CN115261504B - 一种与梨花粉败育性状相关联分子标记及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子标记技术领域，公开了一种与梨花粉败育性状相关联分子标记及其筛选方法。所述筛选分子标记方法包括：获得杂交组合的F1代群体；基因组DNA的提取纯化及混池构建；BSA‑seq分析；SSR分子标记的鉴定。本发明通过BSA‑seq技术，筛选与目的基因紧密连锁的分子标记，利用所获得的分子标记，便于对目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析梨花粉败育性状形成的分子机制打下基础，为通过分子育种途径培育梨优质品种资源提供重要的理论依据。本发明有利于对目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析梨花粉败育性状形成的分子机制打下基础。

Description

一种与梨花粉败育性状相关联分子标记及其筛选方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及一种分子标记技术领域，公开了一种与梨花粉败育性状相关联分子标记及其筛选方法。
背景技术
我国是梨属植物的中心发源地之一，目前我国梨树的栽培面积和产量均居世界首位。花粉败育对于果树育种和生产均有影响。花粉败育性状有杂交育种时省去人工去雄步骤的优点。但该性状同时存在一些缺点，比如优良品种无法作为父本。且花粉败育品种在生产上不利于授粉，需要配授粉树。解决花粉败育，培育自交可育品种有利于节省人工。
关于梨花粉败育的分子调控机制还不清楚。且由于梨树童期长，导致梨品种的培育过程非常漫长。近年来，随着分子标记技术的发展，挖掘高质量分子标记，构建分子遗传连锁图谱，为果树优良品种的选育提供了有效的技术手段。
分子标记(Molecular marker)是一类以分子水平上DNA序列的差异为基础的遗传标记，它直接反映了DNA水平上的遗传多样性。目前，已经有几十多种分子标记被发展利用。随着分子生物学的迅速发展，DNA分子标记技术已广泛应用于亲缘关系和遗传多样性分析，并取得很好的成绩。此外，SSR标记技术以其独特的优势也逐渐应用于果树品种鉴定方面的研究。王晶等鉴定了3个从未报道的甜樱桃品种的S基因型，验证了一种可以有效获得多态性SSR的途径，提供了9个新的多态性SSR及其等位基因大小，用12个分子标记构建了48个甜樱桃品种指纹图谱。
近年来，随着基因组测序技术的飞速发展，第二代测序(短片段)数据和第三代测序(长片段)数据的综合应用，大大提升了基因组组装的完整度和准确性，为开展生物学研究提供了便利。梨基因组的揭秘为梨后基因组学的研究提供了基础。高通量测序技术(High-throughput sequencing)能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短，对揭秘目的基因的形成机理发挥了重要的作用。BSA-seq技术，结合了高通量测序技术和分离群体分组分析法来进行基因定位，能够快速建立基因型与表型之间的高分辨率关系。
目前，该技术己经广泛应用到农艺性状的基因定位研究当中。豆峻岭采用BSA-seq技术对控制西瓜果皮黄色的候选位点进行初定位，之后开发大量的分子标记，通过一系列分子生物学实验最终将候选基因定位到4号染色体上。目前，利用BSA-seq技术对于梨花粉败育性状方面的研究较少。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)目前关于梨花粉败育的形成及分子调控机制还不清楚，且常规的梨育种存在效率低、周期长等问题。
(2)目前利用BSA-seq技术对于梨花粉败育性状方面的研究较少。
解决以上问题及缺陷的难度为：实验材料的获得有季节性限制，且对于材料的筛选需要以花粉发育情况为判断。梨的基因组尚未得到完善，需要建库之后才能筛选得到SSR标记，所需实验时间较长。
解决以上问题及缺陷的意义为：利用获得的分子标记，有利于对目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析花粉败育性状形成的分子机制打下基础，为通过分子育种途径培育梨优质品种资源提供重要的理论依据。
发明内容
为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种与梨花粉败育性状相关联分子标记及其筛选方法。具体涉及一种利用BSA-seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法。
所述技术方案如下：一种与梨花粉败育性状相关联分子标记，所述与梨花粉败育性状相关联分子标记位点为SSR1；正向引物序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列SEQ ID NO：2。
在一个实施例中，所述与梨花粉败育性状相关联分子标记为250bp；
在基因组中的位置：20118415～20118425。
本发明的另一目的在于提供一种利用BSA-seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法包括以下步骤：
S1，获得新梨7号和中香杂交组合的F1代群体；
S2，基因组DNA的提取纯化及对比基因池的构建：根据杂交后代花粉败育性状的调查结果，选取花粉败育和可育植株，提取基因组DNA，并按照DNA等量原则构建花粉败育/可育性状的对比基因池B1和B2；
S3，BSA-seq分析：对两个亲本及子代基因池B1、B2样本进行BSA-seq；
S4，SSR分子标记的鉴定：比对参考基因组，筛选与花粉败育性状相关的SSR分子标记。
在一个实施例中，在步骤S2中，所述基因组DNA的提取方法包括以下步骤：
(1)取腋芽或幼嫩的叶片0.1g，装入样品袋中，做好标记并放到-80℃的超低温冰箱内保存，以备DNA提取用；
(2)将内含2％CTAB的提取缓冲液CTAB buffer事先在65℃预热，然后取800μL加入到2mL的离心管内，在65℃下保温；
(3)将植物材料放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，上下颠倒混匀，并放在65℃水浴锅中保温20min，多次颠倒混匀；
(4)将离心管取出，加体积比为24：1的800μL氯仿：异戊醇，颠倒充分混合，温和震荡2～3min，在高速离心机上14000rpm离心10min；
(5)将上清液转移到1.5mL离心管中，加入6μL 10mg·mL-1的RNase充分颠倒混匀，放在37℃恒温箱内温育1h，用体积比为24：1的氯仿：异戊醇抽提1次；
(6)将上清液转移到1.5mL离心管中，加500μL事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于-20℃冰箱中沉淀DNA 10min；
(7)在高速离心机上用14000rpm离心3min，弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA；
(8)用500μL 70％乙醇洗DNA沉淀两次，在超净工作台上干燥DNA 1h；
(9)将吹干的DNA溶于50μL超纯水中；将提取的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度并将DNA浓度稀释到200ng·L-1。
在一个实施例中，在步骤S3中，所述进行BSA-seq分析的方法包括以下步骤：构建花粉败育/可育性状的对比基因池，按照CTAB法对100个杂交后代梨叶片进行基因组DNA提取，利用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000进行DNA完整性和纯度的初步检测，合格后稀释DNA样品进行DNA浓度的精确定量；每个混池中DNA等量混合，进行样本重测序。
在一个实施例中，所述进行构建花粉败育/可育性状的对比基因池B1和B2的方法包括以下步骤：
(1)样品片段化Covaris：利用超声波剪切DNA，打断的DNA片段大小集中在300-500bp；
(2)末端修复：使用Covaris剪切的DNA片段形成杂合的末端，其中包括3’端悬垂结构、5’端悬垂结构和平末端；大小不一的悬垂结构还会存在并没有磷酸化的末端；用T4DNA聚合酶(Takara Bio Inc，大连，中国)和Klenow酶(Takara Bio Inc，大连，中国)将这些大小不一的悬垂结构补平成平末端；酶具有3'端→5'端外切核酸酶活性切除3'端悬垂结构并具有聚合酶活性补平5'端悬垂结构；另外，T4 PNK将片段5’端磷酸化；最后用AMPure XPBeads对补平反应体系进行纯化；
(3)3'端加A反应：在补平片段的3’末端连接一个A碱基减少在连接接头时片段之间的互连，并且由于接头的3’末端有一个独立T碱基，在连接接头时，接头与片段之间特异性连接；
(4)接头连接反应：在DNA片段末端添加一个测序接头，该接头与flow cell上的扩增引物相对应；接头通过平末端连接在DNA片段的两端，并且通过接头在flow cell上进行桥式PCR扩增，形成测序簇；
(5)纯化连接产物：连接反应结束后用AMPure XP Beads对补平反应体系进行纯化，最后用resuspensionbuffer纯化至20ul的连接产物；用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，切取所要求的片段大小的DNA片段，并用MInElute Gel ExtractionKit进行回收；
(6)扩增目的片段
通过PCR反应扩增已连好两个接头DNA目的片段，PCR引物对应着接头的末端；使用高保真酶和尽可能少的循环数以减少假阳性的出现；
(7)纯化终产物
用AMPure XP Beads对PCR反应体系进行纯化；通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应后的纯化产物，注意其片段大小和文库浓度；
(8)上机前定量后，进行簇生成步骤，将序列固定到测序用的flowcell上。
在一个实施例中，在步骤S3中，进行梨花粉败育性状的SSR分子标记筛选的方法包括以下步骤：
(1)下载西洋梨和白梨基因组序列，利用SSRIT在线分析软件对所下载序列进行SSR搜索，筛选SSR标记；
(2)对SSR标记进行引物设计与PCR扩增分析；
在一个实施例中，所述SSR标记筛选标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数分别大于或等于18次、9次、6次、5次、4次和3次，所有重复类型的总核苷酸数不能少于18个；
所述SSR标记的引物设计方法，包括：
应用Primer 5.0软件对含有SSR的序列进行引物设计；引物设计的主要参数为：引物长度控制在18～24bp；预期产物长度控制在150～350bp；SSR位点距离序列两端大于50bp；引物Tm值在50～65℃之间，且上、下游引物Tm值相差小于5℃；引物GC(％)含量45％～55％；
所述SSR标记的PCR扩增分析包括：
对SSR标记进行扩增分析；SSR反应体系为15μL，其中包括：模板DNA 20ng，10×Buffer，2.0μmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，正向和反向引物各0.2μmol·L-1，1.0UTaq酶；
PCR扩增在MJ Research PTC-200PCR扩增仪上进行；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，然后是95℃变性30s，合适退火温度30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；各引物的合适退火温度参照引物合成报告单；扩增产物用3.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
在一个实施例中，在步骤S4中，经过电泳筛选后在分离群体上进行验证，若获得的多态性片段在后代绝大多数同类型个体上的表现与在对比基因池间的表现一致，该片段为与梨花粉败育性状相关联分子标记。
本发明的另一目的在于提供一种构建的分子遗传连锁图谱，所述构建的分子遗传连锁图谱利用所述利用BSA-seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法进行构建。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明有利于对花粉败育目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析花粉败育性状形成的分子机制打下基础，为通过分子育种途径培育梨优质品种资源提供重要的理论依据。
第二，把技术方案看作一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明提供了一种利用BSA-seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法，包括：获得‘新梨7号’和‘中香’杂交组合的F1代群体；基因组DNA的提取纯化及混池构建；BSA-seq(Bulked Segregant Analysis seq)分析；SSR分子标记的鉴定。本发明通过BSA-seq技术，筛选与目的基因紧密连锁的分子标记，利用所获得的分子标记，便于对目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析梨花粉败育性状形成的分子机制打下基础，为通过分子育种途径培育梨优质品种资源提供重要的理论依据。本发明有利于对目标性状的早期选择，为挖掘决定目标性状的候选基因和解析梨花粉败育性状形成的分子机制打下基础。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本发明获得的分子标记可在梨杂交后代大规模群体中进行早期筛选目标性状，可极大程度地缩短育种时间，降低培育品种所需人力和成本，为生产上梨杂交后代的标记辅助选择育种提供技术依据。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：本发明首次采用BSA-seq和SSR分子标记技术，挖掘与花粉败育性状紧密连锁的分子标记，并进行目标基因的染色体定位。
(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：雄性不育是一种重要农艺性状，对果树来说，雄性不育可以作为杂交育种中免去雄的途径，但其潜在的分子机制在蔷薇科植物中仍不清楚。本发明筛选与梨花粉败育性状紧密连锁的分子标记，为花粉败育性状的分子标记辅助选择、培育自交可育品种及深入研究其形成机制提供重要参考。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
图1是本发明实施例提供的利用BSA-seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法流程图；
图2是本发明实施例提供的与梨花粉败育性状相关联分子标记电泳验证图；标记QauSSRb104在群体‘新梨7号’ב中香’F1代群体中的部分扩增结果。DNA Marker DL2000；B1.花粉败育性状基因池；B2.花粉可育性状基因池；1-10.花粉败育性状个体；11-20.花粉可育性状个体。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一、解释说明实施例：
本发明实施例提供一种与梨花粉败育性状相关联分子标记，SSR分子标记位点为SSR1；
正向引物序列SEQ ID NO：1，F:AATGAAGGGAAGCGGAGGAT；
反向引物序列SEQ ID NO：2，R:GTGGCAATGTCAGTCACTACAAGA；
产物预期大小为250bp；
在基因组中的位置即在西洋梨4号染色体
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CM018508.1？report＝fasta&log$＝seqview)的位置为:20118415～20118425。
实施例
如图1所示，本发明实施例提供的利用BSA-seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法包括以下步骤：
S101，获得‘新梨7号’(何天明,梨雄性不育系‘新梨7号’花器官内氨基酸含量和过氧化氢酶活性分析,果树学报,2012,29(03):338-342.DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.03.023.)和‘中香’(戴洪义等,中香梨授粉品种的选择,落叶果树,1990(01):36.DOI:10.13855/j.cnki.lygs.1990.01.014.)杂交组合的F1代群体；
S102，基因组DNA的提取纯化及对比基因池的构建：根据杂交后代花粉败育性状的调查结果，选取花粉败育和可育植株，采用改良的CTAB法(田义轲等，2003)提取基因组DNA，并按照DNA等量原则构建花粉败育/可育性状的对比基因池B1和B2；
S103，BSA-seq分析：对两个亲本及子代基因池B1、B2样本进行BSA-seq，比对参考基因组，筛选与花粉败育性状相关的SSR分子标记；
S104，SSR分子标记的鉴定：比对参考基因组，筛选与花粉败育性状相关的SSR分子标记。
在本发明一优选实施例中，在步骤S102中，所述基因组DNA的提取方法，包括：
(1)取腋芽或幼嫩的叶片0.1g，装入样品袋中，做好标记并放到-80℃的超低温冰箱内保存，以备DNA提取之用；
(2)将内含2％CTAB的提取缓冲液CTAB buffer事先在65℃预热，然后取800μL加入到2mL的离心管内，在65℃下保温；
(3)将植物材料放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，上下颠倒混匀，并放在65℃水浴锅中保温20min，期间多次颠倒混匀；
(4)将离心管取出，加体积比为24：1的800μL氯仿：异戊醇，颠倒充分混合，温和震荡2～3min，在高速离心机上14000rpm离心10min；
(5)将上清液转移到1.5mL离心管中，加入6μL 10mg·mL-1的RNase充分颠倒混匀，放在37℃恒温箱内温育1h，用体积比为24：1的氯仿：异戊醇抽提1次；
(6)将上清液转移到1.5mL离心管中，加500μL事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于-20℃冰箱中沉淀DNA 10min；
(7)在高速离心机上用14000rpm离心3min，弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA；
(8)用500μL 70％乙醇洗DNA沉淀两次，在超净工作台上干燥DNA 1h；
(9)将吹干的DNA溶于50μL超纯水中；将提取的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度并将DNA浓度稀释到200ng·L-1。
在本发明一优选实施例中，在步骤S103中，所述进行BSA-seq分析的方法，包括：构建花粉败育/可育性状的对比基因池，按照上述CTAB法对100个杂交后代梨叶片进行基因组DNA提取，利用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000进行DNA完整性和纯度的初步检测，合格后稀释DNA样品进行DNA浓度的精确定量；每个混池中DNA等量混合，进行样本重测序，即BSA-seq分析；
在本发明一优选实施例中，在步骤S103中，所述进行构建花粉败育/可育性状的对比基因池B1和B2的方法，包括：
(1)样品片段化Covaris
利用超声波剪切DNA，并将传统超声波法可控制化、精确化；在小体积中被剪切，可以减少因为蒸发带来的样品损耗，并且被剪切的DNA片段大小之间的偏差较小；Covaris剪切的片段大小较小，并且片段大小范围较传统超声波法窄；选择合适的打断参数条件，使最后打断的DNA片段大小集中在300-500bp范围内；
(2)末端修复
使用Covaris剪切的DNA片段都会形成一些杂合的末端，其中包括了3’端悬垂结构、5’端悬垂结构和平末端；大小不一的悬垂结构还会存在并没有磷酸化的末端；用T4DNA聚合酶(Takara Bio Inc，大连，中国)和Klenow酶(TakaraBio Inc，大连，中国)将这些大小不一的悬垂结构补平成平末端；酶具有3'端→5'端外切核酸酶活性切除3'端悬垂结构并具有聚合酶活性补平5'端悬垂结构；另外，T4 PNK将片段5’端磷酸化；最后用AMPure XPBeads对补平反应体系进行纯化；
(3)3'端加A反应
在补平片段的3’末端连接一个A碱基可以减少在连接接头时片段之间的互连，并且由于接头的3’末端有一个独立T碱基，在连接接头时，让接头与片段之间特异性连接；
(4)接头连接反应
在DNA片段末端添加一个测序接头，该接头与flow cell上的扩增引物相对应；接头通过平末端连接在DNA片段的两端，并且通过接头在flow cell上进行桥式PCR扩增，形成测序簇；
(5)纯化连接产物
连接反应结束之后用AMPure XP Beads对补平反应体系进行纯化，最后用resuspensionbuffer纯化至20ul的连接产物；用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，切取所要求的片段大小的DNA片段，并用MInElute Gel Extraction Kit进行回收；
(6)扩增目的片段
通过PCR反应扩增已连好两个接头DNA目的片段，PCR引物对应着接头的末端；使用高保真酶和尽可能少的循环数以减少假阳性的出现；
(7)纯化终产物
用AMPure XP Beads对PCR反应体系进行纯化；通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应后的纯化产物，注意其片段大小和文库浓度；
(8)上机前定量
定量完成后，进行簇生成步骤，将序列固定到测序用的flowcell上。
在本发明一优选实施例中，在步骤S104中，所述进行梨花粉败育性状的SSR分子标记筛选的方法，包括：
(1)下载西洋梨和白梨基因组序列，利用SSRIT在线分析软件对所下载序列进行SSR搜索，筛选SSR标记；
(2)对SSR标记进行引物设计与PCR扩增分析；
所述SSR标记筛选标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数分别大于或等于18次、9次、6次、5次、4次和3次，所有重复类型的总核苷酸数不能少于18个；
所述SSR标记的引物设计方法，包括：
应用Primer 5.0软件对含有SSR的序列进行引物设计；引物设计的主要参数为：引物长度控制在18～24bp；预期产物长度控制在150～350bp；SSR位点距离序列两端大于50bp；引物Tm值在50～65℃之间，且上、下游引物Tm值相差小于5℃；引物GC(％)含量45％～55％；
所述SSR标记的PCR扩增分析包括：
对SSR标记进行扩增分析；SSR反应体系为15μL，其中包括：模板DNA 20ng，10×Buffer，2.0μmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，正向和反向引物各0.2μmol·L-1，1.0UTaq酶(诺唯赞生物科技有限公司)；
PCR扩增在MJ Research PTC-200PCR扩增仪上进行；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，然后是95℃变性30s，合适退火温度30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；各引物的合适退火温度参照引物合成报告单；扩增产物用3.5％琼脂糖凝胶电泳检测；经过电泳筛选后在分离群体上进行验证，若获得的多态性片段在后代绝大多数同类型个体上的表现与在对比基因池间的表现一致，说明该片段就是与花粉败育性状相关的分子标记。
在本发明一优选实施例中，在步骤S103中，利用SSR分子标记在对比基因池之间电泳跑出差异条带。
本发明提供的利用BSA-seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的利用BSA-seq筛选与梨花粉败育性状相关联分子标记方法仅仅是一个具体实施例而已。
下面结合相关内容以及实验对本发明的技术方案作进一步的描述。
1、本发明实施例以‘新梨7号’和‘中香’及其杂交组合的F1代群体为试材，利用BSA-seq技术筛选与梨花粉败育性状相关联的分子标记，并对候选基因进行鉴定。本发明前期工作中已初步筛选到一个与梨花粉败育性状相关联的SSR标记。
其中，梨花粉败育性状的分子标记鉴定包括：根据杂交后代花粉败育性状的调查结果，选取花粉败育和可育植株各20株，提取基因组DNA，然后按照DNA等量原则构建花粉败育/可育性状的对比基因池B1和B2。对两个亲本及子代混池B1、B2样本进行BSA-seq，比对参考基因组，筛选与花粉败育性状相关联的SSR分子标记。
本发明提供的实施例鉴定出与梨花粉败育性状基因位点紧密连锁的分子标记；为现代分子标记辅助育种提供技术依据。并筛查了与梨花粉败育性状紧密连锁的分子标记，为生产上梨杂交后代的标记辅助选择育种提供技术依据。
2、技术方案：
2.1梨花粉败育性状的分子标记鉴定
2.1.1基因组DNA的提取与纯化
采用花粉败育品种‘新梨7号’与花粉可育品种‘中香’及其杂交组合的F1代群体为材料，田间观察开花植株的花粉育性状况，对花粉败育/可育性状的分离情况进行记录，采集小蕾期、中蕾期和开花期的样品幼嫩的叶片或腋芽用于植物基因组DNA提取。
基因组DNA的提取参考田义轲等的方法，并加以改良，主要步骤如下：
(1)取腋芽或幼嫩的叶片0.1g，装入样品袋中，做好标记并放到超低温冰箱(-80℃)内保存，以备DNA提取之用。
(2)将提取缓冲液CTAB buffer(内含2％CTAB、100mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0、20mmol·L-1EDTA、1.4mol·L-1NaCl、2％PVP30)事先在65℃预热，然后取800μL加入到2mL的离心管内，在65℃下保温。
(3)将植物材料放入研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，并迅速转移到装有预热的提取缓冲液的离心管内，上下颠倒混匀，并放在65℃水浴锅中保温20min，期间多次颠倒混匀。
(4)将离心管取出，加800μL氯仿：异戊醇：Tris饱和酚(体积比为25：24:1)。颠倒充分混合，温和震荡2～3min，在高速离心机上14000rpm离心10min。
(5)将上清液转移到1.5mL离心管中，加入6μL RNase(10mg·mL-1)充分颠倒混匀，放在37℃恒温箱内温育1h，用氯仿:异戊醇(体积比为24：1)抽提两次。
(6)将上清液转移到1.5mL离心管中，加500μL事先在-20℃冰箱内预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，于-20℃冰箱中沉淀DNA10～25min。
(7)在高速离心机上用14000rpm离心3min，弃掉上清，得到沉于离心管底部的DNA。
(8)用500μL 70％乙醇洗DNA沉淀两次，在超净工作台上干燥DNA 1h。
(9)将吹干的DNA溶于50μL超纯水中。
将提取的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度并将DNA浓度稀释到200ng·L-1。
2.1.2BSA-seq分析
构建花粉败育/可育性状的对比基因池，按照上述CTAB法对100个杂交后代梨叶片进行基因组DNA提取，利用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000(赛默尔，美国)进行DNA完整性和纯度的初步检测，合格后稀释DNA样品进行DNA浓度的精确定量。每个混池中DNA等量混合，进行样本重测序，即BSA-seq分析。
(1)样品片段化(Covaris)
利用超声波剪切DNA，并将传统超声波法可控制化、精确化。在小体积中被剪切，可以减少因为蒸发带来的样品损耗，并且被剪切的DNA片段大小之间的偏差较小。Covaris剪切的片段大小较小，并且片段大小范围较传统超声波法窄。选择合适的打断参数条件，使最后打断的DNA片段大小集中在300-500bp范围内。
(2)末端修复
使用Covaris剪切的DNA片段都会形成一些杂合的末端，其中包括了3’端悬垂结构、5’端悬垂结构和平末端。这些大小不一的悬垂结构还会存在一些并没有磷酸化的末端。本步操作目的就是用T4DNA聚合酶(TakaraBio Inc，大连，中国)和Klenow酶(Takara BioInc，大连，中国)将这些大小不一的悬垂结构补平成平末端。这些酶具有3'端→5'端外切核酸酶活性切除3'端悬垂结构并具有聚合酶活性补平5'端悬垂结构。另外，本步骤中T4 PNK可以将片段5’端磷酸化。最后用AMPure XP Beads对补平反应体系进行纯化。
(3)3'端加A反应
在补平片段的3’末端连接一个A碱基可以减少在连接接头时片段之间的互连，并且由于接头的3’末端有一个独立T碱基，所以这一步的作用是在连接接头时，让接头与片段之间特异性连接。
(4)接头连接反应
在DNA片段末端添加一个测序接头，该接头与flow cell上的扩增引物相对应。接头通过平末端连接在DNA片段的两端，并且通过接头在flow cell上进行桥式PCR扩增，形成测序簇。
(5)纯化连接产物
连接反应结束之后用AMPure XP Beads对补平反应体系进行纯化，最后用resuspensionbuffer纯化至20ul的连接产物。用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，切取所要求的片段大小的DNA片段，并用MInElute Gel Extraction Kit进行回收。
(6)扩增目的片段
通过PCR反应扩增已连好两个接头DNA目的片段，PCR引物对应着接头的末端。使用高保真酶和尽可能少的循环数以减少假阳性的出现。
(7)纯化终产物
用AMPure XP Beads对PCR反应体系进行纯化。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应后的纯化产物，注意其片段大小和文库浓度。
(8)上机前定量：
定量完成后，进行簇生成步骤，将序列固定到测序用的flowcell上。
2.1.3梨花粉败育性状的SSR分子标记的筛选
下载西洋梨和白梨基因组序列，利用SSRIT在线分析软件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)对所下载序列进行SSR搜索，筛选SSR标记。
SSR标记筛选标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数分别大于或等于18次、9次、6次、5次、4次和3次，所有重复类型的总核苷酸数不能少于18个。
对SSR标记进行引物设计与PCR扩增分析。
SSR标记的引物设计：
应用Primer 5.0软件对含有SSR的序列进行引物设计。引物设计的主要参数为：引物长度一般控制在18～24bp；预期产物长度控制在150～350bp；SSR位点距离序列两端大于50bp；引物Tm值在50～65℃之间，且上、下游引物Tm值相差小于5℃；引物GC(％)含量45％～55％。
SSR标记的PCR扩增分析：
对SSR标记进行扩增分析。SSR反应体系为15μL，其中包括：模板DNA 20ng，10×Buffer，2.0μmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，正向和反向引物各0.2μmol·L-1，1.0UTaq酶(诺唯赞生物科技有限公司)。
PCR扩增在MJ Research PTC-200PCR扩增仪上进行。PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，然后是95℃变性30s，合适退火温度30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。各引物的合适退火温度参照引物合成报告单。扩增产物用3.5％琼脂糖凝胶电泳检测。经过电泳筛选后在分离群体上进行验证，若获得的多态性片段在后代绝大多数同类型个体上的表现与在对比基因池间的表现一致，说明该片段就是与花粉败育性状相关联的分子标记。
2.2技术路线：
与梨花粉败育性状相关联分子标记电泳验证图如图2所示。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
二、应用实施例：
采用基于BSA和SSR分子标记技术，筛选到两个与梨花粉败育性状紧密连锁的SSR标记PpSSR579-51和PpSSR579-104，并在‘新梨7号’ב中香’杂交F1代分离群体(164个结果株)中进行验证。PpSSR579-51在164个单株中有24株表现为标记与性状的重组，即重组率为14.6％；PpSSR579-104在164个单株中有10株表现为标记与性状的重组，即重组率为6.1％。
三、实施例相关效果的证据：
由于梨树童期长，自交不亲和、杂合性高等特点，所以导致梨品种的培育过程非常漫长。与传统杂交育种方法相比，本发明获得的分子标记可在梨杂交后代大规模群体中进行早期筛选目标性状，可极大程度地缩短育种时间，降低育种过程中所需的人力和成本，为生产上梨杂交后代的标记辅助选择育种提供技术依据，也为培育自交可育品种及深入研究其形成机制提供重要参考。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种扩增SSR分子标记的引物在梨花粉败育性状的分子标记辅助选择育种中的用途，其特征在于，所述引物由正向引物和反向引物组成；所述正向引物的序列为：AATGAAGGGAAGCGGAGGAT，所述反向引物序列为：GTGGCAATGTCAGTCACTACAAGA；
当所述引物的扩增产物电泳条带大小仅为250bp时，待测梨为花粉败育性状。
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