CN111944918B

CN111944918B - 一种基于染色体结构变异的桃果实形状早期检测方法

Info

Publication number: CN111944918B
Application number: CN202010636253.3A
Authority: CN
Inventors: 谢华; 徐摇光; 官健涛; 于洋
Original assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Current assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111944918A

Abstract

本发明涉及一种基于PCR技术进行栽培桃果形早期鉴定的方法。本发明PCR检测采用4对引物，包括1对用于鉴定INV56F(Flat)的引物(P1)，以及3对用于鉴定INV56R(Round)的引物(P2/3/4)。鉴定方法是以待测桃基因组DNA为模板，先用P1、P2分别进行扩增，对扩增产物进行检测，如果获得1391bp及705bp两条特异扩增条带，则果形为扁；如果仅有705bp特异扩增条带，则果形为圆；如果没有获得705bp的条带，则继续用P3引物对进行扩增，如果获得981bp的特异扩增产物条带，则果形为圆，否则再继续用P4引物进行扩增；如果获得651bp的特异扩增产物条带，则果形为圆，否则果形暂时不能判断。该方法引物特异性高，设置对照引物，可有效防止假阴性的产生，具有操作简单、鉴别快速，结果准确等特点。

Description

一种基于染色体结构变异的桃果实形状早期检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及桃果实形状的检测，更具体涉及基于染色体结构变异的桃果实形状早期检测方法。

技术背景

桃广泛生长于温带及亚热带地区，具有重要经济价值。果实形状是桃非常显著的农艺特征之一，分为圆形桃和扁形桃。扁形桃又称蟠桃，是桃的一个变种，可食用比例高，风味甜而多汁，深受我国消费者喜爱，近年来在桃消费市场中所占比例正逐渐增大。蟠桃起源于我国，历史悠久，十八世纪中期，蟠桃传入西方，并很快获得当地消费者青睐，具有很大的市场空间。相比于圆形桃来说，蟠桃的种质资源非常有限，又由于丰产性差、易裂顶等因素的影响，使得蟠桃的育种工作发展缓慢。

现有的研究表明，桃果形性状由6号染色体上的S基因控制，蟠桃为杂合显性基因型Ss，圆形桃为纯合隐性基因型ss(Lesley,JW.(1940).“A genetic study of saucerfruit shape and other characters in the peach.”Proc Am Soc Hortic Sci 37:218–222.)。一些分子标记被报道与该性状紧密连锁，例如：SSR分子标记MA040a，MA014a(Dirlewanger,E.and P.Cosson,et al.(2006)."Development of a second-generationgenetic linkage map for peach[Prunus persica(L.)Batsch]and characterizationof morphological traits affecting flower and fruit."Tree Genetics&Genomes 3(1):1-13.)和UDP98-412(Dirlewanger,E.and P.Cosson,et al.(2006)."Combininglinkage and association mapping to search for markers linked to the flatfruit character in peach."Tree Genetics&Genomes(3):1-13.)。此外，一个发生6号染色体上的～10Kb的片段缺失也被认为与果实圆扁性状紧密连锁(López-Girona,E.andY.Zhang,et al.(2017)."A deletion affecting an LRR-RLK gene co-segregates withthe fruit flat shape trait in peach."Scientific Reports 7(1):6714.)。目前，鉴别准确度最高的是位于6号染色体25,060,196bp的SNP分子标记，当该位点为T/T基因型时，表型为圆形；当为A/T或A/A基因型时，表型为扁形(Cao,K.and Z.Zhou,et al.(2016)."Genome-wide association study of 12agronomic traits in peach."NatureCommunications 7:13246.)，利用该分子标记设计一对AS-PCR引物，对待检栽培桃基因组DNA进行PCR扩增时，如果有目标条带即为蟠桃，否则为圆形桃(与桃果形圆、扁性状连锁的SNP位点、基于该位点的分子标记及其应用.王力荣,郭健,曹珂,朱更瑞,方伟超,陈昌文,王新卫,李勇；中国专利:CN104962627B,2019-05-24)。该方法的缺点是可能会存在假阴性等技术问题，例如目的条带的缺失是否是由于譬如DNA质量不好等原因所导致。

因此，需要开发更加准确可靠的桃果实形状的检测方法，尤其是在早期如苗期阶段的检测，以便更有效的开展桃品种的培育。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明利用一个与桃果实形状紧密连锁的染色体结构变异，通过4组PCR引物对对栽培桃果形在选育苗期就可进行快速准确地预测，大大缩短育种时间，提高育种效率。

因此，本发明首先提供一种检测桃果实形状的引物对(简称P1引物对)，其序列如下：

正向引物F：5'GAGACCCGTAGTCTATTAGCAGAGG 3'

反向引物R：5'TTCCTCCACTATTACTTTGACAACA 3'。

P2引物对：

正向引物F：5'AAAAGGAGTTGGACGGTTGAGA 3'，

反向引物R：5'CCTATACGGTGGCACCACTTGC 3'；

P3引物对：

正向引物F：5'AGATTCTGGATTTTGCAGTGGTC 3'，

反向引物R：5'TAGGGTTTTCTCTTTTTGGTGTT 3'；

P4引物对：

正向引物F：5'CACAAGGGTAGGGGGGCAAC 3'；

反向引物R：5'CTCCATAAACCGACTTCAACGAG 3'。

本发明提供一种检测桃果实形状的引物对组合，除包括如一述的P1引物对，还包括如上述的P2引物对、P3引物对和P4引物对中任意一对；优选地除包括如上述的P1引物对和P2引物对，任选还包括如上述的P3引物对和P4引物对中的一对或两对。

本发明其次提供一种检测桃果实形状的试剂盒，其中含有上述的引物对，或引物对组合。其中最优选地同时含有P1引物对、P2引物对，P3引物对和P4引物对。更进一步地，还包括用于PCR反应的试剂，例如Taq酶，缓冲液、纯净水，以及样品处理液等。

本发明还提供一种检测桃果实形状的方法，其是针对位于6号染色体上Scaffold_6:27,959,880-29,634,101的染色体结构序列进行检测确定桃果实的形状(瑞油蟠1号作为参考基因组)，优选地所述方法包括下述步骤：将待测桃样品的基因组DNA作为模板，采用上述引物对进行PCR扩增(对其中任一条引物对，或者依次进行扩增)，以及检测扩增产物的步骤。

其中PCR反应液组成如下：

PCR反应条件如下：

在具体实施方式中，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。在优选的实施方式中的结果判定中，即先采用所述P1与P2引物对进行扩增检测，若存在没有P2特异扩增条带的样品，继续用所述P3引物对进行扩增检测，若还存在没有扩增条带的样品，继续用所述P4引物对进行扩增检测，如此能进一步提高检测的准确性。对待测桃DNA样品分别用P1引物对和P2引物对进行扩增，如果两对引物均扩增出目的条带(分别是1391bp及705bp)，则判定所述桃样品的果形为扁形；如果仅获得P1引物对的目的条带，而没获得有P2引物对的目的条带，则继续用P3引物对和P4引物对中的一对或两对进行验证，如果扩增出相应目的条带，则判定所述桃样品的果形为扁形，否则预测所述样品果实不能正常发育；如果仅获得P2引物对的目的条带，则判定所述桃样品的果形为圆形；如果P1引物对及P2引物对均未扩增出目的条带，则继续用P3引物对和P4引物对中的一对或两对进一步检测，如果至少一对相应引物对扩增出目的条带，则判定所述桃样品的果形为圆形。当然，P2、P3、P4三对引物对都扩增出目的条带则确定所述桃样品的果形为圆形，其中，以P2为引物对时，扩增出目的条带为705bp，以P3引物对进行扩增的目的条带为987bp，以P4引物对进行扩增的目的条带为651bp。但如果这4组引物对均未获得目标长度的带型，则可能是PCR操作过程中存在不当，不能判断待检样品的果实形态。

本发明人通过与现有的桃参考基因组Lovell(圆形)进行序列比对，筛选染色体结构变异，发现其中位于6号染色体上一个染色体倒位结构变异与桃果形圆扁形状密切相关，并根据该位点左侧断点附近序列设计所述4对引物对组合，其中P1用来检测INV56F基因型，P2、P3和P4引物对用来检测INV56R基因型，由于INV56R左侧断点附近序列多态性丰富，因此需要多个引物对来满足提高检测的准确性。并且对INV56R的检测主要用于确认PCR过程中是否存在诸如配方体系、程序参数或者操作错误等原因而导致的目标位置未获得扩增条带，进一步提高检测的可靠性和准确性。通过对采集137份栽培桃幼嫩叶片(包括37份蟠桃与100份圆形桃)的检测实验，结果表明所有检测结果均符合实际样品表型，验证所述引物的准确性和可靠性。因此，本发明的检测引物及其方法操作简单，成本低，对实验硬件条件要求不高，引物扩增特异性高，PCR产物均获得唯一条带，检测准确性高，能在育种苗期阶段快速筛选目标表型的种苗。

附图说明

图1蟠桃中特异存在的结构状态的序列示意图。

图2以P1为引物对时的137份样品检测结果。

图3以P2为引物对时的137份样品检测结果。

图4以P3引物对对13个样品(以P2为引物时未有扩增条带)检测结果。

图5以P4引物对对1个样品(以P3为引物时未有扩增条带)检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例的阐述便于理解本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：检测桃果实形状的引物设计

本发明借助于先进的第三代测序平台Pacbio完成了对瑞油蟠1号的基因组测序，成功组装出第一个蟠桃基因组草图。通过与现有的桃参考基因组Lovell(圆形)进行序列比对，筛选染色体结构变异，结合149份栽培桃重测序数据，发现其中位于6号染色体上一个染色体倒位结构变异与桃果形圆扁形状密切相关，将该结构变异命名为INV56(Scaffold_6:27,959,880-29,634,101)。其中在蟠桃中特异存在的结构状态称为INV56F(扁形，见图1)，另一种状态为INV56R(圆形，见图1)。由于蟠桃中该位点是杂合的，因此蟠桃的基因型为INV56F/R；圆形桃的基因型为INV56R/R。根据INV56F/R左侧断点附近序列设计4对引物组合，引物序列及目标PCR产物长度如表1所示，其中P1用来检测INV56F基因型，P2、P3和P4用来检测INV56R基因型，由于INV56R左侧断点附近序列多态性丰富，因此需要多个引物对来满足检测需求。对INV56R的检测主要用于确认INV56F检测阳性的样品是纯合还是杂合基因型，以及PCR过程中是否存在诸如配方体系、程序参数或者操作错误等原因而导致的目标位置未获得扩增条带。

以蟠桃基因组DNA为模板，以P1为引物对，通过电泳检测PCR产物，在目标位置(1391bp)应能够获得相应条带，并且以P2，P3，P4为引物对，应能够至少获得一条相应大小的目标条带(705/987/651bp)；以圆形桃基因组DNA为模板，当用P1作为引物时，目标位置(1391bp)不会出现条带，而以P2，P3，P4为引物时，则应能够至少获得一条相应大小的目标条带(705/987/651bp)；如果这4组引物对均未获得目标长度的带型，则可能是PCR操作过程中存在不当，不能判断待检样品的果实形态。

表1检测桃果实圆、扁形状的相关引物信息

实施例2：应用实施例

采集137份栽培桃幼嫩叶片，包括37份蟠桃与100份圆形桃(表2)，利用植物DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA，定量后再用无菌水配置成20ng/μL的模板溶液。PCR反应液的配置及反应条件如下：

PCR反应液组成：

PCR反应条件：

上述实验过程先采用所述P1和P2引物对进行扩增检测，若未获得P2引物特异扩增条带，继续用所述P3引物对进行扩增检测，若还存在没有扩增条带的样品，继续用所述P4引物对进行扩增检测。

对扩增产物的检测是取3μl的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。在137份栽培桃的检测中，以P1为引物对时，1-37号样品均扩增出目的条带(1391bp)，38-137号样品未获得目的条带(图2)；以P2为引物对时，124个样品(90.5％)扩增出目的条带(705bp)，13个样品未获得目的条带(图3)；这13个样品继续用P3引物对进行扩增，其中12个样品获得目的条带(987bp)，一个样品未获得目的条带(图4)；该样品再用P4引物对进行扩增，获得目的条带(651bp)(图5)。根据检测结果，所有样品均能得到有效扩增，说明PCR操作流程正确。1-37号样品基因型为INV56F/R，果形为扁形；38-137号样品基因型为INV56R/R，果形为圆形，所有检测结果均符合实际样品表型(表2)。

该方法操作简单，成本低，对实验硬件条件要求不高，引物扩增特异性高，PCR产物均获得唯一条带，检测准确性高，能在育种苗期阶段快速筛选目标表型的种苗。

表2 136份栽培桃表型及基因型鉴定

序列表

<110>北京农业生物技术研究中心

<120>一种基于染色体结构变异的桃果实形状早期检测方法

<160> 8

<170> PatentIn Version 2.1

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 1

gagacccgta gtctattagc agagg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 2

ttcctccact attactttga caaca 25

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 3

aaaaggagtt ggacggttga ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 4

cctatacggt ggcaccactt gc 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 5

agattctgga ttttgcagtg gtc 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 6

tagggttttc tctttttggt gtt 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 7

cacaagggta ggggggcaac 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 引物

<400> 8

ctccataaac cgacttcaac gag 23

Claims

1.一种检测桃果实形状的引物对组合，由下述四对引物对组成：

P1引物对：

正向引物F：5'GAGACCCGTAGTCTATTAGCAGAGG 3'

反向引物R：5'TTCCTCCACTATTACTTTGACAACA 3'；

P2引物对：

正向引物F：5'AAAAGGAGTTGGACGGTTGAGA3'，

反向引物R：5'CCTATACGGTGGCACCACTTGC 3'；

P3引物对：

正向引物F：5'AGATTCTGGATTTTGCAGTGGTC 3'，

反向引物R：5'TAGGGTTTTCTCTTTTTGGTGTT 3'；

P4引物对：

正向引物F：5'CACAAGGGTAGGGGGGCAAC 3'；

反向引物R：5'CTCCATAAACCGACTTCAACGAG 3'。

2.一种检测桃果实形状的试剂盒，其中含有如权利要求1所述的引物对组合。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于PCR反应的试剂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，用于PCR反应的试剂是Taq酶，缓冲液、纯净水，和样品处理液。

5.一种检测桃果实形状的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的引物对组合对待测桃样品的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，

且PCR扩增的顺序如下，先采用所述P1和P2引物对进行扩增检测，若存在没有P2引物扩增条带的样品，继续用所述P3引物对进行扩增检测，若还存在没有扩增条带的样品，继续用所述P4引物对进行扩增检测。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中PCR反应液组成如下：

，其PCR反应条件如下：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，对扩增产物采用琼脂糖凝胶进行电泳检测，并且在结果判定中，当以P1为引物对时，如果出现目的条带，且P2、P3、P4引物对中的任一对、两对或三对引物出现相应目的条带，则判定所述桃样品的果形为扁形；如果P2、P3、P4三对引物对均未出现目的条带，则判定所述桃样品的果实不能正常发育；如果未获得P1目的条带，P2、P3或P4引物对中的任一对、两对或三对出现特异扩增条带，则判定果形为圆形；如果这4组引物对均未获得目标长度的带型，则不能判断待检样品的果实形态。

8.如权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述桃样品为桃的苗期样品。