CN108872588B - 一种与种公猪繁殖性能密切相关的精子蛋白标记spaca4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种与种公猪繁殖性能密切相关的精子蛋白标记SPACA4及其应用。本发明提供了一种新的与种公猪繁殖性能密切相关的精子蛋白标记SPACA4，其相对含量与种公猪繁殖性能呈显著正相关，通过测定精子蛋白SPACA4的相对含量，用来判断种公猪精液的受精能力和繁殖性能的高低，可实现对现有种公猪的繁殖性能进行较准确的评定，在生产中可以利用该蛋白标记较准确地进行高繁殖性能种公猪的选育，剔除淘汰繁殖性能差的公猪，有利于提高猪场的繁殖生产成绩和经济效益。在生产上使用方便，通过检测精液蛋白标记SPACA4的含量即可，不会造成种公猪采样损伤和应激。

Description

一种与种公猪繁殖性能密切相关的精子蛋白标记SPACA4及其 应用

技术领域

本发明涉及一种高繁殖性能种公猪选育的精子蛋白标记SPACA4，特别涉及种公猪精子蛋白SPACA4的相对含量与种公猪繁殖性能呈显著正相关，通过测定精子蛋白SPACA4的相对含量，用来判断种公猪精液的受精能力和繁殖性能的高低，从而从种公猪群体中选育出高繁殖性能的种公猪。

背景技术

畜牧养殖的良种化一直以来就是畜牧科技工作者的核心任务，由此建立了许多优良种畜的选种选育技术。而提高家畜繁殖性能是提高养殖场生产水平和经济效益的主要途径。但家畜的繁殖性状属于多基因控制的低遗传力性状，很难通过现有的遗传育种技术得以提高。

当前猪繁殖性状相关的DNA分子标记有雌激素受体(estrogen receptor，ER)、促卵泡素β亚基(follicle stimulating hormone-beta，FSH-β)、骨形态发生蛋白15(bonemorphogenetic protein 15，BMP15)等基因，可用于母猪的分子标记辅助选择。另外，还有很多其他SNP标记，用来进行基因选择育种。就种公猪育种而言，当前的育种目标通常只考虑生产性状和肉质性状，而不把繁殖性状包括在内。即使考虑到繁殖性状，当前的育种技术如基于表型选择的常规育种技术、分子标记辅助选择技术、全基因组选择技术等也很难准确地选出高繁殖性能的种公猪。因此，造成了当前猪场种公猪的繁殖性能有高有低，参差不齐，增加了种公猪的饲养成本，并导致高繁殖性能种公猪的优良性能不能充分发挥。那么，是否能建立一种针对公猪繁殖性能的选择标记，从而对当前养猪生产中通过分子育种选育出的种公猪进一步进行选育呢？

在种公猪的利用中，一般通过检测公猪精液的常规精液品质(如精子密度、精子活力、畸形率等)来确定精液是否合格、从而确定是否可以用于授精。但实际生产中，存在精液常规品质相同而授精后的繁殖成绩差异巨大的现象。因此，精液的常规品质检查并不能准确地反映精液的受精能力。建立能够反映精液受精能力的评价指标，将有助于评定精液的受精能力，以及用于评估种公猪繁殖性能的高低。

据报道，在西方集约化猪场，虽然种公猪都是经过了高度的选育，但其繁殖力仍存在较大差异，繁殖性能差的公猪，其配种母猪的分娩率和窝产仔数较低。西班牙人工授精中心的数据显示，当把繁殖性能排名靠后的10％的种公猪去除后，每头母猪每胎产仔数能够增加2.23头，这就使得1000头规模的猪场每年增加经济效益10000欧元以上(Roca et al.,2015)。

近年来，随着蛋白组学的发展和基因敲除技术的应用，越来越多精子功能相关的蛋白质被发现，它们可能与精子受精能力及动物繁殖性能相关，如骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)、附睾富含半胱氨酸的分泌蛋白1(Cysteine Rich Secretory Protein 1，CRISP1)和附睾蛋白酶抑制剂(Epididymis Protease inhibitor，EPPIN)、精清中的精子结合蛋白(Binder of Sperm protein，BSP)、精子β-1,4-半乳糖转移酶(beta1,4-galactosyltransferase，GalT)等。精子蛋白标记可帮助鉴别可育精子和不育精子，但相关研究仍处于初级阶段，而且精子蛋白标记的可靠性在临床试验中仍需验证(Kwon et al.,2015)。据报道，荷斯坦公牛精清内OPN水平与其繁殖性能有关；人附睾上皮细胞分泌的EPPIN可抑制精子运动；公牛精囊分泌的精清蛋白BSP可以调节精子活力和精子获能过程，被认为是与公牛繁殖力相关的蛋白质；小鼠精子蛋白GalT可与透明带蛋白3(zonepellucida 3，ZP3)相互结合，并诱发精子顶体反应；山羊附睾来源的14-kDa蛋白质P14(a14-kDa protein)参与顶体膜的融合。因此，精液中的蛋白成分可能与雄性个体的繁殖能力存在密切的关系，相关蛋白质能够作为评价雄性个体精液受精能力和繁殖能力的指标。

2015年，Kwon等检测了高窝产仔数和低窝产仔数长白种公猪的获能后精子的蛋白表达情况，利用双向电泳和质谱技术发现了一些差异蛋白。其中，精子泛醌细胞色素c还原酶核心蛋白II(ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 2，UQCRC2)在高窝产仔数的精子中表达上调，而精子泛醌细胞色素c还原酶核心蛋白I(ubiquinol-cytochromec reductase core protein 1，UQCRC1)、RAS原癌家族成员RAB2A(RAB2A member RASoncogene family)等在低窝产仔数的精子中高表达。UQCRC2与窝产仔数呈正相关，RAB2A和UQCRC1与窝产仔数呈负相关。这些精子中的生物标记在现场试验中有助于发现高繁殖性能的种公猪个体。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种与种公猪繁殖性能密切相关的精子蛋白标记SPACA4，可以通过测定猪精液中精子蛋白SPACA4含量的多少来判断种公猪繁殖性能的高低，从而从种公猪群体中选育出高繁殖性能的种公猪。

本发明的另一目的在于提供上述精子蛋白标记SPACA4的应用。

本发明的再一目的在于提供一种利用精子蛋白标记SPACA4选育高繁殖性能种公猪的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种与种公猪繁殖性能密切相关的精子蛋白标记，所述的精子蛋白标记为精子蛋白标记SPACA4。

本发明还提供一种精子蛋白标记SPACA4在选育高繁殖性能种公猪中的应用。其中，精子蛋白标记SPACA4的相对含量与种公猪繁殖性能呈显著正相关。

本发明还提供一种利用精子蛋白标记SPACA4选育高繁殖性能种公猪的方法，包括如下步骤：

(1)依据精子蛋白标记SPACA4的定量结果，结合各种生产成绩指标，按照不同的选择比例进行统计分析，确定出组间各指标存在显著性差异时，精子蛋白标记SPACA4的相对含量值，作为生产中用于选育高繁殖性能种公猪的参考阈值；

(2)采集待测选育种公猪的精液，提取精子蛋白样品；

(3)定量检测步骤(2)提取的精子蛋白样品中SPACA4蛋白标记的含量，通过与参考阈值的比较来确定待测公猪繁殖性能的高低，从而选育出高繁殖性能种公猪，淘汰低繁殖性能种公猪。

步骤(1)中所述的参考阈值为选育水平是77％，此时SPACA4蛋白相对含量范围是(8.97～10.03)×10^-8。

步骤(2)中所述的精子蛋白样品的制备步骤如下：

制备30％和60％的percoll不连续密度梯度液于15mL离心管，在其上加入3mL原精液，于20℃下400×g离心20min，弃去上清，仅留底部精子沉淀，用DPBS离心洗涤精子3遍，精子计数，调整每管5～10×10⁷个精子，依精子数量加入蛋白抽提试剂，裂解0.5h，4℃条件下14000×g离心20min，取上清至另一离心管中，加入1.5倍体积的-20℃预冷丙酮，-20℃下沉淀24h，再4℃下14000×g离心20min，弃上清，吸干残液，于-80℃保存。

步骤(3)中所述的定量检测采用利用BCA(the bicinchonininc acid assay)和ELISA(the enzyme linked immunosorbent assay)方法。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一种新的与种公猪繁殖性能密切相关的精子蛋白标记SPACA4，可以实现对现有种公猪的繁殖性能进行较准确的评定，在生产中可以利用该蛋白标记较准确地进行高繁殖性能种公猪的选育，剔除淘汰繁殖性能差的公猪，有利于提高猪场的繁殖生产成绩和经济效益。

(2)本发明提供的精子蛋白标记SPACA4，从蛋白标记的发现到蛋白功能的验证，均进行了较系统的严格的试验，所以该蛋白标记非常准确可靠。

(3)在生产上使用方便，通过检测精液蛋白标记SPACA4的含量即可，不会造成种公猪采样损伤和应激。

附图说明

图1是iTRAQ差异蛋白筛选结果的ELISA验证。

图2是SPACA4和IZUMO2基因表达RT-PCR检测；其中，β-actin为内参基因；泳道M：2000bp marker，泳道1：成年公猪睾丸，泳道2：成年公猪附睾，泳道3：成年公猪输精管，泳道4：3月龄公猪睾丸，泳道5：3月龄公猪附睾，泳道6：心。

图3是成年公猪SPACA4蛋白免疫组织化学检测；其中，A、C分别为睾丸和附睾的阴性对照，B、D分别为睾丸和附睾的免疫组化结果。

图4是猪精子SPACA4的免疫荧光定位；其中，箭头所指的红色荧光部位即为SPACA4的分布位置。

图5是在77％选育水平下以SPACA4蛋白标记筛选高繁殖性能种公猪的效果图；低繁组(5头)种公猪的SPACA4精子蛋白相对含量平均为4.09×10^-8，极显著低于高繁组(17头)的9.50×10^-8；两组间的配种分娩率、窝均产仔数、窝均活仔数和繁殖效率均具有显著差异。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本发明有两个核心技术环节：(一)种公猪繁殖性能相关精子蛋白标记SPACA4的确立；

(二)应用SPACA4蛋白标记实现高繁殖性能种公猪的选育。

具体步骤如下：

(一)种公猪繁殖性能相关精子蛋白标记SPACA4的确立

为了确立能够反映种公猪繁殖性能的精液蛋白标记，用于高繁殖性能种公猪的选育，本研究进行了如下工作：

(1)依据已有配种生产成绩，科学合理的选择代表性种公猪作为研究对象。

依据种公猪配种生产成绩记录，同时以重要生产指标(配种分娩率、窝均产仔数、窝均活仔数和繁殖效率)，精液常规品质指标(精子活力、畸形率)，和体外受精效果指标(卵裂率)从种公猪群体中选择高繁殖性能和低繁殖性能种公猪各3头以上，作为研究对象。

具体的，从规模化原种猪场收集了745头长白种公猪的配种生产成绩数据，通过建立数学模型初步筛选出10头高繁殖性能和6头低繁殖性能的种公猪，具体繁殖性能情况见表1和表2。再通过体外受精试验和研究成本情况，最终筛选出3头高繁殖性能和3头低繁殖性能种公猪作为后期研究对象，具体试验数据见表3和表4。结果显示，所选择的两组种公猪，其精液常规指标没有差异，但精液的受精能力和配种繁殖性能指标之间具有显著差异。

表1不同繁殖性能种公猪繁殖成绩的比较

组别	高繁殖性能	低繁殖性能
			个体数(头)	10	6
繁殖效率<sup>*</sup>(头)	8.58±0.88<sup>a</sup>	6.93±0.80<sup>b</sup>
			分娩率(％)	79.23±6.07<sup>a</sup>	72.41±6.47<sup>a</sup>
窝产总仔数(头)	10.80±0.38<sup>a</sup>	9.55±0.39<sup>b</sup>
			窝产活仔数(头)	9.35±0.44<sup>a</sup>	8.41±0.51<sup>b</sup>

注：同行上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

^*繁殖效率：指种公猪每配种1胎母猪所能够生产出的有效后代仔猪数。

表2不同繁殖性能种公猪精液的精子活力与畸形率比较

组别	个体数	精子畸形率(％)	精子活力(％)
				高繁殖性能	10	8.3±1.2<sup>a</sup>	88.0±1.0<sup>a</sup>
低繁殖性能	6	9.8±0.8<sup>a</sup>	87.0±2.0<sup>a</sup>

注：精子活力和畸形率均为组内个体的平均值，相同上标字母表示差异不显著(P>0.05)。

表3不同繁殖性能种公猪精液的IVF效果比较

注：组间上标字母不同表示差异显著，p<0.05。

表4最终筛选的不同组别种公猪繁殖成绩的比较

注：组间上标字母不同表示差异显著，p<0.05。

(2)代表性种公猪精液的采集及其蛋白样品的制备

利用常规手握法分别采集上述6头长白种公猪的精液，检测其精子密度、活力和畸形率均合格。分别制备精子蛋白样品，方法如下：

精子蛋白样品的制备：

制备30％和60％的percoll不连续密度梯度液于15mL离心管，在其上加入3mL原精液，于20℃下400×g离心20min，弃去上清，仅留底部精子沉淀，用DPBS离心洗涤精子3遍，精子计数，调整每管5～10×10⁷个精子，依精子数量加入蛋白抽提试剂，裂解0.5h，4℃条件下14000×g离心20min，取上清至另一离心管中，加入1.5倍体积的-20℃预冷丙酮，-20℃下沉淀24h，再4℃下14000×g离心20min，弃上清，吸干残液，于-80℃保存。

(3)不同繁殖性能种公猪精子差异蛋白的筛选

将精子蛋白样品送至生物检测公司，利用高通量iTRAQ技术检测两组种公猪的精子差异蛋白。具体流程概括如下：

对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续步骤充分酶解蛋白。用Brandford法进行蛋白的浓度测定。用SDS-PAGE电泳检测蛋白样品质量(质控)。每个样品取等量蛋白Trypsin酶解(质控)。用iTRAQ试剂标记肽段(质控)。将标记后的肽段进行等量混合，对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(SCX)进行预分离。进行液相串联质谱(LC-MS/MS)分析。

经过质控检测，所有精子蛋白质量合格，可用来进行iTRAQ检测。每组精子蛋白检测有3个生物学重复，2个技术重复。在相对定量时，如果同一个蛋白的量在两个样品间没有显著变化，那么其蛋白质丰度比接近于1。当蛋白的丰度比(即差异倍数)达到1.2以上，且经过统计检验其p-value值小于0.05时，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。

经iTRAQ检测，高繁殖性能组和低繁殖性能组的精子差异蛋白有42个(上调41个，下调1个)。利用David Bioinformatics Resources网络数据库对上述差异蛋白进行GO和KEGG pathway功能富集分析，结果发现，除疾病相关功能和信号通路外，差异蛋白GO功能主要集中在线粒体、氧化呼吸链复合物1、电子传递、金属结合等，涉及的主要KEGG信号通路有氧化磷酸化和代谢等。

然后，我们从精子差异蛋白中，选取2个(精子顶体相关蛋白4(sperm acrosomeassociated 4，SPACA4)、精子膜蛋白IZUMO2(IZUMO family member 2))，利用ELISA方法对其进行相对含量测定，验证iTRAQ检测结果的准确性。结果如图1所示，2种蛋白的组间差异变化趋势与iTRAQ结果完全一致，表明iTRAQ检测结果的可靠性较高。

所述的SPACA4的mRNA ID号：NM_001177929.1，氨基酸序列的ID号：NP_001171400.1。

(4)种公猪繁殖性能相关精子蛋白标记的确立

①精子SPACA4蛋白含量与种公猪繁殖性能相关性研究

从广东省某原种猪场采集22头在役种公猪的精液，分别制备了相应精子蛋白样品。利用BCA法进行总蛋白浓度测定，并利用ELISA法测定了SPACA4蛋白的相对含量。然后分别进行了SPACA4蛋白相对含量与种公猪配种成绩的相关性分析，结果发现，SPACA4精子蛋白相对含量与参配母猪分娩率、窝产活仔数、繁殖效率的相关系数分别为0.521、0.421和0.533，其中SPACA4相对含量与参配母猪的配种分娩率和繁殖效率呈显著正相关(P<0.05)，而与窝产活仔数存在正相关趋势(p＝0.051，表5)。表明种公猪精子蛋白SPACA4相对含量越高，其繁殖性能越高；精子蛋白SPACA4可以作为反映种公猪繁殖性能的候选蛋白标记。

表5SPACA4相对含量与长白种公猪生产成绩的相关性分析

注：长白种公猪n＝22头，配种母猪头数1510头；*表示在0.05水平(双侧)上显著，**表示在0.01水平(双侧)上显著。

②精子蛋白SPACA4对精子活力和受精能力的影响

采用抗体封闭的方法研究了SPACA4蛋白在维持精子活力和受精能力中的作用。在受精液中以1:200稀释比例添加SPACA4抗体，在不同处理时间用全自动精子分析仪检测精子活力，蛋白抗体对精子活力的影响如表6所示。在处理时间为0min、30min和60min时，对照组与SPACA4抗体组的活力精子比例均无显著差异(P>0.05)。说明添加SPACA4抗体不会对精子活力产生严重影响。

表6SPACA4抗体对精子活力的影响

注：同一列中，上标字母相同表示差异不显著。

在受精液中添加SPACA4抗体(1：200)对体外受精卵裂率的影响如表7所示，SPACA4抗体组的卵裂率为45.29±13.20％，显著低于对照组(P<0.05)。表明SPACA4抗体影响了受精过程，使卵裂率显著降低。表明精子上的SPACA4蛋白对于维持精子的受精能力具有显著的积极作用。该结果的发现，有助于进一步阐释SPACA4蛋白与种公猪繁殖能力的相关关系，确立SPACA4的繁殖性能精子蛋白标记。

表7SPACA4抗体对体外受精卵裂率的影响

分组	卵母细胞数(枚)	卵裂数(枚)	卵裂率(％)
				对照组	429	221	51.45±13.05<sup>a</sup>
SPACA4抗体组	373	162	45.29±13.20<sup>b</sup>

注：组间上标字母不同表示差异显著，p<0.05。

③精子蛋白SPACA4的表达规律与细胞定位研究

为了进一步阐释精子蛋白SPACA4影响精液受精能力和种公猪繁殖性能的途径，我们进行了SPACA4蛋白的表达模式与细胞定位研究。

首先利用RT-PCR技术检测了3月龄公猪睾丸、附睾及成年公猪睾丸、附睾、输精管和心脏组织中SPACA4在RNA水平的表达情况。结果发现，SPACA4在成年公猪的睾丸组织中特异表达，在3月龄公猪的睾丸、附睾及成年公猪的附睾、输精管和心组织中均未见表达(图2)。

随后，对成年公猪睾丸和附睾组织切片进行SPACA4蛋白免疫组化检测，结果如图3显示，成年公猪睾丸的生精细管中可观察到精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子，在各时期精细胞的胞质上均有SPACA4表达；在睾丸的间质组织中可观察到肌样细胞和间质细胞，在间质细胞的胞质上有SPACA4的表达；但在成年公猪附睾组织中未见SPACA4蛋白的表达，这与上述RT-PCR结果相一致。

对精子进行SPACA4蛋白免疫荧光原位杂交检测，结果如图4所示，SPACA4蛋白分布于猪精子头部顶体前端和头部后段，提示其可能在精卵结合过程中发挥作用。

本部分试验研究了SPACA4在公猪主要生殖器官和精子上的表达模式与定位情况，发现其在成年公猪睾丸和精子上均有分布，预示着SPACA4可能在调控精子功能或受精能力方面具有重要作用。

(5)精子蛋白标记SPACA4的筛选阈值及其在种公猪选育中的应用效果

为了验证精子蛋白SPACA4能否作为生物标记选育高繁殖性能种公猪，我们从广东某原种猪场中选择22头种公猪，分别制备其精子蛋白样品，并利用BCA和ELISA方法进行SPACA4蛋白相对含量的测定。然后将22头长白种公猪按繁殖效率从高到低进行排序，选取前11头作为高繁殖组，后11头作为低繁殖组，检验两组间的配种生产成绩、以及SPACA4精子蛋白含量是否存在显著差异。结果如表8所示：高繁殖组的SPACA4精子蛋白含量均显著和极显著高于低繁殖组，并且高繁殖组种公猪参配母猪分娩率、窝均产仔数、窝均活仔数和繁殖效率均极显著高于低繁殖组(P<0.01)。说明精子蛋白SPACA4相对含量确实能够反映种公猪的繁殖性能，可以作为筛选高繁殖性能种公猪的生物标记。

表8不同繁殖性能种公猪的繁殖性能指标及精子蛋白含量的比较

注：同列比较，不同大写上标字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写上标字母表示差异显著(P<0.05)。

(二)应用SPACA4蛋白标记实现高繁殖性能种公猪的选育

为了建立应用精子蛋白标记SPACA4选育高繁殖性能种公猪的具体操作方法，我们将22头种公猪分别按照SPACA4蛋白含量由高到低进行排序，并按照不同的选育(选留)水平对其生产数据进行对比分析，为生产中根据不同的选育强度需求来选育高繁殖性能种公猪提供参考依据。

以SPACA4精子蛋白标记进行种公猪选育，在不同选育水平下的选择效果如表9所示。由表可知，当选择水平为77％时效果最好，组间各指标均差异显著(p<0.05)，此时留种公猪的精子蛋白SPACA4相对含量为(9.50±0.53)×10^-8(表9和图5)。

表9不同选择水平下以SPACA4含量选育种公猪的效果

注：在同一选择水平下，上标字母ns表示组间差异不显著，*表示差异显著，**表示差异极显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用精子蛋白标记SPACA4选育高繁殖性能种公猪的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）测定精子蛋白标记SPACA4的含量，根据生产成绩指标，按照不同的选择比例进行分组，确定出组间各指标存在显著性差异时，以精子蛋白标记SPACA4的相对含量值，作为生产中用于选育高繁殖性能种公猪的参考阈值；所述的生产成绩指标是配种分娩率、窝均产仔数、窝均活仔数、繁殖效率、精子活力、畸形率或卵裂率；

（2）采集待测选育种公猪的精液，提取精子蛋白样品；

（3）定量检测步骤（2）提取的精子蛋白样品中SPACA4蛋白标记的含量，通过与参考阈值的比较来确定待测公猪繁殖性能的高低，从而选育出高繁殖性能种公猪，淘汰低繁殖性能种公猪；

所述的精子蛋白标记SPACA4的相对含量与种公猪繁殖性能呈显著正相关。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的参考阈值为选留率是77%时的SPACA4蛋白相对含量，此时SPACA4蛋白相对含量范围是（8.97～10.03）×10^-8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的精子蛋白样品的制备步骤如下：

制备30%和60%的percoll不连续密度梯度液于15 mL离心管，在其上加入3mL原精液，于20℃下400×g离心20 min，弃去上清，仅留底部精子沉淀，用DPBS离心洗涤精子3遍，精子计数，调整每管5～10×10⁷个精子，依精子数量加入蛋白抽提试剂，裂解0.5h，4℃条件下14000×g离心20min，取上清至另一离心管中，加入1.5倍体积的-20℃预冷丙酮，-20℃下沉淀24h，再4℃下14000×g离心20min，弃上清，吸干残液，于-80℃保存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的定量检测采用利用BCA和ELISA方法。

Images