CN103173558B - 猪肉肉质的鉴定或预测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪肉肉质的鉴定或预测方法，其通过通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定基因glycogenin-1-like、基因PRKAG3的表达量、基因glycogen synthase-1的表达量、基因hexokinase-1的表达量、基因hexokinase-2的表达量来鉴定和预测猪肉的肉质。该方法可以根据对这几个关键基因表达量的检测来对猪肉肉质性能进行判断，避免了凡是肉质测定就必须要进行猪只屠宰的过程，减少了肉质性能检测的成本。通过该公式可以再猪育种工作中增加更多的可靠数据，提高选育准确度，同时替代部分同胞测定，减少企业育种成本。

Description

猪肉肉质的鉴定或预测方法

技术领域：

本发明涉及猪肉肉质的鉴定和预测方法，属于养殖领域。

背景技术：

猪肉是最主要的肉食品来源，养猪业一直是畜牧业中最重要的组成部分之一。随着近代以来世界人口的爆炸式增长和人们生活水平的提高，为人类提供最主要的肉制品来源的养猪业也在快速的发展。在过去的很长一段时间内猪的遗传育种焦点主要集中于用最少的饲料在最短的时间内生产出最多的瘦肉，随着猪育种在提高生长性能和瘦肉率取得进展和人们生活水平的提高，人们在满足了“量”的需求以后开始越来越重视“质”的改善。在上世纪的九十年代肉质成为了人们在育种工作中的关注点，并且随着时间的推移这个关注点成为了投入越来越多的一个焦点。肉质是一个综合性的复杂指标，从肉类科学的立场出发，包括了肉类生产、加工、销售等行业以及消费者的要求，以与肉的食用品质和最终适口性等有关指标为重点的一个综合性指标。具体的衡量指标包括了肌肉的颜色、酸碱度(pH)、坚实度、大理石纹、嫩度、系水率(滴水损失)、风味、膻味、贮存损失与熟肉率等性状。

在这些众多的肉质形状指标中最为重要的是pH。一般说来在牲畜被屠宰后，机体转为无氧呼吸，肌肉组织中肌糖原发生糖酵解反应，生成乳酸不能经血循环运到肝脏进行糖异生合成葡萄糖或糖原，而只能以乳酸存在于肌肉中导致pH值的下降。直到催化发生的相应的酶钝化，反应才终止。在这个过程中无氧糖酵解所产生的乳酸对肌肉纤维细胞的侵蚀作用又会导致肉色、系水力、剪切力和熟肉率等主要肉质指标的变化。所以代表者猪肉当中乳酸和含量多寡的pH值被认为是最重要的肉质指标。

pH被认为是最重要的肉质指标，在现在的肉质形成理论中绝大多数的肉质指标的形成决定于pH所代表的乳酸量的多寡。由于认知的不同对于最终pH的定点有所差异，一般我们认为猪屠宰24h后的pH值为最终的pH，但是也有一些研究者认为24h时pH还不稳定，还有变化的潜力，所以把48hpH作为最终pH较为的正确。通过相关的研究我们发现24h pH和48h pH之间具有着密切的相关性，与他很多的肉质指标之间存在着显著的相关性。与24h和48h pH密切相关的指标包括了肉色、滴水损失、嫩度、风味、异味以及烹煮损失等，结果表明，拥有较低的最终pH的肉的颜色更亮、滴水损失更大、剪切力更小、风味更差、但是异味更浓。研究还发现pH值经常与坚实度相关，最终pH较低或者pH下降速度较快的猪肉的坚实度较差；包括L值、初始pH和与最终pH相关的其他因素的生化指标和肉质性状与滴水损失和烹煮率是息息相关的，即最终pH值越低、糖酵解潜力越高的产品的滴水损失越高，在其他的眼肌中也有类似的结果报道；剪切力、多汁性、风味和膻味都与最终pH以及生化因素之间的相关性显示其对pH的下降相关，有研究指出了剪切力和pH之间相似的关系，即最终pH越高，其可食性更高。

一般说来，肉色与坚实度、滴水损失和嫩度之间存在显著相关性，而较暗的产品的坚实度更高，滴水损失更小，而剪切力更大；大理石纹和坚实度、滴水损失、烹煮损失、和嫩度之间也存在显著性的相关，在所有的这些肉质形状中大理石纹和坚实度的相关性是最高的，通过相关的研究说明有较高的大理石纹的产品也有较高的坚实度，这也反映在了总脂肪含量和坚实度之间的关系上，这有可能是冷冻的猪肉的脂肪凝结造成坚实度的增加，而相关性最小的是大理石纹(或者说脂肪含量)与嫩度之间的相关性，研究表明大理石纹评分较高的猪肉的剪切力较小，当然在这方面存在争议，如蛋白的降解和乳酸的侵蚀也对剪切力造成了影响，一些研究中发现不管是大理石纹还是肌间脂肪含量都与多汁性没有显著的相关性；不管是大理石纹还是肌间脂肪都与风味相关，这主要是因为大理石纹或者肌间脂肪含量决定了风味的主要产生者——脂肪酸的多少。

在常规测定的肉质指标中滴水损失都被认为是最重要的肉质加工指标。通过研究可知道滴水损失和鲜肉表观参数相关：滴水损失和肉色、剪切力和风味都显著相关，总的说来滴水损失较大的猪肉的L值更大，剪切力更小，风味更差，异味更大。综合考虑剪切力、多汁性、风味和异味等指标可以知道越嫩的猪肉的多汁性越好，风味也较好，而异味较少；相关研究还说明烹煮损失越大，产品的多汁性越差，这是因为在烹煮的过程中水分的损失，但是滴水损失和多汁性不成显著相关关系；烹煮损失和滴水损失也成显著相关关系，但相关系数较小(0.16)。

根据以上内容可以知道猪只屠宰以后的最终肉质指标在很大程度上取决于乳酸的产生量，而在猪肉熟化的过程中，糖酵解潜力决定了能够参与合成乳酸的原料的大小。目前在基因、分子层级对于肌肉糖酵解潜力及其转化为乳酸的能力的研究主要集中于糖原合成酶(Glycogen Synthase-1&Glycogen Synthase-2)、糖基转移酶(glycogenin-1-like)、糖原分解过程中的重要调控酶AMPK酶的控制亚基(PRKAG3)以及糖酵解过程中的己糖激酶基因(hexokinase，HK)等主导糖代谢的基因的研究。

糖原合成酶基因根据分布的不同分为1型和2型两种，一般说来1型糖原合成酶基因(Glycogen Synthase-1，GYS-1)主要在肌肉中表达，而2型(Glycogen Synthase-2，GYS-2)则主要在肝脏中表达控制糖原的合成。

GYS-1编码骨骼肌糖原合成的的限速酶——糖原合成酶1，是一个通过肌肉对肉质产生影响的候选基因，通过对5个中国地方品种和3个西方种猪品种的研究发现在GYS1的一个内含子上存在限制性酶切片段多态性，这导致了不同的猪种之间的差异。通过对GYS-1在梅山猪和大白猪的杂交后代之间的连锁相关性分析发现GYS1的限制性酶切位点多态性会对胴体性状产生影响，并且通过RT-PCR对GYS1的表达进行检测发现其在心脏、胃和骨骼肌中有最高的的表达量。经研究发现，糖原合酶主要是通过变构激活G-6-P和通过糖原合成酶激酶以及胰岛素的去磷酸化来控制糖原的合成的，而这两者之间的协调则是通过多个磷酸化位点和变构效应来实现的，即胰岛素促进糖原的合成和积累主要是通过糖原合成酶的变构激活实现的。

glycogenin-1-like位于猪的第13号染色体上，是编码糖基转移酶的主效基因。糖基转移酶是生物体内数量最为庞大的一个酶家族，其主要通过在糖基化反应中催化活化糖基从糖基供体转移到受体的过程来促进糖原的合成。根据研究可以知道糖基转移酶在合成低聚糖、多糖和糖复合物的过程中通过促进工体和受体的结合起着重要的作用，折叠识别是研究酶的催化作用的重要途径，而糖基转移酶是这一方法的第一场实践胜利。

对PRKAG3(Protein kinase AMP-actiated Y3 subunit gene，一磷酸腺苷激活蛋白激酶γ3基因)的研究始于RN基因研究的基因，实验表明在RN^-型动物在骨骼肌的PRKAG3的一个位点(R200Q)发生突变导致高糖原含量，这对于肉质加工是不利的，通过在酵母中的实验发现这个突变会造成糖代谢缺陷，对PRKAG3的调控通路进行研究甚至可以发现其造成的糖代谢紊乱会导致非胰岛素依赖型的糖尿病。PRKAG3对糖代谢的作用是通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作用的，研究表明PRKAG3基因编码了AMPK酶的γ3亚基。在调节细胞能量平衡的联级反应中AMP激活AMPK，并以AMP/ATP的比值调节AMPK的活性，激活以后的AMPK激发反应来使得细胞内的能量平衡，且AMPK可以启动分解、代谢途径从而增加ATP的产生或者关闭代谢途径减少ATP的产生。而根据2012年针对PRKAG3基因在牛肉中的研究通过对4个新发现的PRKAG3的SNP的关联性分析说明其中的T2885C这个SNP与剪切力有着密切的关联，可以作为未来肉牛选育方案的辅助标记。

糖转化为乳酸的过程中最重要的步骤就是糖酵解过程，这个过程中最重要的是限速步骤的三个关键酶：(己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶)以及糖酵解过程中所需的ATP供给，因而控制这些关键酶以及ATP的合成的关键代谢步骤的基因也就是控制糖酵解过程的关键基因。在众多控制己糖激酶、6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶以及ATP代谢的基因中Hexokinase 1、Hexokinase 2、Hexokinase 4、ATP synthase (ATP5A1 &ATP5B)、ATP citrate lyase(ACL)、pyruvate kinase(PKM2)、phosphofructokinase(PFKM)是其中的关键基因，他们共同通过糖酵解这个过程控制着猪屠宰以后乳酸的生成，是影响糖酵解潜力代谢的重要基因。

糖代谢过程中的第一步的磷酸化就是由己糖激酶催化实现的，是整个糖酵解过程的开启。己糖激酶包括了4种同工酶，Hexokinase 1、Hexokinase2和Hexokinase 4是控制其中的三种基因。己糖激酶主要是在催化细胞内葡萄糖、果糖和甘露糖等单糖的代谢中起作用，根据John G等人的研究可以知道己糖激酶1和己糖激酶2绑定于细胞外膜上，在很大程度上依赖于外膜电压依赖型阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)，这种借助于BCL2蛋白家族的信号介导方式会由于线粒体的感受性变化而凋亡；而己糖激酶在肿瘤细胞中的表达上调被认为细胞抑制凋亡提供了一种新陈代谢支持，并支撑了其对抗癌药物的抑制，对于其在肿瘤细胞上的作用机制还只是基于VDAC的一种猜测，另外有证据表明线粒体膜上的胆固醇可能有助于己糖激酶与膜的结合，与此同时VDAC相关蛋白参与了胆固醇的吸收。除了在糖酵解过程中的作用以外，越来越多酵母、植物和哺乳动物体内发现己糖激酶还充当着多功能蛋白的作用，与血糖讯号传感相关，在糖酵解糖基板扮演者碳源激素调节者的作用；通过其与细胞核的相互作用在分子基础上维持糖代谢的转录调控平衡和葡萄糖的动态平衡；通过克拉布特里酵母作为比较功能基因组学模型的研究发现：在克拉布特里阳性酵母中葡萄糖的平衡是随着己糖激酶1、己糖激酶4和ScMig1进入细胞核并形成寡聚合物抑制ScMig1的靶基因的转录实现的，而在克拉布特里阴性酵母中葡萄糖信号的作用机制是未知的。

pH：猪只屠宰以后的无氧糖酵解过程产生乳酸，导致pH值的下降。在这个过程中以glycogenin-1-like、glycogen synthase-1、PRKAG3为代表的基因的表达情况决定了能够参与无氧糖酵解的糖的量的多少；而以hexokinase-1和hexokinase-2为代表的糖酵解过程中的调控基因决定了转化的过程情况。一般说来屠宰以后24h后pH趋于稳定，为pH₂，正常的pH₂为5.7-5.9；PSE猪肉的pH₂值在5.1-5.6之间。最终的pH代表了猪肉肉质的状况。

发明内容：

本发明一方面涉及一种猪肉肉质鉴定或预测方法，其特征在于包括如下步骤：

提取猪总RNA，对RNA进行反转录；

通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定基因glycogenin-1-like、基因PRKAG3的表达量、基因glycogen synthase-1的表达量、基因hexokinase-1的表达量、基因hexokinase-2的表达量；

glycogenin-1-like、glycogen synthase-1、PRKAG3、hexokinase-1和hexokinase-2的表达量通过qRT-PCR得到Ct值，再通过对数据进行处理得到相对表达量，这个过程中以基因ACTB作为看家基因进行校正，即相对表达量是相对于看家基因ACTB的表达量。

实验采用引物基本情况

：是现在最常用的基因相对表达量分析方法，其具体推导方法如下：

PCR指数扩增的公式是：

X_n＝X₀×(1+E_X)ⁿ，     [1]

X_n是第n个循环后目标分子数；

X₀是初始目标分子数；

E_x是目标分子扩增效率；

n是循环数；

C_T代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：

$X_T=X_0\×{(1+E_X)}^{C_{T.X}}=K_X---\left[2\right]$

X_T是目标分子达到设定的阈值时的分子数；

C_T，X是目标分子扩增达到阈值时的循环数；

K_x是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式：

$R_T=R_0\×{(1+E_R)}^{C_{T.R}}=K_R,---\left[3\right]$

用X_T除以R_T得到：

$\frac{X_T}{R_T}=\frac{X_0\×{(1+E_X)}^{C_{T.X}}}{R_0\×{(1+E_R)}^{C_{T.R}}}=\frac{K_X}{K_R}=K.---\left[4\right]$

对于使用Taqman探针的实时扩增而言，XT和RT的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K并不一定等于1。

假设目标序列与内参序列扩增效率相同：

E_X＝E_R＝E.

$\frac{X_0}{R_0}\×{(1+E)}^{C_{T.X}-C_{T.R}}=K.---\left[5\right]$

或：

$X_N\×{(1+E)}^{\mathrm{\Δ}{C}_T}=K,---\left[6\right]$

X_N代表经过均一化处理过的初始目标分子量；ΔC_T表示目标基因和内标基因CT值的差异(C_T，X-C_T，R)

整理上式得：

$X_N=K\×{(1+E)}^{-\mathrm{\Δ}{C}_T}.---\left[7\right]$

最后用任一样本q的X_N除以参照因子(calibrator，cb)的XN得到：

$\frac{X_{N.q}}{X_{N.\mathrm{cb}}}=\frac{K\×{(1+E)}^{-\mathrm{\Δ}{C}_{T.q}}}{K\×{(1+E)}^{-\mathrm{\Δ}{C}_{T.\mathrm{cb}}}}={(1+E)}^{-\mathrm{\Δ\Δ}{C}_T}.---\left[8\right]$

在这里-ΔΔC_T＝-(ΔC_T.q-ΔC_T.cb).

对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg²⁺浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：

$\mathrm{amount\; of\; t}\arg \mathrm{et}=2^{-\mathrm{\Δ\Δ}{C}_T}.---\left[9\right]$

针对看家基因而言，根据上述过程得到相对表达量后再根据所选看家基因的数目不同以相对表达量(单个看家基因)或者相对表达量的几何平均数(多个看家基因)作为校正系数对目的基因的表达量进行校正。

通过以上qRT-PCR实验、荧光定量数据处理方法得到基因的相对表达量，然后根据图2所示的流程进行计算：

经计算，基因相对表达量的平均数：

$\stackrel{\‾}{x_1}=0.00120668649277419,$ $\stackrel{\‾}{x_2}=0.0353560329144349,$

$\stackrel{\‾}{x_3}=0.0477485972030921,$ $\stackrel{\‾}{x_4}=0.0328598301377417,$

$\stackrel{\‾}{x_5}=0.0544126525539175,$ $\stackrel{\‾}{y}=5.72666666666667;$

平方和：

SS₁＝0.0000208861256800988，SS₂＝0.0279622472646969，

SS₃＝0.0531553371029418，SS₄＝0.000700954118810759，

SS₅＝0.0133031788231225，SS_y＝-0.306666666666668；

乘积和：

SP₁₀＝-0.00202135449244822，SP₁₂＝0.000717254699900131，

SP₁₃＝0.00103379295272494，SP₁₄＝-0.0000547063160098692，

SP₁₅＝-0.000336594034121288，SP₂₀＝-0.0744250383961427，

SP₂₃＝0.0338872921681692，SP₂₄＝-0.00241278072115685，

SP₂₅＝-0.01266878086124，SP₃₀＝-0.115272721236794，

SP₃₄＝-0.00256253391205527，SP₃₅＝-0.0187512642010886，

SP₄₀＝0.00816030483968418，SP₄₅＝0.00199663350390745，

SP₅₀＝0.0892312513196637。

将测定结果带入如下的公式计算y值，根据y值的大小鉴定或预测猪肉肉质；

y＝5.823-1789.991×x₁+14.826×x₂+29.259×x₃-31.185×x₄+21.458×x₅

其中：y是最终pH值；

x₁：基因glycogenin-1-like的表达量，

x₂：基因PRKAG3的表达量，

x₃：基因glycogen synthase-1的表达量，

x₄：基因hexokinase-1的表达量，

x₅：基因hexokinase-2的表达量。

本发明的方法适用于活猪或者是已经屠宰的猪，并且可应用于猪育种。避免了凡是肉质测定就必须要进行猪只屠宰的过程，减少了肉质性能检测的成本。通过该公式可以再猪育种工作中增加更多的可靠数据，提高选育准确度，同时替代部分同胞测定，减少企业育种成本。

附图说明：

图1：对定量数据和肉质形状数据的相关性分析找出与各个肉质指标有显著相关性的基因；

图2：通过多元回归求的glycogenin-1-like、glycogensynthase-1、PRKAG3、hexokinase-1和hexokinase-2与最终pH值之间的关系式的数据分析过程，SS_x：自变量x的离均差平方和；SS_y：y的总平方和；SP：乘积和。。

具体实施方式：

下面结合附图1和2详细介绍本发明的具体实施方式，对屠宰猪只的眼肌和眼肌中的糖原合成基因和糖酵解调控基因进行qRT-PCR定量分析，并根据分析结果选出对最终肉质起着决定性作用相关基因。

根以糖原合成基因和糖酵解调控基因作为自变量，以最终pH(24h)为因变量进行简单的多元回归分析得到这些基因的表达量与肉质指标(最终pH)之间的关系式。具体步骤如下图，最终得到glycogenin-1-like、glycogen synthase-1、PRKAG3、hexokinase-1和hexokinase-2与最终pH值之间的关系式：

y＝5.823-1789.991×x₁+14.826×x₂+29.259×x₃-31.185×x₄+21.458×x₅(R＝0.947)

其中：依变量：y是最终pH值(猪只屠宰后24h的pH值)；

自变量：x₁：基因glycogenin-1-like的表达量，

x₂：基因PRKAG3的表达量，

x₃：基因glycogen synthase-1的表达量，

x₄：基因hexokinase-1的表达量，

x₅：基因hexokinase-2的表达量。

通过实验所得公式可以根据对这几个关键基因表达量的检测来对猪肉肉质性能进行判断，避免了凡是肉质测定就必须要进行猪只屠宰的过程，减少了肉质性能检测的成本。通过该公式可以再猪育种工作中增加更多的可靠数据，提高选育准确度，同时替代部分同胞测定，减少企业育种成本。

应当理解的是，上述具体实施方式仅是例举性说明，而不是对本发明的限制，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1. 一种猪肉肉质鉴定或预测方法，其特征在于包括如下步骤：提取猪总RNA，对RNA进行反转录； 通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定基因glycogenin-1-like、基因PRKAG3的表达量、基因glycogen synthase-1的表达量、基因hexokinase-1的表达量、基因hexokinase-2的表达量； 

将测定结果带入如下的公式计算y值，根据y值的大小鉴定或预测猪肉肉质； 

y＝5.823-1789.991×x1+14.826×x2+29.259×x3-31.185×x4+21.458×x5

其中：y是最终pH值； 

x1：基因glycogenin-1-like的相对表达量， 

x2：基因PRKAG3的相对表达量， 

x3：基因glycogen synthase-1的相对表达量， 

x4：基因hexokinase-1的相对表达量， 

x5：基因hexokinase-2的相对表达量； 

所述的猪总RNA是活猪或者是已经屠宰的猪,

所述相对表达量是相对于看家基因ACTB的表达量。  

2. 权利要求1所述的方法在猪育种中的应用。