLP. Jung et al., Theor Appl . Genet. , 77:271-274 (1989), incorporada en la presente para referencia, reporta el análisis RFLP de los genes de la Clase I de SLA en ciertos verracos. Los autores establecen que los resultados sugieren que pueden estar en asociación entre genes de Clase I SLA/MHC de puerco y la producción y rasgos de rendimiento. Establecen que el uso de los fragmentos de restricción de Clase I de SLA, como marcadores genéticos, puede tener potencialidad en el futuro para mejorar el rendimiento del crecimiento de puercos. La capacidad para seguir un alelo genético favorable especifico implica un proceso novedoso y prolongado de la identificación de un marcador de ADN molecular para un gen de mayor efecto. El marcador puede unirse a un gen único con un efecto mayor o unirse a un número de genes con efectos aditivos. Los marcadores de ADN tienen varias ventajas; la segregación es fácil de medir y es inequívoca, y los marcadores de ADN son co-dominantes, es decir, los animales heterocigosos y homocigosos pueden identificarse distintamente. Una vez que el sistema marcador se establece, las decisiones de selección pueden tomarse muy fácilmente, ya que los marcadores de ADN pueden analizarse en cualquier momento después de que una muestra de tejido o se sangre puedan recolectarse del animal recién nacido individual, o aún un embrión. El uso de diferencias genéticas en los genes receptores ha llegado a ser un sistema marcador valioso para la selección. Por ejemplo, las Patentes Norteamericanas 5,550,024 y 5,374,526 expedidas a Rothschild et al., describen un polimorfismo en el gen receptor de estrógeno de puerco el cual se asocia con el tamaño de la carnada más grande, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia. La Patente Norteamericana número 5,935,784 describe marcadores polimórficos en el gen receptor de prolactina de puerco, el cual se asocia con el tamaño de carnada más grande y eficiencia reproductiva completa.

El tamaño de la carnada, por supuesto tiene un impacto económico directo para un criador, también importante para animales que producen carne es la calidad de la carne. La calidad de la carne es una característica difícil de evaluar, como muchos aspectos diferentes, tanto objetivos como subjetivos, desarrollan los rasgos completos. La lista de factores que determinan la calidad de la carne, como con otros alimentos, es más bien larga (Wood et al., Proceedings of The Nutrition Society (1999) 58:363-70). Esto incluye libertad a partir de peligros microbiológicos (seguridad de los alimentos) y prevención del aprovechamiento animal (bienestar animal) . Esto también incluye el atractivo sensorial de la carne, es decir, su sabor o calidad al comerse, y sanidad percibida, especialmente con relación a la cantidad y tipo de grasa. La calidad de carne de puerco cruda es afectada por un gran número de factores genéticos y no genéticos. Los más recientes incluyen granja, transporte, matanza y condiciones de procesamiento. Los científicos de la carne han realizado una cantidad sustancial de investigación en estos factores, que han conducido a mejorar la calidad considerablemente. Parte de la investigación se ha dedicado al antecedente genético de los animales, y diversos estudios han revelado la importancia de factores genéticos. Esto ha hecho a la industria consciente de la reproducción selectiva de animales y el uso de tecnología genética puede jugar un papel importante en el mejoramiento de calidad de la carne de puerco . La información del nivel de ADN puede ayudar a asegurar un gen principal específico, pero esto puede también ayudar a la selección de rasgos cuantitativos para los cuales se seleccionaron. La información molecular en adición a los datos fenotipicos puede incrementar la exactitud de selección y por lo tanto la respuesta de selección. El tamaño de la respuesta extra en tal programa Marker Assisted Selection (MAS) se ha considerado por muchos trabajadores a partir de un punto de vista teórico. En términos generales, MAS es más benéfico para rasgos con una baja heredabilidad y el cual es caro para medirse fenotípicamente. La calidad de la carne en particular califica como una excelente oportunidad para utilizar MAS. Por ejemplo, Meuwissen, T.H.E. and Goddard, M.E. (1996) . "The use of Marker Haplotypes in Animal Breeding Schemes", Genet. Sel. Evol., 28 161-176 considerado el impacto de la Selección Asistida del Marcador para rasgos tales como reproducción y calidad de carne que son difíciles para desarrollarse utilizando métodos tradicionales. Sus resultados son extremadamente alentadores, mostrando que para los rasgos tales como calidad de carne, en donde el rasgo es medido después de la matanza, una respuesta adicional de hasta 64% podría lograrse.

Ciertamente, el mejor enfoque para mejorar genéticamente los rasgos económicos tales como la calidad de la carne o tamaño de la carnada es encontrar marcadores de ADN relevantes directamente en la población bajo selección. La calidad de la carne medida puede realizarse continuamente en algunos animales a partir de poblaciones del núcleo de organizaciones de reproducción. Ya que una valoración total de la calidad de la carne puede únicamente hacerse después de la matanza, los datos deben recolectarse en animales seleccionados y no pueden obtenerse en animales de reproducción potenciales. Similamiente, para el tamaño de la carnada, las hembras pueden identificarse únicamente después de su nacimiento para determinar el tamaño de la carnada. Para identificar una predisposición genética para esos rasgos se permitiría la selección en el nivel genético. Estos datos fenotípicos se recolectan para permitir la detección de marcadores de ADN relevantes, y para confirmar marcadores identificados utilizando poblaciones experimentales o para probar genes candidatos. Los marcadores significativos o genes pueden incluirse entonces directamente en el proceso de selección. Una ventaja de la información molecular es que se puede obtener esto ya a muy corta edad del animal criado, lo cual significa que los animales pueden seleccionarse previamente basados en los marcadores del ADN antes que la prueba de rendimiento de crecimiento se complete. Esto es una gran ventaja para el sistema de prueba y selección completo. Puede verse a partir de lo anterior que existe una necesidad para la identificación de marcadores que pueden utilizarse para mejorar la calidad de la carne asi como las características de reproducción en animales identificando y seleccionando animales con las características mejoradas en el nivel genético. Un objeto de la presente invención es para proporcionar un marcador genético basado en o dentro del gen PRKAG3 que es indicativo de características favorables de carne tales como aquellas evidenciadas por pH, jaspeadura, color y pérdida por goteo y/o por el tamaño de carnada más grande . Otro objeto de la invención es proporcionar un análisis para determinar la presencia de este marcador genético . Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para evaluar animales que aumentan la exactitud de selección y métodos de reproducción para los rasgos deseados. Aún otro objeto de la invención es proporcionar una prueba de amplificación PCR que acelerará en gran medida la determinación de presencia del marcador. Objetos y ventajas adicionales de la invención se establecerán en parte en la descripción que sigue, y en parte será obvia a partir de la descripción, o puede entenderse por la práctica de la invención. Los objetos y ventajas de la invención se lograrán por medios de las mediaciones y combinaciones particularmente apuntadas en las reivindicaciones anexas. Esta invención se relaciona al descubrimiento de formas genéticas alternas del gen PRKAG3 que son útiles como marcadores genéticos asociados con los rasgos de calidad de la carne y rasgos reproductivos en los animales. El gen PRKAG3 es altamente conservado entre especies y animales, y se espera que los diferentes alelos descritos en la presente se correlacionarán con la variabilidad de este gen en otros animales económicos o que producen carne, tales como bovino, ovejas, pollos, etc. Para lograr los objetos y de acuerdo con el propósito de la invención, como se incluye y describe ampliamente en la presente, la presente invención proporciona el descubrimiento de genotipos alternados que proporcionan un método para seleccionar animales para determinar aquellos más aptos para poseer rasgos de calidad de carne favorables o para seleccionar contra puercos que tienen alelos que indican menos rasgos de calidad de carne favorables. Como se usa en la presente, "rasgo de calidad de carne favorable" significa una mejora significativa (incremento o disminución) en uno de muchos rasgos de calidad de carne medibles acerca de la medida de una población dada, de manera que esta información puede utilizarse en la reproducción para lograr una población uniforme que se optimiza para la calidad de la carne, esto puede incluir un incremento en algunos rasgos o una disminución en otros, dependiendo de las características de carne deseadas. Estos factores que pueden considerarse incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: Claridad de Lomo Minolta (L*) : El rango de 43-47 unidades (de oscuro a color claro) es aceptable, pero L* de 43 es mejor; es decir, tiene mayor valor económico, en general en este rango (esto puede ser dependiente del mercado, por ejemplo en Japón la carne de puerco oscura se prefiere) . Calificación de Color de Lomo Japonés (JCS) : El rango de 2.5-5.0 unidades (de color ligero a oscuro) es aceptable, pero JCS de 3-4 es mejor. Lomo Jaspeado (nivel de grasa intramuscular) : Generalmente, mayor jaspeado es mejor cuando se asocia con las características de calidad de carne para comer mejorada. pH de Lomo: (la acidez de carne final medida 24 horas post-mortem; este atributo es el único rango más importante de calidad de la carne de puerco) ; — El rango de 5.50-5—80 es deseable, pero 5.80 es mejor cuando se influencia positivamente el color y purga (baja) de la carne.

Claridad del Jamón Minolta (L* El rango de 43-52 unidades es aceptable, pero inferior (43) es mejor pHu del Jamón: superior; es decir, 5.80 es mejor Pérdida por goteo o purga: el rango de l%-3% es aceptable, pero inferior es mejor Estas medidas de la calidad de la carne son ejemplos de aquellos aceptados generalmente por aquellos con experiencia en la técnica. Para una revisión de los rasgos de calidad de la carne puede consultarse lo siguiente: Sosnicki, A.A., E.R., Wilson, E.B. S eiss, A. deVries, 1998 "Is t ere a cost effective way to produce high quality pork?", Reciprocal Meat Conference Proceedings, Vol. 51. Así, la presente invención proporciona un método para seleccionar puercos para identificar aquellos más aptos para producir calidad de carne favorable, y/o aquellos menos aptos para producir calidad de carne favorable para optimizar las técnicas de reproducción y selección para la mejor calidad de carne. También, la invención incluye un método para seleccionar puercos para determinar aquellos más aptos para producir una mayor carnada cuando se reproducen o para seleccionarse contra puercos los cuales tienen alelos que indican tamaños de carnada más pequeños. Como se usa en la presente "carnadas más grandes" significa un incremento significativo en el tamaño de carnada sobre la media de una población dada. Asi, la presente invención proporciona un método para seleccionar puercos para determinar aquellos más aptos para producir carnadas más grandes, y/o aquellos menos aptos para producir carnadas más grandes. Los métodos para analizar estos rasgos generalmente comprenden las etapas 1) obtener una muestra biológica de un puerco; y 2) analizar el ADN genómico o proteina obtenida en 1) para determinar que el o los alelos PRKAG3 está o están presentes. También incluidos en la presente son datos de haplotipo que permiten dejar un margen de polimorfismos en el gen PRKAG3 para combinarse en un protocolo de selección o identificación para maximizar los beneficios de cada uno de estos marcadores. Ya que varios de los polimorfismos implican cambios en la composición aminoácida de la proteina PRKAG3, los métodos analizados pueden aún implicar determinar la composición del aminoácido de la proteina PR AG3. Los métodos para este tipo o purificación y análisis normalmente implican el aislamiento de la proteina a través de medios que incluyen etiquetas fluorescentes con anticuerpos, separación y purificación de la proteina (es decir, a través del sistema HPLC de fase inversa) , y uso de un secuenciador de proteina automatizado para identificar la secuencia de aminoácido presente. Los protocolos para este análisis son estándares y se conocen en la técnica y se describen en Ausubel et. al.(eds-), Short Protocols in Molecular Biology Fourth ed. John iley and Sons 1999. Se analiza una muestra genética en una modalidad preferida. Brevemente, una muestra de material genético se obtiene de un animal, y la muestra se analiza para determinar la presencia o ausencia de un polimorfismo en el gen (PRKAG3) de subunidad gamma regulador de cinasa de proteina activada AMP que se correlaciona con cualquier tamaño de carnada incrementado o calidad de carne mejorada o ambos rasgos dependiendo de la forma genética. Como se conoce bien por aquellos expertos en la técnica, puede utilizarse una variedad de técnicas cuando se comparan moléculas de ácido nucleico para diferencias de secuencia. Esto incluye a manera de ejemplo, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, análisis heterodúplex, análisis de polimorfismo de conformación de un solo ramal, electroforesis de gradiente desnaturalizante y electroforesis de gradiente de temperatura. <¦ En una modalidad preferida el polimorfismo es un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción y el análisis comprende identificar el gen PRKAG3 de puerco a partir del material genético aislado; exponer el gen a una enzima de restricción que produce fragmentos de restricción del gen de longitud variada; separar los fragmentos de restricción para formar un patrón de restricción, tal como por electroforesis o separación HPLC; y comparar el patrón de fragmento de restricción resultante de un GEN PRKAG3 que es conocido ya sea por tener o no tener el marcador deseado. Si un animal resulta positivo para los marcadores, tal animal puede considerarse para inclusión en el programa de reproducción. Si el animal no resulta positivo para el genotipo marcador el animal puede seleccionarse del grupo y utilizarse de otra manera. El uso de datos de haplotipo puede también incorporarse con la selección para múltiples alelos para calidad de carne y/o tamaño de carnada. En una modalidad más preferida el gen se aisla por el uso de cebadores y polimerasa de ADN para ampliar una región especifica del gen que contiene el polimorfismo. Después que la región ampliada se asimila con una enzima de restricción y los fragmentos se separan nuevamente. La visualización del patrón RFLP es por simple tinción de los fragmentos, o por etiquetado de los cebadores o los trifosfatos de nucleósido utilizados en la amplificación. En otra modalidad, la invención comprende un método para identificar un marcador genético para calidad de la carne y/o tamaño de carnada en una población particular. Los puercos macho y hembra de la misma especie o cruza de especies o linaje genético similar se reproducen, y el número de descendientes (para hembras) y/o calidad de carne producida por cada puerco se determina. Un polimorfismo en el gen PRKAG3 de cada puerco se identifica y asocia con el número de descendientes o calidad de la carne. Preferiblemente, el análisis RFLP se usa para determinar el polimorfismo. En otra modalidad, la invención comprende un método para identificar un marcador genético para la calidad de la carne y/o tamaño de la carnada (número de nacimientos) en cualquier animal económico particular diferente de un puerco. con base en la naturaleza altamente protegida de este gen entre diferentes animales se espera que con no más que la prueba de rutina como se describe en la presente, este marcador puede aplicarse a diferentes especies animales para seleccionarse para calidad de la carne o tamaño de la carnada (número de nacimientos) basado en las enseñanzas de la presente. Los animales macho y hembra de la misma especie o cruza de especies o linaje genético similar se reproducen, y el número de descendientes o calidad de carne producida por cada animal se determina y se correlaciona. Para otros animales en donde las secuencias están disponibles puede utilizarse una comparación de secuencias BLAST para verificar si el alelo particular es análogo al descrito en la presente. El polimorfismo análogo se presentará en otros animales y en otros genes estrechamente relacionados. El término "polimorfismo análogo" será un polimorfismo el cual es el mismo como cualquiera de aquellos descritos en la presente como se determina por las comparaciones BLAST. Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad sustancial" . (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencia. En este caso la secuencia PRKAG3 de Referencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de un ADNC de longitud total o secuencia genética, o el ADNc completo o secuencia genética. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" incluye referencia a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido puede compararse a una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, vacíos) comparadas a la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es al menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser 30, 40, 50, 100 o más larga. Aquellos con experiencia en la técnica entienden que para evitar una similaridad elevada a una secuencia de referencia debida a la inclusión de vacíos en la secuencia de polinucleótido, se introduce normalmente una desventaja de vacío y se sustrae del número de equivalencias . Los métodos de alineación de las secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede conducirse por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) ; por la investigación para el método de similaridad de Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444 (1988); por implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero no limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/genético por Intelligenetics, Mountain View, California; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA; el programa CLUSTAL se describe bien por Higgins and Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Blosciences 8:155-65 (1992), y Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994). La familia BLAST de los programas que pueden utilizarse para las investigaciones de similaridad de base de datos incluyen: BLASTN para secuencias de recuperación de nucleótido contra secuencias de base de datos de nucleótido; BLASTX para secuencias de recuperación de nucleótido contra secuencias de base de datos de proteína; BLASTP para secuencias de recuperación de proteína contra secuencias de base de datos de nucleótido; TBLASTN para secuencias de recuperación de proteina contra secuencias de base de datos de nucleótido; y TBLASTX para secuencias de recuperación de nucleótido contra secuencias de base de datos de nucleótido. Véase, Current Protocole in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad/similaridad de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando el conjunto BLAST 2.0 de programas utilizando parámetros predefinidos. Altschul et a., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997) . El software para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente, por ejemplo, a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica . (http://www.hcbi.nlm.nih.gov/) .

Este algoritmo implica primero identificar los pares de secuencia de puntuación elevada (los HSP) identificando palabras cortas de la longitud W en la secuencia recuperada, la cual compara o satisface algún grado T de umbral estimado positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en la secuencia de base de datos. T se refiere a como el umbral de grado de palabra en la vecindad (Altschul et al., supra) . Estos aciertos de palabra de vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar investigaciones para encontrar los HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta el punto que el grado de alineamiento acumulativo puede incrementarse. Los grados acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótido, los parámetros M (grado de gratificación para un par de residuos igualados; siempre >0) y N (grado de desventaja para residuos incompatibles; siempre <0) . Para las secuencias de aminoácido, una matriz de clasificación se utiliza para calcular el grado acumulativo. La extensión de los aciertos de la palabra en cada dirección se para cuando: el grado de alineamiento acumulativo cae por la cantidad X de su valor logrado máximo; el grado acumulativo va de cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuo de clasificación negativos; o el final de cualquier secuencia es alcanzado. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótido) utiliza como predefinidas una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un atajo de 100, M=5, N=4, y una comparación de ambos ramales. Para las secuencias de aminoácido, el programa BLASTP utiliza como predefinidas una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de clasificación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 : 10915) . Además para calcular el porcentaje de la identidad de la secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de similaridad entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similaridad proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual el emparejar entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido ocurriría por casualidad. Las investigaciones BLAST asumen que las proteínas pueden modelarse como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias que pueden ser regiones homopoliméricas, repeticiones de periodo corto, o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad pueden alinearse entre proteínas no relacionadas aunque otras regiones de la proteína son totalmente diferentes. Un número de programas de filtro de baja complejidad pueden emplearse para reducir tales alineamientos de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad SEG (Wooten and Federen, Comput. Chem. , 17:149-163 (1993)) y X U (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993) pueden emplearse solos o en combinación. (c) Como se utiliza en la presente "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido incluyen referencias a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima durante una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza con referencia a las proteínas éste reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas con frecuencia difieren por sustituciones de aminoácido moderadas, en donde los residuos de aminoácido se sustituyen por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en las sustituciones moderadas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza moderada de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones moderadas se dice que tienen "similaridad de secuencia" o "similaridad". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Normalmente, esto implica clasificar una sustitución moderada como una parcial en lugar de una incompatibilidad completa, por lo que incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Asi, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico da un grado de 1 y una sustitución no moderada da un grado de cero, una sustitución moderada da un grado entre cero y 1. La clasificación de sustituciones moderadas se calcula, por ejemplo de acuerdo con el algoritmo de Meyers and Miller, Computer ñpplic. Biol. Sci . , 4:11-17 (1988) por ejemplo, como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA) . (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, vacíos) cuando se compara con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones a las cuales la base de ácido nucleico idéntica o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones compatibles, dividiendo el número de posiciones compatibles por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. (e) (I) El término "identidad sustancial" de las secuencias de polinucleótido significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 70% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 80%, de mayor preferencia al menos 90% y de mayor preferencia al menos 95%, comparada a una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineamiento descrito utilizando parámetros estándares. Alguien con experiencia reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótido tomando en cuenta la degeneración del codón, similaridad de aminoácido, posicionamiento del cuadro de lectura y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácido para estos propósitos normalmente significa identidad de secuencia de al menos 60% o preferiblemente al menos 70%, 80%, 90% y de mayor preferencia al menos 95%. Estos programas y algoritmos pueden determinar la analogía de un polimorfismo particular en un gen objetivo a aquellos descritos en la presente. Como se establece antes con base en la naturaleza altamente conservada del gen PRKAG3 (Jeon T. J., V. Armeger, C. Roger-Gaillard, A. Robic, E. Bongcam-Rudloff et al., 2001 Genomics 72: 297-303) se espera que este polimorfismo existirá en otros animales y el uso del mismo en otros animales que se describe en la presente implica no más que la optimización de rutina de los parámetros utilizando las enseñanzas en la presente. La secuencia PRKAG3 de porcino se muestra en la Figura 1. Es también posible establecer conexiones entre alelos específicos de marcadores de ADN alternativos y alelos de marcadores de ADN conocidos por estar asociados con un gen particular (por ejemplo, el gen PRKAG3 discutido en la presente) , el cual ha sido previamente mostrado por estar asociado con un rasgo particular. Así, en la presente situación, tomando el gen PRKAG3, sería posible, al menos en el término corto, seleccionar puercos aptos para producir carnadas más grandes y/o mejor calidad de la carne, o alternativamente contra puercos aptos para producir carnadas más pequeñas y/o menos calidad de carne favorable, indirectamente, seleccionando por ciertos alelos de un marcador asociado PRKAG3 a través de la selección de alelos específicos de marcadores 15 de cromosoma alternativo. Ejemplos de tales marcadores conocidos por estar unidos a PRKAG3 en el cromosoma 15 de porcino incluyen SW1683 y S 1983. Como se usa en la presente el término "marcador genético" incluirá no únicamente el polimorfismo descrito por cualesquiera medios de ensayo para los cambios de proteina asociados con el polimorfismo, son marcadores unidos, el uso de microsatélite, o aún otros medios para ensayar para los cambios de proteina causativa indicados por el marcador y el uso del mismo para influir en la calidad de la carne de un animal . Como se usa en la presente, con frecuencia la designación de un polimorfismo particular se hace por el nombre de una enzima de restricción particular. Esto no se pretende para denotar que la única manera que el sitio pueda identificarse es por el uso de esa enzima de restricción. Existen numerosas bases de datos y recursos disponibles por aquellos con experiencia en la técnica para identificar otras enzimas de restricción que pueden utilizarse para identificar un polimorfismo particular, por ejemplo http : //darwin.bio . geneseo . edu que puede dar enzimas de restricción al análisis de una secuencia e identificarse el polimorfismo. De hecho como se describe en las enseñanzas en la presente existen numerosas formas para identificar un polimorfismo particular o alelo con métodos alternativos que no pueden aún incluir una enzima de restricción, pero que pueden analizarse para la misma genética o forma alternativa proteómica .

Las figuras adjuntas, que se incorporan en la presente y las cuales constituyen una parte de esta especificación, ilustran una modalidad de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una descripción de la secuencia de nucleótido PRKAG3 de porcino que incluye los aminoácidos, se identifican lugares geométricos polimórficos alternativos y sus cambios de aminoácido. Las Figuras 2A y 2B describen la secuencia de la región de flanqueo 5' del gen PRKAG3 que incluye exon 1, exon 2 y secuencia de intrón novedosa de por medio. La Figura 2A es con SINE (11) y la Figura 2B es sin SINE (22). Esta secuencia puede utilizarse para formar cebadores adicionales. Las designaciones en negritas administran repeticiones entre SINE; los exones designados con negritas y cursivas del gen PRKAG3 (exon 1 y exon 2) . Las Figuras 3a y 3b son gráficas que ilustran las curvas de relación F para evidencia de QTL asociada con la calidad de la carne para SSC 15. El eje x indica la posición relativa en el mapa de acoplamiento. Los ejes representan la relación F. Las flechas en el eje x indican la posición en donde un marcador se presentó. Se proporcionan tres lineas para 5% del modo cromosómico ( ) , 5% del modo genómico ( ) y el 1% del significado del modo genómico (- - - -), A, glicógeno promedio, lactato promedio, y rasgos potenciales glicoliticos promedio. 3b muestra rasgos de pH. La Figura 4 demuestra efectos de sustitución haplotipo de PRKAG3 en pH y clasificaciones de color en el jamón y el lomo. Los efectos de sustitución de haplotipo se estiman por 5 líneas (ALL) y dentro de cada línea. Las líneas se basan en Landrace (LR) , Large White (LW) o Duroc (DU) , una línea sintética basada en Duroc (DS) y una línea basada en Berkshire (BE) . Se utiliza una escala separada para la línea BE. Las evaluaciones dentro de una columna que tienen el mismo índice superior son significativamente diferentes en p<.005 para las líneas estimadas en tat p<.005 para dentro de las estimaciones de la línea. Se hará ahora referencia en detalle a las modalidades actualmente referidas de la invención, que junto con los siguientes ejemplos, sirven para explicar los principios de la invención. La cinasa de proteína activada de AMP está implicada en volverse en trayectorias que producen ATP e inhibe las trayectorias que consume ATP. También, puede inactivar glicogen sintasa por fosforilación. AMPK se compone de tres subunidades: la cadena a catalítica y dos subunidades reguladoras ß y ?.

La Solicitud WO/01/20003 publicada por Institut National De Le Recherche Agronomique describe variantes del gen PRKAG3. Estos incluyen una sustitución R41Q (que corresponde en este caso al aminoácido 200) , una sustitución V40I (aminoácido 199) , como se asocia con el alelo R conocido de PRKAG3. La solicitud reporta que el descubrimiento de una mutación en el codón 200 en el gen PRKAG3 se asocia (en estados homocigosos o heterocigosos) con potencial glicolitico elevado en puercos Hampshire llamados el fenotipo RN-(200Q). Los puercos con este fenotipo tienen un pH final bajo, una capacidad de retención de agua reducida y da un rendimiento reducido de jamón curado cocinado- Los análisis de diferentes líneas de puercos sugieren, sin embargo, que esta mutación en el codón 200 se eleva en la especie Hampshire y ocurre en muy poca frecuencia o es completamente inexistente en otras especies de puercos. Además, como se describe en el ejemplo 5 de la publicación de PCT, 200Q se mostró para estar siempre presente con un 199V que sugeriría que el marcador en la posición 199 no tiene variación o valor independiente como un marcador genético del marcador 200Q. La solicitud WO/01/2003 identifica que el marcador 200Q se asocia con la mutación RN desfavorable. La aplicación enseña que este marcador se encuentra siempre junto con el 199V, sin embargo, 199V se presenta también con 200R el cual tiene mejor calidad de carne. Se ha encontrado sorprendentemente que una tercera combinación 199I/200R tiene una mejor calidad de carne promedio que 199V/200R. Además, se ha descubierto que el polimorfismo V199I se asocia sorprendentemente con la variación en el tamaño de la camada. Esta información permite al marcador 199 ser utilizado como una herramienta de reproducción. Todavía más allá, se ha identificado un lugar geométrico polimórfico nuevo, G52S que se asocia con la calidad de carne mejorada. Finalmente, se realizaron análisis de haplotipo para asegurar la interacción entre 199I-52G y el polimorfismo 30T conocido (descrito en Milán et. al., 2000). De acuerdo a esta modalidad, el haplotipo 30T-52G-199I (más adelante haplotipo 3) fue el más favorable para los rasgos de calidad de la carne. La Figura 1 describe el gen PRKAG3 y todos los poliformismos discutidos en la presente. (SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 1 es del tipo silvestre) . Antes del trabajo descrito en esta solicitud, no había evidencia para este gen que influye en los rasgos económicos en otras especies. Sorprendentemente, nuevos marcadores en el gen PRKAG3, PRKAG3-199, PRKAG-30 y PRKAG3-52, se han encontrado ahora para correlacionarse con la variación en los rasgos de calidad de la carne así como en los rasgos reproductivos tales como el tamaño de camada en muchas especies de puercos diferentes de la especie Hampshire. Estos nuevos marcadores se han mostrado ahora para correlacionarse con la carne de la calidad técnica elevada en términos de color, nivel de pH, jaspeado, y pérdida por goteo y también con el rasgo del tamaño de la carnada. De acuerdo con esta invención, la asociación de estos polimorfismos con este o estos rasgos habilita marcadores genéticos para identificarse por reproducciones especificas o lineas genéticas para identificar animales con características de carne favorables y/o tamaño de carnada temprano en la vida del animal. Los diferentes genotipos marcadores de PRKAG3-199 son el resultado de un polimorfismo con el gen PRKAG3 que resulta en una transición de guanina a adenina a la posición 595 nucleótida (SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 7) resultando en un cambio de la valina de aminoácido a isoleucina (número de aminoácido 199) (SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 8) . Esta transición a su vez genera un sitio de restricción en el alelo 1 asociado con el glicógeno inferior, lactato y potencial glicolítico. Este sitio se encontró también para correlacionarse con el tamaño de carnada incrementado cuando al menos se presentó una copia. Los diferentes genotipos marcadores de PRKAG3-52 resultan de un polimorfismo con el gen PRKAG3 que resulta en una transición de guanina a adenina en la posición 154 del nucleótido (SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 5 (aminoácido 52), resultando en una transición de la glicina de aminoácido a serina (SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 6) . Este cambio a su vez genera un sitio de restricción de manera que el alelo 2 se asocia con el glicógeno inferior, lactato y potencial glicolitico. Los diferentes genotipos marcadores de PRKAG3-30 resultan de un polimorfismo con el gen PRKAG3 que resulta en una transversión de adenina a citosina en la posición 89 de nucleótido SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 3 (aminoácido 30), resultando en un cambio de aminoácido de asparagina a treonina SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 4. Este polimorfismo se reportó previamente, pero no se encontró correlacionarse con ningún fenotipo de calidad de la carne. La treonina se asoció significativamente con calidad de carne mejorada. La invención se relaciona a marcadores genéticos para rasgos económicamente valiosos en animales. Los marcadores representan alelos que se asocian significativamente con un rasgo de la calidad de carne y/o tamaño de carnada, un rasgo de reproducción, y proporciona asi un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para producir una carnada más grande o mejor calidad de la carne (o ambos) cuando se identifica en la especie la presencia o ausencia de un polimorfismo en el gen PRKAG3 que también se correlaciona.

Así, la invención se relaciona a marcadores genéticos y métodos para identificar esos marcadores en un animal de una especie particular, cepa, población, o grupo, por lo que el animal hembra es más apto para producir una carnada que se incrementa significativamente en tamaño (número) sobre la media para esa carnada particular, cepa, población, o grupo. De manera similar, el método puede utilizarse para identificar animales que son más aptos para producir carne de calidad de carne preferida. Cualquier método para identificar la presencia o ausencia de este marcador puede utilizarse, incluyendo por ejemplo, análisis de polimorfismo de conformación de un solo ramal (SSCP) , exploración de secuencia de escisión de base (BESS), análisis RFLP, análisis heterodúplex, electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante, y electroforesis del gradiente de temperatura, PCR alélico, secuencia directa de reacción de cadena ligasa, mini secuenciación, hibridación del ácido nucleico, detección del tipo de micro matriz del gen PRGAG3, u otras secuencias unidas del gen PRKAG3. También dentro del alcance de la invención incluye analizar la proteína adaptativa o cambios de secuencia que ocurren en la presencia de este polimorfismo. El polimorfismo puede o no puede ser la mutación causativa, pero será indicativo de la presencia de este cambio y se puede analizar para las bases genéticas o de proteína para la diferencia fenotipica.

Lo siguiente es una visión general de las técnicas que pueden utilizarse para analizar los polimorfismos de la invención. En la presente invención, se obtiene una muestra del material genético de un animal. Las muestras pueden obtenerse de sangre, tejido, semen, etc. Generalmente, las células hemáticas periféricas se utilizan como la fuente, y el material genético es ADN. Una cantidad suficiente de células se obtienen para proporcionar una cantidad suficiente de ADN para el análisis. Esta cantidad se conocerá o será fácilmente determinable por aquellos expertos en la técnica. El ADN se aisla de las células hemáticas por técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Aislamiento y Amplificación del Ácido Nucleico Las muestras del ADN genómico se aislan de cualquier fuente conveniente, incluyendo saliva, células bucales, raices del pelo, sangre, sangre del cordón, liquido amniótico, liquido intersticial, liquido peritoneal, vellosidad del corión, y cualquier otra muestra de célula o tejido adecuada con células de metafase o núcleo de interfase intacta. Las células pueden obtenerse de tejido sólido como de un órgano fresco o conservado o de una muestra de tejido o biopsia. La muestra puede contener compuestos que no se entremezclan naturalmente con el material biológico tal como conservadores, anticoagulantes, reguladores, fijadores, nutrientes, antibióticos, o similares. Métodos para aislamiento del ADN genómico de estas diversas fuentes se describen en, por ejemplo, Kirby, DNA Fingerprinting, An Introduction, W.H. Freeman & Co. New York (1992) . El ADN genómico puede también aislarse de cultivos de células primarias o secundarias cultivadas o de líneas celulares transformadas derivadas de cualquiera de las muestras de tejido mencionadas anteriormente. Las muestras del ARN de animal pueden utilizarse también. El ARN puede aislarse de tejidos que expresan el gen PRKAG3 como se describe en Sambrook et al., supra. El ARN puede ser ARN celular total, ARNm, poli A+ARN, o cualquier combinación de los mismos. Para mejores resultados, el ARN se purifica, pero puede también ser un ATN citoplásmico no purificado. El ARN puede ser transcrito inversamente para formar el ADN que se utiliza entonces como la plantilla de amplificación, de manera que la PCR amplifica indirectamente una población especifica de copias de ARN. Véase, por ejemplo., Sambrook, supra, Kawasaki et al., Capítulo 8 en PCR Technology, (1992) supra, y Berg et al., Hum. Genet . 85:655-658 (1990) . Amplificación PCR Los medios más comunes para la amplificación es la reacción de cadena de polimerasa (PCR) , como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,965,188 cada uno de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Si PCR se utiliza para amplificar las regiones objetivo en las células hemáticas, la sangre completa heparinizada debe ser extraída en un tubo de vacío sellado mantenido separado de otras muestras y manejado con guantes limpios. Para mejores resultados, la sangre debe procesarse inmediatamente después de la recolección; si esto es imposible, ésta debe mantenerse en un recipiente sellado a 4°C hasta el uso. Las células en otros líquidos fisiológicos pueden analizarse también. Cuando se utiliza cualquiera de estos líquidos, las células en el líquido deben separarse del componente líquido por centrifugación. Los tejidos deben desmenuzarse toscamente utilizando un escalpelo desechable estéril y una aguja estéril (o dos escalpelos) en un plato Petri de 5 mm. Los procedimientos para remover parafina de las secciones del tejido se describen en una variedad de manuales especializados bien conocidos por aquellos expertos en la técnica . Para amplificar una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra por PCR, la secuencia debe ser accesible a los componentes del sistema de amplificación. Un método para aislar el ADN objetivo es la extracción sin purificar la cual es útil para muestras relativamente grandes. Brevemente, las células mononucleares de las muestras de sangre, aminocitos del liquido amniótico, células de las vellocidades del corión cultivadas, o similares se aislan estratificándose en un gradiente Ficoll-Hypaque estéril por procedimientos estándares. Las células de interfase se recolectan y se lavan tres veces en solución salina regulada con fosfato estéril antes de la extracción del ADN. Si al probar el ADN de los linfocitos sanguíneos periféricos, se sugiere un choque osmótico (tratamiento del gránulo durante 10 segundos con agua destilada), seguido por dos lavados adicionales si los glóbulos rojos residuales son visibles siguiendo los lavados iniciales. Esto evitará el efecto inhibitorio del grupo heme transportado por la hemoglobina en la reacción PCR. Si la prueba PCR no se realiza inmediatamente después de la recolección de la muestra, las alícuotas de 10° células pueden ser granuladas en tubos Eppendorf estériles y los gránulos secos congelados a -20°C hasta su uso. Las células se vuelven a suspender (106 células nucleadas por 100 µ?) en un regulador de 50 mM de Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM de KCl 1.5 mM de MgCl2, 0.5% Tween 20, 0.5% de NP40 suplementado con 100 g/ml de proteinasa K. Después de incubarse a 56°C durante 2 horas, las células se calientan a 95°C durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K e inmediatamente se mueve la nieve (frapé) . Si se presentan los aglomerados en total, otro ciclo de la asimilación en el mismo regulador debe ser emprendido. Diez µ? de este extracto se utiliza para la amplificación. Cuando se extrae el ADN de los tejidos, por ejemplo, células de vellosidad de corión o células de cultivo confluentes, la cantidad del regulador mencionado anteriormente con la proteinasa K puede variar de acuerdo al tamaño de la muestra tejido. El extracto se incuba durante 4-10 horas a 50°C-60°C y luego a 95°C durante 10 minutos para inactivar la proteinasa. Durante las largas incubaciones, la proteinasa K reciente debe agregarse después de aproximadamente 4 horas a la concentración original. Cuando la muestra contiene un número pequeño de células, la extracción puede lograrse por métodos como se describe en Higuchi, "Simple and Rapid Preparation of Samples for PCR", en PCR Technology PCR, Ehrlich, H.A. (ed.), Stockton Press, New York, que se incorpora en la presente para referencia. La PCR puede emplearse para amplificar regiones objetivos en un número muy pequeño de células (1000-5000) derivadas de colonias individuales de la médula espinal y cultivos sanguíneos periféricos. Las células en la muestra se suspenden en 20 µ? de regulador de lisis PCR (10 mM Tris-HC1 (pH 8.3), 50 mM de KC1, 2.5 mM de MgCl2, 0.1 mg/ml de gelatina, 0.45% de NP40, 0.45% de Tween 20) y se congelan hasta su uso. Cuando la PCR se va a realizar, se agregan 0.6 µ? de proteinasa K (2 mg/ml) a las células en el regulador de lisis de PCR. La muestra se calienta entonces a aproximadamente 60°C y se incuba durante 1 hora. La asimilación se detiene a través de la inactivación de la proteinasa K calentando las muestras a 95°C durante 10 minutos y luego enfriéndolas con hielo. Un procedimiento relativamente fácil para extraer el ADN por PCR es un procedimiento de salificación adaptado del método descrito por Miller et al., Nucleic Acids Res. 16:1215 (1988) que se incorpora en la presente para referencia. Las células mononucleares se separan en un gradiente Ficoll-Hypaque. Las células se vuelven a suspender en 3 mi de regulador de lisis (10 mM de Tris-HCl, 400 mM de NaCl, 2 mM de Na2 EDTA, pH 8.2). Cincuenta µ? de una solución de 20 mg/ml de proteinasa K y 150 µ? de una solución de SDS al 20% se agregan a las células y luego se incuban a 37°C durante la noche. Agitar los tubos durante la incubación mejorará la asimilación de la muestra. Si la asimilación de la proteinasa K está incompleta después de la incubación por la noche (fragmentos son visibles aún), una solución adicional de 50 µ? de proteinasa K 20 mg/ml se mezcla en la solución y se incuba durante otra noche a 37°C en un agitador suave o plataforma giratoria. Siguiendo la asimilación adecuada, se agrega un mi de una solución de NaCl 6M a la muestra y se mezcla vigorosamente. La solución resultante se centrifuga durante 15 minutos a 3000 rpm. El gránulo contiene las proteínas precipitadas, mientras gue el sobrenadante contiene el ADN. El sobrenadante se remueve a un tubo de 15 mi que contiene 4 mi de isopropanol. Los contenidos del tubo se mezclan suavemente hasta que las fases acuosas y de alcohol se han mezclado y se ha formado un precipitado de ADN blanco. El precipitado de ADN se remueve y se sumerge en una solución de 70% de etanol y se mezcla suavemente. El precipitado de ADN se remueve del etanol y se seca al aire. El precipitado se coloca en agua destilada y se disuelve. Los equipos para la extracción de ADN de elevado peso molecular para PCR incluyen un Equipo de Aislamiento Genómico A.S.A.P. (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Ind.), Sistema de Aislamiento de ADN Genómico (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.), Equipo de Purificación de ADN Elu-Quik (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), Equipo de Extracción de ADN (Stratagene, LaJolla, Calif.) Equipo de Aislamiento TurboGen (Invitrogen, San Diego, Calif.) y similares. El uso de estos equipos de acuerdo a las instrucciones del fabricante es generalmente aceptable para la purificación de ADN antes de practicar los métodos de la presente invención. La concentración y pureza del ADN extraído puede determinarse por análisis espectrofotométrico de la absorbancia de una alícuota diluida a 260 nm y 280 nm. Después de la extracción del ADN, la amplificación PCR puede proceder. La primera etapa de cada ciclo de la PCR implica la separación del doble ácido nucleico formado por la extensión cebadora. Una vez que los ramales se separan, la siguiente etapa en PCR implica hibridizar los ramales separados con cebadores que flanquean la secuencia objetivo. Los cebadores se extienden entonces para formar copias complementarias de los ramales objetivo. Para amplificación PCR exitosa, los cebadores se designan de manera que la posición en donde cada cebador hibridiza junto con una secuencia doble es semejante de un producto de extensión sintetizado de un cebador, cuando se separa de la plantilla (complemento) , sirve como una plantilla para la extensión del otro cebador. El ciclo de desnaturalización, hibridización, y extensión se repite tantas veces como sea necesario para obtener la cantidad deseada del ácido nucleico amplificado. En una modalidad particularmente útil de la amplificación PCR, la separación del ramal se logra calentando la reacción a una temperatura suficientemente elevada durante un tiempo suficiente para provocar la desnaturalización del dúplex, pero no para provocar una desnaturalización irreversible de la polimerasa (véase Patente Norteamericana No. 4,965,188, incorporada en la presente para referencia) . La desnaturalización de calor normal implica temperaturas que varían de aproximadamente 80°C a 105°C por lapsos que varían de segundos a minutos. La separación del ramal, sin embargo, puede lograrse por cualquier método de desnaturalización adecuado que incluye medios físicos, químicos o enzimáticos. La separación del ramal puede inducirse por una helicasa, por ejemplo, o una enzima capaz de exhibir la actividad helicasa. Por ejemplo, la enzima RecA tiene actividad helicasa en la presencia de ATP. Las condiciones de reacción adecuadas para la separación del ramal por helicasas se conocen en la técnica (véase Kuhn Hoffman-Berling, 1978, CSH-Quantitative Biology, 43:63-67; y Radding, 1982, Ann. Rev. Genetics 16:405-436, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia) . La extensión dependiente de plantilla de los cebadores en PCR se cataliza por un agente de polimerización en la presencia de cantidades adecuadas de cuatro trifosfatos de desoxiribonucleótido (normalmente dATP, dGTP, dCTP y dTTP) en un medio de reacción comprendido de las sales apropiadas, cationes metálicos, y sistemas de regulación de pH. Los agentes de polimerización adecuados son enzimas conocidas para síntesis de ADN dependiente de plantilla catalizada. En algunos casos, las regiones objetivo puede codificar al menos una porción de una proteína expresada por la célula. En este caso, el AR m puede utilizarse para amplificación de la región objetivo. Alternativamente, la PCR puede utilizarse para generar una biblioteca de ADNc a partir de ARN para amplificación adicional, la plantilla inicial para la extensión cebadora es ARN. Los agentes de polimerización adecuados para sintetizar una secuencia de ADN-copia (ADNc) complementaria de la plantilla de ARN son transcriptasa inversa (RT) , tal como virus de mieloblastosis de ave RT, virus de leucemia murina Moloney RT, o polimerasa de ADN Thermus thermophilus (Tth) , una polimerasa de ADN termoestable con actividad de transcriptasa inversa comercializada por Perkin Elmer Cetus, Inc. Normalmente, la plantilla de ARN genómico es calor degradado durante la primera etapa de desnaturalización después de la etapa de trascripción inversa inicial dejando únicamente la plantilla de ADN. Las polimerasas adecuadas para uso con la plantilla de ADN incluyen, por ejemplo, polimerasa de ADN E. coli I o su fragmento Klenow, polimerasa de ADN T4, polimerasa Tth, y polimerasa Taq, una polimerasa de ADN estable al calor aislada de Thermus aquaticus y comercialmente disponible de Perkin Elmer Cetus, Inc. La última enzima se utiliza ampliamente en la ampli icación y secuenciación de ácidos nucleicos. Las condiciones de reacción para utilizar polimerasa Taq se conocen en la técnica y se describen en Gelfand, 1989, PCR Technology, supra. Alelo de PCR Especifico Los alelos de PCR específicos se diferencian entre regiones objetivo diferenciándose de la presencia o ausencia de una variación o polimorfismo. Los cebadores de amplificación PCR se eligen únicamente porque se unen a ciertos alelos de la secuencia objetivo. Este método se describe por Gibbs, Nucleic Acid Res. 17:12427-2448 (1989). Métodos de Clasificación de Alelo de Oligonucleótido Específico Los métodos para clasificar diagnóstico adicionales emplean los métodos de clasificación de oligonucleótido específico de alelo (ASO) , como se describe por Saiki et al, Nature 324:163-166 (1986). Los oligonucleótidos con uno o más incompatibilidades de par de base se generan por cualquier alelo particular. Los métodos de clasificación ASO detectan incompatibilidades entre variantes genómicas objetivo o ADN amplificado de PCR y oligonucleótidos sin mutante, mostrando disminución de unión del oligonucleótido relativo a un oligonucleótido mutante. Los ensayos de oligonucleótido pueden ser diseñadas que bajo baja severidad unirá a ambas formas polimórficas del alelo, pero cuya elevada severidad, se une al alelo al cual corresponden. Alternativamente, las condiciones de severidad pueden diseñarse en donde se obtiene una respuesta esencialmente binaria, es decir, un ASO correspondiente a una forma variante del gen objetivo hibridizará a ese alelo, y no al alelo de tipo silvestre. Método de Detección de Alelo Mediado con Ligasa Las regiones objetivo de un ADN sujeto a prueba puede compararse con regiones objetivo en miembros de la familia no afectados y afectados por detección de alelo mediado por ligasa. Véase Landegren et al., Science 241:107- 1080 (1988) . La ligasa puede también utilizarse para detectar mutaciones de punto en la reacción de amplificación de ligación descrita en Wu et al., Genomics 4:560-569 (1989). La reacción de amplificación de. ligación (LAR) utiliza amplificación de secuencia de ADN específica utilizando rutas secuenciales de ligación dependientes de la plantilla como se describe en Wu, supra, y Barany, Proc. Nat. Acad. Sci . 88:189-193 (1990) . Electroforesis de Gel de Gradiente Desnaturalizante Los productos de amplificación generados utilizando la reacción de cadena de polimerasa pueden analizarse por el uso de electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante. Diferentes alelos pueden identificarse con base en las diferentes propiedades de fusión dependientes de secuencia y migración electroforética de ADN en solución. Las moléculas de ADN fundidas en segmentos, llamadas dominios de fusión, bajo condiciones de temperatura incrementada o desnaturalización. Cada dominio de fusión funde cooperativamente en una temperatura de fusión específica de base, distinta (TM) . Los dominios de fusión son al menos 20 pares de bases de largo, y pueden ser hasta varios cientos de pares de bases de longitud.

La diferenciación entre alelos basados en diferencias de dominio de fusión especificas de secuencia pueden evaluarse utilizando electroforesis de gel de poliacrilamida, como se describe en el Capitulo 7 de Erlich, ed., PCR Technology, Principies and Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman and. Co., New York (1992), los contenidos de los cuales se incorporan en la presente para referencia. Generalmente, una región objetivo a ser analizada por electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante se amplifica utilizando cebadores PCR que flanquean la región objetivo. El producto PCR amplificado se aplica a un gel de poliacrilamida con un gradiente de desnaturalización lineal como se describe en Myers et al., Meth. Enzymol. 155:501-527 (1986) and Myers et al., en Genomic Analysis, A Practical Approach, . Davies Ed. IRL Press Limited, Oxford, pp. 95-139 (1988) , los contenidos de los cuales se incorporan en la presente para referencia. El sistema de electroforesis se mantiene a una temperatura ligeramente debajo de la Tm de los dominios de fusión de las secuencias objetivo. En un método alternativo de la electroforesis del gel de gradiente desnaturalizante, las secuencias objetivo pueden unirse inicialmente a una región de nucleótidos GC, llamados una sujeción GC, como se describe en el Capitulo 7 de Erlich, supra. Preferiblemente, al menos 80% de los nucleótidos en la sujeción GC son ya sea guanina o citosina. Preferiblemente, la sujeción GC es al menos 30 bases largas. Este método se ajusta particularmente a las secuencias objetivo con las Tm elevadas. Generalmente, la región objetivo se amplifica por la reacción de cadena de polimerasa como se describió anteriormente. Uno de los cebadores PCR de oligonucleótido porta en su extremo 5' , la región de sujeción GC, al menos 30 bases de la secuencia abundante GC, que se incorpora en el extremo 5' de la región objetivo durante la amplificación. La región objetivo amplificada resultante se activa en gel de electroforesis bajo condiciones de gradiente de desnaturalización como se describe anteriormente. Los fragmentos de ADN difieren por un cambio de base único migrando a través del gel a posiciones diferentes, que pueden visualizarse por tinción de bromuro de etidio. Electroforesis de Gel de Gradiente de Temperatura La electroforesis de gel de gradiente de temperatura (TGGE) se basa en los mismos principios fundamentales como electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante, excepto que el gradiente desnaturalizante se produce por diferencias en temperaturas en lugar de diferencias en la concentración de un desnaturalizante químico. La TGGE estándar utiliza un aparato de electroforesis con un gradiente de temperatura que corre a lo largo de la trayectoria de electroforesis . Cuando las muestras emigran a través de un gel con una concentración uniforme de un desnaturalizante químico, encontraron temperaturas incrementadas. Un método alternativo de TGGE, electroforesis de gel de gradiente de temperatura temporal (TTGE o tTGGE) utiliza una temperatura firmemente incrementada del gel de electroforesis completo para lograr el mismo resultado. Cuando las muestras migran a través del gel, la temperatura del gel completo se incrementa, conduciendo las muestras para encontrar temperatura incrementada cuando emigran hacia el gel . La preparación de muestras, incluyendo amplificación PCR con incorporación de una sujeción GC, y visualización de productos son lo mismo como para la electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante. Análisis de Polimorfismo de Conformación de un Solo Ramal Las secuencias objetivo o alelos en el lugar PRKAG3 puede diferenciarse utilizando análisis de polimorfismo de conformación de un solo ramal, que identifica diferencias de base por la alteración en la migración electroforética de productos PCR de un solo ramal, como se describe en Orita et al., Proc. Nat . Acad. Sci. 85:2766-2770 (1989). Los productos PCR amplificados pueden generarse como se describió anteriormente, y calentarse o de otra manera desnaturalizarse, para formar productos de amplificación de un solo ramal. Los ácidos nucleicos de un solo ramal pueden replegar o formar estructuras secundarias gue son parcialmente dependientes en la secuencia base. Así, la movilidad electroforética de los productos de amplificación de un solo ramal puede detectar diferencia de secuencia base entre alelos o secuencias objetivo. Desdoblamiento Químico o Enzimático de Incompatibilidad Las diferencias entre las secuencias objetivo pueden detectarse también por desdoblamiento guímico diferencial de pares de base incompatibles, como se describe en Grompe et al., Am. J. Hum. Genet. 48:212-222 (1991). En otro método, las diferencias entre secuencias objetivo pueden detectarse por desdoblamiento enzimático de pares de base incompatibles, como se describe en Nelson et al., Nature Genetics 4:11-18 (1993). Brevemente, el material genético de un animal y un miembro de la familia afectada puede utilizarse para generar incompatibilidad libre de dobles ADN heterohíbridos. Como se usa en la presente, "heterohíbrido" significa un ramal dúplex de ADN que comprende un ramal de ADN de un animal, y un segundo ramal de ADN de otro animal, usualmente un animal diferente en el fenotipo para el rasgo de interés. La selección positiva para heterohíbridos libres de incompatibilidad permite la determinación de pequeñas inserciones, supresiones u otros polimorfismos que pueden asociarse con polimorfismos PRKAG3.

Sistemas Sin gel Otras posibles técnicas incluyen sistemas sin gel tales como TaqMan™ (Perkin^ Elmertv' En este sistema los cebadores PCR de oligonucleótido se designan para flanquear la mutación en cuestión y permitir la amplificación PCR de la región. Un tercer ensayo de oligonucleótido se designa entonces para hibridizar a la región que contiene el sujeto base para cambiar entre diferentes alelos del gen. Este ensayo se etiqueta con tintes fluorescentes en ambos extremos 5' y 3' . Estos tintes se eligen de para que en esta proximidad uno del otro la fluorescencia de uno de ellos se extinga bruscamente por el otro y no pueda detectarse. La extensión por polimerasa de Taq ADN del cebador PCR posicionado en 5' en la plantilla relativa al ensayo conduce al desdoblamiento del tinte unido al extremo 5' del ensayo templado a través de la actividad de nucleasa 5' de la polimerasa Taq ADN. Esto remueve el efecto de extinción permitiendo la detección de la fluorescencia del tinte en el extremo 3' del ensayo. La discriminación entre diferentes secuencias de ADN se eleva a través del hecho de que si la hibridización del ensayo a la molécula de la plantilla no se completa, es decir, existe una incompatibilidad de alguna forma, el desdoblamiento del tinte no tiene lugar. Asi únicamente si la secuencia de nucleótido del ensayo de oligonucleótido es completamente complementaria a la molécula de la plantilla a la cual se une se extinguirá bruscamente. Una mezcla de reacción puede contener^—do_s diferentes secuencias de ensayo cada una designada contra diferentes alelos que pueden estar presentes permitiendo asi la detección de ambos alelos en una reacción. Aún otra técnica incluye un Ensayo Invasor el cual incluye amplificación isotérmica que se basa en una liberación catalítica de fluorescencia. Véase Tirad Wave Technology en www. twt . com Diagnósticos de ADN Basados sin PCR La identificación de la secuencia de ADN unida a PRKAG3 puede hacerse sin una etapa de amplificación, basada en los polimorfismos incluyendo polimorfismos de longitud de fragmento de restricción en un animal y un miembro de familia. Los ensayos de hibridización son generalmente oligonucleótidos que se unen a través de la base complementaria emparejando todos o parte de un ácido nucleico objetivo. Los ensayos normalmente unen secuencias objetivo que carecen de complementariedad completa con la secuencia de ensayo dependiendo de la severidad de las condiciones de hibridización. Los ensayos se etiquetan preferiblemente directa o indirectamente, de manera que al analizarse por la presencia o ausencia del ensayo, uno puede detectar la presencia o ausencia de la secuencia objetivo. Los métodos de etiquetado directos incluyen etiquetado con radioisótopo, tal como con 32P o 35S. Los métodos de marcado indirectos incluyen etiquetas fluorescentes, complejos de biotina que pueden unirse a avidina o estreptavidina, o etiquetas de péptido o proteina. Los métodos de detección visuales incluyen fotoluminiscentes, rojo Texas, rodamina y sus derivados, tinte rojo leuco y e, e' , 5, 5'-5354ametilbenzidina (TMB) , fluoresceina, y sus derivados, dansilo, umbelliferona y similares y con peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y similares. Los ensayos de ibridización incluyen cualquier secuencia de nucleótido capaz de hibridizar al cromosoma porcino en donde reside PRKAG3, y asi definir un marcador genético unido a PR AG3, que incluye un polimorfismo de longitud del fragmento de restricción, una región hipervariable, elemento repetitivo, o una repetición de tándem de número variable. Los ensayos de hibridización pueden ser cualquier gen o un análogo adecuado. Los ensayos de hibridización adecuados adicionales incluyen fragmentos exon o porciones de las ADNc o genes conocidos para mapear a la región relevante del cromosoma. Los ensayos de hibridización de repetición de tándem preferidos para usarse de acuerdo con la presente invención son aquellos que reconocen un pequeño número de fragmentos en un lugar específico en las condiciones de hibridización de severidad elevada, o que reconocen un gran número de fragmentos en ese lugar cuando las condiciones severas se reducen. Pueden utilizarse una o más enzimas y/o ensayos y/o cebadores de restricción adicional. Las enzimas adicionales, ensayos construidos, y cebadores pueden determinarse por experimentación rutinaria por aquellos con experiencia común en la técnica y se pretenden para estar dentro del alcance de la invención. Aunque los métodos descritos en la presente pueden estar en los términos del uso de una única enzima de restricción y un único conjunto de cebadores, los métodos no son asi limitados. Pueden utilizarse, si se desea una o más enzimas y/o ensayos y/o cebadores de restricción adicional. Ciertamente en algunas situaciones puede ser preferible utilizar combinaciones de marcadores dando haplotipos específicos. Las enzimas adicionales, ensayos construidos y cebadores pueden determinarse a través de experimentación rutinaria, combinada con las enseñanzas proporcionadas e incorporadas en la presente. De acuerdo con la invención, los polimorfismos en el gen PRKAG3 han sido identificados que tienen una asociación con la calidad de la carne y tamaño de la carnada. La presencia o ausencia de los marcadores, en una modalidad puede analizarse por análisis PCR RFLP utilizando las endonucleasas de restricción y los cebadores de amplificación pueden diseñarse utilizando genes humanos, de puerco u otros genes relacionados análogos a PRKAG3 debidos a la elevada homología en la región que rodea los polimorfismos, o pueden diseñarse utilizando datos de secuencia de gen PRKAG3 conocidos como se ejemplifica en GenBank o aún diseñados de secuencias obtenidas de datos de acoplamiento de genes circundantes basados en las instrucciones y referencias en la presente. Las secuencias que rodean el polimorfismo facilitarán el desarrollo de las pruebas PCR alternas en las cuales un cebador de aproximadamente 4-30 bases contiguas se toman a partir de la secuencia inmediatamente adyacente al polimorfismo se utilizan junto con una reacción en cadena de polimerasa para amplificar en gran medida la región antes del tratamiento con la enzima de restricción deseada. Los cebadores no necesitan ser el complemento exacto; son aceptables las secuencias sustancialmente equivalentes. El diseño de cebadores para la amplificación por PCR se conoce por aquellos expertos en la técnica y se discute en detalle en Ausubel (ed.), "Short Protocols in Molecular Biology, Fourth Edition" John Wiley and Sons 1999. Lo siguiente es una breve descripción del diseño cebador. ESTRATEGIA DE DISEÑO DEL CEBADOR El uso incrementado de métodos de reacción de cadena de polimerasa (PCR) ha estimulado el desarrollo de muchos programas para ayudar en el diseño o selección de oligonucleótidos utilizados como cebadores para PCR. Cuatro ejemplos de tales programas que están libremente disponibles a través de Internet son: PRIMER por Mark Daly y Steve Lincoln del Instituto Whitehead (UNIX, VMS, DOS y Macintosh), Programa de Selección de Oligonucleótido (OSP) por Phil Green y LaDeana Hiller de Washington University en St. Louis (UNIX, VMS, DOS y Macintosh), PGEN por Yoshi (únicamente DOS) y Amplify por Bill Engels de la Universidad de Wisconsin (únicamente Macintosh) . Generalmente estos programas ayudan en el diseño de cebadores PCR investigando por bits o elementos de secuencia repetidos conocidos y optimizando luego la Tm analizando la longitud y contenido de GC de un cebador putativo. El software comercial está también disponible y los procedimientos de selección de cebador están siendo rápidamente incluidos en la mayoría de los paquetes de análisis de secuencia general. Secuencia y Cebadores PCR Los oligonucleótidos diseñados para utilizarse como cualquier secuencia o cebadores PCR requieren selección de una secuencia apropiada que reconozca específicamente el objetivo, y luego pruebe la secuencia para eliminar la posibilidad que el oligonucleótido tendrá una estructura secundaria estable. Las repeticiones invertidas en la secuencia pueden identificarse utilizando una identificación repetida o programa que dobla ARN tal como aquellos descritos anteriormente (véase predicción de la Estructura del Ácido Nucleico) . Si una estructura de tronco posible se observa, la secuencia del cebador puede cambiar unos pocos nucleótidos en cualquier dirección para minimizar la estructura secundaria prevista. La secuencia del oligonucleótido debe también ser comparada con las secuencias de ambos ramales del vector apropiado e insertar el ADN. Obviamente, un cebador de secuencia debe únicamente tener una sola comparación al ADN objetivo. Es también conveniente excluir cebadores que tienen únicamente una única incompatibilidad con una secuencia de ADN objetivo indeseada. Para los cebadores PCR utilizados para amplificar el ADN genómico, la secuencia cebadora debe compararse con las secuencias en la base de datos GenBank para determinar si cualquier comparación significativa ocurre. Si la secuencia de oligonucleótido se presenta en cualquier secuencia de ADN conocida o, más importantemente, en cualesquiera elementos repetitivos conocidos, la secuencia cebadora debe cambiarse. Los métodos y materiales de la invención pueden utilizarse más generalmente para evaluar el ADN de puerco, genéticamente clasifican puercos individuales, y detectar diferencias genéticas en puercos. En particular, una muestra del ADN genómico de puerco puede evaluarse para referencia para uno o más controles para determinar si un polimorfismo en el gen PRKAG3 está presente. Preferiblemente, el análisis RFLP se realiza con respecto al gen PRKAG3 de puerco, y los resultados se comparan con un control. El control es el resultado de un análisis RFLP del gen PRKAG3 de puerco de un puerco diferente en donde el polimorfismo del gen PRKAG3 de puerco es conocido. Similarmente, el genotipo PRKAG3 de un puerco puede determinarse obteniendo una muestra de su ADN genómico, conduciendo a análisis RFLP del gen PRKAG3 en el ADN, y comparando los resultados con un control. Nuevamente, el control es el resultado del análisis RFLP del gen PRKAG3 de un puerco diferente. Los resultados genéticamente clasifican el puerco especificando el polimorfismo en sus genes PRKAG3. Finalmente, las diferencias genéticas entre puercos puede detectarse obteniendo muestras del ADN genómico a partir de al menos dos puercos, identificando la presencia o ausencia de un polimorfismo en el gen PRKAG3, y comparando los resultados. Estos ensayos son útiles para identificar los marcadores genéticos relacionando a la calidad de la carne como se discutió anteriormente, para identificar otros polimorfismos en el gen PRKAG3 que puede correlacionarse con otras características, tales como tamaño de la carnada y por el análisis científico general de los genotipos y fenotipos de puerco . Los marcadores genéticos, métodos y alelos novedosos de la invención son también útiles en un programa de reproducción para mejorar la calidad de la carne y/o eficiencia reproductiva (tamaño de la carnada) en una especie, linea, o población de puercos. En algunas situaciones, la selección continua y reproducción de cerdas que son al menos heterócigotas y homocigosas para un polimorfismo asociado con la calidad de la carne favorable' se conduciría también para mejorar el tamaño de la carnada. Se aplicaría esto en las poblaciones estudiadas en el Ejemplo 2. Los ejemplos y métodos describen en la presente ciertos genes que han sido identificados por tener un polimorfismo el cual se asocia ya sea positiva o negativamente con un rasgo benéfico que tendrá un efecto en la calidad de la carne/tamaño de la carnada para animales que llevan este polimorfismo. La identificación de la existencia de un polimorfismo dentro de un gen con frecuencia se hace por una única base alternativa que resulta en un sitio de restricción en ciertas formas alélicas. Un cierto alelo, sin embargo, como se demuestra y discute en la presente, puede tener un número de cambios de base asociados con éste, que puede analizarse por lo cual son indicativos del mismo polimorfismo (alelo) . Además, otros marcadores genéticos o genes pueden unirse a los polimorfismos descritos en la presente de manera que los análisis puedan implicar la identificación de otros genes o fragmentos genéticos, pero que finalmente se basan en la caracterización genética de animales para el mismo polimorfismo. Cualquier análisis que clasifica e identifica animales basados en las diferencias alélicas descritas en la presente se pretenden para incluirse dentro del alcance de esta invención. Alguien de experiencia en la técnica, una vez que se ha identificado un polimorfismo y se ha establecido una correlación a un rasgo particular, entenderá que existen muchas formas de animales de genotipo para este polimorfismo. El diseño de tales pruebas alternativas solamente representa la optimización de parámetros conocidos por aquellos con experiencia en la técnica y se pretenden estar dentro del alcance de esta invención como se describe totalmente en la presente . MATERIALES Y METODOS Pedigri, Eslabonamiento y Mapeo de QTL: Se ha generado un entrecruzamiento entre especies de puerco Berkshire y Yorkshire (BxY) produciendo la descendencia 525 F2 y se utilizó este pedigri para mapear QTL para la calidad de la carne (Malek et al., 2001) utilizando un método de mapeo de intervalo (Haley et al., 1994). En esta cruza, la especie Berkshire se eligió como considerada por tener muy buena calidad de carne, particularmente en términos de pH, color, capacidad de retención de agua y blandura. El gen PRKAG3 se mapeo al mapa del eslabonamiento de la familia BxY utilizando el programa de mapeo CRI-MAP (versión 2.4) (Green et al., 1990). El intervalo que mapea el método (Haley et al., 1994) incluyendo la información del sitio PRKAG3 se utilizó para mapear QTL para la calidad de carne para el cromosoma 15 de puerco (SSC 15) (Figura 1). Los efectos de QTL se calcularon y representaron el efecto alélico Berkshire promedio comparado al efecto alélico Yorkshire promedio. Muestras de Tejido y Aislamiento de ADN/AR : Las muestras sanguíneas y fenotipos se recolectaron y registraron en los animales F0, Fi y F2 a partir de la familia entrecruzada ( alek et al., 2001) junto con muestras sanguíneas y tejido muscular a partir del área del jamón y lomo de varios animales F3. También se obtuvo una gran biblioteca de muestras sanguíneas de cinco diferentes líneas comerciales de puercos (Landrace, Large White, Duroc, Duroc Sintético y Berkshire) . El ADN genómico se aisló de sangre total por procedimientos de salación estándares y el ARN total se extrajo del tejido muscular del jamón y el lomo utilizando . el método reactivo TRIzol de acuerdo a las instrucciones del fabricante (GIBCO/BRL, Rockville, MD) . Descubrimiento de PCR, RT-PCR, RACE y Polimorfismo: Basado en la secuencia genética de puerco PRKAG3 disponible de GenBank (AF214521), se diseñaron cebadores para amplificar las regiones de codón totales del gen PRKAG3. Las reacciones PCR se realizaron utilizando 12.5 ng del ADN genómico porcino, 1.5 mM de MgCl2, 0.125 mM de dNTP, 0.3 uM de cada cebador y 0.35 U de Taq ADN polimerasa (Promega, Madison, WI) y regulador PCR (10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KC1, y 0.1% de Triton®X-100) en un volumen final de 10 µ? . Esta trascripción inversa del ARN total (3.5 \ig) se realizó por imprimación de hexanucleótido aleatorio y Superscript II (GIBCO/BRL, Rockville, MD) de acuerdo al protocolo del fabricante (cebadores: Conjunto A, 5'ATGAGCTTCCTAGAGCAAGGAG 3' hacia delante y 5' CAGGTCTCAATCTTATGTTCTTC 3' inversa; conjunto B 5'CGTCCGAGCGGCACCTTTGT 3' hacia delante, y 5' AAGGTTCCAAGGTTCTCAGGC 3' inversa) . La Amplificación Rápida 5' de los experimentos de Extremos de ADNc (RACE) se realizaron utilizando un equipo FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Austin, TX) de acuerdo a las instrucciones del fabricante seguidas por la secuenciación de los productos PCR (cebadores específicos de gen: 5' CCCACGAAGCTCTGCTTCTT 3' externo y 5' TCCTTGCTCTAGGAAGCTCAT 3' interno) . Los amplímeros se secuenciaron utilizando exterminadores de tinte (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) en un secuenciador automatizado ABI 377. Se utilizó software Sequencher (Gene Codes Corporation, versión 4.0.5, Ann Arbor, MI) para integrar las secuencias y para identificar polimorfismos. Genotipo y análisis PCR-RFLP: La región que flanquea cada mutación equivocada analizada se amplificó utilizando el mismo par de cebadores para las sustituciones T30N y G52S (5'ATGAGCTTCCTAGAGCAAGGAG 3' hacia delante y 5' GGCTGCATGATGTTATGTGCCT 3' inversa) y un par diferente para I199V (5'GGAGCAAATGTGCAGACAAG 3' hacia delante y 5' CCCACGAAGCTCTGCTTCTT 3' inversa). Después de la asimilación con BsaHI (para I199V) , las enzimas de restricción Hphl (para G52S) y Styl (para T30N) , los productos PCR asimilados se separaron en 4% de geles de agarosa NuSieve (FMC, Rockland, ME) y se tiñeron con bromuro de etidio. Para el polimorfismo SINE, la amplificación PCR (cebadores: 5 ' GAAACTCTTCTCCCCACAGAC 3' hacia delante y 5' GGCTGCATGATGTTATGTGCCT 3' inversa) se siguió por la separación de los productos en un gel de agarosa al 1% (AMRESCO, Solón, OH) . Después de clasificar en genotipos para esos polimorfismos, todos los animales con haplotipo 2 (Tabla 6) se clasifican en genotipos también para la sustitución R200Q para incrementar la oportunidad de encontrar el alelo R o 200Q (véase Milán et al., 2000). Dos homocigosos para el alelo 200Q y cuatro portadores se encontraron y se removieron a partir de análisis estadístico adicional de manera que la mutación NR- no afectó el análisis de las otras sustituciones. Para la sustitución R200Q se utilizaron los mismos cebadores como para la mutación I199V y se realizó la digestión con la enzima de restricción BsrBI . Como una inspección final, una muestra aleatoria de aproximadamente 100 animales con diferentes haplotipos se clasificó también para la sustitución R200Q, pero ninguno de los animales transportó el alelo 200Q. Medición de rasgo fenotipico: Las mediciones fenotipicas para la familia BxY se hicieron utilizando técnicas de industria típica ( alek et al., 2001) y se incluyó pH, color y potencial glicolítico. Para los puercos de cinco líneas comerciales, los datos se recolectaron en una planta de empacado comercial y el color de la carne individual (reflectancia del lomo y el jamón - valores inferiores preferidos) y el pH del lomo y el jamón individual se recogieron después de 24 horas (valores superiores preferidos) se obtuvieron. Se obtuvieron datos no medidos para la planta de empacado del glicógeno o potencial glicolítico. Las mediciones de color y rasgos fenotípicos de pH son medidas de industria comunes de calidad de la carne que se correlacionan indirectamente con el glicógeno y el potencial glicolítico. Análisis Estadístico - Análisis de población Berkshire x Yorkshire F2. Las asociaciones entre la sustitución PRKAG3 I199V y el glicógeno, lactato, potencial glicolítico y los rasgos de calidad de la carne en la población BxY F2 se probaron utilizando procedimientos de modelos lineales generales (procedimiento SAS® GLM, SAS Institute Inc., Cary, NC) con un modelo que incluye un semental hembra, fecha de la matanza, sexo y genotipo I199V. Los medios mínimos cuadrados para todos los tres genotipos se obtuvieron para la sustitución I199V. Análisis de lineas comerciales. Las asociaciones entre los polimorfismos PRKAG3 y los rasgos de calidad de carne se probaron utilizando procedimientos de modelo mezclados (procedimiento SAS® MIXED, SAS Institute Inc., Cary, NC) con un modelo el cual siempre incluye un semental como un efecto aleatorio y fecha de matanza y el o los genotipos marcadores como efectos fijos. Se agregó la línea como un efecto fijo para cruzar los análisis de línea. El sexo y la granja no se incluyeron porque todos los rasgos se midieron en hembras únicamente y no más de una granja se representó en cada fecha de matanza. Aunque los machos no se utilizaron en esta porción del análisis, los resultados en BxY sugieren nada de sexo por el efecto genotipo. Un modelo total que incluye un efecto de genotipo separado para cada uno de los tres sitios de sustitución se adaptó a través de las cinco líneas comerciales. Los efectos de genotipo no significativos se removieron por la eliminación trasera (p para remover > .10) para identificar qué sustituciones se asociaron con efectos en los rasgos de calidad de la carne. Los medios mínimos cuadrados (LS) para las tres clases de genotipo se obtuvieron dentro de las líneas comerciales para cada una de las sustituciones individualmente analizadas. Ninguna linea para las interacciones de genotipo se encontró y por lo tanto, para mejorar la veracidad de las evaluaciones de los efectos del alelo, los datos de cinco lineas se combinaron para un análisis de lineas transversales. Los efectos combinados de las tres sustituciones se calcularon como efectos de sustitución de haplotipo. Los contrastes entre los haplotipos se calcularon de un modelo que incluye un semental (aleatorio) , día de matanza y una variable para cada haplotipo con valores -1, 0 y 1 correspondientes al animal que tiene 0, 1 ó 2 copias del haplotipo en cuestión. Los efectos de sustitución de haplotipo se presentaron como desviaciones de la media de los haplotipos y refleja las diferencias del peor y del mejor haplotipo. El número de animales utilizados en los análisis de asociación variados basados en el rasgo medido, y se listan en las Tablas 3, 4 y 5. RESULTADOS Desarrollo de Marcador y Mapeo de Eslabonamiento: Varios QTL significativos se detectaron en SSC15 (Malek et al., 2001) en la región en donde el gen PRKAG3 se ubicó (Milán et al., 2000), entre los marcadores SW1683 y S 1983 (Figura 1) . Estos QTL incluidos para contenido de glicógeno promedio y potencial glicolitico que se han reportado (Milán et al., 2000) para afectarse por el alelo PRKAG3 200Q asi como los rasgos de 24 horas de pH de jamón y lomo y 24 horas de valores de lomo Hunter L (reflectancia ligera) . El alelo favorable en este QTL, el cual interesantemente tiene un efecto aditivo (la mutación R - es dominante) se derivó predominantemente de la especie Berkshire (generalmente considerada que tiene muy buena ' calidad de carne) como se espera (Tabla 1) . El gen PRKAG3 fue el único candidato gen en esta área, basado en el desarrollo reciente de BAC contigua en la región RN porcina (Milán et al., 2000), el grado elevado de conservación de orden de eslabonamiento del mapa porcino en esta área con el mapa de copia humana (Jeon et al., 2001) y el mapa de genoma humano desarrollado recientemente (Lander et al, 2001) . Se probaron primero los animales fundadores, dos sementales Berkshire y nueve sementales hembras Yorkshire, para la sustitución RN-publicada (R200Q) . Todos los animales fundadores tuvieron el alelo rn+ (200R) . Al secuenciar la región de código completo del gen PRKAG3 en fundadores de la familia BxY y en cuatro F3 individuales con valores extremos para la calidad de la carne, se identificaron tres mutaciones equivocadas. Estos son las sustituciones T30N y la I199V previamente descritas (Milán et al., 2000) y una nueva mutación de sentido erróneo (G52S) . Otra sustitución sin sinónimo (P53L) encontrada por Milán et al. (2000) no se encontró para segregarse en los fundadores de la familia BxY en donde fueron todos 53P.

Debido a la falta de información en 5'UTR, se utilizaron RACE para encontrar la secuencia de flanqueo 5' completa y la organización genética en esa región. Un polimorfismo SINE intrónico se descubrió que inicia 79pb corriente arriba del codón inicial pero éste se presentó únicamente en tres hembras mayores Yorkshire. Basadas en las diferencias en la frecuencia de alelo de cada sitio entre los fundadores de la familia entrecruzada, se consideraron las sustituciones G52S y I199V como los más probables candidatos para la calidad de la carne QTL reportados previamente. Al utilizar la sustitución I199V se mapeo el gen PRKAG3 en el mapa de eslabonamiento BxY a una posición por debajo del o de los picos amplios de QTL para el glicógeno, lacto y potencial glicolitico y pH de 24 horas (Figura 1) . Después de agregar la información PRKAG3 I199V la longitud del mapa y el orden marcador en SSC15 fue el mismo como en Malek et al. (2001). El re-análisis de QTL que incluye PRKAG3 I199V (Figura 1) provocó pequeños cambios en el valor F y la ubicación de los picos QTL en SSC 15 (de 0 a 3 cM) cuando se comparó con los resultados de Malek et al. (2001). Estudio de Asociación F2: Al utilizar un análisis de asociación, se encontraron efectos significativos de todas las tres sustituciones (T30N, G52S y I199V) en glicógeno promedio y contenido de lactato y también en potencial glicolitico en la población F2 BxY (datos mostrados únicamente para la sustitución I199V - Tabla 2) . Los mayores efectos significativos se revelaron para la sustitución I199V para la mayoría de los rasgos analizados, incluyendo glicógeno y contenido de lactato y potencial glicolítico medidos, pero también en algunos de los rasgos de calidad de la carne asociados con estas medidas. De los datos F2, los alelos 30T, 52G y 1991 fueron favorables en términos de la calidad de la carne. Dado el gran desequilibrio de eslabonamiento esperado en el entrecruzamiento éste fue necesario para investigar y confirmar los efectos de estas mutaciones en varias lineas comerciales cruzadas de puercos para determinar si este gen es probable para implicarse directamente en la variación observada en la calidad de la carne . Análisis de Poblaciones Comerciales: Las frecuencias genotípicas para las sustituciones analizadas se presentan en la Tabla 3. Para todas, los tres sitios de sustitución, la línea Berkshire tuvo una elevada frecuencia para los genotipos asociados con bajo contenido de glicógeno (y elevada calidad de la carne) en el músculo esquelético basado en los datos BxY F2. Las otras poblaciones comerciales tienen bajas frecuencias de los alelos favorables con esto siendo particularmente marcados para la sustitución I199V cuando se comparan con la población Berkshire.

Las mutaciones PRKAG3 y sus asociaciones con la calidad de la carne se probaron para cada una de las cinco lineas comerciales y también por todas las lineas. La eliminación trasera de los sitios de sustitución, en el análisis de lineas transversales, mantuvo I199V en el modelo para todos los seis rasgos, G52S para pH de jamón, pH de lomo, lomo Minolta L y lomo Minolta b y T30N se mantuvo para jamón Minolta L, lomo Minolta L y jamón Minolta b. Debido a que cada una de las sustituciones mostró distintas asociaciones con al menos tres de los rasgos, los efectos de cada una de las sustituciones se calcularon independientemente. Los mínimos cuadrados se calcularon de las lineas transversales de los medios del genotipo (Tabla 4) y dentro de la línea (Tabla 5) mostraron efectos significativos entre las sustituciones analizadas y las mediciones de la calidad de la carne, sugiriendo que varios alelos rn+ (nuevos) adicionales pueden existir. El estudio de asociación reveló que los más grandes efectos atraviesan las líneas (Tabla 4) y también dentro de las líneas (Tabla 5, datos mostrados únicamente por I199V) se obtuvieron con la sustitución I199V para todos los rasgos analizados. Para esta sustitución las asociaciones fueron altamente significativas (p<0.0005) para todos los rasgos de calidad de la carne utilizados en este estudio cuando se analizaron a través de lineas. Las asociaciones significativas con al menos uno de los rasgos se revelaron por la misma sustitución dentro de cada una de las líneas individuales, con efectos altamente significativos para jamón Minolta b en Duroc y Duroc Sintético y para pH de lomo en Duroc Sintético. Estas dos especies (Duroc Sintético, Duroc) tienen la mejor distribución de frecuencia para análisis de asociación con un número suficiente de animales para cada genotipo (Tabla 5) . En el análisis de líneas transversales y la mayoría de los resultados de línea individual, los efectos estuvieron en la misma dirección para todos los rasgos con el alelo 1991 siendo el alelo favorable para la calidad elevada de la carne. Los efectos significativos, aunque más pequeños cuando se comparan al I199V, se revelaron por la sustitución T30N en cinco de los rasgos cuando se analizan a través de las líneas (Tabla 4) . Dentro de los análisis de línea de los efectos revelados T30N al menos exclusivamente en poblaciones Duroc y Duroc Sintético (datos no mostrados) . En la mayoría de las situaciones, los efectos estuvieron en la misma dirección, el alelo 30T siendo asociado con una mejor calidad de carne. Para la sustitución G52S, los efectos significativos (p<0.05) se identificaron para únicamente dos de los rasgos (pH de jamón y lomo Minolta L) en análisis de líneas transversales, y un diferente alelo se identificó como favorable para aquellos rasgos. Dentro del análisis de linea de asociaciones significativas reveladas para sólo la población de Duroc Sintético para clasificaciones de color Minolta de lomo (datos no mostrados) . En las cinco poblaciones comerciales que se probaron, se encontró sólo cuatro haplotipos (Tabla 6) . La población Berkshire es la menos polimórfica, teniendo haplotipo 3 (30T-52G-199I) a una frecuencia elevada (0.87). En el haplotipo Blanco Grande 2 (30T-52S-199V) es el más frecuente y el haplotipo 1 (30N-52G-199V) tiene la más elevada frecuencia en las poblaciones Landrace, Duroc and Duroc Sintético. El haplotipo 4 (30T-52G-199V) tiene la más baja frecuencia en todas las poblaciones. Los efectos de sustitución de haplotipo para cada linea y lineas transversales se calcularon como la desviación del promedio de los cuatro haplotipos (Figura 2) . A través y dentro de los análisis de linea se mostraron grandes diferencias entre haplotipos de pH de jamón y mediciones de color que para los rasgos del lomo. Para el pH de jamón, a través y dentro de los análisis de linea se mostró el haplotipo 3 que tiene el más elevado efecto el cual fue significativamente diferente de cada uno de los otros haplotipos en el análisis de lineas transversales (p <.0005) y de al menos otro haplotipo en cada análisis de linea individual (p<.05) . El haplotipo 2 fue el siguiente mejor para la mayoría de los rasgos y lineas con haplotipos 1 y 4 tendiendo a ser el peor con respecto a la calidad de la carne. Esta jerarquía no se evidencia en la población Berkshire, en donde las diferencias significativas son únicamente vistas con el haplotipo 4 el cual tiene el valor más bajo, correspondiendo al resultado de líneas transversales. Los resultados no significativos en Berkshire son aptos para estar debido en parte al bajo nivel de polimorfismo en esta especie y el número concomitante muy bajo de observaciones para los haplotipos 1 y 4. La evaluación para el haplotipo 4 en la población Duroc Sintético parece ser diferente a aquel en las otras líneas (especialmente para el pH de jamón en donde es significativamente más elevado que el haplotipo 2 (p <.05) y el haplotipo 1 (p <.01), pero la frecuencia del haplotipo 4 en esta población fue muy baja (0.07). La naturaleza sintética de esta línea (aunque su comienzo fue seis generaciones atrás) también proporciona la oportunidad para extender el desequilibrio de eslabonamiento extendido para estar presente, incrementando la oportunidad para los sitios unidos para contribuir a los efectos de sustitución de haplotipo . Los resultados de haplotipo para las clasificaciones Minolta estuvieron en línea con los resultados del pH. El haplotipo 3 se encontró generalmente que tiene el efecto favorable (clasificaciones de color inferiores) . Existen pocas excepciones en los resultados de las lineas individuales y estas pueden ser el resultado de la muestra. La única desviación significativa es con el haplotipo 2, que se asocia con una clasificación Minolta b inferior en Berkshire (p <.05). En el análisis de línea transversal, el haplotipo 2 fue segundo al haplotipo 3 en la mayoría de los casos. DISCUSIÓN Los resultados reportados en este trabajo proporcionan evidencia importante a favor de la presencia de nuevos alelos del gen PRKAG3 afectando los rasgos de calidad de la carne. Esta conclusión se basa en tres puntos: 1) el efecto conocido de los alelos PRKAG3, rnT y RN" en la calidad de la carne. 2) observación de varios QTL para rasgos de calidad de la carne relacionados descubiertos en SSC15 en la región en donde PRKAG3 se ubica en la familia BxY. Estas QTL se descubrieron en esta cruza de puerco en donde la sustitución R200Q original no estaba segregándose y 3) los resultados presentados aquí en la asociación entre las sustituciones PRKAG3 y el glicógeno y el contenido de lactato, el potencial glicolitico y los rasgos de calidad de la carne en la población BxY F2 y con los rasgos de calidad de la carne en varias líneas de puerco comerciales no relacionadas.

Los análisis en asociación de las sustituciones individuales revelaron que, de los tres estudios aquí, la sustitución I199V mostró las más significativas y grandes diferencias en los rasgos de calidad de la carne. Por ejemplo, los análisis BxY F2 mostraron diferencias significativas entre las clases de genotipo I199V para el potencial glicolítico, pero también en glicógeno y contenido de lactato (Tabla 2) . Los efectos importantes se revelaron también para la mayoría de los rasgos de calidad de la carne analizados. El alelo 1991 se encontró estar asociado con un nivel inferior de glicógeno, lactato y potencial glicolítico, pH de jamón y lomo elevado y con mejores clasificaciones de color. Este marcador fue suficientemente informativo en BxY F2, para proporcionar buena evaluación de los efectos de alelo. En los análisis de las poblaciones comerciales, la sustitución I199V se asocia con diferencias significativas en medios LS entre las clases homocigosas hasta a 0.14 en la línea Landrace y 0.10 a través de las líneas para el pH de jamón (Tablas 4 y 5) . Para una de las mediciones de color de carne, Jamón Minolta L, las diferencias de medios LS significativos se encontraron entre genotipo homocigosos de hasta 3.5 unidades de reflectancia (en Landrace) y 2.0 a través de las líneas. Estos efectos están en el rango de 0.5 a l desviación estándar fenotípica. Diferencias importantes se revelaron también para los otros rasgos y especies. Efectos de esta magnitud en rasgos importantes para la calidad de la carne total son de gran interés para la industria de la reproducción de animal. Aparte de I199V, grandes efectos se calcularon también del análisis de sustitución único de T30N. Sin embargo, únicamente efectos modestos de la sustitución T30N permanecían si I199V también se incluía en el análisis. Desequilibrio de eslabonamiento fuerte entre sitios 30 y 199, se considera que es principalmente responsable para los efectos detectados para el sitio 30. Pequeños efectos, que no fueron significativos, se observaron para el único análisis del sitio de G52S. El análisis de haplotipo ayudó a analizar los efectos de las sustituciones sin sinónimos y proporcionar evidencia adicional para un efecto en la posición 199 así como 52. El haplotipo 3, el cual es el único haplotipo que contiene 1991, fue el más favorable haplotipo con respecto al pH y mediciones de color de carne. En la mayoría de las situaciones probadas, el haplotipo 2, el cual es el único haplotipo que contiene 52S, mostró un valor intermediario, especialmente para los rasgos de calidad del jamón donde las diferencias en efectos fueron más significativos y más grandes que en otros rasgos. Los valores para los haplotipos 1 y 4 se unen en el fondo del rango y en la mayoría de los casos no son significativamente diferentes de las otras. La observación que los valores de estos dos haplotipos (1 y 4) son relativamente similares para la mayoría de las estimaciones hace concluir que la sustitución T30N es únicamente para realizar una contribución marginal para la variación de la calidad de la carne. En la línea transversal, los análisis Landrace y Large White, en donde la frecuencia del haplotipo 4 es arriba de 0.10, se encontró un efecto favorable de haplotipo 1 en las clasificaciones de jamón Minolta (este haplotipo siendo asociado con la variante 30N) cuando se compara con el haplotipo 4. En las otras poblaciones, las diferencias entre estos efectos de haplotipo se estiman deficientemente debidas a muy baja frecuencia del haplotipo . Las diferencias entre el haplotipo 4 y el haplotipo 2 es únicamente en el sitio G52S. Los efectos de haplotipo 4 y 2 son significativamente diferentes para el pH y las clasificaciones Minolta L en el lomo y jamón en el análisis de líneas transversales y para varios rasgos de las líneas individuales, más notablemente la Large White. El haplotipo 2 (el cual contiene 52S y codifica una serina) es favorable sobre el haplotipo 4 (el cual contiene 52G y codifica una glicina) . Esto es lo opuesto de lo que se encontró en el estudio BxY en donde 52G se pronosticó para ser el alelo favorable. El desequilibrio de eslabonamiento fuerte con el sitio I199V, debido al número limitado de fundadores de F2, puede tener enmascarado el efecto verdadero de la sustitución G52S en esta población. De manera interesante, el análisis individual de G52S no mostró ningún efecto para más rasgos y lineas. Ese análisis compara el haplotipo 2 con los otros tres combinados. Puede verse a partir de la Figura 2 que una mezcla de los otros tres haplotipos pueden, dependiendo de las frecuencias del haplotipo, resultar en un valor medio cercano de ése del haplotipo 2 de manera que una diferencia no seria detectada cuando G52S se analiza individualmente, cuyos puntos fuera del valor del análisis basado en el haplotipo . La variante 30T, presente en el haplotipo 4, se encontró que es favorable para la calidad de la carne basada en el único análisis del sitio, siendo asociada con efectos significativos en las líneas Duroc y Duroc Sintético para la mayoría de los rasgos. En estas dos poblaciones el haplotipo 3 tiene una frecuencia moderada (Tabla 6) y contiene ambas variables al 30T y la 1991 favorable. Así, la variante 1991 contribuye a efectos más elevados para la variante del sitio 30T debido al desequilibrio de eslabonamiento. Se concluye que los análisis en conjunto de sustituciones y los análisis de haplotipo demuestran la presencia de tres sustituciones sin sinónimos en el gen PRKAG3 con diferentes efectos de tamaño en las mediciones de la calidad de la carne en los puercos. Este modelo interesante de "un gen - varios polimorfismos - diversos fenotipos" se basa en los efectos aditivos distintos en un rasgo fenotipico complejo y puede servir como un modelo para futuros estudios con otros rasgos. La presencia de múltiples alelos como una consecuencia de mutaciones consecutivas en un gen bajo la selección ha sido también propuesta recientemente en puercos (Jeon et al., 1999; Nezer et al., 1999). La sustitución I199V es un dominio de cistationina beta-sintasa (CBS) , una región muy conservada en genes de esta familia (Milán et al., 2000). El papel del dominio CBS es aún incierto pero se sugiere para w implicarse en la apuntación citoplásmica (Pontig, 1997), interacción de proteina-proteina (Bateman, 1997) y/o regulación (Bateman, 1997) de la actividad de la proteina. Existen cuatro dominios CBS en el gen PRKAG3 (Milán et al., 2000) y la sustitución I199V se ubica en el primero y más conservado dominio. El alineamiento entre el dominio CBS y el péptido ?3 obtenido utilizando software Pfam, reveló que el aminoácido preferido en esta posición es isoleucina (el resultado no se muestra) . De manera interesante en este estudio, el alelo 1991 (que codifica isoleucina en el sitio 199) se encontró estar asociado con mejor calidad de la carne en poblaciones comerciales y la familia BxY F2 y también en niveles inferiores de glicógeno, lactato y potencial glicolitico en el último. Milán et al. (2000) muestra que la variante 200Q (RN~) se encuentra siempre con 199V. Sin embargo, 199V se encuentra con ambos 200R y 200Q y 1991 se encuentra siempre con 200R. Como únicamente tres, nucleótidos separan estos sitios de sustitución, la probabilidad de recombinación entre ellos es extremadamente pequeña. Por esta razón, se considera R200Q ser la más reciente sustitución, una hipótesis también sostenida por la presencia de esta mutación únicamente en la especie de puerco Hampshire. Ambos de los haplotipos 199V-200R y 199I-200R podrían ser ancestrales, porque cada uno se ha identificado en la mayoría de las especies analizadas a la fecha (Milán et al., 2000) incluyendo jabalís y varias especies del suborden Suisformes (Ciobanu et al., resultados no publicados) . El haplotipo 199V-200R se asocia con el contenido de glicógeno elevado y pH de jamón/lomo post mortem inferior cuando se compara con el haplotipo 199I-200R (datos BxY F2) . La sustitución en el codón 199 presumiblemente conduce a un efecto en el metabolismo de glucosa y por lo tanto un incremento en el contenido del glicógeno de músculo. El tercer haplotipo 199V-200Q confiere el fenotipo RN~. El efecto asociado 199V-200Q en el contenido de glicógeno es mayor que el efecto de otros haplotipos y el haplotipo 199V- 200Q es dominante sobre los otros. Por estas razones, se sugiere que el fenotipo RN~ podría ser un efecto combinado del haplotipo 199V-200Q en lugar de ser únicamente un resultado de la sustitución R200Q. Este efecto podría provocarse por la modificación del dominio CBS por estas sustituciones. Las funciones exactas de las subunidades reguladoras ß y ? del AMPK son aún inciertas. Sin embargo, se conoce que ambos son esenciales para la actividad de la cinasa (Hardie and Carling, 1997) . Los experimentos in vitro muestran que la subunidad ß puede tener un importante papel en la formación de la estructura heterotrimérica de AMPK, como ß interactúa con ambas de las subunidades ? y a que no interactúan directamente entre sí ( oods et al., 1996). Evidencia reciente sugiere que el sitio de unión AMP alostérico puede implicar ambas subunidades ? y a del complejo AMPK (Cheung et al., 2000). Cheung et al. (2000) propone un modelo elegante en donde, en la ausencia de AMP, el complejo heterotrimérico puede estar predominantemente inactivo sin interacción entré las subunidades ? y a. En esta situación de fosforilación del sitio Thr172 en la subunidad a y la interacción con los sustratos, se bloquea por la región autoinhibidora de la subunidad a. En la forma activa de AMPK la interacción entre la región autoinhibidora a y uno o más dominios ? CBS evita la autoinhibición, y AMP se une en ambas subunidades para estabilizar el ensamble (Cheung et al., 2000) . La información de alineamiento, el modelo propuesto de la regulación del complejo AMPK y también la presencia del sitio R200Q cercano, soporta la hipótesis de un posible papel de la sustitución I199V en la actividad de AMPK. Aunque la estructura molecular del complejo AMPK no ha sido resuelta aún, se hizo hipótesis que el cambio de aminoácido, puede también influir en la estructura y actividad de la enzima resultante en el efecto observado de la sustitución G52S. Aunque la subunidad 73 es altamente expresada en el músculo esquelético. La actividad AMPK parece asociarse más con las isoformas Yi y 72 (Cheung et al., 2000). Sin embargo, en un mecanismo aún no entendido, la sustitución R200Q (o combinación I199V-R200Q) en el gen PRKAG3 provoca importantes diferencias en la actividad AMPK en puercos Hampshire (Milán et al., 2000) que sugieren que la isoforma ?3 tiene un papel importante en el metabolismo de glucosa en el músculo esquelético. Los estudios funcionales detallados de las combinaciones de diferente subunidad serán necesarios para resolver la situación. El papel de AMPK en el metabolismo de glucosa realiza el sentido fisiológico, basado en las comparaciones con el complejo SNF1 relacionado de la levadura. También, varios estudios muestran que AMPK participa en el metabolismo de glicógeno por: inactivación de glicógeno sintasa (Carling and Hardie, 1989; Poulter et al., 1998; Zhang et al., 1993), activación del óxido nítrico sintasa (Fryer et al., 2000) y por incrementar la translación del transportador 4 de glucosa a las membranas de plasma (Hayashi et al., 1998; Kurth-Kraczek et al., 1999; Bergeron et al., 1999; Holmes et al., 1999). Aunque los efectos de las sustituciones reportados aquí en las medidas de la calidad de la carne son de menor magnitud que aquellas de la mutación RN" dominante, son de importancia biológica y económica. En particular esos alelos se segregan en todas las líneas comerciales y especies analizadas a la fecha en contraste con la mutación RN", que se asocia únicamente con la especie Hampshire y tiene uso limitado en la mayoría de los programas de producción de la carne de puerco. Los resultados reportados aquí para PRKAG3 también sugieren que los especialistas en genética deben buscar mutaciones adicionales con un impacto económico en genes conocidos para provocar más efectos drásticos ambos dentro y entre las especies. Esta opinión se sustenta por reportes de mayores efectos asociados con otros genes fuera de las especies objetivo o la raza, por ejemplo, grandes efectos de mutaciones MC4R en ratones (Huszar et al., 1997) y humanos (Yeo et al., 1998) y a un grado menor en puercos (Kim et al. , 2000) . La identificación de genes novedosos con significado bioquímico en especies animales proporcionará también información útil para los objetivos biomédicos humanos. Este conocimiento se mejora cuando nuevos e interesantes alelos se descubren. En el caso de PRKAG3, se ha sugerido (Milán et al., 2000) que este gen, y otros genes relacionados AMPK en humanos, son candidatos interesantes para diabetes del tipo II en humanos, basada en su función y ubicaciones QTL. Por esta razón el efecto de estos nuevos alelos puede proporcionar nuevas visiones acerca de los factores de potencial que afectan el metabolismo de glucosa y debe considerarse en investigaciones adicionales de esta enfermedad. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan por este medio en su totalidad para referencia, incluyendo, pero no limitándose a lo siguiente: Bateman, A., 1997 The structure of a domain common to archaebacteria and the homocystinuria disease protein. Trends Biochem. Sci . 22: 12-13. Bergeron, R., R. R. Russell 3rd, L. H. Young, J. M. A. Ren, M. Marcucci et al., 1999 Effect of AMPK activation on muscle glucose metabolism in conscious rats. Am. J. 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Tabla 1. Evidencia para QTL significativa en el nivel de modo de cromosoma para diversos rasgos de calidad de la carne para el cromosoma 15 de puerco.

Ubicación Aditivo Dominio Variación Rasgo Valor-F" (cM) Efecto b SJ¡. Efecto SJ). <%) Glicógeno Promedio" 7.74 69 -0.70 0.21 0.65 0.03 3.52 i X Lactato Promedio" 4.50 69 -2.24 0.79 -1.10 1.16 2.00 Glioitico Promedio" 6.37 69 -3.63 1.02 0.18 1.50 4.69 Potencial"1 PH de Jamón 24 horas 8.42* 72 0.06 0.01 -0.02 0.02 4.00 PH de Lomo 24 horas 12.21** 78 0.05 0.01 -0.01 0.02 6.61 aUmbrales estadísticos F de modo Cromosoma en el nivel de 5%, como se determinó por la prueba de permutación fue 5.02. b Efectos QTL del aditivo (a) y dominio (d) corresponden a los valores de genotipo de +a, d y -a, respectivamente, para individuos que tienen heredados dos alelos Berkshire, heterocigosos e individuos con dos alelos Yorkshire. Los efectos aditivos positivos indican que los alelos Berkshire incrementan los rasgos, negativo que los alelos Berkshire lo disminuyan. Los efectos de dominio son relativos a la media de los dos homocigotos . c% Variación = variación genética en QTL basado en el aditivo evaluado y efectos de dominio y frecuencias de alelo de ½, como un porcentaje de la variación residual en F2. d unidades de medida - umol/g * Significativa en el nivel de modo genómico al 5% (F>8.22) ** Significativa en el nivel de modo genómico al 1% (F>9.96) Tabla 2. Resultados de asociación entre los genotipos en el sitio de sustitución I199V del gen PBKAG3 y los rasgos de la calidad de la carne en animales Berkshire x Yorkshire F2. I199V RASGOS ? XX Glicógeno Promedio 8.01(0.31)= 9.10(0.24)* 9.37 (0.33)* Lactato Promedio 84.83 (1.17)· 86.83 (0.91)· 90.64????* Promedio Glicolítlco 100.84(1.60)·^ 106.02(1.17)» 109.28(1-64)*· Potencial PH de Jamón 6.91(0.02)» 6.89 (0.02) B.84(0.02)d Empacado en la Planta PH de Lomo 6.80(0.02)· 5.76 (0.01)*· 6.71 (0.02)» Empacado en la Planta PH de Lomo de Laboratorio 6.86 (0.02)··· 6.80(o.oiy 5.77 (0.02)**» Lomo Minolta de Laboratorio 21.54(0.29)° 22.11(0.22) 22.76(0.31* Lomo Hunter 44.17(0.41)* 46.07(0.32) 46.49 (0-46 Empacado en la Planta Lomo Hunter de Laboratorio 46.56 (O.SO 47.07 (0.23) 47.70 (0.33)»> Los siguientes rasgos no fueron significativos en p<.05: Jamón Minolta de Lab, Jamón Hunter de Lab, y Lomo Minolta Empacado en la planta. Los medios mínimos cuadrados se calcularon para cada rasgo y se presentaron con errores estándares de los calculados entre paréntesis. El número de animales en cada clase genotipica son: n =131 (II), 260-265 (IV), y 111-113 (W) . Diferencias significativas entre los cálculos de mínimos cuadrados se indican con superescritos de 2-letras: a-b p<.05, c-d p<.005, e-f p<.0005. Un cálculo con superescrito "a" es significativamente diferente del o de los cálculos con superescrito wb", lo misma para c-d y e-f en sus niveles de significado respectivos. Tabla 3. Frecuencias Genotípicas para sustituciones T30N, G52S e I199V en el gen PKKAG3 en cinco especies de puerco comerciales .

SNP Genotipo IiKndxaoe Larga Duroc Duroc White Sintético T80N TT 0.27 0.69 0.89 0.34 0.37 TN 0.60 0.29 0.11 0.46 0.48 NN 0-23 0.02 0.00 0.20 0.16 n 656 404 103 298 627 G62S SS 0.07 0.19 0.00 0.02 0.03 SQ 0.42 0.49 0.10 0.25 0.24 GG 0.61 0.32 0.90 0.73 0.73 n 560 409 91 267 649 I199V ? 0.02 0.07 0.74 0.17 0.14 IV 0.23 0.31 0.25 0.44 0.47 w 0.76 0.62 O.O 0.39 0.39 n 569 376 89 260 578 Tabla 4. Resultados de asociación entre los genotipos en los sitios de sustitución T30N, GS2S e I199V del gen PRKAG3 y los rasgos de la calidad de la carne a través de cinco especies de puerco comerciales.

T80N G628 I199V RASGOS ?G rs N SO aa ? IV W PH del Jamón 6.76(1)1) · 5.71 (.01) *» 6.69 (.01) » 6.77 (.02) · 6.74 (.01) 6.74 (.01)» 6.81 (.01) · 5.74 (.01) * ' 5.71 COI)' n 461 606 176 76 878 669 128 876 659 PH del Lomo 6.74 (.01)*· 5.78 (.01) ' 6.70 COI)** 6.74 (.01) 6.78 (.01) 5.78 (.01) 6.78 (.01) · 5.74 (.01) * ' 6.71 (.01) ' n 772 766 256 185 620 1054 199 614 922 Jamón Minolta L 45.9 (.26)*· 4ß.? (.26) ' 47.2 (.86) ' 45.6 (.49) 46.2 (Jt9) 46.5 (.25) 44.9 (.88) * 46.5 (.27) * 46.9 (.26) ' n 462 509 176 76 879 662 126 876 561 Lomo Minolta L 44.8 (.17) · 44.8 (.18) · 45.8 (.24) » 45.6 (.80) · 45.0 (.19) k 44.9 (.16) * 44.2 (.26) · 44.7 (.18) · 45.2 (.18)" n 774 790 260 186 622 1060 200 615 925 Jamón Minolta b 4.18 (.10) *· 4.48 (.10) ** 4.79 (.14) <» 4.05 (.19) 4.28 (.11) 4.40 (.10) 8.68 (.15) · 4.81 (.10) *' 4.70 (.10) ' n 459 604 175 75 876 656 128 878 554 Lomo Minolta b 8.84 (.06) 8.48 (.06) 8.49 (.08) 3.46 (.10) 8.42 (.06) 8.84 (.05) 8.16 (.08) · 8.81 (.06) · 8.49 (.06) " n 765 777 266 181 610 1650 188 609 906 Se calcularon los medios mínimos cuadrados para cada sitio de sustitución individualmente y se presentan con errores estándares de las evaluaciones entre paréntesis. Las diferencias significativas entre los cálculos de medios mínimos cuadrados (dentro de un sitio de rasgo y sustitución) se indican con los superescritos de 2 letras: a-b p<.05 c-d p<.005, e-f p<.0005. Una evaluación con superescríto "a" es significativamente diferente en p<.05 de la o las evaluaciónes con el superescríto "b", lo misma para c-d y e-f en sus niveles de significado respectivos.

Tabla d. Resultados de asociación entre los genotipos en el sitio de sustitución I199V del gen PRKAG3 y los rasgos de la calidad de la carne dentro de las cinco especies de puerco comerciales.

PH del Jamón Jamón Minolta L Jamón Minolta b Genotipo n 17 W ? IV W ? IV W X_UK-XS09 5.82 05)*· 6.72 (.01)» 6.66 (.01)** 444 (1-6)· 47.2 C46) 47.8084)» 8.74062) 4^7018) 4.57018) n 6 74 242 6 74 242 6 74 288 LaxgaWbJl» 5.75 (.06) 6.70 (.02) 6.67 (.02) 44.4 (L8) 46 A (.61) 46.8058) 8.28 (.48)** 4.880S¾* 4.88 (.19)* n 9 66 109 9 56 111 9 55 109 Betkahin 6.91 (.08) 5.89606) 5.69 015) 42.4 (.65) 448(1.1) 45.0 (8.0) 8JH 26) 4.84050) 8.20 (1.8) n 88 10 1 28 10 1 28 10 1 Duna 5.77 08) 5.69 (.02)» 8.ßß (.02)* 48.0 (.78)» 47.9 C*8)* 47.9 CB8)> 8.29029)· 4.48018/ 4.68 (.21 n 83 68 78 88 88 78 88 87 78 Duroc Sintético 5.74 (.08)· 6.70 COI) 5.67 OI)* 47.8 (.60)· 48.0 (89) 49.0 C41J» 4.58028)· 4.42015)· 5.16 (.1*)" n 68 148 129 62 148 129 62 147 128 PH del Lomo Lomo Minolta L Lomo Minolta b Genotipo ? IV W p rv W ? IV w Lancino* 6.76 (.04)· 5.71 COI) 6.69 COI)» 4L5 C95)* 44.8081)» ??(3 2.52 081) 2,98000) 8.04 (.06) B 11 189 896 11 128 899 9 129 887 5.78 (.08)· 6.69 (.01) 5.66 (.01)» 44.7 (.71) 44.60*6) 44.9 080) 8.81 0*8) 8.06 (.12) 8-20 (10) n 28 110 224 22 110 224 22 105 217 Berfcehtr» 5.88 (.02)» 5.80 (.08)» 6.70 (.18) 44.4 (.46) 46.6086) 44.4 (8 J) 8.49017) 8.81 (.29) 2.65 i) n 65 20 1 56 20 1 58 20 1 Duna 5.76 (.02) 6.74 COI) 5.71 (.02) 44.8 (.68) 46.1 (.89) 45 J 0*6) 8.16 080) 8.86 (.12) 8.60 C O n 86 104 90 86 108 90 86 108 90 Duroc Sintético 5.78008)·" B.72(.01) e.68 r* 45.6 041)· 46.7084)· 46JK26)M 8.86018)· 8.52 (.08)· 8.88 C06)* n 76 251 209 76 258 211 75 252 211 Se calcularon los medios mínimos cuadrados para el sitio de sustitución I199V individualmente y se presentan con errores estándares de las evaluaciones en paréntesis. Las diferencias significativas (dentro de un sitio de línea y sustitución) se indican con superescritos de 2 letras: a-b p<.0S, c-d p<.005, e-f p<.0005. Una evaluación con superescrito "a" es significativamente diferente en p<.05 de la o las evaluaciones con superescrito "b", lo mismo para c-d y e-f en sus niveles de significado respectivos.

Tabla 6. Frecuencias de haplotipo para las sustituciones T30N, G52S y I1 9V en el gen PRKAG3 en cinco especies de puerco comerciales . ahaplotipo 1: 30N-52G-199V; haplotipo 2: 30T-52S-199V; haplotipo 3: 30T-52G-199I; haplotipo 4: 30T-52G-199V bN - número de animales utilizados en el análisis de asociación de haplotipo. EJEMPLO 2 De acuerdo con la invención, y bastante sorprendente, los alelos PRKAG3 mostraron también tener una asociación significativa con el tamaño de carnada en los animales. La invención en esta modalidad particular se relaciona a marcadores genéticos para tamaño de carnada en animales. Esto proporciona un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para producir una carnada más grande cuando se engendró identificando la presencia o ausencia de un polimorfismo en el gen PRKAG3 que se correlaciona con el tamaño de carnada incrementado. Como se usa en la presente, el término "tamaño de carnada incrementado" significa un incremento biológicamente significativo en el tamaño de la carnada acerca de la media de una población dada. Una asociación entre el genotipo PRAG3 y el tamaño de la carnada. El polimorfismo en el codón 199 de PR AG3 se utilizó en el genotipo del semental hembra con datos del tamaño de carnada. Se utilizaron dos lineas, correspondientes a una linea Landrace (A) y una linea Duroc Sintético (B) que se encontró previamente que tenían una asociación entre este polimorfismo y los rasgos de la calidad de la carne. Los datos se analizaron de acuerdo a los primeros registros de paridad y todas las paridades (Tabla 7) .

Una asociación estadísticamente significativa (p<0.05) se encontró entre el genotipo y los rasgos del tamaño de la carnada (número total nacido, número de nacimientos vivo) para la línea B en la Primera Paridad (Tabla 8) . El heterocigoso se encontró que tiene el tamaño de carnada más grande, además del genotipo 11 tuvo más grandes carnadas que el homocigoto 22 (p<0.3) sugiriendo una ventaja para los sementales hembra que portan al menos una copia del alelo 1. De manera interesante, un efecto similar parece ser visto en la línea A, aunque las diferencias en esta línea no alcanzan significancia estadística, posiblemente debido a los bajos números de observaciones. Sin embargo, la diferencia entre el heterocigoto y el genotipo 22 en donde existen enfoques de observaciones de significado estadístico (p<0.1) para números nacidos vivos. Efectos similares se ven a través de todos los conjuntos de datos de paridades para ambas líneas. En este caso el efecto en la Línea A para el número total de nacidos tiene un significado de genotipo de p<0.08.

Tabla 8 Análisis de los rasgos de reproducción Los niveles de significancia de los medios LS : a - b p<0.30; c - d p<0.10; e - f p<0.05; g - h p<0.01; i - j p<0.005. PROTOCOLOS DE PRUEBA PCR: Prueba PRKAG3-30 PCR-RFLP Polimorfismo Styl Cebadores RF1 - 5'ATG AGC TTC CTA GAG CAA GGA G 3' R 52R2 - 5'GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3' Condiciones PCR Mixl Regulador 10 x PCR 1.0 µ? MgCl2 (15 mM) 1.0 µ? dNTPs (2mM) 1.0 µ? cebador Rfl 0.25 µ? cebador RN52R2 0.25 µ? Polimerasa Taq 0.07 µ? ddH20 5.43 µ? ADN genómico 1 µ? Combinar Mixl y ADN en un tubo de reacción. Revestir con un aceite mineral. Operar el siguiente programa PCR: 94°C durante 4 minutos; 35 ciclos de 94°C durante 45 segundos, 59°C durante 45 segundos y 72°C durante 45 segundos; seguido por una extensión final a 72°C durante 12 minutos . Comprobar 3 µ? del PCR en un gel de agarosa al 2% para confirmar el éxito de la amplificación y la limpieza del control negativo. El tamaño del producto es 270pb. La asimilación puede realizarse por el siguiente procedimiento : Reacción de asimilación Styl Productos PCR 3 µ? Regulador NE 3 1 µ? BSA (10 mg/ml) 0.1 µ? Styl (lOU/µ?) O .3 µ? ddH20 5.6 µ? Realizar un cóctel del producto PCR, regulador, enzima y agua. Incubar durante 2 horas a 37 °C. Mezclar el producto asimilado con tinte de carga (1:6) y operar en un gel de agarosa al 4%. Genotipos : 11 - 198 y 72 pb -AAC/AAC 12 - 198, 181, 72 y 17pb -AAC/ACC 22 - 181, 72 y 17pb -ACC/ACC Prueba de polimorfismo PRKAG3-SI E (Elemento Entremezclado Corto) Cebadores RP1F -5' GAA ACT CTT CTC CCC ACA GAC 3' RN52R2 -5' GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3' Condiciones PCR Mixl Regulador lOx PCR 1.0 µ? MgCl2 (15 mM) 1.0 µ? dNTPs (2 mM) 1.0 µ? cebador RP1F 0.25 µ? cebador R52R2 0.25 µ? polimerasa Taq 0.07 µ? ddH20 5.43 µ? ADN genómico 1 µ? Combinar Mixl y ADN en un tubo de reacción. Revestir con aceite mineral. Operar el siguiente programa PCR: 1 ciclo de - 95°C durante 4 minutos; 15 ciclos de - 95°C durante 1' 20" 6 °C durante 1' 7 °C durante 1' 40" 30 ciclos de - 95°C durante 1' 20" 58 °C durante 1' 73°C durante 1'40" -extensión final a 73°C durante 12 minutos Prueba PRKAG3-52 PCR-RFLP Polimorfismo Hphl Cebadores RF1 -5'ATG AGC TTC CTA GAG CAA GGA G 3' R 52R2 -5'GGC TGC ATG ATG TTA TGT GCC T 3' Condiciones PCR Mixl Regulador lOx PCR 1.0 µ? gCl2 (15 mM) 1.0 µ? d TPs (2 mM) 1.0 µ? cebador Rfl (10 mp/µ?) 0.25 µ? cebador RN52R2 (10 ??/µ?) 0.25 µ? polimerasa Taq (5?/µ1) 0.07 µ? ddH20 5.43 µ? ADN genómico 1 µ? Combinar Mixl y ADN en un tubo de reacción. Revestir con aceite mineral. Operar el siguiente programa PCR: 94°C durante 4 minutos; 35 ciclos de 94°C durante 45 segundos, 59°C durante 45 segundos y 72°C durante 45 segundos; seguido por una extensión final a 72 °C durante 12 minutos . Comprobar 3 µ? del PCR en un gel de agarosa al 2% para confirmar el éxito de amplificación y la limpieza del control negativo. Tamaño de producto es 270pb. La asimilación puede realizarse por el siguiente procedimiento : Reacción de asimilación Hphl Producto PCR 3 µ? Regulador NE 4 1 µ? Hphl (5?/µ1) 0.6 µ? ddH20 5.4 µ? Realizar un cóctel del producto PCR, regulador, enzima y agua. Incubar durante 2 horas a 37°C. Mezclar el producto asimilado con tinte de carga (1:6) y operarlo en un gel de agarosa al 4%. Genotipos : 11 - 270pb 12 - 270pb, 158pb y 112pb 22 - 158pb y 112pb.

Prueba PRKAG3-199 PCR-RFLP Polimorfismo BsaHI Cebadores RNF -5' GGA GCA AAT GTG CAG ACA AG 3 RNR -5' CCC ACG AAG CTC TGC TTC TT 3 Condiciones PCR Mixl Regulador lOx PCR 1.0 µ? MgCl2 (15mM) 1.0 µ? dNTPs (2mM) 1.0 µ? cebador RNF (lOpm/µ?) 0.25 µ? cebador RFR (10??/µ1) 0.25 µ? polimerasa Taq (5?7µ1) 0.07 µ? ddH20 5.43 µ? ADN genómico 1 µ? Combinar Mixl y ADN en un tubo de reacción. Revestir con aceite mineral. Operar el siguiente programa PCR: 94°C durante 4 minutos; 35 ciclos de 94°C durante 45 segundos, 61 °C durante 45 segundos, y 72 °C durante 1 minuto; seguido por una extensión final a 72 °C durante 12 minutos. Comprobar 3 µ? del PCR en un gel de agarosa al 2% para confirmar el éxito de amplificación y la limpieza del control negativo. El tamaño del producto es 258pb. La asimilación puede realizarse por el siguiente procedimiento: Reacción de asimilación BsaHl Producto PCR 3 µ? Regulador NE 4 1 µ? BasHI (5?/µ1) 0.6 µ? BSA (10 mg/nl) 0,1 µ? ddH20 5.3 µ? Realizar un cóctel del producto PRC, regulador, enzima y agua. Incubar durante 2 horas a 37 °C. Mezclar el producto asimilado con tinte de carga (1:6) y operarlo en un gel de agarosa al 4%. Genotipos : 11 - 167pb y 91pb 12 - 167pb, 119pb y 91pb 22 - 119pb y 91pb LISTA DE SECUENCIA <110> Io a State TJniversity Research Foundation <120> ALELOS PR AG3 NOVEDOSOS Y USO DE LOS MISMOS COMO MARCADORES GENETICOS PARA RASGOS DE LA CALIDAD DE CARNE Y DE LA REPRODUCCION <130> PO46680S3 <150¾ 60/231045 <151> 2000-09-08 <150> 60/260,239 <151> 2001-01-08 <150> 60/299,111 <151> 2001-06-18 <160> 17 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 1873 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> CDS <222> (1)..(1392) <400> 1 atg age ttc cta gag caá gga gag age cgt tea tgg cea tec cga gct 48 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 gta acc acc age tea gaa aga age cat ggg gac cag ggg aac aag gcc Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser Ele Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 tct aga tgg aca agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg cct ccg ggc 144 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ccg agg gaa ggt ccc cag tec agg cea gtt gct gag tec acc ggg cag 192 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 gag gcc aca ttc ccc aag gcc aca ccc ttg gcc caá gcc gct ccc ttg 240 Glu Ala Thr Phe Pro Lye Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 gcc gag gtg gac aac ccc cea aca gag cgg gac ate ctc ccc tct gac 288 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp lie Iteu Pro Ser Asp 85 90 95 tgt gca gcc tea gcc tec gac toe aac aca gac cat ctg gat ctg ggc 336 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp Eis Iteu Asp Leu Gly 100 105 110 ata gag ttc tea gcc teg gcg gcg teg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384 lie Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 gaa gag aag cea gcc ceg tgc cea tec cea gag gtg ctg tta ccc agg 432 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cye Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ceg ggg gcc cag gtc tac atg 480 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Ty Met 145 150 155 160 cae ttc atg cag gag cae acc tgc tac gat gcc atg gcg acc age tec 528 Bis Phe Met Gln Glu His Thr Cye Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 aaa ctg gtc atc ttc gac acc atg ctg gag atc aag aag gcc ttc ttt 576 Lys Leu Val lie Phe Asp Thr Met Leu Glu lie Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 gcc ctg gtg gcc aac ggc gtc cga gcg gca ect ttg tgg gac age aag 624 Ala Leu Val Ala ABII Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 aag cag age ttc gtg ggg atg ctg acc atc aca gac ttc atc ttg gtg £72 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr lie Thr Asp Phe lie Leu Val 210 215 220 ctg cae cgc tat tac agg tec ccc ctg gtc cag atc tac gag att gaa 720 Leu His Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln lie Tyr Glu lie Glu 225 230 235 240 gaa cat aag att gag acc tgg agg gag atc tac ctt caá ggc tgc ttc 768 Glu Bis Lys l e Glu Thr Trp Arg Glu lie Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 aag ect ctg gtc tec atc tet ccc aat gac age ctg ttc gaa gct gtc 816 Lys Pro Leu Val Ser lie Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 tac gcc etc atc aag aac cgg atc cae cgc ctg ceg gtc ctg gac ect 864 Tyr Ala Leu lie Lys Asn Arg lie His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 gtc tec ggg gct gtg etc cae atc etc aca cat aag cgg ctt etc aag 912 Val Ser Gly Ala Val Leu His lie Leu Thr Bis Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 ttc ctg cae atc ttt ggc acc ctg ctg ccc cgg ccc tec ttc etc tac 960 Phe Leu Bis lie Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 cgc acc atc caá gat ttg ggc atc ggc aca ttc cga gac ttg gcc gtg 1008 Arg Thr lie Gln Asp Leu Gly lie Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 gtg ctg gaa acg gcg ccc atc ctg acc gca ctg gac atc ttc gtg gac 1056 Val Leu Glu Thr Ala Pro lie Leu Thr Ala Leu Asp lie Phe Val Asp 2 340 345 350 cgg cgt gtg tct gcg ctg cct gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 ggc ctc tac tct cgc ttt gat gtg ate cae ctg gct gee caá caá acá Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val lie His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 tac aac cae ctg gac atg aat gtg gga gaa gee ctg agg cag cgg acá Tyr Asn Hla Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tec tgc cag ecc cae gag acc ttg ggg Leu Cye Leu Glu Gly Val Leu Ser Cye Gln Pro Els Glu Thr Leu Gly 405 410 415 gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa cag gtg cae cgc ctg gtg ctc Glu Val lie Asp Arg lie Val Arg Glu Gln Val Bis Arg Leu Val Leu 420 425 430 gtg gat gag acc cag cae ctt ctg ggc gtg gtg tec ctc tct gac ate Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp lie 435 440 445 ctt cag gct ctg gtg ctc age cct gct gga att gat gee ctc ggg gee Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly lie Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452 gccgtggact cagctctcac ttcccetcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512 taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572 atetcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632 gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692 atgatggagg geetcataag aggggggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752 gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctet cagttcagtt cccccctgct 1812 gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872 9 1873 <210> 2 <211> 464 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 2 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 3 Val rhr Thr Ser Ser Glu Arg Ser Hle Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu £5 70 75 80 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp He Leu Pro Ser Asp 85 90 95 Cye Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp Ele Leu Asp Leu Gly 100 105 110 He Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu iys Pro Ala Pro Cye Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 His Phe Met Gln Glu Hls Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 Lys Leu Val He Phe Asp Thr Met Leu Glu He Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr He Thr Asp Phe He Leu Val 210 215 220 Leu Hle Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln He Tyr Glu He Glu 225 230 235 240 Glu His Lye He 3lu Thr Trp Arg Glu He Tyr Leu Gln Gly cya Phe 245 250 255 4 Lys Pro Leu Val Ser lie Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Ala Leu lie Lys Asn Arg lie His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Ala Val Leu His lie Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lye 290 295 300 Phe Leu His ie Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr lie Gln Asp Leu Gly lie Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 Val Leu Glu Thr Ala Pro lie Leu Thr Ala Leu Asp lie Phe Val Asp 340 345 350 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val lie His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 3B5 390 395 400 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 ' 410 415 Glu Val lie ?e? 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gtg gac aac ecc cca aca gag cgg gac atc etc ecc tet gac Ala Glu Val Aep Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp lie Leu Pro Ser Asp 85 90 95 tgt gca gcc tea gcc tcc gac tcc aac aca gac cat ctg gat ctg ggc Cye Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asa Thr Asp Hie Leu Asp Leu Gly 100 105 110 ata gag ttc tea gcc teg gcg gcg teg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384 lie Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gl Asp Glu Leu Oly Leu Val 115 120 125 gaa gag aag cca gcc ceg tgc cca tcc cca gag gtg ctg tta ecc agg 432 Glu Glu Lye Pro Ala Pro Cye Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ceg ggg gcc cag gtc tac atg 480 Leu Gly Trp Aep Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 cae ttc atg cag gag cae acc tgc tac gat gcc atg gcg acc age tcc 528 Hie Phe Met Gln Glu Hie Thr Cys Tyr Aep Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 aaa ctg gtc atc ttc gac acc atg ctg gag atc aag aag gcc ttc ttt 576 Lys Leu Val lie Phe Asp Thr Met Leu Glu lie Lys Lys Ala Pbe Phe 180 185 190 gcc ctg 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acc ctg ctg ecc cgg ecc tcc ttc ctc tac Phe Leu Ele lie Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 cgc acc ate caá gat ttg ggc ate ggc acá ttc cga gac ttg gcc gtg Arg Thr lie Gln Asp Leu Gly lie Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 gtg ctg gaa acg gcg ecc ate ctg acc gca ctg gac ate ttc gtg gac Val Leu Glu Thr Ala Pro lie Leu Thr Ala Leu Asp lie Phe Val Asp 340 345 350 cgg cgt gtg tct gcg ctg cct gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Aen Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 ggc ctc tac tct cgc ttt gat gtg ate cae ctg gct gcc caá ca acá Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val lie His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 tac aac cae ctg gac atg aat gtg gga gaa gcc ctg agg cag cgg acá Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tcc tgc cag ecc cae gag acc ttg ggg Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa 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Val lie Hie Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn HÍB Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 Leu Cya Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 Glu Val lie Aep Arg lie Val Arg Glu Gln Val Hie Arg Leu Val Leu 420 425 430 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp lie 435 440 445 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly lie Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 <210> 5 <211> X873 <212> DNA <213> Sus 1 <220> <221> CDS <222> (1). <400> 5 atg age ttc 48 Met Ser Phe 1 10 15 gta acc acc 96 Val Thr Thr 20 25 30 tct aga tgg acá agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg ect ceg ggc 144 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ceg agg gaa agt ccc cag tec agg cea gtt gct gag tec acc ggg cag 192 Pro Arg Glu Ser Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 gag gcc acá ttc ccc aag gcc acá ccc ttg gcc caá gcc gct ccc ttg 240 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 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Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Ser Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp lie Leu Pro Ser Asp 85 90 95 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 lie Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135. 140 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 His Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyx Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 Lys Leu Val lie Phe Asp Thr Met Leu Glu lie Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lye 195 200 205 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr lie Thr Asp Phe lie Leu Val 210 215 220 Leu Hie Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln lie Tyr Glu lie Glu 13 225 230 235 240 Glu HÍB Lys lie Glu Thr Trp Arg Glu lie Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 Lys Pro Leu Val Ser lie Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Ala Leu lie Lys Asn Arg lie HÍB Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Ala Val Leu His lie Leu Thr HÍB Lys Arg Leu Leu Lys 290 255 300 Phe Leu Hie lie Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr lie Gln Asp Leu Gly lie Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 Val Leu Glu Thr Ala Pro lie Leu Thr Ala Leu Asp lie Phe Val Asp 340 345 350 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val lie Ele Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn HÍB Leu Asp Met ?e? Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro HÍB Glu Thr Leu Gly 405 410 415 Glu Val lie Asp Arg lie Val Arg Glu Gln Val HÍB Arg Leu Val Leu 420 425 430 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Aep lie 435 440 445 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly He Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 14 <2I0> 7 <211> 1873 <212> DKA <213> Sue scrofa <220> <221> CDS <222> (1)..(1392) <400> 7 atg agc ttc cta gag caa gga gag age cgt tea tgg cea tec cga gct 48 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 gta acc acc age tea gaa aga age cat ggg gac cag ggg aac aag gcc 96 val Thr Thr Ser ser Glu Arg Ser Ble Gly Asp Gln Gly ABO Lys Ala 20 25 30 tet aga tgg acá agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg cct ceg ggc Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu <31y Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ceg agg gaa ggt cec cag tec agg cea gtt gct gag tec acc ggg cag Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 €0 gag gcc acá ttc ecc aag gcc acá ecc ttg gcc caa gcc gct ecc ttg 240 Glu Ala Thr Phe Pro Lye Ala Th Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 gcc gag gtg gac aac cec cea acá gag cgg gac atc etc ecc tet gac Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp lie Leu Pro Ser Asp 85 90 95 tgt gca gcc tea gcc tec gac tec aac acá gac cat ctg gat ctg ggc 336 Cye Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 100 105 110 ata gag ttc tea gcc teg gcg gcg teg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 384 lie Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 gaa gag aag cea gcc ceg tgc cea tec cea gag gtg ctg tta ecc agg 432 Glu Glu Lye Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ceg ggg gcc cag gtc tac atg 480 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gl¾ Val Tyr Met 145 150 155 160 cae ttc atg cag gag cae acc tgc tac gat gcc atg gcg acc age toe 528 Hie Phe Met Gln Glu His Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 aaa ctg gtc atc ttc gac acc atg ctg gag atc aag aag gcc ttc ttt 576 Lye Leu Val lie Phe Asp Thr Met Leu Glu lie Lys Lys Ala Phe Phe 180 185 190 gcc ctg gtg gcc aac ggc atc cga gcg gca cct ttg tgg gac age aag 624 15 Ala Leu Val Ala Asn Gly lie Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lye 195 200 205 aag cag age ttc gtg ggg atg ctg acc ate acá gac ttc ate ttg gtg 672 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr lie Thr Asp Phe lie Leu Val 210 215 220 ctg cae cgc tat tac agg tec ecc ctg gtc cag ate tac gag att gaa 720 Leu Eis Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln lie Tyr Glu lie Glu 225 230 235 240 gaa cat aag att gag acc tgg agg gag ate tac ctt caá ggc tgc ttc 768 Glu Eis Lys lie Glu Thr Trp Arg Glu lie Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 aag ect ctg gtc tec ate tet ecc aat gac age ctg ttc gaa gct gtc 816 Lys Pro Leu Val Ser lie Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 tac gee ctc ate aag aac cgg ate cae cgc ctg ceg gtc ctg gac ect 864 Tyr Ala Leu lie Lys Asn Arg lie Ele Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 gtc tec ggg gct gtg ctc cae ate ctc acá cat aag cgg ctt ctc aag 912 Val Ser Gly Ala Val Leu His lie Leu Thr Eis Lys Arg Leu Leu Lys 2S0 295 300 ttc ctg cae ate ttt ggc acc ctg ctg ecc cgg ecc tec ttc ctc tac 960 Phe Leu Eis He Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg. Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 31S 320 cgc acc ate caá gat ttg ggc ate ggc acá ttc cga gac ttg gee gtg 1008 Arg Thr He Gln Asp Leu Gly He Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 gtg ctg gaa acg gcg ecc ate ctg acc gca ctg gac ate ttc gtg gac 1056 Val Leu Glu Thr Ala Pro He Leu Thr Ala Leu Asp He Phe Val Asp 340 345 350 cgg cgt gtg tet gcg ctg ect gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg 1104 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Qln Val Val 355 360 365 ggc ctc tac tet cgc ttt gat gtg ate cae ctg gct gee caá caá acá 1152 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val He His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 tac aac cae ctg gac atg aat gtg gga gaa gee ctg agg cag cgg acá 1200 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Qlu Ala Leu Arg Qln Arg Thr 385 390 395 400 ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tec tgc cag ecc cae gag acc ttg ggg 1248 Leu Cys Leu Qlu Qly Val Leu Ser Cys Gln Pro Eis Qlu Thr Leu Qly 405 410 415 gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa cag gtg cae cgc ctg gtg ctc 1296 Glu Val He Asp Arg He Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 16 gtg gat gag acc cag cac ctt ctg ggc gtg gtg tcc ctc tct gac atc 1344 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp lie 435 440 44S ctt cag gct ctg gtg ctc age cct gct gga att gat gcc ctc ggg gcc 1392 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly lie Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg taggctcegc ccggggcecc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag atctcagact ggggcaccct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa atgatggagg geetcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc <210> 8 <211> 464 <212> PRT <213> Sus <400> 8 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lye Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 B0 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp lie Leu Pro Ser Asp 85 90 95 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp His Leu Asp Leu Gly 17 lOO 105 110 lie Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu Lys Pro Ala Pro CyB Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 ??e Phe Met Gln Glu Hle Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 Lys Leu Val lle Phe Asp Thr Met Leu Glu lie Lys Lys Ala Phe Phe 180 165 190 Ala Leu Val Ala Aen Gly lie Arg Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr lie Thr Asp Phe lie Leu Val 210 215 220 Leu Hie Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln lle Tyr Glu lie Glu 225 230 235 240 Glu His Lye lie Glu Thr Trp Arg Glu lie Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 Lys Pro Leu Val Ser lie Ser Pro Asn Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Ala Leu lie Lys Asn Arg lie His Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Ala Val Leu Hie He Leu Thr Hie Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 Phe Leu Hie He Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr lie Gln Asp Leu Gly lie Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 18 Val Leu Glu Thr Ala Pro lie Leu Thr Ala Leu Asp lie Phe Val Asp 340 345 350 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val lie His Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 390 395 400 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro Eis Glu Thr Leu Gly 405 410 415 Glu Val lie Asp Arg lie Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp lie 435 440 445 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly lie Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 <210> 9 <211> 1873 <212> DNA <213> SUB scrofa <220> <221> CDS <222> (1) ..(1392) <400> 9 atg age ttc cta gag caa gga gag age cgt tea tgg cca tcc cga gct 48 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 gta acc acc age tea gaa aga age cat ggg gac cag ggg aac aag gcc 96 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser His Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 tet aga tgg aca agg cag gag gat gta gag gaa ggg ggg ect ccg ggc 144 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ccg agg gaa ggt ccc cag tcc agg cca gtt gct gag tcc acc ggg cag 192 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Qly Gln 50 55 60 gag 9CC aca ttc ccc aag gcc aca ccc ttg gcc caa gcc gct ccc ttg 240 19 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 gcc gag gtg gac aac ecc cea acá gag cgg gac ate ctc ecc tet gac 286 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp lie Leu Pro Ser Asp B5 90 95 tgt gca gcc tea gcc tcc gac tcc aac acá gac cat ctg gat ctg ggc 336 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp Bis Leu Asp Leu Gly 100 105 110 ata gag ttc tea gcc teg gcg gcg teg ggg gat gag ctt ggg ctg gtg 364 lie Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 gaa gag aag cea gcc ceg tgc cea tcc cea gag gtg ctg tta ecc agg 432 Glu Glu Lye Pro Ala Pro Cys Pro Ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 ctg ggc tgg gat gat gag ctg cag aag ceg ggg gcc cag gtc tac atg 480 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu Gln Lye Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 cae ttc atg cag gag cae acc tgc tac gat gcc atg gcg acc age tcc 528 Bis Phe Net Gln Glu Eis Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 aaa ctg gtc ate ttc gac acc atg ctg gag ate aag aag gcc ttc ttt 576 Lys Leu Val lie Phe Asp Thr Met Leu Glu lie Lys Lys Ala Phe Phe ISO 165 190 gcc ctg gtg gcc aac ggc gtc caá gcg gca ect ttg tgg gac age aag 624 Ala Leu Val Ala Asn Gly Val Gln Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lys 195 200 205 aag cag age ttc gtg ggg atg ctg acc ate acá gac ttc ate ttg gtg 672 LyB Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr l e Thr Asp Phe lie Leu Val 210 215 220 ctg cae cgc tat tac agg tcc ecc ctg gtc cag ate tac gag att gaa 720 Leu Bis Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln lie Tyr Glu lie Glu 225 230 235 240 gaa cat aag att gag acc tgg agg gag ate tac ctt caá ggc tgc ttc 768 Glu Bis Lys lie Glu Thr Trp Arg Glu lie Tyr Leu Gln Gly Cye Phe 245 250 255 aag ect ctg gtc tcc ate tet ecc aat gac age ctg ttc gaa gct gtc 816 Lys Pro Leu Val Ser lie Ser Pro Aen Asp Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 tac gcc ctc ate aag aac cgg ate cae cgc ctg ceg gtc ctg gac ect 864 Tyr Ala Leu lie Lys Asn Arg lie Eis Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 gtc tcc ggg gct gtg ctc cae ate ctc acá cat aag cgg ctt ctc aag 912 Val Ser Gly Ala Val Leu Bis lie Leu Thr His Lys Arg Leu Leu Lys 290 295 300 ttc ctg cae ate ttt ggc acc ctg ctg ecc cgg ecc tec ttc etc tac 960 Phe Leu His Ile Phe Gly hr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 cgc acc ate caá gat ttg ggc atc ggc acá ttc cga gac ttg gee gtg 1008 Arg Thr lie Gln Asp Leu Gly lie Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 gtg ctg gaa acg gcg ecc atc ctg acc gca ctg gac atc ttc gtg gac 1056 Val Leu Glu Thr Ala Pro lie Leu Thr Ala Leu Asp lie Phe Val Asp 340 345 350 cgg cgt gtg tet gcg ctg ect gtg gtc aac gaa act gga cag gta gtg 1104 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Aun Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 ggc etc tac tet cgc ttt gat gtg atc cae ctg gct gee caá caá acá 1152 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val lie Hie Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 tac aac cae ctg gac atg aat gtg gga gaa gee ctg agg cag cgg acá 1200 Tyr Asn His Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 385 3S0 395 400 ctg tgt ctg gaa ggc gtc ctt tec tgc cag ecc cae gag acc ttg ggg 1248 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cye Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 gaa gtc att gac cgg att gtc cgg gaa cag gtg cae cgc ctg gtg etc 1296 Glu Val lie Asp Arg lie Val Arg Glu Gln Val His Arg Leu Val Leu 420 425 430 gtg gat gag acc cag cae ctt ctg ggc gtg gtg tec etc tet gac atc 1344 Val Asp Glu Thr Gln His Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp lie 435 440 445 ctt cag gct ctg gtg etc age ect gct gga att gat gee etc ggg gee 1392 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly lie Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 tgagaacctt ggaacctttg ctctcaggcc acctggcaca cctggaagcc agtgaaggga 1452 gccgtggact cagctctcac ttcccctcag ccccacttgc tggtctggct cttgttcagg 1512 taggctccgc ccggggcccc tggcctcagc atcagcccct cagtctccct gggcacccag 1572 atetcagact ggggcaecct gaagatggga gtggcccagc ttatagctga gcagccttgt 1632 gaaatctacc agcatcaaga ctcactgtgg gaccactgct ttgtcccatt ctcagctgaa 1692 atgatggagg gcctcataag aggggtggac agggcctgga gtagaggcca gatcagtgac 1752 gtgccttcag gacctccggg gagttagagc tgccctctct cagttcagtt cccccctgct 1812 gagaatgtcc ctggaaggaa gccagttaat aaaccttggt tggatggaat ttggagagtc 1872 g 1873 21 <210> 10 <211> 464 <212> PRT <213> Sus scro a <400> 10 Met Ser Phe Leu Glu Gln Gly Glu Ser Arg Ser Trp Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Val Thr Thr Ser Ser Glu Arg Ser HÍB Gly Asp Gln Gly Asn Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Trp Thr Arg Gln Glu Asp Val Glu Glu Gly Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Arg Glu Gly Pro Gln Ser Arg Pro Val Ala Glu Ser Thr Gly Gln 50 55 . €0 Glu Ala Thr Phe Pro Lys Ala Thr Pro Leu Ala Gln Ala Ala Pro Leu 65 70 75 80 Ala Glu Val Asp Asn Pro Pro Thr Glu Arg Asp lie Leu Pro Ser Asp 65 90 95 Cys Ala Ala Ser Ala Ser Asp Ser Asn Thr Asp Eis Leu Asp Leu Gly 100 105 110 lie Glu Phe Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Asp Glu Leu Gly Leu Val 115 120 125 Glu Glu Lys Pro Ala Pro Cys Pro ser Pro Glu Val Leu Leu Pro Arg 130 135 140 Leu Gly Trp Asp Asp Glu Leu <3ln Lys Pro Gly Ala Gln Val Tyr Met 145 150 155 160 Eis Phe Met Gln Glu Hie Thr Cys Tyr Asp Ala Met Ala Thr Ser Ser 165 170 175 Lys Leu Val He Phe Asp Thr Met Leu Glu He Lys Lys Ala Phe Phe 180 18S 190 Ala Leu Val Ala Asn Gly val Gln Ala Ala Pro Leu Trp Asp Ser Lye 195 200 205 22 Lys Gln Ser Phe Val Gly Met Leu Thr lie Thr Asp Phe lie Leu Val 210 215 220 Leu HÍB Arg Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Val Gln lie Tyr Glu lie Glu 225 230 235 240 Glu Hie Lye lie Glu Thr Trp Arg Glu lie Tyr Leu Gln Gly Cys Phe 245 250 255 Lys Pro Leu Val Ser lie Ser Pro ?e? e? Ser Leu Phe Glu Ala Val 260 265 270 Tyr Ala Leu lie Lye Asn Arg lie Hie Arg Leu Pro Val Leu Asp Pro 275 280 285 Val Ser Gly Ala Val Leu His lie Leu Thr Eis Lys Arg Leu Leu Lys 290 255 300 Phe Leu His lie Phe Gly Thr Leu Leu Pro Arg Pro Ser Phe Leu Tyr 305 310 315 320 Arg Thr lie Gln Asp Leu Gly lie Gly Thr Phe Arg Asp Leu Ala Val 325 330 335 Val Leu Glu Thr Ala Pro lie Leu Thr Ala Leu Asp lie Phe Val Asp 340 345 350 Arg Arg Val Ser Ala Leu Pro Val Val Asn Glu Thr Gly Gln Val Val 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Arg Phe Asp Val lie Hie Leu Ala Ala Gln Gln Thr 370 375 380 Tyr Asn HÍB Leu Asp Met Asn Val Gly Glu Ala Leu Arg Gln Arg Thr 365 390 395 400 Leu Cys Leu Glu Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro His Glu Thr Leu Gly 405 410 415 Glu Val lie Asp Arg lie Val Arg Glu Gln Val HÍB Arg Leu Val Leu 420 425 430 Val Aep Olu Thr Gln HÍB Leu Leu Gly Val Val Ser Leu Ser Asp lie 435 440 445 23 Leu Gln Ala Leu Val Leu Ser Pro Ala Gly lie Asp Ala Leu Gly Ala 450 455 460 <210> 11 <211> 1095 <2 2> DMA <213> SUS scrofa <400> 11 gaaactcttc tccccacaga ctccetcctg gagcagcctc gggggaccta agcatcaagg 60 taggtggggc tgcccctgct cgcgggccca ggctcttctc ccacctcctt ttcttccacg 120 tcttcaggac cccaatctcc cccactccac tcgcctggct cttgtcttcc tctcctttgc 180 cttctttgtt ccgctttgtt tcttcttcct ccctctccct cacctcctcc ctctttcaaa 240 agagtagagg gggcatctat agagtctgga gattgggact ctcttgactt tctcgcttac 300 tagctgtgtg atttgtggca aattgcttca cctctctgag ctcaggtctc tcgttagtaa 360 aacagggctg atagccatgc ccttcggata agattgccgt gagggttgaa tgagaaattt 420 gttggaggac aagccctttg aagcttccca atattaaata tttttattta tttatttatt 480 ttttgtcttt ttgctattcc tttgggccgc tcccacggca tatggaggtt cccaggctag 540 gggtcgaatc ggagctgtag ccaetggcct acgccagagc cacagcaacg cgggatccga 600 gccgcatctg caacctacac cacagctcac ggcaacgccg gatcgttaac ccactgagca 660 ggggcaggca ccgaacctgc aacctcatgg ttcctagtgg gattcgttaa ccactgcgcc 720 acgacgggaa ctccccaata ttaaatatta ttattagtaa cattttaatg gaatttattg 780 tgttactccc cattaaccaa acaggtccca ttctcccttg cagagatgag cttcctagag 840 caaggagaga gccgttcatg gccatcccga gctgtgacca ccagctcaga aagaagccat 900 ggggaccagg ggaccaaggc ctctagatgg acaaggcagg aggatrtaga ggaagggggg 960 cctccgggcc cgagggaarg tgagttcaag gccagttctg gggagctggg actgggggca 1020 gtgggcagtc ctcaaacctg gggcccgtct ctggtctggt ccctccataa cacaggcaca 1080 taacatcatg cagcc 1095 <210> 12 <211> 808 <212> DKA <213> Sue scrofa <400> 12 gaaactcttc tccccacaga ctccctcctg gagcagcctc gggggaccta agcatcaagg 60 taggtggggc tgcccctgct cgcgggccca ggctcttctc ccacctcctt ttcttccacg 120 24 tcttcaggac cccaatctcc cccactccac tcgcctggct cttgtcttcc tctcctttgc 180 cttctttgtt ccgctttgtt tcttcttcct ccctctccct cacctcctcc ctctttcaaa 240 agagtagagg gggcatctat agagtctgga gattgggact ctcttgactt tctcgcttac 300 tagctgtgtg atttgtggca aattgcttca cctctctgag ctcaggtctc tcgttagtaa 360 aacagggctg atagccatgc ccttcggata agattgccgt gagggttgaa tgagaaattt 420 gttggaggac aagccctttg aagcttccca atattaaata ttattattag taacatttta 460 atggaattta ttgtgttact ccccattaac caaacaggtc ccattctccc ttgcagagat 540 gagcttccta gagcaaggag agagccgttc atggccatcc cgagctgtga ccaccagctc 600 agaaagaagc catggggacc aggggaccaa ggcctctaga tggacaaggc aggaggatat 660 agaggaaggg gggcctccgg gcccgaggga argtgagttc aaggccagtt ctggggagct 720 gggactgggg gcagtgggca gtcctcaaac ctggggcccg tctctggtct ggtccctcca 780 taacacaggc acataacatc atgcagcc BOB <210> 13 <211> 21 <2 2> DNA <213> SUS scrofa <400> 13 atgagcttcc tagagcaagg a 21 <210> 14 <211> 22 <212> OSA <213> Sus scrofa <400> 14 ggctgcatga tgttatgtgc ct 22 <210> 15 <211> 21 <212> USA. <213> Sus scrofa <400> 15 gaaactcttc tccccacaga c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <2 3> Sus scrofa <400> 16 25 ggagcaaatg tgcagacaag <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> SUB ecrofa <400> 17 cccacgaagc tctgcttctt

Claims (1)

102 REIVINDICACIONES 1. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para producir carnadas grandes, que comprende: obtener una muestra de material genético del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal que está asociado con el tamaño de carnada incrementado, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: a) un polimorfismo en el gen PR AG3. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polimorfismo resulta en un cambio de aminoácido de la valina a isoleucina en el número de aminoácido 199 del gen PRKAG3 o su equivalente como se determinó por una comparación BLAST de la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 2. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polimorfismo es una transición de una guanina a una adenina en la posición 595 de nucleótido o su equivalente. . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el genotipo es un polimorfismo BsaHI. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de analizar se selecciona del grupo que consiste de: análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) , minisecuenciación MALD-TOF, SINE; análisis heterodúplex, 103 polimorfismo conformacional de un solo ramal (SSCP) , electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) y electroforesis de gel de gradiente de temperatura (TGGE) . 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el animal es un puerco. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende la etapa de amplificar la cantidad del gen PRKAG3 o una porción del mismo el cual contiene el polimorfismo. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la amplificación incluye las etapas de: seleccionar un cebador de secuencia hacia delante e inversa capaz de amplificar una región del gen PRKAG3 el cual contiene un sitio BsaHI polimórfico. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque los cebadores hacia delante e inversos se seleccionan de, y se basan en el cebador RNF y cebador RNR. 10. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para exhibir rasgos de calidad de carne mejorados que comprende: obtener una muestra biológica del material del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal el cual se asocia con rasgos de calidad de la carne mejorados, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: 104 a) un polimorfismo en el gen PRKAG3, el polimorfismo resulta en, y se caracteriza por un aminoácido de valina en la posición 199 y arginina en la posición 200, o una isoleucina en la posición 199 cuando una arginina está en la posición 200 o su equivalente como se determina por una comparación BLAST de la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 2. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polimorfismo es una transición de una guanina a una adenina en la posición 595 del nucleótido o su equivalente. 12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la etapa de analizar comprende una prueba de polimorfismo del elemento entremezclado corto. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ensayo comprende la etapa de amplificar el gen PRKAG3 utilizando cebadores seleccionados de, y basados en el cebador RP1F y cebador PN52R2. 1 . El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende además la etapa de amplificar la cantidad del gen PRKAG3 o una porción del mismo el cual contiene el polimorfismo. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la amplificación incluye las etapas de: seleccionar un cebador de secuencia hacia delante e 105 inversa capaz de amplificar una región del gen PRKAG3 el cual contiene un sitio BsaHI polimórfico . 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque los cebadores hacia delante e inversos se seleccionan de, y se basan en el Cebador RNF y cebador RNR. 17. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para exhibir rasgos de calidad de la carne mejorados, que comprenden: obtener una muestra biológica del material a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal el cual se asocia con los rasgos de calidad de la carne mejorados, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: a) un polimorfismo en el gen PRKAG3, el polimorfismo que resulta en, y se caracteriza por un cambio de aminoácido de asparagina a treonina en la posición 30 de aminoácido o su equivalente como se determina por una comparación BLAST de la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 1. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polimorfismo es una transición de una adenina a citosina en la posición 89 de nucleótido o su equivalente como se determina por una comparación BLAST de la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 1. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el genotipo es un polimorfismo Styl . 106 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la etapa de ensayar se selecciona del grupo que consiste de: análisis de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) , minisecuenciación, MALD-TOF, SINE, análisis heterodúplex, polimorfismo conformacional de un ramal (SSCP) , electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) y electroforesis de gel de gradiente de temperatura (TGGE) . 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el animal es un puerco. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende además la etapa de amplificar la cantidad del gen PRKAG3 o una porción del mismo que contiene el polimorfismo. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la amplificación incluye las etapas de: seleccionar un cebador de secuencia hacia delante e inversa capaz de amplificar una región del gen PRKA.G3 que contiene un sitio Styl polimórfico. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los cebadores hacia delante e inverso se seleccionan de, y basan en el Cebador RF1 y cebador RN52R2. 25. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para exhibir rasgos de calidad 107 de la carne mejorados, que comprende: obtener una muestra biológica del material a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal el cual se asocia con los rasgos de calidad de la carne mejorados, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: a) un polimorfismo en el gen PRKAG3, el polimorfismo que resulta en, y se caracteriza por un cambio de aminoácido de glicina a serina en la posición 52 de aminoácido o su equivalente como se determina por una comparación BLAST de la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 1. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polimorfismo es una transición de una guanina a una adenina en la posición 154 de nucleótido o su equivalente como se determina por una comparación BLAST de la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 1. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el genotipo es un polimorfismo Hphl. 28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la etapa de analizar se selecciona del grupo que consiste de: análisis de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) , minisecuenciación, MALD-TOF, SINE, análisis heterodúplex, polimorfismo conformacional de un solo ramal (SSCP) , electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) y electroforesis de gel de gradiente de temperatura (TGGE) . 108 29. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el animal es un puerco. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque comprende la etapa de amplificar la cantidad del gen PRKAG3 o una porción del mismo el cual contiene el polimorfismo. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la amplificación incluye las etapas de: seleccionar un cebador de secuencia hacia delante e inverso, capaz de amplificar una región del gen PRKAG3 el cual contiene un sitio Hphl polimórfico. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque los cebadores hacia delante e inversos se seleccionan de, y se basan en el Cebador RF1 y cebador RN52R2. 33. Una secuencia de nucleótido que codifican en la expresión una proteina PRKAG3, caracterizada porque comprende además una serina en la posición 52. 34. La secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque comprende la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 5. 35. Una proteina PRKAG3 de conformidad con la reivindicación 33. 109 36. La proteína de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque comprende la SECUENCIA DE IDENTIDAD NO: 6. 37. Una secuencia de nucleótido que codifica en la expresión una proteína PRKAG3, la proteína está caracterizada porque comprende una isoleucina en la posición 199 y una arginina en la posición 200 o el equivalente de la misma, de tal proteína. 38. Una proteína PRKAG3 de conformidad con la reivindicación 37. 39. Una secuencia de nucleótido que codifica en la expresión una proteína PRKAG3, la proteína está caracterizada porque comprende una isoleucina en la posición 199, una treonina en la posición 30, una glicina en la posición 52 y una arginina en la posición 200 o el equivalente de la misma, de tal proteína. 40. Una proteína PRKAG3 de conformidad con la reivindicación 39. 41. Una secuencia de nucleótido que codifica en la expresión una proteína PRKAG3, la proteína está caracterizada porque comprende una valina en la posición 199 y una arginina en la posición 200 o el equivalente de la misma, de tal proteína. 42. Una proteína PRKAG3 de conformidad con la reivindicación 41. 110 43. Una secuencia de nucleótido que codifica en la expresión una proteina PRKAG3, la proteina está caracterizada porque comprende una isoleucina o valina en la posición 199 y una arginina en la posición 200 o el equivalente de la misma, de tal proteina. 44. Una proteina PRKAG3 de conformidad con la reivindicación 43. 45. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para tener rasgos de la calidad de carne favorables, que comprende: obtener una muestra del material genético a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal, el cual se asocia con los rasgos de calidad de carne favorables, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: una treonina en la posición 30 del aminoácido, una glicina en la posición 52 del aminoácido y una isoleucina en la posición 199 del aminoácido . 46. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para tener rasgos de calidad de la carne favorables, que comprende: obtener una muestra de material genético a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal el cual se asocia con los rasgos de calidad de la carne favorables, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: una isoleucina en la posición 199 y una arginina en la posición 200. 111 47. El método para identificar un marcador genético para la calidad de la carne y/o tamaño de carnada en animales, caracterizado porque comprende las etapas de: determinar el número de descendientes producidos por cada animal hembra o la calidad de la carne del animal; determinar el polimorfismo en el gen PRKA.G3 o equivalente de cada animal; el polimorfismo comprende el polimorfismo de conformidad con la reivindicación 1, 7, 17 u 11 o sus equivalentes y se asocia al número de descendientes producidos por cada animal hembra o la calidad de la carne con el polimorfismo por lo que identifica un polimorfismo para la calidad de carne del animal o tamaño de carnada. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado . además porque comprende la etapa de seleccionar animales para reproducción los cuales se vaticinan tener calidad de carne favorable o tamaño de carnada por tal marcador. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el análisis comprende asimilación de ADN amplificado con PCR con una enzima de restricción seleccionada del grupo que consiste de BsaHI, Hphl, y Styl. 50. Un método para clasificar animales para determinar aquellos con una combinación favorable de rasgos para la calidad de la carne y/o tamaño de carnada, cuyo método comprende las etapas de: determinar los alelos de PRKAG3 112 presentes en un animal, los alelos comprenden aquellos que incluyen uno o más de lo siguiente un BsaHI polimórfico, Hphl, o sitio Styl en el gen PRKAG3; determinar los alelos de otros marcadores para los genes conocidos para afectar la calidad de la carne y/o el tamaño de la carnada; y selección para animales con combinaciones favorables de alelos y contra aquellos que portan combinaciones desfavorables. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la determinación de los alelos PRKAG3 comprenden determinar la presencia de al menos un alelo asociado con al menos un marcador de ADN unido ya sea directa o indirectamente a PRKAG3. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el marcador de ADN es un microsatélite. 53. Un método para clasificar animales para determinar aquellos con rasgos de calidad de la carne favorables, que comprende: obtener una muestra de material genético a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal que se asocia con rasgos de carne favorable, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: a) un polimorfismo en el gen PRKAG3, el polimorfismo es diferente de la mutación RN~ en el aminoácido 200. 113 54. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para tener rasgos de calidad de la carne favorables, que comprende: obtener una muestra de material genético a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal el cual se asocia con la calidad de la carne favorable, y el genotipo está caracterizado por una combinación de al menos dos polimorfismos en el PRKAG3. 55. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para tener valor incrementado para tamaño de carnada y/o rasgos de la calidad de la carne, que comprende: obtener una muestra de material genético a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal el cual se asocia con el tamaño de la carnada favorable y/o calidad de la carne, el genotipo está caracterizado por una combinación de al menos dos polimorfismos en el PRKAG3. 56. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para tener rasgos de calidad de carne favorables, que comprende: obtener una muestra de material genético a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal, el cual se asocia con los rasgos de la calidad de la carne favorables, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: una treonina en la 114 posición 30 del aminoácido, una serina en la posición 52 del aminoácido y una valina en la posición 199 del aminoácido. 57. Un método para clasificar animales para determinar aquellos más aptos para exhibir rasgos de calidad de carne mejorada y, o tamaño de carnada mayor que comprende: obtener una muestra biológica del material a partir del animal; y analizarla por la presencia de un genotipo en el animal el cual se asocia con los rasgos, el genotipo está caracterizado por lo siguiente: a) un polimorfismo del elemento entremezclado corto en el gen PRKAG3. 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el ensayo comprende la etapa de amplificar el gen PRKAG3 utilizando cebadores seleccionados de, y con base en el cebador RPIF y el cebador PN52R2.