CN1768581B - 一种用于优质嫩度商品猪筛选的方法及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于猪肉嫩度的选育方法，包括用于种猪的嫩度选育，以生产具有最优嫩度的商品肥育猪的类型A，或用于商品肥育猪群中最优嫩度的商品肥育猪只的筛选的类型B；其特征是方法包括以下的步骤：(1)猪耳组织基因组DNA的提取；(2)猪CAST基因的PCR扩增；(3)PCR产物酶切反应，获得酶切图谱；(4)根据获得的酶切图谱与阳性样品酶切图谱的对照，确定待测猪CAST基因的基因型；(5)根据上述测定的基因型，确定待测猪的交配组合或根据上述测定的基因型，确定待测猪是否为最优嫩度的商品肥育猪。本发明还涉及用于实施上述方法的检测试剂盒。

Description

一种用于优质嫩度商品猪筛选的方法及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及动物分子育种方法，具体是一种用于最优嫩度商品猪筛选的方法及其检测试剂盒。

背景技术

近半个世纪以来，动物遗传育种者对于猪的研究一直以提高生长速度和瘦肉率为主攻目标，并取得了巨大的成功，使猪的生长速度、饲料转化效率和瘦肉率得到很大提高，但是这种高强度的选择却带来了猪肉品质的下降。近年来，劣质猪肉不断出现，严重地影响了养猪生产和猪肉加工业。因此，猪的肌肉品质改良成为新的研究热点。

肉的嫩度是反映猪肉品质的一个重要指标，其含义是消费者对肉的口感惬意程度。人们通常所谓的肉嫩和老化，是主观的定性描述，客观上是对骨骼肌各种蛋白质结构特性的总概括(陈润生，1995)。几十年来，人们试图用物理的和化学的方法测定嫩度，尤其是想用各种复杂机械来模拟人的咀嚼动作，但始终未能找出被普遍接受的方法(周光宏等，1999；Pearson，A.M.1963)。早在20世纪30年代初由Warner(1928)和Bratzler(1932)设计的一种简单的剪切仪(ShearDevice)，一直沿用至今，被国际认可。陈润生和马小愚等(1988)根据剪切力(Shear force)原理设计的C-LM型肌肉嫩度计被国内普遍应用。正常肉平均剪切力值愈高表示肉愈老化，剪切力值愈低则肉愈嫩。一般来说剪切力值大于4kg就比较老了，难以被消费者所接受(周光宏等，1999)。

传统的猪肉嫩度选育以剪切力值测定为基础，根据种猪的全同胞、半同胞、后裔等亲属屠宰后的剪切力测定值来估测该种猪的育种值，然后决定是否留种。该方法有很大的局限性，而且费时、费力。分子生物学的兴起尤其是分子标记辅助选择技术在其他性状上的成功应用，向我们提供了一项新的途径。

目前，还没有专门用于猪肉嫩度的分子标记辅助育种方法及其相关的检测试剂盒。

发明的内容

本发明的目的之一是提供一种基于分子标记辅助育种技术的最优嫩度商品猪筛选的方法。

本发明的另一目的是提供用于所述基于分子标记辅助育种技术的、最优嫩度商品猪筛选方法的检测试剂盒。

本发明所述方法的前提是嫩度的分子标记辅助选择体系的建立，首要是找到影响猪肉嫩度的主效基因或其他分子标记。钙蛋白酶系统是细胞中普遍存在一种蛋白质水解体系，参与了大量生长和代谢过程。钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)是钙蛋白酶系统的重要成员之一，是钙蛋白酶(calpain)特异性的抑制剂。CAST可抑制钙蛋白酶的活性，降低蛋白质的水解。大量的研究表明，CAST与肉的嫩度相关：T.D.Pringle(2000)等在杂交牛试验中证实CAST与μ-calpain的活性比值与嫩度高度相关。Delgado等(2001)肉的嫩化与CAST的活性及降解速度有关。因此，CAST基因成为研究肉嫩度一个极有希望的侯选基因。

为了建立猪肉嫩度的分子标记辅助选择体系，以加速猪肉嫩度的改良。我们选择CAST基因作为目标标记。为确认CAST基因的多态是否与猪肉的嫩度相关，我们运用PCR-RFLP技术对72头猪的CAST基因的多态进行了研究，并借助Popgen32和SPSS软件，就其基因型与猪肉嫩度作了相关性分析。结果：嫩度在HinfI/MspI/RsaI三酶切产生的部分基因型间差异显著，以基因型ABDDEF剪切力值最小，肉质越嫩。由此得出结论：猪CAST基因可作为嫩度的遗传标记，应用育种实践。

为实现本发明的第一目的而采用的技术方案是这样的，即一种用于最优嫩度商品猪筛选的方法，其特征是方法包括以下的步骤：

类型A：用于筛选种猪的最佳交配组合，以生产具有最优嫩度的商品肥育猪

(1)猪耳组织基因组DNA的提取；

(2)猪CAST基因的PCR扩增；

(3)PCR产物酶切反应；

(4)猪CAST基因的基因型的确定；

(5)最佳交配组合的确定；

或类型B：主要用于商品肥育猪群中最优嫩度的商品肥育猪只的筛选

(1)猪耳组织基因组DNA的提取；

(2)猪CAST基因的PCR扩增；

(3)PCR产物酶切反应；

(4)猪CAST基因的基因型的确定；

(5)最优嫩度的商品肥育猪只的确定。

为实现本发明的第二目的而采用的技术方案是这样的，即一种用于最优嫩度商品猪筛选方法的检测试剂盒，试剂盒包括基因组DNA提取试剂、PCR扩增试剂、酶切分型试剂；其中酶切分型试剂有两种类型：A和B。类型A主要用于筛选种猪的最佳交配组合，以生产具有最优嫩度的商品肥育猪；类型B主要用于商品肥育猪群中最优嫩度的商品肥育猪只的筛选。

本发明通过对与猪肉嫩度紧密相关的CAST基因进行分型，确定最佳交配组合来选育猪肉嫩度的方法具有独特性。而传统的猪肉嫩度选育以剪切力值测定为基础，根据种猪的全同胞、半同胞、后裔等亲属屠宰后的剪切力测定值来估测该种猪的育种值，然后决定选留。该方法具有很大的局限性，而且费时、费力。本发明所建立的猪肉嫩度选育的方法：通过PCR-RFLP技术对种猪的CAST基因进行基因分型，确定最佳的交配组合，从而生产基因型为ABDDEF的猪作为肥育商品猪。该方法不但节省了屠宰测定实验所花费的资金，而且可以早期选种，极大地缩短了育种周期。同时，本发明所提供的方法和试剂盒可用于猪肉嫩度选育。通过该方法，可加速猪肉的嫩度改良，进而生产出符合人类口味的猪肉，市场前景广阔。

附图说明

附图1为HinfI酶切产物凝胶电泳图谱；

图中，M：DNA Marker DL2000，1、4：AA型，2：BB型，3，5：AB型。

附图2为Msp I酶切产物凝胶电泳图谱；

图中M：DNA Marker DL2000，1、4：CC型，2：DD型，3，5：CD型。

附图3RSA I酶切产物凝胶电泳图谱；

图中M：DNA Marker DL2000，1、2、3：EE型，4：EF型，5：FF型

具体实施方式

实施例1CAST基因的多态与猪肉嫩度的相关性实验

从遗传学角度讲，猪肉嫩度是一个数量性状，尽管受许多微效基因控制，但是也存在对其影响极大的主效基因。钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)是钙蛋白酶系统的重要成员之一，是钙蛋白酶(calpain)特异性的抑制剂。CAST可抑制钙蛋白酶的活性，降低蛋白质的水解。大量的研究表明，CAST与肉的嫩度相关：T.D.Pringle(2000)等在杂交牛试验中证实CAST与μ-calpain的活性比值与嫩度高度相关。Delgado等(2001)肉的嫩化与CAST的活性及降解速度有关。因此，CAST基因成为研究肉嫩度一个极有希望的侯选基因。

为确认CAST基因的多态是否与猪肉的嫩度相关，我们运用PCR-RFLP技术对72头猪的CAST基因的多态进行了研究，并借助Popgen32和SPSS软件，就其基因型与猪肉嫩度作了相关性分析。结果：嫩度在在HinfI/MspI/RsaI三酶切产生的部分基因型差异显著，以基因型ABDDEF剪切力值最小，肉质越嫩。由此得出结论：猪CAST基因可作为嫩度的遗传标记，应用育种实践。

本发明方法正是基于上述结论，该方法原理可概括为：CAST基因是影响猪肉嫩度的一个重要的分子标记，以基因型ABDDEF剪切力值最小，肉质越嫩，故通过PCR-RFLP技术对种猪群猪只的CAST基因进行基因分型，确定最佳的交配组合，从而生产基因型为ABDDEF的猪作为肥育商品猪。该原理也可用于商品肥育猪群中最优嫩度的商品肥育猪只的筛选。

实施例2最优嫩度商品猪筛选方法

方法包括类型A：主要用于筛选种猪的最佳交配组合，以生产具有最优嫩度的商品肥育猪，步骤如下：

(1)猪耳组织基因组DNA的提取；

(2)猪CAST基因的PCR扩增；

(3)PCR产物酶切反应；

(4)猪CAST基因的基因型的确定；

(5)最佳交配组合的确定；

或类型B：主要用于商品肥育猪群中最优嫩度的商品肥育猪只的筛选，步骤如下：

(1)猪耳组织基因组DNA的提取；

(2)猪CAST基因的PCR扩增；

(3)PCR产物酶切反应；

(4)猪CAST基因的基因型的确定；

(5)最优嫩度的商品肥育猪只的确定；

具体实施步骤：

类型A：主要用于筛选种猪的最佳交配组合，以生产具有最优嫩度的商品肥育：

(1)猪耳组织基因组DNA的提取

用上海华舜生产的少量组织/细胞基因组DNA抽提试剂盒(W6501)提取猪耳组织基因组DNA。依照其说明进行，稍做修改。具体如下：

①、取待测猪的耳组织约1g盛于70％酒精中，-20℃冻存。

②、剪取20mg，用剪刀/刀片将组织切小后，移入离心管中。加入400ulDL液，振荡悬浮后，置65℃温浴使小块组织消失(15分钟以上)，期间来回颠倒离心管数次。再加入200ul DT液，20ul RNase A和25ulProteinase K，迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。置65℃温浴15-30分钟，期间来回颠倒离心管数次。离心3分钟，将上清移至另外一个离心管中。

③、加入200ul异丙醇，剧烈颠倒离心管使溶液混匀后，移取600ul至吸附柱中，离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。将剩余的全部移至吸附柱中，离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

④、加入500ul W1液，静置1分钟后，离心30秒。

⑤、将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。加入500ul W1液，离心15秒。

⑥、弃掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。离心1分钟。

⑦、将吸附柱移入一个干净的1.5ml离心管中。在吸附膜中央加入100ulT1液，65℃静置5分钟后，离心1分钟。将1.5ml离心管(DNA)-20℃保存。

(2)猪CAST基因的PCR扩增

引物序列来源于文章：C M Ernst(1998)。上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’，下游引物：5’-TGCAGATACACCAGTAACAG-3’。DNA Marker DL2000，Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司的.

扩增反应总体积为30μL，其中10×反应缓冲液3μL，MgCL₂1.5mM，每种dNTP200μM，每种引物1μM，1U Taq DNA聚合酶，50ng基因组DNA，用灭菌水补足30μL。反应条件为94℃热变性4min，然后94℃40sec，60℃复性1min，72℃延伸1.5min，33个循环，最后72℃延伸10min。

将所扩增的PCR产物、DNA Marker DL2000、任意一个阳性样品各5μL在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测是否扩增出目标片段。

(3)PCR产物酶切反应

将扩增出目标片段的PCR产物，利用三种限制性酶分别进行酶切。同时，对阳性样品1(AA)，2(BB)进行HinfI酶切；阳性样品3(DD)进行MspI酶切；阳性样品4(EE)，5(FF)进行RsaI酶切。具体操作如下：

PCR产物、阳性样品1(AA)，2(BB)的HinfI酶切：

总反应体系为20μL，其中扩增产物(或阳性样品)为10-15μL，限制性内切核酸酶HinfI 1μL，酶切缓冲液10×H Buffer 2μL，然后加双蒸水至20μL，37℃恒温2小时。

PCR产物、阳性样品3(DD)的MspI酶切：

总反应体系为20μL，其中扩增产物(或阳性样品)为10-15μL，限制性内切核酸酶MspI 1μL，酶切缓冲液10×T Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，然后加双蒸水至20μL，37℃恒温2小时。

PCR产物、阳性样品4(EE)，5(FF)的RsaI酶切：

总反应体系为20μL，其中扩增产物(或阳性样品)为10-15μL，限制性内切核酸酶RsaI 1μL，酶切缓冲液10×T Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，然后加双蒸水至20μL，37℃恒温2小时。

(4)猪CAST基因的基因型的确定

酶切产物上样于2％的琼脂糖凝胶，同时将DNA Marker DL2000、阳性样品在同种酶切下的酶切产物同时上样，依次确定待检猪的基因型。

如果已检测的PCR产物的HinfI酶切图谱与阳性样品1(AA)的HinfI酶切图谱完全吻合，则定义其基因型为：AA型。如果已检测的PCR产物的HinfI酶切图谱与阳性样品2(BB)的HinfI酶切图谱完全吻合，则定义其基因型为：BB型。如果已检测的PCR产物的HinfI酶切图谱与阳性样品1(AA)、2(BB)的HinfI酶切图谱都不吻合，则直接淘汰该号种猪。

如果已检测的PCR产物的MspI酶切图谱与阳性样品3(DD)的MspI酶切图谱完全吻合，则定义其基因型为：DD型。如果已检测的PCR产物的MspI酶切图谱与阳性样品3(DD)的MspI酶切图谱不吻合，则直接淘汰该号种猪。

如果已检测的PCR产物的RsaI酶切图谱与阳性样品4(EE)的RsaI酶切图谱完全吻合，则定义其基因型为：EE型。如果已检测的PCR产物的RsaI酶切图谱与阳性样品5(FF)的RsaI酶切图谱完全吻合，则定义其基因型为：FF型。如果已检测的PCR产物的RsaI酶切图谱与阳性样品4(EE)、5(FF)的RsaI酶切图谱都不吻合，则直接淘汰该号种猪。

经过三次酶切后，对于HinfI酶切为AA型且MspI酶切为DD型且RsaI酶切为EE型的种猪，定义其CAST基因的基因型为：ADE；

经过三次酶切后，对于HinfI酶切为BB型且MspI酶切为DD型且RsaI酶切为EE型的种猪，定义其CAST基因的基因型为：BDE；

经过三次酶切后，对于HinfI酶切为AA型且MspI酶切为DD型且RsaI酶切为FF型的种猪，定义其CAST基因的基因型为：ADF；

经过三次酶切后，对于HinfI酶切为BB型且MspI酶切为DD型且RsaI酶切为FF型的种猪，定义其CAST基因的基因型为：BDF；

(5)确定交配组合

为保证后代的商品肥育猪都为具有最优嫩度基因型的商品猪，我们要定向地选择下列任意一个交配组合：

CAST基因型为ADE的公猪与CAST基因型为BDF的母猪交配；

CAST基因型为ADF的公猪与CAST基因型为BDE的母猪交配；

CAST基因型为BDE的公猪与CAST基因型为ADF的母猪交配；

CAST基因型为BDF的公猪与CAST基因型为ADE的母猪交配。

下面我们以第一个交配组合为例从理论上证明该交配组合产生的后代商品肥育猪都为具有最优嫩度基因型的商品猪。

遗传学理论认为，商品猪CAST基因的基因型来源于其亲代种猪CAST基因的基因型，而且是父母产生配子基因型的组合。对于CAST基因型为ADE的公猪，其只能产生ADE型的精子；对于CAST基因的基因型为BDF的母猪，其只能产生BDF型的卵子，当精子与卵子结合并发育成个体时，其CAST基因的基因型一定为ABDDEF，而这正是最佳肉质嫩度猪所具有的基因型。

其他交配组合应用同样的理论也可证明交配组合产生的后代商品肥育猪都为具有最优嫩度ABDDEF基因型的商品猪。

类型B：主要用于商品肥育猪群中最优嫩度的商品肥育猪只的筛选

(1)猪耳组织基因组DNA的提取

用上海华舜生产的少量组织/细胞基因组DNA抽提试剂盒(W6501)提取猪耳组织基因组DNA。依照其说明进行，稍做修改。具体如下：

①、取待测猪的耳组织约1g盛于70％酒精中，-20℃冻存.

②、剪取20mg，用剪刀/刀片将组织切小后，移入离心管中。加入400uL DL液，振荡悬浮后，置65℃温浴使小块组织消失(15分钟以上)，期间来回颠倒离心管数次。再加入200ul DT液，20ul RNaseA和25ulProteinase K，迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。置65℃温浴15-30分钟，期间来回颠倒离心管数次。离心3分钟，将上清移至另外一个离心管中。

③、加入200ul异丙醇，剧烈颠倒离心管使溶液混匀后，移取600ul至吸附柱中，离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。将剩余的全部移至吸附柱中，离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

④、加入500ul W1液，静置1分钟后，离心30秒。

⑤、将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。加入500ul W1液，离心15秒。

秒⑥、弃掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。离心1分钟。

秒⑦、将吸附柱移入一个干净的1.5ml离心管中。在吸附膜中央加入100ulT1液，65℃静置5分钟后，离心1分钟。将1.5ml离心管(DNA)-20℃保存。

(2)猪CAST基因的PCR扩增

引物序列来源于文章：C M Ernst(1998)。上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’，下游引物：5’-TGCAGATACACCAGTAACAG 3’。DNA Marker DL2000，Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司的.

扩增反应总体积为30μL，其中10×反应缓冲液3μL，MgCL₂1.5mM，每种dNTP200μM，每种引物1μM，1U Taq DNA聚合酶，50ng基因组DNA，用灭菌水补足30μL。反应条件为94℃热变性4min，然后94℃40sec，60℃复性1min，72℃延伸1.5min，33个循环，最后72℃延伸10min。

将所扩增的PCR产物、DNA Marker DL2000、任意一个阳性样品各5μL在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测是否扩增出目标片段。

(3)PCR产物酶切反应

将扩增出目标片段的PCR产物，利用三种限制性酶分别进行酶切。同时，对阳性样品0(ABDDEF)分别进行HinfI酶切、MspI酶切和RsaI酶切。具体操作如下：

PCR产物、阳性样品0(ABDDEF)的HinfI酶切：

总反应体系为20μL，其中扩增产物(或阳性样品)为10-15μL，限制性内切核酸酶HinfI 1μL，酶切缓冲液10×H Buffer 2μL，然后加双蒸水至20μL，37℃恒温2小时。

PCR产物、阳性样品0(ABDDEF)的MspI酶切：

总反应体系为20μL，其中扩增产物(或阳性样品)为10-15μL，限制性内切核酸酶MspI 1μL，酶切缓冲液10×T Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，然后加双蒸水至20μL，37℃恒温2小时。

PCR产物、阳性样品0(ABDDEF)的RsaI酶切：

总反应体系为20μL，其中扩增产物(或阳性样品)为10-15μL，限制性内切核酸酶RsaI1μL，酶切缓冲液10×T Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，然后加双蒸水至20μL，37℃恒温2小时。

(4)猪CAST基因的基因型的确定

酶切产物上样于2％的琼脂糖凝胶，同时将DNA Marker DL2000、阳性样品在同种酶切下的酶切产物同时上样，依次确定待检猪的基因型。

如果已检测的PCR产物的HinfI酶切图谱与阳性样品0(ABDDEF)的HinfI酶切图谱完全吻合，则定义其基因型为：AB型。否则，直接淘汰该号商品猪。

如果已检测的PCR产物的MspI酶切图谱与阳性样品0(ABDDEF)的MspI酶切图谱完全吻合，则定义其基因型为：DD型。否则，直接淘汰该号商品猪。

如果已检测的PCR产物的RsaI酶切图谱与阳性样品0(ABDDEF)的RsaI酶切图谱完全吻合，则定义其基因型为：EF型。否则，直接淘汰该号商品猪。

经过三次酶切后，对于HinfI酶切为AB型且MspI酶切为DD型且RsaI酶切为EF型的商品猪，定义其CAST基因的基因型为：ABDDEF。

(5)最优嫩度的商品肥育猪只的确定

在商品肥育猪群中，选择CAST基因的基因型为ABDDEF的猪留下，作为商品肥育用，该商品猪的猪肉将来具有最优嫩度。

实施例3用于猪肉嫩度的选育方法的试剂盒

上述试剂盒包括基因组DNA提取试剂、PCR扩增试剂、酶切分型试剂；其中酶切分型试剂有两种类型：A和B，其中类型A主要用于种猪的嫩度选育，以生产具有最优嫩度的商品肥育猪；类型B主要用于商品肥育猪群中最优嫩度的商品肥育猪只的筛选。其中：

(1)基因组DNA提取试剂：

上海华舜生产的少量组织/细胞基因组DNA抽提试剂盒(W6501)，包括：吸附柱50套，收集管50支，DT液15ml，DL液20ml，W1液12ml，T1液10ml，Proteinase K 25mg，Rnase A 4mg。

(2)PCR扩增试剂：

大连宝生物工程有限公司生产的PCR扩增相关试剂(产品编号：DR001AM，包括：TaKaRa Taq(5u/ul)50ul，10×PCR Buffer(Mg²⁺free)1mL，MgCL₂(25mM)1mL，dNTP Mixture(2.5mM)800ul，6×Loading Buffer 1mL)

分子标准DNA Marker DL2000(产品编号：D501A)。

北京赛百胜生物技术有限公司合成的2.5OD引物。引物序列来源于文章：C M Ernst(1998)。具体序列为：上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’，下游引物：5’-TGCAGATACACCAGTAACAG-3’。

(3)酶切分型试剂：

酶切分型试剂有两种类型：A和B。类型A主要用于种猪的嫩度选育，以生产具有最优嫩度的商品肥育猪。类型B主要用于商品肥育猪群中最优嫩度的商品肥育猪只的筛选。

A类酶切分型试剂：

包括大连宝生物工程有限公司生产的三种限制性内切酶：HinfI(产品编号：D1061A，1500U)，MspI(产品编号：D1150A，750U)，RsaI(产品编号：D1116A，300U)，还包括由我们提供的5个阳性样品，其编号依次为：1(AA)，2(BB)，3(DD)，4(EE)，5(FF)。每个阳性样品浓度≥10纳克/微升，体积500微升。

关于上述阳性样品的解释：上述阳性样品是我们依次按照实施例2猪肉嫩度的选育方法中的步骤(1)、(2)、(3)进行后的PCR产物，该产物依照(4)步骤进行了酶切验证：1号阳性样品，该PCR产物在HinfI酶切图谱中包含一条大小约为700bp特征性片段，故定义HinfI酶切的基因型为AA型，如图1中的泳道1或泳道4所示；2号阳性样品，该PCR产物在HinfI酶切图谱中包含一条大小约为450bp特征性片段，故定义HinfI酶切的基因型为BB型，如图1中的泳道2所示；3号阳性样品，该PCR产物在MspI酶切图谱中包含一条大小约为720bp特征性片段，故定义MspI酶切的基因型为DD型，如图2中的泳道2或泳道4所示；4号在阳性样品，该PCR产物在RsaI酶切图谱中包含一条大小约为400bp特征性片段，故定义RsaI酶切的基因型为EE型，如图3中的泳道1或泳道2或泳道3所示；5号阳性样品，该PCR产物在RsaI酶切图谱中包含一条大小约为250bp特征性片段，故定义RsaI酶切的基因型为FF型，如图3中的泳道5所示。

B类酶切分型试剂：

包括大连宝生物工程有限公司生产的三种限制性内切酶：HinfI(产品编号：D1061A，1500U)，MspI(产品编号：D1150A，750U)，RsaI(产品编号：D1116A，300U)，还包括由我们提供的1个阳性样品，编号为：0(ABDDEF)。该阳性样品浓度≥10纳克/微升，体积500微升。

关于0号(ABDDEF)阳性样品的解释：该阳性样品是我们依次按照实施例2猪肉嫩度的选育方法中的步骤(1)、(2)、(3)进行后的PCR产物，该产物依照(4)步骤进行了酶切验证：0号阳性样品，该PCR产物在HinfI酶切图谱中包含两条大小约为700bp、450bp特征性片段，故定义HinfI酶切的基因型为AB型，如图1中的泳道3或泳道5所示；0号阳性样品，该PCR产物在MspI酶切图谱中包含一条大小约为720bp特征性片段，故定义MspI酶切的基因型为DD型，如图2中的泳道2或泳道4所示；0号在阳性样品，该PCR产物在RsaI酶切图谱中包含两条大小约为400bp、250bp特征性片段，故定义RsaI酶切的基因型为EF型，如图3中的泳道4所示。综合三种酶切结果，0号阳性样品在三种酶切后的基因型为：ABDDEF型。

序列表

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工合成的用于PCR扩增的引物序列

<400>1

gcgtgctcataaagaaaaagc   21

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工合成的用于PCR扩增的引物序列

<400>2

tgcagatacaccagtaacag 20

Claims (4)

1.一种用于优质嫩度商品猪筛选的方法，用于筛选种猪的交配组合，以生产优质嫩度商品肥育猪，其特征是方法包括以下的步骤：

(1)、建立阳性样品：用上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’和下游引物：5’-TGCAGATACACCAGTAACAG-3’扩增猪CAST基因后的PCR产物酶切及筛选后得到：将满足在HinfI酶切图谱中包含一条大小约为700bp特征性片段的PCR产物设定为1号阳性样品；将在HinfI酶切图谱中包含一条大小约为450bp特征性片段的PCR产物设定为2号阳性样品；将在MspI酶切图谱中包含一条大小约为720bp特征性片段的PCR产物设定为3号阳性样品；将在RsaI酶切图谱中包含一条大小约为400bp特征性片段的PCR产物设定为4号阳性样品；将在RsaI酶切图谱中包含一条大小约为250bp特征性片段的PCR产物设定为5号阳性样品；

(2)待测种猪耳组织基因组DNA的提取；

(3)待测种猪CAST基因的PCR扩增；

用上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’和下游引物：

5’-TGCAGATACACCAGTAACAG-3’扩增猪CAST基因得PCR产物；

(4)CAST基因的酶切分型及待测种猪交配组合的确定：

将步骤(3)获得的PCR产物和步骤(1)获得的1号阳性样品、2号阳性样品分别通过HinfI酶切反应，比较待测种猪CAST基因PCR产物的酶切图谱与阳性样品的酶切图谱是否吻合；将步骤(3)获得的PCR产物和获得的3号阳性样品分别通过MspI酶切反应，比较待测种猪CAST基因PCR产物的酶切图谱与阳性样品的酶切图谱是否吻合；将步骤(3)获得的PCR产物和获得的4号阳性样品、5号阳性样品分别通过RsaI酶切反应，比较待测种猪CAST基因PCR产物的酶切图谱与阳性样品的酶切图谱是否吻合；然后选择下列交配组合生产子代为优质嫩度商品肥育猪：

选择酶切图谱分别与1号阳性样品、3号阳性样品、4号阳性样品酶切图谱完全吻合的公猪与酶切图谱分别与2号阳性样品、3号阳性样品、5号阳性样品酶切图谱完全吻合的母猪交配；

选择酶切图谱分别与1号阳性样品、3号阳性样品、5号阳性样品酶切图谱完全吻合的的公猪与酶切图谱分别与2号阳性样品、3号阳性样品、4号阳性样品酶切图谱完全吻合的母猪交配；

选择酶切图谱分别与2号阳性样品、3号阳性样品、4号阳性样品酶切图谱完全吻合的的公猪与酶切图谱分别与1号阳性样品、3号阳性样品、5号阳性样品酶切图谱完全吻合的母猪交配；

选择酶切图谱分别与2号阳性样品、3号阳性样品、5号阳性样品酶切图谱完全吻合的的公猪与酶切图谱分别与1号阳性样品、3号阳性样品、4号阳性样品酶切图谱完全吻合的母猪交配。

2.一种用于优质嫩度商品猪筛选的方法，用于商品肥育猪群中优质嫩度商品肥育猪只的筛选，其特征是方法包括以下的步骤：

(1)、建立阳性样品：用上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’和下游引物：5’-TGCAGATACACCAGTAACAG-3’扩增猪CAST基因后的PCR产物酶切及筛选后得到：将在HinfI酶切图谱中包含两条大小约为700bp、450bp特征性片段、在MspI酶切图谱中包含一条大小约为720bp特征性片段、并在RsaI酶切图谱中包含两条大小约为400bp、250bp特征性片段的PCR产物设定为0号阳性样品；

(2)待测商品肥育猪耳组织基因组DNA的提取；

(3)待测商品肥育猪CAST基因的PCR扩增；

用上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’和下游引物：5’-TGCAGATACACCAGTAACAG-3’扩增猪CAST基因得PCR产物；

(4)CAST基因的酶切分型及待测商品育肥猪的选留

将步骤(3)获得的PCR产物和和步骤(1)获得的0号阳性样品依次分别通过HinfI、MspI和RsaI酶切反应，酶切产物上样于2％的琼脂糖凝胶，同时将DNA Marker DL2000上样，逐一比较后确定待检猪是否为优质嫩度：如果两者的HinfI酶切图谱、MspI酶切图谱和RsaI酶切酶切图谱均完全吻合，则待测商品肥育猪为优质嫩度，可以留下；否则，直接淘汰该商品肥育猪。

3.一种用于优质嫩度商品猪筛选方法的检测试剂盒，用于筛选种猪的交配组合，其特征是：所述试剂盒包括基因组DNA提取试剂、PCR扩增试剂、酶切分型试剂；其中酶切分型试剂包括：

A类酶切分型试剂，其组份为：HinfI、MspI、RsaI，还包括1号阳性样品、2号阳性样品、3号阳性样品、4号阳性样品及5号阳性样品；每个阳性样品浓度≥10纳克/微升，体积500微升；

所述1号阳性样品、2号阳性样品、3号阳性样品、4号阳性样品、5号阳性样品采用如下步骤制备：

(1)猪耳组织基因组DNA的提取；

(2)猪CAST基因的PCR扩增；

用上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’和下游引物：5’-TGCAGATACACCAGTAACAG-3’扩增猪CAST基因的PCR产物；

(3)PCR产物的酶切及阳性样品的筛选：

将步骤(2)获得的PCR产物酶切后进行筛选：将满足在HinfI酶切图谱中包含一条大小约为700bp特征性片段的PCR产物设定为1号阳性样品；将在HinfI酶切图谱中包含一条大小约为450bp特征性片段的PCR产物设定为2号阳性样品；将在MspI酶切图谱中包含一条大小约为720bp特征性片段的PCR产物设定为3号阳性样品；将在RsaI酶切图谱中包含一条大小约为400bp特征性片段的PCR产物设定为4号阳性样品；将在RsaI酶切图谱中包含一条大小约为250bp特征性片段的PCR产物设定为5号阳性样品。

4.一种用于优质嫩度商品猪筛选方法的检测试剂盒，用于商品肥育猪群中优质嫩度的商品肥育猪只的筛选；其特征是：所述试剂盒包括基因组DNA提取试剂、PCR扩增试剂、酶切分型试剂；其中酶切分型试剂包括：

B类酶切分型试剂，其组份为：HinfI、MspI、RsaI及0号阳性样品，该阳性样品浓度≥10纳克/微升，体积500微升；

所述0号阳性样品采用如下步骤制备：

(1)猪耳组织基因组DNA的提取；

(2)猪CAST基因的PCR扩增；

用上游引物：5’-GCGTGCTCATAAAGAAAAAGC-3’和下游引物：5’-TGCAGATACACCAGTAACAG-3’扩增猪CAST基因的PCR产物；

(3)PCR产物的酶切及阳性样品的筛选：

将步骤(2)获得的PCR产物酶切后进行筛选：将在HinfI酶切图谱中包含两条大小约为700bp、450bp特征性片段、在MspI酶切图谱中包含一条大小约为720bp特征性片段、并在RsaI酶切图谱中包含两条大小约为400bp、250bp特征性片段的PCR产物设定为0号阳性样品。

Images