KR100671213B1 - 고추 세포질웅성불임성 안정화 관련 유전자와 연관된분자표지의 개발 및 이를 이용한 안정화 관련 유전인자판별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고추 세포질웅성불임성(CGMS) 안정화 유전자와 연관된 분자표지 개발에 관한 것으로 증폭단편길이다형성(AFLP) 분석 방법으로 찾아진 안정화 유전자 연관 분자 표지들 중에서 하나를 사용하여 그 분자표지 주변부의 DNA 염기서열을 분석하였고 안정한 개체와 불안정한 개체 사이의 염기서열의 차이를 확인함으로써 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지를 개발할 수 있었다. 즉 두 재료의 염기서열의 차이를 보이는 부분을 증폭할 수 있는 프라이머를 작성하였고, 이를 이용하여 공시재료의 특이적인 염색체 단편을 중합효소반응(PCR)으로 증폭시킨 다음 증폭된 중합효소반응(PCR) 산물을 엠에스이원(MseI) 제한효소로 자르고 전기영동을 함으로써 고추의 세포질웅성불임 안정화 유전인자를 판별할 수 있었다. 본 발병은 자연계에 존재하거나 교배를 통하여 얻어진 서로 다른 안정화 관련 유전자들의 유전형을 식물체를 포장에 정식한 후 개화기에 화기의 구조 및 화분의 생성 유무를 육안 또는 현미경으로 관찰하지 않고 실험실에서 DNA 분석을 통하여 유전인자를 판별할 수 있을 뿐만 아니라 대립유전자가 동형인지 이형인지를 구분할 수 있기 때문에 일반적인 교배를 이용한 판별 방법보다 분석에 소요되는 시간을 2～3년은 단축시킬 수 있으며, 환경의 영향을 전혀 받지 않기 때문에 판별의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있고, 또한 실제 육종 과정 중에서 인공 교잡 단계와 육안으로 확인하는 임성 안정성 확인 단계를 생략할 수 있는 등 육종 과정에서 선발의 효율을 극대화 시킬 수 있는 방법이다.
고추, 세포질웅성불임성(CMS), 웅성불임의 안정성, AFLP(amplified fragment length polymorphism) 분자표지, CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 분자표지
Description
도1은 고추 세포질웅성불임성 안정화 연관 분자표지를 개발하기 위해 사용한 BC3F2 집단의 계통도이다.
도2은 BC3F2 분리집단에서 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지를 이용하여 그린 St 유전자좌 부근의 연관지도이다.
도3는 BC3F2 분리집단에서 고추 세포질웅성불임성 안정성을 조절하는 St 유전자좌와 연관된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313) 사진이다.
도4은 도3에서 다형성을 보이는 밴드의 DNA 염기서열이다.
도5는 도4의 염기서열을 중심으로 염색체의 양방향으로 더 분석한 염기서열이다.
도6는 각각 다른 대립유전자를 가지고 있는 HN11(St 1 /St 1 ), SG55(St u /St u ), HN41(St 2 /St 2 ) 계통에서 도5의 염기서열을 비교한 그림이다.
도7은 새로운 F2 분리집단에 이번에 개발된 프라이머를 이용하여 중합효소반응(PCR) 증폭한 산물을 엠에스이원(MseI) 제한효소로 자른 후 전기영동한 사진이다.
도8은 F2 분리집단에서 새롭게 개발된 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지와 변형 이전의 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지를 비교한 그림이다.
본 발명은 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지를 이용한 고추 세포질웅성불임성 안정화 관련 유전인자를 판별하는 방법에 관한 것으로서 증폭단편길이다형성(AFLP) 분석 방법(Vos et al. 1995. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res. 23:4407-4414.)으로 찾아진 분자표지를 사용의 편리성 제고는 물론 동형접합체와 이형접합체를 한 번에 구분할 수 있는 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지(Konieczny et al. 1993. ) A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4:403-410.)로 전환시켰으며 이를 이용하여 실제 육종과정에서 개체들의 유전자형을 동정할 수 있는 방법에 관한 것이다.
증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지는 특정형질에 연관된 분자표지 탐색에 많이 이용되는 방법이나 DNA 추출(extraction), 제한효소 처리(enzyme digestion), 어댑터 접합(adaptor ligation), 전선택증폭(pre-selective amplification), 선택증폭(selective amplification), 폴리아크릴아마이드젤(polyacrylamide gel) 분석 등 일련의 방법이 매우 복잡하고 그 경비가 많이 소요될 뿐만 아니라 우성 분자표지이기 때문에 실제 육종 프로그램에서는 이용될 수 없다. 따라서 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지로 바꾸어야 하는데, 이 증폭산물절단다형성(CAPS) 방법은 특정 프라이머로 중합효소반응(PCR) 한 후, 그 산물을 특정 제한효소로 자르고 바로 아가로스젤(agarose gel) 분석을 통하여 그 결과를 얻을 수 있는 것이기 때문에 아주 간편하고 경비도 증폭단편길이다형성(AFLP) 방법 보다 적게 들 뿐만 아니라 공우성 분자표지이기 때문에 육종 프로그램에 아주 유용하게 이용될 수 있다.
우리나라의 고추 품종은 100％ 일대잡종이다. 하지만 우리나라에서 주로 고춧가루로 소비되는 신미건과군에서는 Peterson에 의해 찾아진 세포질웅성불임 계통을 사용하여 세포질적-유전자적 웅성불임(CGMS, cytoplasmic-genic male sterility) 시스템을 이용해 일대잡종 종자를 생산하고 있지만 주로 중국에서 생과로 소비되고 있는 대과종인 신미청과군과 미국이나 유럽에서 주로 소비되고 있는 맵지 않은 피망인 감미청과군에서는 이 CGMS 시스템을 이용하고 있지 못하다. 그 이유는 Peterson 세포질웅성불임(CMS) 계통에 여러 가지 신미청과군과 감미청과군의 계통을 교배한 후대에서 불안정한 표현형을 보이는 불안정친이 많이 나타나기 때문이다. 이는 안정한 웅성가임을 보이는 회복친과 안정한 웅성불임을 보이는 유지친의 확보가 어려워 일대잡종을 위한 교배조합이 제한을 받기 때문이다.
이러한 고추의 세포질웅성불임 불안정 현상은 유전되는 것으로 밝혀졌고 이를 St 유전자좌라고 명명하였다(Lee, D.H. 2001. Studies on unstable fertility of CGMS (cytoplasmic-genic male sterility) in Capsicum annuum L. Ph.D. Thesis, Seoul Nat'l Uni., Seoul ). 이 유전자좌에는 지금까지 3개의 대립유전자(St1, St2, Stu )가 밝혀져 있는데, 이들의 우열관계는 다음과 같다: St2 >Stu >St1 . 그리고 St1 과 St2 대립유전자는 임성을 안정화시키고, Stu 는 임성을 불안정하게 만든다. 따라서 이 유전인자를 구분하기 위해서는 S 세포질, Stu /Stu 인 고추에 교배하여 후대 임성안정성을 확인한 후 그 잡종(F1)을 자가수정하여 후대검정을 수행한 후에야 그 유전인자 형태를 확인할 수 있다.
또한 불안정(Stu /Stu )한 고추를 안정(St2 /St2 )한 고추로 만들기 위해서는 여러 번의 여교잡을 수행하여야 한다. 이때 분리집단이 형성되는데 개화가 일어나고 임성안정성을 확인 한 후에야 선발할 수가 있다. 또한 대립유전자의 동형과 이형을 판별하기 위해서는 후대검정을 해 보아야 한다. 후대검정은 자가수정 과정을 거쳐 다음 세대에서 표현형의 분리를 확인하는 것인데, 자가수정을 위한 노력과 고추 한 세대(5～6개월)에 해당하는 시간이 필요하게 된다.
증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지는 특정형질에 연관된 분자표지 탐색에 많이 이용되는 방법이나 DNA 추출(extraction), 제한효소 처리(enzyme digestion), 어댑터 접합(adaptor ligation), 전선택증폭(pre-selective amplification), 선택증폭(selective amplification), 폴리아크릴아마이드젤(polyacrylamide gel) 분석 등 일련의 방법이 매우 복잡하고 그 경비가 많이 소요될 뿐만 아니라 우성 분자표지이기 때문에 실제 육종 프로그램에서는 이용될 수 없다. 따라서 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지로 바꾸어야 하는데, 이 증폭산물절단다형성(CAPS) 방법은 특정 프라이머로 중합효소반응(PCR) 한 후, 그 산물을 특정 제한효소로 자르고 바로 아가로스젤(agarose gel) 분석을 통하여 그 결과를 얻을 수 있는 것이기 때문에 아주 간편하고 경비도 증폭단편길이다형성(AFLP) 방법 보다 적게 들 뿐만 아니라 공우성 분자표지이기 때문에 육종 프로그램에 아주 유용하게 이용될 수 있다.
우리나라의 고추 품종은 100％ 일대잡종이다. 하지만 우리나라에서 주로 고춧가루로 소비되는 신미건과군에서는 Peterson에 의해 찾아진 세포질웅성불임 계통을 사용하여 세포질적-유전자적 웅성불임(CGMS, cytoplasmic-genic male sterility) 시스템을 이용해 일대잡종 종자를 생산하고 있지만 주로 중국에서 생과로 소비되고 있는 대과종인 신미청과군과 미국이나 유럽에서 주로 소비되고 있는 맵지 않은 피망인 감미청과군에서는 이 CGMS 시스템을 이용하고 있지 못하다. 그 이유는 Peterson 세포질웅성불임(CMS) 계통에 여러 가지 신미청과군과 감미청과군의 계통을 교배한 후대에서 불안정한 표현형을 보이는 불안정친이 많이 나타나기 때문이다. 이는 안정한 웅성가임을 보이는 회복친과 안정한 웅성불임을 보이는 유지친의 확보가 어려워 일대잡종을 위한 교배조합이 제한을 받기 때문이다.
이러한 고추의 세포질웅성불임 불안정 현상은 유전되는 것으로 밝혀졌고 이를 St 유전자좌라고 명명하였다(Lee, D.H. 2001. Studies on unstable fertility of CGMS (cytoplasmic-genic male sterility) in Capsicum annuum L. Ph.D. Thesis, Seoul Nat'l Uni., Seoul ). 이 유전자좌에는 지금까지 3개의 대립유전자(St1, St2, Stu )가 밝혀져 있는데, 이들의 우열관계는 다음과 같다: St2 >Stu >St1 . 그리고 St1 과 St2 대립유전자는 임성을 안정화시키고, Stu 는 임성을 불안정하게 만든다. 따라서 이 유전인자를 구분하기 위해서는 S 세포질, Stu /Stu 인 고추에 교배하여 후대 임성안정성을 확인한 후 그 잡종(F1)을 자가수정하여 후대검정을 수행한 후에야 그 유전인자 형태를 확인할 수 있다.
또한 불안정(Stu /Stu )한 고추를 안정(St2 /St2 )한 고추로 만들기 위해서는 여러 번의 여교잡을 수행하여야 한다. 이때 분리집단이 형성되는데 개화가 일어나고 임성안정성을 확인 한 후에야 선발할 수가 있다. 또한 대립유전자의 동형과 이형을 판별하기 위해서는 후대검정을 해 보아야 한다. 후대검정은 자가수정 과정을 거쳐 다음 세대에서 표현형의 분리를 확인하는 것인데, 자가수정을 위한 노력과 고추 한 세대(5～6개월)에 해당하는 시간이 필요하게 된다.
본 발명은 종래의 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서 고추의 세포질웅성불임성 안정성을 조절하는 유전인자를 교배를 통하지 않고 실험실에서 빠르게 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 일대잡종 품종 육성을 위해 꼭 필요한 안정한 유지친과 안정한 회복친을 육성하는 기간을 단축시킬 수 있는 신속 정확한 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자의 판별 방법을 제공하는 것이다
아래 방법은 실험실 내에서 간단히 수행될 수 있을 뿐 아니라 높은 정확도와 신뢰도를 보여준다.
본 발명의 상기와 같은 목적은 BC3F2 분리집단에서 증폭단편길이다형성(AFLP) 방법과 벌크분리분석(BSA) 방법(Michelmore et al. 1991. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9828-9832)을 동시에 이용하여 찾은 St 유전자좌에 가까이 연관된 분자표지인 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313)를 공우성 분자표지인 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지로 바꿈으로서 가능하게 되었다.
본 발명의 다른 목적은 일대잡종 품종 육성을 위해 꼭 필요한 안정한 유지친과 안정한 회복친을 육성하는 기간을 단축시킬 수 있는 신속 정확한 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자의 판별 방법을 제공하는 것이다
아래 방법은 실험실 내에서 간단히 수행될 수 있을 뿐 아니라 높은 정확도와 신뢰도를 보여준다.
본 발명의 상기와 같은 목적은 BC3F2 분리집단에서 증폭단편길이다형성(AFLP) 방법과 벌크분리분석(BSA) 방법(Michelmore et al. 1991. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9828-9832)을 동시에 이용하여 찾은 St 유전자좌에 가까이 연관된 분자표지인 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313)를 공우성 분자표지인 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지로 바꿈으로서 가능하게 되었다.
본 발명은 세포질웅성불임성이 안정한 고추와 불안정한 고추가 분리되는 집단을 만드는 단계, 이 집단의 어린 고춧잎으로부터 DNA를 추출하는 단계, 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자와 연관된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지 탐색하는 단계, 탐색된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지로 연관지도를 작성하는 단계, 연관된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지 E112M313(서열번호1)을 실제 육종에 이용할 수 있는 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지로 바꾸기 위해 E112M313(서열번호1)의 염기서열을 분석하는 단계, 상기 염기서열(서열번호1)을 중심으로 양방향으로 주위의 염기서열(서열번호3)을 결정하는 단계, 서열번호3을 이용하여 프라이머 조합을 선택하는 단계, 분석하고자 하는 고춧잎(고추 세포질웅성불임성이 안정한 개체와 불안정한 개체)으로부터 추출된 DNA에 대해 상기 프라이머 조합으로 중합효소반응(PCR)을 수행하는 단계, 증폭된 중합효소반응(PCR) 산물에 제한효소를 처리하고 이를 전기영동하는 단계를 포함하는 과정을 통하여 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자의 유무를 판별하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 웅성불임 세포질을 가지고 있는 고추에서 St2 와 Stu 가 분리되는 BC3F2 분리집단 육성에서부터 시작되었다(도1). 표현형을 통해 안정한 임성을 보이는 개체(St2_)와 불안정한 임성을 보이는 개체(Stu Stu )의 분리를 확인하고 벌크분리분석(BSA)과 증폭단편길이다형성(AFLP) 분석을 통해 다형성밴드를 탐색했다. 총 756조합을 탐색한 결과 9개의 연관 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지를 찾을 수 있었고, 그들의 연관지도를 그릴 수 있었다(도2). 특히 2개의 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지가 1.3cM으로 가까이 연관되어 있었는데(도2), 그 중 하나의 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313)(도3)를 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지로 바꿀 수 있었다. 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지로 전환하기 위해 먼저 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313) 단편을 분리해 염기서열을 결정하였다(도4). 그리고 이 염기서열을 중심으로 GenomeWalkerTM Universal Kit(BD Biosciences Clontech)를 이용해 주위의 염기서열을 결정할 수 있었다(도5). 이 염기서열을 이용해 프라이머를 작성(L, 5'-CCTCAAGTTAGGCCCCAACCAAAAGTTG-3'; ‘서열번호6참조’ R, 5'-TCCCATCTAGCCTCTGCCTTCTCAAATG-3';‘서열번호7참조’)하고, HN11(St1 /St1 ), SG55(Stu /Stu ), HN41(St2 /St2 ) 계통에 대해 앞에서 제작된 프라이머를 사용해 이 염기서열 부분을 중합효소반응(PCR)으로 증폭하였고 각각의 염기서열을 결정하여 비교하였다(도6). 특히 HN41(St2 /St2 )과 SG55(Stu /Stu ) 사이에 엠에스이원(MseI) 제한효소 자리에 단염기다형성(SNP)를 찾을 수 있었다(도6). 그래서 중합효소반응(PCR) 산물의 크기가 약 570bp정도 되게 새롭게 프라이머를 제작(L, 5'-GTAGAGGAGTACCCGAGCCAGCGACAT-3'; ‘서열번호4참조’ R, 5'-CCACCGAATCTGAGGTCAAAGTCAAGG-3', ‘서열번호5참조’)하여 중합효소반응(PCR)을 수행하였고, 중합효소반응(PCR)산물을 엠에스이원(MseI) 제한효소를 처리하면 St2 대립유전자와 연관된 부분은 절단되고, Stu 와 연관된 부분은 절단되지 않는다(도7).
이하, 본 발명 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지를 이용한 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자의 판별방법을 실시예를 들어 상세하게 설명하면 다음과 같다.
〈실시예 1〉
A. DNA 추출
1. 어린 고추 잎 0.1g을 1.5㎖ 튜브에 채취하여 액체질소를 이용하여 잎을 완전히 파쇄하고, 60℃에 보관한 DNA 추출 버퍼(DNA extraction buffer) (50mM 트리스-염산(Tris-HCl); 20mM 이디티에이(EDTA); 1.4M 염화나트륨(NaCl), 0.5％ 에스디에스(SDS))를 550㎕씩 첨가하고, 0.05g 피브이피(PVP)와 12.5㎕ 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 넣어 잘 섞은 다음 65℃ 진동수조에서 2시간 반응시켰다.
2. 반응 후 동량의 클로로포름:아이소아밀알콜(24:1)을 첨가하고 충분히 섞은 후 12,000rpm으로 15분간 원심분리하고, 상등액을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 그리고 2배의 에탄올을 넣고 조심스럽게 섞으며 DNA를 침전시켰다.
3. 침전된 DNA를 건져내고 70％ 에탄올로 두 번 씻어낸 후 65℃ 오븐에 넣어 말리고 티이 버퍼(TE buffer)를 넣어 DNA를 녹인다.
4. 티이 버퍼(TE buffer)에 녹아있는 DNA 튜브에 RNA 분해효소(RNase) 1㎕를 넣고 37℃에 1시간 넣어둔다. 그리고 DNA 농도는 DNA 형광계(fluorometer, Hoefer Co.)를 이용하여 100ng/㎕ 농도로 맞추었다.
B. 벌크분리분석(BSA)과 증폭단편길이다형성(AFLP) 분석
증폭단편길이다형성(AFLP) 분석은 Vos 등(1995, AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res. 23:4407-4414)의 방법과 동일하게 수행하였고, 벌크분리분석(BSA ,bulked segregant analysis)는 Michelmore 등(1991,. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9828-9832)의 방법을 응용하여 수행하였는데 방법은 다음과 같다. 증폭단편길이다형성(AFLP)의 전선택증폭(pre-selective amplification) 과정 후에 St2 St2 와 Stu Stu 를 각각 8개씩 섞어 2개의 벌크(bulk)를 만든 후, PCR를 이용하여 선택증폭(selective amplification)을 수행하였다.
C. 염기서열 결정
증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313) 단편의 염기서열을 결정하기 위해 클로닝 운반체로서 pGEM-T Easy Vector(Promega Co.)를 이용하였고, DNA 염기서열결정(sequencing)은 서울대학교 농업과학기기센터(http://nicem.snu.ac.kr/)에서 분석하였다(도4). 그리고, 중합효소반응(PCR) 산물은 전기영동 후 젤에서 분리 정제(QIAquick Gel Extraction Kit 이용, Promega Co.)한 다음 DNA 염기서열을 결정하였다(도5와 도6).
D. 증폭단편길이다형성(AFLP) 단편 주위의 염기서열 결정
위에서 나온 염기서열을 바탕으로 반풀림은도(Tm)가 72℃ 정도 되는 양방향으로 각각 2개씩의 프라이머를 제작(도4)하고 GenomeWalkerTM Universal Kit(BD Biosciences Clontech)를 이용해 주위의 염기서열을 결정할 수 있었다(도5). 이 염기서열을 바탕으로 프라이머를 작성(L, 5'-CCTCAAGTTAGGCCCCAACCAAAAGTTG-3'; ‘서열번호6참조’ R, 5'-TCCCATCTAGCCTCTGCCTTCTCAAATG-3';‘서열번호7참조’)하고, HN11(St1 /St1 ), SG55(Stu /Stu ), HN41(St2 /St2 ) 계통에 대해 앞에서 제작된 프라이머를 사용해 이 염기서열 부분을 중합효소반응(PCR) 증폭(94℃, 5분, 전변성(pre-denaturation); 94℃, 45초, 변성(denaturation); 68℃, 1분, 프라이머접합(annealing); 72℃, 45초, 중합반응(extension); 40회 반복 후; 72℃, 5분, 추가중합반응(post-extension))하였고 각각의 염기서열을 결정하여 클러스털엑스(ClustalX) 프로그램을 이용하여 다중정렬분석(multiple alignment)을 수행하여 이 3개의 염기서열을 비교하여 12개의 단염기다형성(SNP)을 찾았고, 그 중 4개의 단염기다형성(SNP)이 제한효소 작용 위치에 있었다(도6).
도면5와 도면6에 나와 있는 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), RGB(http://riceblast.dna.affrc.go.jp/), SOL(http://soldb.cit.cornell.edu/tools/blast/), TAIR(http://www.arabidopsis.org/Blast/) 등의 데이터베이스에 블라스트(blast) 검색을 통해 전혀 알려지지 않은 염기서열로 확인되었다.
E. 증폭산물절단다형성(CAPS) 분석
위에서 분석된 염기서열을 보면 HN41(St2 /St2 )과 SG55(Stu /Stu ) 사이에 엠에스이원(MseI) 제한효소 자리에 단염기다형성(SNP)이 있는 것을 찾을 수 있다(도5). 그래서 중합효소반응(PCR) 산물의 크기가 약 570bp 정도 되게 새롭게 프라이머를 제작(L, 5'-GTAGAGGAGTACCCGAGCCAGCGACAT-3';‘서열번호4참조’ R, 5'-CCACCGAATCTGAGGTCAAAGTCAAGG-3';‘서열번호5참조’)하여 중합효소반응(PCR)을 수행(94℃, 5분, 전변성(pre-denaturation); 94℃, 45초, 변성(denaturation); 68℃, 45초, 프라이머접합(annealing); 72℃, 45초, 중합반응(extension); 40회 반복 후; 72℃, 5분, 추가중합반응(post-extension))하였고, 중합효소반응(PCR) 산물을 엠에스이원(MseI) 제한효소를 처리하면 St2 대립유전자와 연관된 부분은 절단되고, Stu 와 연관된 부분은 절단되지 않는다(도7). 이렇게 전환된 증폭산물절단다형성법(CAPS) 분자표지를 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지와 비교해 본 결과 완전연관되어 있는 것을 확인 할 수 있다(도8).
F. 유용성 검증
실제 해당 프라이머를 제작하여 세포질웅성불임성이 안정한 고추(St2 /St2 )와 불안정한 고추(Stu /Stu )가 분리되는 집단(108개체)에 검정하여 본 결과, 도면7에서 보는 것처럼 뚜렷이 분리되는 것을 확인할 수 있었고 이러한 결과는 실제 육종에서 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서 본 발병은 자연계에 존재하거나 교배를 통하여 얻어진 서로 다른 안정화 관련 유전자들의 유전형을 식물체를 포장에 정식한 후 개화기에 화기의 구조 및 화분의 생성 유무를 육안 또는 현미경으로 관찰하지 않고 실험실에서 DNA 분석을 통하여 유전인자를 판별할 수 있을 뿐만 아니라 대립유전자가 동형인지 이형인지를 구분할 수 있기 때문에 일반적인 교배를 이용한 판별 방법보다 분석에 소요되는 시간을 2～3년은 단축시킬 수 있으며, 환경의 영향을 전혀 받지 않기 때문에 판별의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있고, 또한 실제 육종 과정 중에서 인공 교잡 단계와 육안으로 확인하는 임성 안정성 확인 단계 생략할 수 있는 등 육종 과정에서 선발의 효율을 극대화시킬 수 있는 방법이다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
본 발명은 웅성불임 세포질을 가지고 있는 고추에서 St2 와 Stu 가 분리되는 BC3F2 분리집단 육성에서부터 시작되었다(도1). 표현형을 통해 안정한 임성을 보이는 개체(St2_)와 불안정한 임성을 보이는 개체(Stu Stu )의 분리를 확인하고 벌크분리분석(BSA)과 증폭단편길이다형성(AFLP) 분석을 통해 다형성밴드를 탐색했다. 총 756조합을 탐색한 결과 9개의 연관 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지를 찾을 수 있었고, 그들의 연관지도를 그릴 수 있었다(도2). 특히 2개의 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지가 1.3cM으로 가까이 연관되어 있었는데(도2), 그 중 하나의 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313)(도3)를 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지로 바꿀 수 있었다. 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지로 전환하기 위해 먼저 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313) 단편을 분리해 염기서열을 결정하였다(도4). 그리고 이 염기서열을 중심으로 GenomeWalkerTM Universal Kit(BD Biosciences Clontech)를 이용해 주위의 염기서열을 결정할 수 있었다(도5). 이 염기서열을 이용해 프라이머를 작성(L, 5'-CCTCAAGTTAGGCCCCAACCAAAAGTTG-3'; ‘서열번호6참조’ R, 5'-TCCCATCTAGCCTCTGCCTTCTCAAATG-3';‘서열번호7참조’)하고, HN11(St1 /St1 ), SG55(Stu /Stu ), HN41(St2 /St2 ) 계통에 대해 앞에서 제작된 프라이머를 사용해 이 염기서열 부분을 중합효소반응(PCR)으로 증폭하였고 각각의 염기서열을 결정하여 비교하였다(도6). 특히 HN41(St2 /St2 )과 SG55(Stu /Stu ) 사이에 엠에스이원(MseI) 제한효소 자리에 단염기다형성(SNP)를 찾을 수 있었다(도6). 그래서 중합효소반응(PCR) 산물의 크기가 약 570bp정도 되게 새롭게 프라이머를 제작(L, 5'-GTAGAGGAGTACCCGAGCCAGCGACAT-3'; ‘서열번호4참조’ R, 5'-CCACCGAATCTGAGGTCAAAGTCAAGG-3', ‘서열번호5참조’)하여 중합효소반응(PCR)을 수행하였고, 중합효소반응(PCR)산물을 엠에스이원(MseI) 제한효소를 처리하면 St2 대립유전자와 연관된 부분은 절단되고, Stu 와 연관된 부분은 절단되지 않는다(도7).
이하, 본 발명 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지를 이용한 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자의 판별방법을 실시예를 들어 상세하게 설명하면 다음과 같다.
〈실시예 1〉
A. DNA 추출
1. 어린 고추 잎 0.1g을 1.5㎖ 튜브에 채취하여 액체질소를 이용하여 잎을 완전히 파쇄하고, 60℃에 보관한 DNA 추출 버퍼(DNA extraction buffer) (50mM 트리스-염산(Tris-HCl); 20mM 이디티에이(EDTA); 1.4M 염화나트륨(NaCl), 0.5％ 에스디에스(SDS))를 550㎕씩 첨가하고, 0.05g 피브이피(PVP)와 12.5㎕ 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 넣어 잘 섞은 다음 65℃ 진동수조에서 2시간 반응시켰다.
2. 반응 후 동량의 클로로포름:아이소아밀알콜(24:1)을 첨가하고 충분히 섞은 후 12,000rpm으로 15분간 원심분리하고, 상등액을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 그리고 2배의 에탄올을 넣고 조심스럽게 섞으며 DNA를 침전시켰다.
3. 침전된 DNA를 건져내고 70％ 에탄올로 두 번 씻어낸 후 65℃ 오븐에 넣어 말리고 티이 버퍼(TE buffer)를 넣어 DNA를 녹인다.
4. 티이 버퍼(TE buffer)에 녹아있는 DNA 튜브에 RNA 분해효소(RNase) 1㎕를 넣고 37℃에 1시간 넣어둔다. 그리고 DNA 농도는 DNA 형광계(fluorometer, Hoefer Co.)를 이용하여 100ng/㎕ 농도로 맞추었다.
B. 벌크분리분석(BSA)과 증폭단편길이다형성(AFLP) 분석
증폭단편길이다형성(AFLP) 분석은 Vos 등(1995, AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res. 23:4407-4414)의 방법과 동일하게 수행하였고, 벌크분리분석(BSA ,bulked segregant analysis)는 Michelmore 등(1991,. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9828-9832)의 방법을 응용하여 수행하였는데 방법은 다음과 같다. 증폭단편길이다형성(AFLP)의 전선택증폭(pre-selective amplification) 과정 후에 St2 St2 와 Stu Stu 를 각각 8개씩 섞어 2개의 벌크(bulk)를 만든 후, PCR를 이용하여 선택증폭(selective amplification)을 수행하였다.
C. 염기서열 결정
증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313) 단편의 염기서열을 결정하기 위해 클로닝 운반체로서 pGEM-T Easy Vector(Promega Co.)를 이용하였고, DNA 염기서열결정(sequencing)은 서울대학교 농업과학기기센터(http://nicem.snu.ac.kr/)에서 분석하였다(도4). 그리고, 중합효소반응(PCR) 산물은 전기영동 후 젤에서 분리 정제(QIAquick Gel Extraction Kit 이용, Promega Co.)한 다음 DNA 염기서열을 결정하였다(도5와 도6).
D. 증폭단편길이다형성(AFLP) 단편 주위의 염기서열 결정
위에서 나온 염기서열을 바탕으로 반풀림은도(Tm)가 72℃ 정도 되는 양방향으로 각각 2개씩의 프라이머를 제작(도4)하고 GenomeWalkerTM Universal Kit(BD Biosciences Clontech)를 이용해 주위의 염기서열을 결정할 수 있었다(도5). 이 염기서열을 바탕으로 프라이머를 작성(L, 5'-CCTCAAGTTAGGCCCCAACCAAAAGTTG-3'; ‘서열번호6참조’ R, 5'-TCCCATCTAGCCTCTGCCTTCTCAAATG-3';‘서열번호7참조’)하고, HN11(St1 /St1 ), SG55(Stu /Stu ), HN41(St2 /St2 ) 계통에 대해 앞에서 제작된 프라이머를 사용해 이 염기서열 부분을 중합효소반응(PCR) 증폭(94℃, 5분, 전변성(pre-denaturation); 94℃, 45초, 변성(denaturation); 68℃, 1분, 프라이머접합(annealing); 72℃, 45초, 중합반응(extension); 40회 반복 후; 72℃, 5분, 추가중합반응(post-extension))하였고 각각의 염기서열을 결정하여 클러스털엑스(ClustalX) 프로그램을 이용하여 다중정렬분석(multiple alignment)을 수행하여 이 3개의 염기서열을 비교하여 12개의 단염기다형성(SNP)을 찾았고, 그 중 4개의 단염기다형성(SNP)이 제한효소 작용 위치에 있었다(도6).
도면5와 도면6에 나와 있는 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), RGB(http://riceblast.dna.affrc.go.jp/), SOL(http://soldb.cit.cornell.edu/tools/blast/), TAIR(http://www.arabidopsis.org/Blast/) 등의 데이터베이스에 블라스트(blast) 검색을 통해 전혀 알려지지 않은 염기서열로 확인되었다.
E. 증폭산물절단다형성(CAPS) 분석
위에서 분석된 염기서열을 보면 HN41(St2 /St2 )과 SG55(Stu /Stu ) 사이에 엠에스이원(MseI) 제한효소 자리에 단염기다형성(SNP)이 있는 것을 찾을 수 있다(도5). 그래서 중합효소반응(PCR) 산물의 크기가 약 570bp 정도 되게 새롭게 프라이머를 제작(L, 5'-GTAGAGGAGTACCCGAGCCAGCGACAT-3';‘서열번호4참조’ R, 5'-CCACCGAATCTGAGGTCAAAGTCAAGG-3';‘서열번호5참조’)하여 중합효소반응(PCR)을 수행(94℃, 5분, 전변성(pre-denaturation); 94℃, 45초, 변성(denaturation); 68℃, 45초, 프라이머접합(annealing); 72℃, 45초, 중합반응(extension); 40회 반복 후; 72℃, 5분, 추가중합반응(post-extension))하였고, 중합효소반응(PCR) 산물을 엠에스이원(MseI) 제한효소를 처리하면 St2 대립유전자와 연관된 부분은 절단되고, Stu 와 연관된 부분은 절단되지 않는다(도7). 이렇게 전환된 증폭산물절단다형성법(CAPS) 분자표지를 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지와 비교해 본 결과 완전연관되어 있는 것을 확인 할 수 있다(도8).
F. 유용성 검증
실제 해당 프라이머를 제작하여 세포질웅성불임성이 안정한 고추(St2 /St2 )와 불안정한 고추(Stu /Stu )가 분리되는 집단(108개체)에 검정하여 본 결과, 도면7에서 보는 것처럼 뚜렷이 분리되는 것을 확인할 수 있었고 이러한 결과는 실제 육종에서 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서 본 발병은 자연계에 존재하거나 교배를 통하여 얻어진 서로 다른 안정화 관련 유전자들의 유전형을 식물체를 포장에 정식한 후 개화기에 화기의 구조 및 화분의 생성 유무를 육안 또는 현미경으로 관찰하지 않고 실험실에서 DNA 분석을 통하여 유전인자를 판별할 수 있을 뿐만 아니라 대립유전자가 동형인지 이형인지를 구분할 수 있기 때문에 일반적인 교배를 이용한 판별 방법보다 분석에 소요되는 시간을 2～3년은 단축시킬 수 있으며, 환경의 영향을 전혀 받지 않기 때문에 판별의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있고, 또한 실제 육종 과정 중에서 인공 교잡 단계와 육안으로 확인하는 임성 안정성 확인 단계 생략할 수 있는 등 육종 과정에서 선발의 효율을 극대화시킬 수 있는 방법이다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
이상의 결과와 같이 본 발명의 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지와 증폭산물절단다형성(CAPS) 분자표지를 이용한 고추 세포질웅성불임성 안정화 유전인자의 판별 방법은 교배를 통하지 않고 실험실에서 DNA 분석을 통하여 유전인자를 판별할 수 있을 뿐만 아니라 대립유전자가 동형인지 이형인지를 구분할 수 있기 때문에 일반적인 교배를 이용한 판별 방법보다 분석에 소요되는 시간을 2～3년은 단축시킬 수 있고, 포장에서 발생할 수 있는 환경의 영향을 받지 않아 판별의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있으며, 또한 교배과정과 후대 임성안정성 확인 과정을 생략할 수 있는 등 실제적인 육종 효율을 높이는데 크게 기여할 수 있다.
또한 상기와 같은 판별 기간 단축으로 일대잡종 종자생산에 세포질적-유전자적 웅성불임(CGMS) 시스템을 이용하지 못하고 있던 신미청과군과 감미청과군에서도 세포질-유전자적 웅성불임(CGMS) 시스템을 이용하게 된다면 일대잡종 종자생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있으며 이는 종자산업의 국가적인 측면에 있어서도 종자 수출 경쟁력을 한층 강화시킬 수 있는 효과가 있다.
또한 상기와 같은 판별 기간 단축으로 일대잡종 종자생산에 세포질적-유전자적 웅성불임(CGMS) 시스템을 이용하지 못하고 있던 신미청과군과 감미청과군에서도 세포질-유전자적 웅성불임(CGMS) 시스템을 이용하게 된다면 일대잡종 종자생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있으며 이는 종자산업의 국가적인 측면에 있어서도 종자 수출 경쟁력을 한층 강화시킬 수 있는 효과가 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (5)
- 표현형을 통해 세포질웅성불임성이 안정한 임성을 보이는 고추(St2_)와 불안정한 임성을 보이는 고추(Stu Stu )가 분리되는 집단을 만드는 단계, 상기 집단의 어린 고춧잎으로부터 DNA를 추출하는 단계, 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자와 연관된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지 탐색하는 단계, 상기 탐색된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지로 연관지도를 작성하는 단계, 상기 연관된 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지 E112M313(서열번호1)을 실제 육종에 이용할 수 있는 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지로 바꾸기 위해 E112M313(서열번호1)의 염기서열을 분석하는 단계, 상기 서열번호1을 중심으로 양방향으로 주위의 서열번호3을 결정하는 단계, 상기 서열번호3을 이용하여 프라이머 조합 서열번호4와 서열번호5를 선택하는 단계, 분석하고자 하는 고춧잎 으로부터 추출된 DNA에 대해 상기 프라이머 조합으로 중합효소반응(PCR)을 수행하는 단계, 증폭된 중합효소반응(PCR) 산물에 제한효소 MseI를 처리하고 이를 전기영동하는 단계를 포함하는 과정을 통하여 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자의 유무를 판별하는 것을 특징으로 하는 고추 세포질웅성불임성 안정화 유전인자의 판별방법.
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- 증폭단편길이다형성(AFLP) 분자표지(E112M313)를 이용한 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자의 판별에 사용되는 서열번호1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분자표지.
- 증폭단편절단다형성(CAPS) 분자표지를 이용한 고추 세포질웅성불임 안정화 유전인자의 판별에 사용되는 서열번호3의 염기서열으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분자표지.
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|---|---|---|---|---|
| CN108411027A (zh) * | 2018-05-24 | 2018-08-17 | 武汉市农业科学院 | 一种检测辣椒cms雄性不育恢复基因的caps分子标记引物及应用 |
| CN110373487A (zh) * | 2019-04-24 | 2019-10-25 | 华南农业大学 | 一种与辣椒辣味性状相关的InDel标记及其应用 |
| KR20200063381A (ko) | 2018-11-27 | 2020-06-05 | (주)고추와 육종 | 고추의 세포질-웅성불임을 이용하여 과실이 열리지 않는 고기능성 잎-줄기 전용 품종 육종 기술 |
-
2005
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