KR101961855B1 - 식물의 화분 발달에 관여하는 phd 유전자 및 이를 이용한 유전자적 웅성불임성의 판별방법 - Google Patents

식물의 화분 발달에 관여하는 phd 유전자 및 이를 이용한 유전자적 웅성불임성의 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물의 화분 발달에 관여하는 PHD 유전자 및 이를 이용한 유전자적 웅성불임성의 판별방법에 관한 것으로, 본 발명은 파프리카 및 고추의 웅성불임을 판별할 수 있는 유전자 마커에 관한 것으로, 본 발명의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 변이체 확인을 통해, 포장에서 발생할 수 있는 환경의 영향을 받지 않아 웅성불임 판별의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있으며, 또한 교배과정과 후대 임성안정성 확인 과정을 생략할 수 있는 등 실제적인 육종 효율을 높이는데 크게 기여할 수 있다. 또한 상기와 같은 판별 기간 단축으로 비용을 획기적으로 절감할 수 있으며, 이는 종자산업의 국가적인 측면에 있어서도 종자 수출 경쟁력을 한층 강화시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 손쉬운 신품종 개발 및 고부가가치의 산업생산에 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

Description

식물의 화분 발달에 관여하는 PHD 유전자 및 이를 이용한 유전자적 웅성불임성의 판별방법{PHD gene involved in pollen development in plants and method for discriminating genic male sterility of plant by using the gene}
본 발명은 식물의 화분 발달에 관여하는 PHD 유전자 및 이를 이용한 유전자적 웅성불임성의 판별방법에 관한 것이다.
우리나라와 미국을 비롯하여 유럽의 많은 농업선진국의 재배용 고추는 대부분 교잡육종법과 잡종강세육종법을 이용한 일대잡종(F1) 품종이며, 이들 품종의 종자생산(채종)에는 제웅교배 및 웅성불임성이 이용되고 있다. 최근 들어 거의 모든 나라에서는 제웅교배보다는 채종경제성이 높은 웅성불임성을 이용한 채종 기술을 사용하고 있다. 일대잡종 종자 생산에 사용되고 있는 웅성불임성은 불임을 유기하는 유전자가 핵 내에 존재하는지 또는 세포질 내에 존재하는지에 따라서 유전자적 웅성불임성(GMS)과 세포질-유전자적 웅성불임성(CGMS)으로 크게 구분할 수 있다. 유전자적 웅성불임성은 불임을 야기하는 유전자가 핵 내에 존재하며 열성 동형접합체(msms)의 경우에만 불임이 표현형으로 나타나게 되며 고추에서는 전 세계적으로 약 20여 개의 유전자가 보고되고 있다. 반면 세포질-유전자적 웅성불임성은 불임을 만드는 유전자는 세포질의 미토콘드리아에 존재하며 우성으로 작용하는 핵 내의 회복유전자(Rf)가 존재할 경우에는 가임이 되지만 회복유전자가 열성 동형접합체(S, rfrf)일 경우에는 불임이 된다. 전자의 경우에는 반드시 매 세대마다 웅성불임 유전자좌가 열성 동형접합체인 불임개체(msms)와 이형접합체(Msms)와의 교잡을 통해서 웅성불임성을 유지해야 하는 반면 후자의 경우에는 세포질이 불임이고 회복유전자좌가 열성 동형접합체인 불임개체(S, rfrf)와 세포질은 정상이면서 회복유전자좌가 열성 동형접합체인 가임개체(N, rfrf)와의 교잡을 통해서 불임을 유지할 수 있다.
유전자적 웅성불임성은 세포질-유전자적 웅성불임성을 사용하지 못하는 거의 대부분의 유럽 국가들과 중국, 미국 등의 나라에서 가장 많이 사용되고 있는 방법이며 우리나라의 경우에도 하우스 재배용 풋고추 품종이나 단기간에 새로운 품종을 개발할 목적으로 사용되고 있으나, 이 방법은 전술한 바와 같이 웅성불임성이 열성유전자에 의해 조절되기 때문에 모계를 육성하는데 많은 시간과 노력이 소요된다. 유전자적 웅성불임성(GMS)을 이용하여 웅성불임 계통(모계)을 개발하는 기존의 방법을 살펴보면, 일반적인 열성유전자 도입을 위한 여교잡 육종 방법을 사용하게 되는데, 크게 우량한 특성을 가지고 잡종강세를 많이 보이는 계통(모계)에 유전자적 GMS를 도입하는 단계와 형매교배(sibcrossing)를 통한 유전자적 웅성불임성을 유지하는 단계로 나눌 수 있다. 우선 GMS를 도입하는 방법을 살펴보면, i) 모계를 교배하여 일대잡종(F1, Ms 1 ms 1 )을 얻고 이후에 자가수정하여 F2 세대에서 웅성불임 개체(ms 1 ms 1 )를 선발하고 여기에 다시 모계를 여교잡하는 방법과 ii) 바로 모계와 여교잡하여 이들을 각각 자가수정하여 분리가 일어나는 집단에서 웅성불임 개체(ms 1 ms 1 )를 선발하는 방법이 있다. 실제 육종에서는 전자보다 후자의 방법이 주로 많이 이용되는데, 이는 육종 연한이 전자의 방법보다 짧기 때문이다. 위의 두 방법에서 대부분의 원예적 특성이 모계 쪽으로 고정이 된 후에는 형매교배(sibcrossing)를 통하여 웅성불임성을 유지하게 되는데 가임(Ms 1 Ms 1 또는 Ms 1 ms 1 )과 불임(ms 1 ms 1 )이 분리되었을 때, 가임을 불임에 교배한 후대에서 모두 가임이 나오는 경우는 교배한 가임이 Ms 1 Ms 1 이고, 가임과 불임이 분리가 일어나는 경우는 교배한 가임이 Ms 1 ms 1 이다. 따라서 분리가 일어나는 집단을 선발하고 여기에서 가임(Ms 1 ms 1 )과 불임(ms 1 ms 1 )을 교배하면 계속 1:1(가임:불임) 웅성불임 계통을 유지할 수가 있다.
또한, 위의 방법과는 다르게 유전자적 웅성불임성(GMS)을 이용한 상용 품종(F1 varieties)으로부터 새로운 웅성불임계통을 개발하는 방법이 있다. 우선 일대잡종종자(F1)를 자가수정하여 그 후대(F2)에서 특성이 좋은 가임 개체(Ms 1 Ms 1 또는 Ms 1 ms 1 )를 선발하고 자가수정하여 다음 세대(F3)에서 모두 가임이 나타나면 에프투(F2) 개체의 유전자형은 Ms 1 Ms 1 이고, 에프쓰리(F3)에서 가임과 불임이 분리되면 에프투(F2) 개체의 유전자형은 Ms 1 ms 1 이다. 이때 동형접합체(Ms 1 Ms 1 )는 선발하지 않고, 이형접합체(Ms 1 ms 1 )만 선발하여 자가수정한다. 또 이와 함께 웅성불임성이 육성 중간에 소실되는 것을 막기 위해 에프투(F2) 세대의 가임 개체와 불임 개체를 교배하는 형매교배(sibcrossing)를 매 세대마다 실시하게 된다. 그리고 선발된 이형접합체(Ms 1 ms 1 )의 자가수정을 계속 반복 및 선발하여 나머지 특성들이 상당히 고정(homozygous)되었을 때, 위의 두 방법에서와 마찬가지로 형매교배(sibcrossing)를 통하여 불임 모계를 유지하게 된다. 위에 열거한 어떠한 방법을 사용하더라도 유전자적 웅성불임성을 이용한 일대잡종 종자생산에 있어서는 채종포에서 웅성불임 계통에서 발생하는 50％의 가임주를 반드시 제거해야 하는 번거로움이 따르게 되므로, 효과적인 방법에 대한 연구가 계속 요구되는 실정이다.
한편, 한국등록특허 제0998142호에서는 '피망형 고추의 유전자적 웅성불임성 유전자 ms 1 과 연관된 분자표지 개발 및 이를 이용한 선발과 계통 육성 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0998124호에서는 '파프리카(착색단고추)의 유전자적 웅성불임성(GMS)과 연관된 분자표지 개발 및 이를 이용한 새로운 GMS 계통육성 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '식물의 화분 발달에 관여하는 PHD 유전자 및 이를 이용한 유전자적 웅성불임성의 판별방법'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 앞선 연구에서 색이 있는 벨 모양의 달콤한 고추인 파프리카(Capsicum annuum L.)에서 유전자적 웅성불임은 다량의 잡종 종자의 경제적이고 효과적인 생산에 사용되어온 ms 1 유전자에 의해 유발되었으며, ms 1 유전자좌로부터 약 2-3　cM에 위치한 CAPS 마커인 PmsM1-CAPS가 보고된 점을 인지하였다.
이로부터, 본 발명에서는 867 웅성가임 및 251 웅성불임 식물체로 분리되는 1118 개체로 구성된 F2 집단에서 HRM(high-resolution melting) 마커를 이용하여 ms 1 유전자좌와 가까운 정교한 유전자 지도를 구축하였다. ms 1 유전자좌에 인접한 총 12 HRM 마커는 종내 SNPs(intraspecific SNPs)를 타겟팅하고, 차세대 재시퀀싱 분석(next-generation resequencing analysis)에 의해 얻은 전장 유전체 시퀀스와 비교하여 유도된 53개 프라이머 세트로부터 개발되었다. 이러한 분석으로, 본 발명자는 ms 1 유전자와 공동분리되는 869.9　kb의 시퀀스 영역을 확보하였다. 상기 영역은 유전자 예측 분석에 의해 11개의 ORF(open reading frames)로 분석되었다.
본 발명에서는 파프리카의 웅성불임에 대한 강력한 ms 1 후보 유전자로 CA05g06780(서열번호 1)가 동정되었으며, 상기 유전자는 애기장대 MALE STERILITY 1 (MS1) 유전자의 상동체로, 화분 발달을 조절하는 PHD-유형 전사인자를 암호화한다. 특히, 서열번호 1의 파프리카 CA05g06780 유전자의 염기서열 중 1790번째 염기의 결손(deletion)으로 프레임시프트 돌연변이(frameshift mutation)가 유발되어 조기 정지 코돈(premature stop codon, TGA)이 유발되어 ms 1 기능에서 중요한 LZ 및 PHD-핑거 도메인이 없는 197aa의 짧은 ms 1 단백질이 생성됨으로써, 웅성불임이 유발되는 점을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 파프리카 및 고추의 웅성불임 판별용 In/Del(insertion/deletion) 마커를 제공할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 변이를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 파프리카 및 고추의 웅성불임을 판별할 수 있는 유전자 마커에 관한 것으로, 본 발명의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 변이체 확인을 통해, 포장에서 발생할 수 있는 환경의 영향을 받지 않아 웅성불임 판별의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있으며, 또한 교배과정과 후대 임성안정성 확인 과정을 생략할 수 있는 등 실제적인 육종 효율을 높이는데 크게 기여할 수 있다. 또한 상기와 같은 판별 기간 단축으로 비용을 획기적으로 절감할 수 있으며, 이는 종자산업의 국가적인 측면에 있어서도 종자 수출 경쟁력을 한층 강화시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 손쉬운 신품종 개발 및 고부가가치의 산업생산에 유용하게 이용할 수 있을 것이다.
도 1은 파프리카 ms 1 유전자좌 주변의 고밀도 유전자지도(A 및 B), F2 분리집단 및 상용품종에서 재조합체의 유전형과 표현형(C), 11개의 후보유전자(D), Ms 1 및 ms 1 에서 CA05g06790 유전자의 비교(E)를 나타낸다.
도 2는 Ms 1 및 ms 1 에서 CA05g06780 단백질의 아미노산 서열의 비교 결과를 나타낸다.
도 3은 CA05g06780 유전자의 1bp 결손(deletion)을 확인할 수 있는 루나 프로브(luna probe) HRM 분자표지(MS1-HRM)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 CA05g06780 유전자의 염기서열 일부를 나타낸 것이다. 색깔로 표시한 부분의 염기서열은 순서대로 다음과 같은 영역을 나타낸 것이다. 검은색: 5'-UTR, 파란색: exon1, 붉은색: intron1, 파란색: exon2, 붉은색: intron2, 파란색: exon3. exon2에 동그라미가 표시된 염기는 ms 1 대립유전자 1bp 결손(deletion) 위치를 표시한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 변이를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명에서 용어, "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.
본 발명에서 용어, "결손(deletion) 변이"는 유전자 또는 염색체의 결손 변화가 일어난 것을 의미다. 즉, 품종간의 유전자의 차이가 존재하는 영역을 의미할 수 있다. 상기 결손 변이는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 결손(deletion)된 염기를 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다.
본 발명의 유전자 마커를 웅성 불임성의 식물체 품종 판별에 사용할 수 있는 것은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기가 결손(deletion)되는 것에 근거한 것으로, CA05g06780 유전자의 1790번째 염기가 결손되면 웅성 불임성 식물로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 웅성 불임성 식물 판별용 유전자 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커 조성물을 제공한다. 상기 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커 특이적인 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 키트는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, PrimePrepTM Genomic DNA isolation kit(GenetiBio, 한국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시 예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭할 수 있다. 표적 서열을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템 (transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
또한, PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손 여부를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 유전자형 확인은 염기서열 분석법(direct sequencing) 또는 HRM(high-resolution melting) 분석 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석을 이용하여 탐색할 수 있으며, 바람직하게는 HRM(high-resolution melting)을 사용하여 검정할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물이 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기가 결손(deletion)된 유전자형인 경우에 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 변이 여부는 식물체로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하여 주형으로 사용하고, 비표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(Luna probe) 및 본 발명에 따라 제작된 프라이머 세트 또는 프로브를 첨가하여 실시간(real-time) 중합효소반응(PCR)을 실시한 다음 멜팅 커브 분석(melting curve analysis)을 실시하여 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트일 수 있으며, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브(Luna probe)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
식물 재료
1118개로 구성된 파프리카 F2 분리집단은 농협종묘로부터 분양받아 ms 1 유전자의 고밀도 유전자지도 작성에 사용하였다. 이 집단은 웅성불임(ms 1 ms 1 )과 웅성가임(Ms 1 Ms 1 )을 교배한 F1을 자가수정한 F2이며, 24-28℃ 온실에서 재배되었다. 총 15개의 파프리카 상용 F1 품종과 48개의 육성 계통을 대상으로 본 발명에서 개발된 ms 1 연관 분자표지의 효용성을 실험하였다. 15개의 상업 품종은 자카토(Zagato), 베이런(Veyron), 콜레티(Coletti), 마두로(Maduro), 페라리(Ferrari), 마라넬로(Maranello), 볼란테(Volante) 및 마조나(Mazzona)(상기 8개 품종은 Enza Zaden에서 개발됨), 나가노(Nagano), 아란시아(Arancia), 보기애(Boogie), 지리산(Jirisan), 요리테(Yorite) 및 헬싱키(Helsinki, Rijk Zwaan), 마그니피코(Magnipico, Syngenta)을 포함했다. 웅성가임과 웅성불임의 표현형을 확인하기 위하여, 파프리카 종자를 2016년 2월에 전북대학교 온실에서 파종하여 개별 포트로 옮겨 심었다. 웅성가임(MF)과 웅성불임(MS)의 표현형은 식물 당 최소 5개의 꽃의 약 안의 화분립을 육안 관찰을 통해 구별하였다. 화분이 있는 식물은 웅성가임(MF) 표현형으로 평가하고, 화분이 없는 식물은 웅성불임(MS) 표현형으로 평가하였다.
DNA 추출
게놈 DNA는 은 등(Eun et al., 2016 Hortic Environ Biotechnol 57:589-597)에 의해 확립된 방법에 따라 파프리카의 어린잎에서 추출하였다. BioDrop LITE (BioDrop UK Ltd., Cambridge, UK)를 사용하여 DNA 농도를 측정하였고, 100 ng/㎕로 희석하여 HRM 분석에 사용하였다. PmsM1-CAPS 분자표지(Lee et al. 2010 Breed Sci 60:93-98)에 인접하여 위치하는 고추(C. annuum)의 종내 SNPs를 전장 유전체로부터 얻고, 그로부터 53개의 HRM 분석용 프라이머 세트(표 1)를 선발하였다. HRM 분석은 LightCycler Real-Time PCR (Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 수행되었다. HRM 반응은 게놈 DNA 20ng, 10x 버퍼 2.0㎕, 2.5mM dNTP 1㎕, SYTO9 녹색 형광 염료 1㎕, 0.5 유닛의 EasyTaq DNA 중합효소, 10pmol의 프라이머 1㎕, 멸균된 3차 증류수 11.9㎕를 포함한 총 20㎕의 반응액을 만들어 수행하였다. PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다. 95℃에서 5분 동안 전변성 반응을 수행하고, 다음 2단계를 40회 반복하였는데, 95℃에서 20초간 변성 반응하고, 60℃에서 20초간 어닐링 및 증폭을 수행하였다. 그리고 마지막으로 60℃에서 5분 동안 마지막 증폭을 수행하였다. 용융 곡선 분석은 60℃와 90℃ 사이에서 0.2℃씩 온도를 높여가면서 측정하였다. 용융 곡선의 그래프를 HRM 소프트웨어 버전 1.1 (Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 분석한 후 식물을 3가지 그룹으로 분류하였다: F (동형 웅성가임 마커타입, Ms 1 Ms 1 ), H (이형 웅성 가임 마커타입, Ms 1 ms 1 ), S (웅성불임 마커타입, ms 1 ms 1 ). 정방향 프라이머(5'-GCG ATC CCA AAA GTC CAT GAT AGA-3': 서열번호 2), 역방향 프라이머(5'-GGT CAT ATG ATG CAT GGT GTG TTT-3': 서열번호 3) 그리고 라벨링되지 않은 프로브(5'-AGG CAA GTC AGA AGAAGC AAT CTC CAA-spacer-C3-3': 서열번호 4)를 사용하여 deSilva 및 Blackett (2007, http://www.genengnews.com/gen-articles/assay-high-resolution-melting-unlabeled-probes/1986. Accessed 20 Sept 2017)에 의해 고안된 방법인 루나 프로브(Luna probe)를 이용한 32187928-HRM 마커 분석을 하였다.
파프리카 5번 염색체 위의 ms 1 유전자좌 주변에 있는 53개의 HRM용 프라이머 리스트
No. HRM marker name Forward primer
(서열번호)		 Reverse primer
(서열번호)		 SNP Product size (bp)
1 31061906-HRM ATTTTGAGTCTATCACGTTACCT(5) TCGCTATATTTAATGTGTCGTGA(6) A/C 114
2 31095248-HRM TGAATTGCCACCTGGAGCTT(7) ACATTTCTCAGAGAGAGTTCAGT(8) T/C 97
3 31107823-HRM TGCCCTCACAAGCAACTGAA(9) AGAGTGCCTTGAAAGAGTTGTCA(10) G/A 136
4 31210417-HRM TCTACTGGACATCCACCTGG(11) AAGACTCATCTATTGCAACAGA(12) G/A 100
5 31230290-HRM TGGATCACCTTGTCGTATACCTC(13) TCTCTTGGTCTTTGTAGGCT(14) T/C 120
6 31232858-HRM TGAAGATTGTCATTTGATTCCCCT(15) ACTCCTCCATATCACACCCCA(16) C/T 103
7 31387076-HRM GACCGAGCTTTAAGATTCTGCT(17) TTGGTACTTCGGCATCCATT(18) G/A 150
8 31403125-HRM TCATGCTCACTCTCCCAAACC(19) CAGTTAGTGAGGATGTCTCTACCA(20) A/G 111
9 31406942-HRM AGGGGAGTTATTAGGGACTCGA(21) TCCAACGCATTCACAAGATCC(22) A/G 122
10 31436107-HRM TGATTGGGCTCGGTGTACTG(23) TGGAAGTGTTGCAACTAGAAACG(24) A/G 90
11 31442831-HRM AGCATGTATTTGGTGTTTGCA(25) TCACAGATACTATCGAATTTCACA(26) G/A 104
12 31463786-HRM GCCTTTTCTTCTATTAGAGCTGT(27) GTGCCAAGCGATTCAACCTC(28) T/G 150
13 31501280-HRM AGACATTCCAAGAACAATAACGA(29) ACAGATAAAGCACAGTCTCCT(30) T/C 81
14 31504333-HRM TCTGTTGTACTTGAAGGCTTCT(31) CACCATTACCCAAAGTAAATACAT(32) T/G 97
15 31504856-HRM TGTAAGGAAGTCCAACCTGTGA(33) TGCACTCACATCTTAGGGAAGA(34) G/A 123
16 31506449-HRM TCTCATTTTGACCATAAAGACGA(35) TCTTTGAGAAATCTAACAACGCT(36) C/T 133
17 31507928-HRM GCTCTCAGCTCTTGTTCAGA(37) GATTTCACCGATCCAGCAAT(38) T/C 102
18 31507995-HRM AGAAGATTATTGCTGGATCGGTGA(39) CTCTTGGCTTAGGCGCAGAT(40) C/T 90
19 31516016-HRM TTTTTCCAACTACCGCTGCA(41) TGTTAGAAGGGAGAGGCCAA(42) C/T 80
20 31739204-HRM GCCATAACCCGCCATCATTG(43) TGGGTCTTTGAACCATGATCA(44) T/G 83
21 31977357-HRM TCAGCTATCGTCTCAATCACA(45) ACTGTAACTGGGACTAATACTGGA(46) T/C 141
22 32019086-HRM ACATCAACAACCTATTTCACCA(47) CGCATCACTTTCTTCATCTCGT(48) T/C 132
23 32110760-HRM TGGAGGGATGTTATACCTGTGG(49) ATGACATTGTGTCCACACTT(50) C/T 121
24 32125314-HRM ACCCTTGAGCTTTTAGACTAGT(51) AGGATTCTTGGAGTCTTTTGGGT(52) A/C 122
25 32187928-HRM CAAAAGTCCATGATAGAGTGACCA(53) GTATCAATGGCTCATTGGAGATT(54) T/- 64
26 32241095-HRM TCACGGCATGTCCAAGACAA(55) ACTCTCTTTTGCACCAGGGT(56) G/A 95
27 32243676-HRM TCACAAATTGCGCCAAGACG(57) TGTTGACCTTTTGGACTCCT(58) A/G 80
28 32385930-HRM TGCACACACACAAAAGACAT(59) TTGAGCCGTAAGTGTTCCCC(60) A/G 84
29 32437536-HRM TCTCTTGAAAAATGCATTAAGTGA(61) AGATTTGTCCACTCCACTAAAA(62) T/C 136
30 32448644-HRM CTGTCTAAATGCGGTCGGGA(63) TGTACTGATGCACTCTTTCTTTG(64) A/G 82
31 32500411-HRM ACAAGTGATTCGGTCCAAAACT(65) TCCCTCGTGAAATCACCATCA(66) A/G 149
32 32507045-HRM ACTCTGTATATCTGGCTAGACTGA(67) TCAAGAACCCACGTTGAATTGC(68) T/C 80
33 32509032-HRM TGAAAGAAGATGGGGCAGCA(69) AAAGCCTCCCAATGCTTAGT70) A/C 99
34 32514977-HRM AGCAATCGGAATTCTTGTTGCT(71) AAGCCTGGGGTTGTTTCACA(72) C/T 125
35 32515707-HRM AGGGTACTGGGGATCTGGTC(73) TCCTATCAACCAGGTACCTTGT(74) T/C 99
36 32516312-HRM AGATTGTGAGTAGTGATCAAGTCT(75) ACTGCTTCCTCAGTATGACCA(76) A/G 87
37 32518922-HRM GTTCTTCTTGTCTACTACGTGCC(77) AAGTTAATCTATGGTCATTGAGGA(78) C/T 81
38 32579933-HRM AAGGGCCTTTTCCATTTGGA(79) TCGGAGCACTTCTCGGTCTA(80) T/C 91
39 32593668-HRM ACCTGTACGTCTGGTCATCC(81) TTGACGTTCACCATTTGTGT(82) A/C 143
40 32620968-HRM ACCAATTTTGCCTCATTCGA(83) CATGGTGCTTATGCGATGCC(84) T/C 82
41 32653591-HRM GGGAAGTTCACCGGTTAGCT(85) ACGGTCCTTGTCCTGTTTCTC(86) A/G 128
42 32667836-HRM GCATTTCGTCGCCAACCATT(87) TCAGTGGAAAGGCAGAGAAA(88) C/T 107
43 32668828-HRM TGAAATTGCTGTTGGGTTCA(89) TGGGAGAATTGGACTTTCCT(90) C/T 111
44 32670098-HRM GTGAGCGCACACTTAAACCG(91) CCTCTTGGTTCTTGCCTCCC(92) T/G 138
45 32670864-HRM TCATGAAATCGAGGGACTTGGT(93) CACTTCATTACAAGTCAAGAATGT(94) A/G 147
46 33537446-HRM TGTTCTTGAGGTGGACCACA(95) TCAATTCATCTATTTACTACCCCA(96) T/G 98
47 33537481-HRM TGTACTTGGGGTAGTAAATAGATG(97) GCGAGAAAGTGTTTCCGCG(98) A/G 81
48 33539697-HRM AGTGTATACATGTACCTTATCCCT(99) TTAATGTGTCCTTGAATCGAGGA(100) G/A 80
49 33539757-HRM GCGAGAGTCTATGCAATTGATCC(101) TGCTTTTCGAATGGCAAATT(102) A/C 91
50 33542146-HRM ATCGGTTTGATTTGGATCGCG(103) TTGACATGCAAGTCTCATGT(104) A/G 80
51 33559191-HRM TTGCAGGCATGGAAGGGAAA(105) TGCATAACAATGTATGGGAATGCT(106) A/C 93
52 33559990-HRM TGTGGAGGATATGGAAAGGAAGA(107) ACCAGCACTTTGAAGGACCA(108) A/G 81
53 33604859-HRM TGCTAAGACCCCACATGAGT(109) TTGCTTCGACTGACATCCCC(110) A/G 82
연관지도(Linkage mapping)
F2 개체를 HRM 마커를 이용하여 유전분석하였다. 유전자 연관 지도는 JoinMap ver. 4.1 (Kyazma B. V., Wageningen, the Netherlands) 프로그램으로 분석한 결과 LOD ≥ 3.0, 최대 거리 30cM인 마커들로 구성되었다. 마커간 거리는 코삼비 맵핑 펑션(Kosambi 1944 Ann Eugen 12:172-175)을 사용하여 계산하였다. 연관지도는 MapChart 버전 2.1 소프트웨어(Voorrips 2002)를 이용하여 작성하였다.
후보 유전자들의 어노테이션
제한된 게놈 범위에서 잠재적 OFR(open reading frames)를 예측하기 위해 웹 소프트웨어 FGENESH (http://www.softberry.com/)을 이용하였다(Solovyev et al. 2006 Genome Biol 7(Suppl I):S10). 후보 유전자의 잠재적 기능은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST SEARCH와 TAIR(https://www.arabidopsis.org/) 데이터베이스를 기반하여 분석하였다.
웅성불임과 웅성가임 식물의 CA05g06780 유전자 시퀀싱 및 비교
웅성불임과 웅성가임 식물의 CA05g06780 유전자 염기서열(4023bp) 비교를 위해 8개의 프라이머(표 3)를 새로 디자인하였다. PCR 프로토콜은 앞에 제시된 HRM 분석에 사용되었던 방법과 동일했다. QIAquick Gel 추출 키트 (Promega, Fitchburg, WI, USA)를 이용하여 아가로스 젤로부터 분리해 낸 각각의 PCR 산물은 BIONICS Co. (Seoul, South Korea; http://bionicsro.co.kr/)에서 직접 염기서열 분석을 수행하였다. 분석된 염기서열은 온라인 프로그램 MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)을 통해 정렬하여 비교하였다.
실시예 1. 웅성가임 및 웅성불임의 분리 분석
웅성가임과 웅성불임의 분리 분석과 웅성불임의 표현형은 매우 안정적이며 명확하게 분리되었다. 웅성가임(MF) 식물은 화분립이 많은 반면 웅성불임(MS) 식물은 화분립을 갖고 있지 않았다. F2 분리집단에서 총 1118개의 식물을 분석한 결과 867개의 웅성가임과 251개의 웅성불임으로 분리되었다. 이는 카이자승(chi-square) 값 3.87과 p-value 0.049를 나타내 통계적으로 3:1 분리 비율과 다른 것으로 판단되었다.
실시예 2. ms 1 유전자에 연관된 HRM 마커의 개발
16개의 F2 DNA 샘플을 이용하여 HRM 마커에 대해 53개의 프라이머(표 1)로 스크리닝한 결과 총 12개의 마커가 다형성을 보였다: 31501280-HRM, 31504333-HRM, 31504856-HRM, 31506449-HRM, 31507928-HRM, 31516016-HRM, 32187928-HRM, 32385930-HRM, 32516312-HRM, 32667836-HRM, 32668828-HRM 및 32670864-HRM. 이 12개의 다형성 마커를 사용하여 F2 분리집단 전체를 분석하였다. 유전형과 표현형을 비교한 결과 6개의 재조합이 확인되었다. 재조합이 일어났던 7, 274, 971, 1043의 표현형은 32516312-HRM, 32667836-HRM, 32668828-HRM 및 32670864-HRM 마커에서 표현형과 유전형이 일치하지 않았다. 또한 F2 식물 239번과 882번은 32385930-HRM, 32516312-HRM, 32667836-HRM, 32668828-HRM, 32670864-HRM인 5개의 마커에서 표현형과 유전형이 일치하지 않았다. 추가적으로 파프리카 15개 F1 품종을 12개의 HRM 마커로 분석하였다. 그 중 3개 품종에서 재조합이 일어난 것을 발견하였다. 볼란테와 헬싱키는 32667836-HRM, 32668828-HRM 및 32670864-HRM 마커에서 재조합이 있었고, 요리테는 1501280-HRM, 31504333-HRM, 31504856-HRM, 31506449-HRM, 31507928-HRM, 31516016-HRM 마커에서 재조합이 있었다(도 1C). 그 중 32187928-HRM 마커만이 GMS 표현형과 완전히 일치하였다(도 1C). 하지만, 32187928-HRM 마커를 이용한 S(웅성불임)와 F(동형접합성 웅성가임)의 용융 곡선이 명확하게 구별되지 않았다. 따라서, S 및 F를 명확히 구별할 수 있도록 루나 프로브 방법을 이용한 32187928-HRM 마커를 새로 개발하였다. 이 마커의 효용성을 검정하기 위해 48개의 육종 계통과 15개의 F1 상업용 품종을 분석한 결과 GMS 표현형과 마커형이 완벽하게 일치하고 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. ms 1 자리의 맵핑
고추(C. annuum)의 염색체 5번에 위치한 ms 1 인접 영역에 대한 고밀도 유전자지도 작성을 위해 본 연구에서 개발된 다형성 마커를 이용하여 1118개의 F2 개체를 분석하였다(도 1). 32187928-HRM 마커는 표현형과 완전 연관되어 있었다. 또한 2개의 인접한 마커인 31516016-HRM 및 32385930-HRM는 각각 2개 및 4개의 재조합을 나타내었다. 그에 상응하는 유전적 거리는 각각 0.2 cM과 0.4 cM이었다(도 1B). 이 결과를 바탕으로 ms 1 유전자는 5번 염색체의 31.5-32.3 Mbp에 위치한다고 볼 수 있었다(도 1B). 마커 이름은 5번 염색체에 위치한 SNP의 물리적 위치를 의미한다(도 1B). 결과적으로 ms 1 유전자는 염기서열의 869.9 kb 내에 위치한다고 볼 수 있었다(도 1D).
실시예 4. 후보 유전자들의 동정
유전자 예측 프로그램인 FGENESH를 이용하여 869.9 kb의 염기서열에서 11개의 잠재적인 ORF를 찾았다(도 1d). 이 11개의 ORFs는 고추(C. annuum)의 참조 게놈인 CM334의 ORFs와 일치하였다(http://peppergenome. snu.ac.kr/). 각각의 ORFs는 코딩 서열인 CA05g06740에서 CA05g06840까지의 이름을 각각 부여하였다(도 1d, 표 2). 유전자 기능을 예측하기 위해서, 각각의 OFR를 번역한 아미노산 서열을 BLASTP를 이용하여 NCBI와 TAIR의 데이터베이스 기반으로 분석하였다. 이러한 결과는 표 2에 정리하였다.
후보 유전자의 블라스트(blast) 분석을 통한 기능 예측
No Gene Gene annotation
1 CA05g06740 Potassium transporter 17
2 CA05g06750 Uncharacterized protein LOC107877032
3 CA05g06760 Amino acid permease 3-like
4 CA05g06770 Serine/threonine-protein kinase BRI1-like 2
5 CA05g06780 PHD finger protein MALE STERILITY 1
6 CA05g06790 Pentatricopeptide repeat(PPR)-containing protein mitochondrial
7 CA05g06800 G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase
8 CA05g06810 G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase
9 CA05g06820 Disease resistance protein RPP13-like
10 CA05g06830 G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase
11 CA05g06840 G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase
CA05g06740 유전자는 포타슘 트란스포터 17을 암호화한다. CA05g06750 유전자는 아직 알려져 있지 않는 단백질을 암호화한다. CA05g06760은 아미노산 퍼미아제 3 유사 단백질을 암호화한다. CA05g06770, CA05g06800, CA05g06810, CA05g06830 및 CA05g06840 유전자는 세린/트레오닌-단백질 키나아제를 암호화한다. CA05g06790 유전자는 PPR 모티브를 포함하는 미토콘드리아 단백질을 암호화한다. 그리고 CA05g06820 유전자는 병 저항성 RPP13-유사 단백질을 암호화한다. 흥미롭게도 CA05g06780은 유전자 웅성불임과 관련 있는 호메오도메인 (PHD) 핑거 단백질 MALE STERILITY1을 코딩하고 있는 유전자와 상동체로 밝혀졌다. 그러므로 CA05g06780은 ms 1 유전자의 가장 유력한 후보 유전자였다.
실시예 5. 웅성가임(MF)과 웅성불임(MS) 식물에서 CA05g06780 유전자의 비교
웅성가임(MF)과 웅성불임(MS) 식물의 CA05g06780 유전자는 3개의 엑손(exon)과 2개의 인트론(intron)으로 구성되어 있었다. 그러나 MS 식물의 유전자는 엑손 2에서 한 개의 뉴클레오티드(T)의 결실이 있었다. 그 결실은 엑손 3에서 미성숙(premature) 정지 코돈(TGA)을 야기했다(도 1e). 그 결과 웅성불임(MS)과 웅성가임(MF) 식물의 유전자는 각각 197개 및 664개의 아미노산으로 서로 다른 길이의 단백질을 암호화했다(도 2).
CA05g06780 유전자인 MALE STERILITY 1은 애기장대에서 화분 성숙을 위해 필수적인 유전자로 밝혀져 있었다. 이 유전자는 화분발달 동안 발현되며 소포자를 생성하기 위해 영양적인 역할을 담당하는 융단(tapetal) 세포에서 관찰되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이 유전자는 웅성불임을 야기하는 강력한 후보 유전자로 예상하고 있다(표 2). 따라서 Ms 1 과 ms 1 에서 CA05g06780 유전자의 염기서열을 비교하기 위해 PCR 산물의 시퀸싱 분석을 수행하였다. 사용한 프라이머는 표 3과 같다.
CA05g06780 염기서열을 분석하기 위해 사용한 프라이머 리스트
CA05g06780 부분 정방향 프라이머(서열번호) 역방향 프라이머(서열번호)
CA05g06780-1 CAACGCGTTTAGGTGACCA(111) AGGATTCCGAAGGAAAGTAACCT(112)
CA05g06780-2 CCCGGATAACATGAGGTAAGGT(113) TTCATTAGTCACACTTTGTGATGC(114)
CA05g06780-3 TGCTACAAACAATAGCATAATTGAA(115) TCATTTGTTTACATGTTTGTAATTTGA(116)
CA05g06780-4 CATGCATCATATGACCCTCTATTT(117) CTTGTGTAGAGGGAGGCCTAAAA(118)
CA05g06780-5 CTTCTTGTTGCACATTAGATGGTT(119) TCATGGATGTAGTAATTAAAATGTAGC(120)
CA05g06780-6 ATACAAAGAAATCAAGGGGATTCA(121) ACAAGTTCATGTGAAGTCCGTAAA(122)
CA05g06780-7 AAAAACAATTTGGCCATGCTTA(123) TCTAATTAAATCAAACAACATGAGATG(124)
CA05g06780-8 CGATGTTTGATTTAATTAGAATGAGTT(125) CCTTTTCATATTTTTAGTCCCTTAACA(126)
Ms 1 과 ms 1 에서 CA05g06780 유전자의 염기서열을 비교한 결과, ms 1 대립유전자의 두 번째 엑손에서 1bp 결손(deletion)을 발견하였다(도 1E 및 도 4). 이는 CA05g06780 유전자(서열번호 1)의 1790번째 염기가 결손된 것으로 확인되었고(도 4), 이 염기의 결손은 프레임시프트(frameshift)를 일으켜 조기 정기 코돈(premature stop codon)을 형성하여 정상 단백질보다 훨씬 짧은 단백질을 형성할 것이라고 분석되었다(도 1E와 도 2).
웅성가임 애기장대 MS1과 파프리카 CA05g06780 단백질에서는 정상적으로 루이신 지퍼-유사 영역(LZ) 및 식물 호메오 도메인 (PHD) 핑거 모티프가 존재하지만, 웅성불임 파프리카 CA05g06780 단백질에서는 조기 정지 코돈으로 인해 이 두 도메인(domain)이 만들어지지 않는다(도 2).
이러한 결과들을 종합해 볼 때, 파프리카의 CA05g06780 유전자는 ms 1 유전자인 것으로 분석된다. 물론 이를 완전히 증명하기 위해서는 파프리카에서 CA05g06780 유전자의 기능 소실 돌연변이(loss-of-function, 유전자 넉아웃) 및 기능획득 돌연변이(gain-of-function, 상보성) 실험을 추가로 수행하여야 한다. CA05g06780 유전자의 1bp 결손은 유전자 기초의 마커(gene-based marker)뿐만 아니라 기능적인(functional marker)로서 개발될 수 있다. 따라서 이 1bp 결손을 확인할 수 있는 루나 프로브 HRM(MS1-HRM) 분자표지를 개발하였다(도 3). 개발된 MS1-루나-HRM 분자표지를 사용하여 또 다른 1,071개의 F2 분리집단에 적용하여 본 결과, 표현형과 마커형이 100% 일치하는 결과를 얻었다(표 4).
F2 분리집단에서 MS1-루나-HRM 분자표지의 적용성 검정
No. 표현형 MS1-루나-HRM No. 표현형 MS1-루나-HRM
1 MF F 36 MS S
2 MF H 37 MF F
3 MS S 38 MF H
4 MS S 39 MF F
5 MF F 40 MS S
6 MF H 41 MS S
7 MS S 42 MF H
8 MF F 43 MF F
9 MF F 44 MF H
10 MS S 45 MF F
11 MF F 46 MF H
12 MF F 47 MF F
13 MF H 48 MF H
14 MF F 49 MF F
15 MF H 50 MF F
16 MS S 51 MF F
17 MF H 52 MF H
18 MF H 53 MF H
19 MS S 54 MF F
20 MF H 55 MS S
21 MF H 56 MF H
22 MF H 57 MF H
23 MF H 58 MF F
24 MS S 59 MF H
25 MF H 60 MS S
26 MF F 61 MF H
27 MF F 62 MF H
28 MF H 63 MS S
29 MF H 64 MF F
30 MF H 65 MF H
31 MS S 66 MS S
32 MS S 67 MF H
33 MS S 68 MS S
34 MS S 69 MF H
35 MS S 70 MF F
표현형: MF, 웅성가임; MS, 웅성불임
MS1-루나-HRM: F, Ms 1 Ms 1 유전자형; H, Ms 1 ms 1 유전자형; S, ms 1 ms 1 유전자형
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> PHD gene involved in pollen development in plants and method for discriminating genic male sterility of plant by using the gene <130> PN18053 <160> 126 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4045 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 tttaatttct ctttaaacac ctaggtaatg aggttggtaa gttgtaacta gtaagtaacg 60 aactcccttt aaattttctt gaattcattc tatctttggt ccttctctga tggtgaagga 120 gatgaaggag atgtcgactt tagatctaag cggatcgaaa aaaaggaaga ggaatataaa 180 tgagaaggtg tttaagttca agaattttgg tgaacaaggg tttcctatag agtttatagg 240 gtgcaatttt gagcaaaatg ttaagcttct tttggaattt gcacaacaag aaaatgttag 300 tatttggtca tttcagctag aagttcatag acatccacca atgcatgtgg ttctctttgt 360 tgttgaagaa caagttgagt tgtccctcaa tcccaattgc aagcattgtc aatatatagg 420 taatatcatt aattatatga gatttgttac aagttcatgt gaagtccgta aatatagatc 480 gttaaaaaaa tcaatgaatc aaaaaaggtc agtagtatat tcagaacata tagtgatgta 540 acttcatttg ttaggtttgt gtctggtgaa aaatggtcgt gatctgtccc catagacaca 600 aaataaataa atcaaataca aagcgaaatc actaaaatca tgcaaacttt taaaaaatgc 660 caaggatgag ttcaatttac tgtatatttc tttgcctgct gtttcttcct catctttaca 720 acttgcatat tcattttata ctttcacagt tttcaccgcc tactttaata tgttatagca 780 gataacctga tatgttttca agattattat cccacttatc atatacagtc ggtagtggtg 840 gagtcattct tgtttaaggg ttatctagtg ttggctgaaa agttacattg tgtaaatagg 900 taacatttat gtgtatatac tatattaggg gtgacaaaat taatccagga aaacatggcc 960 ctcccaacct gctcaagttt ggacggatta atacccattt atttattagc tcaattcatt 1020 ttggttcgcc taattcagca cctttaagat ctaggttaat atgtagttac ccatttagac 1080 ccctccgaat ttaatccagt ctgttcattt tttggcacct atacattata tgttgaatcc 1140 ccttgatttc tttgtatatt taccttttca tatttttagt cccttaacaa aaaaggtagt 1200 tcttccccaa ccatcggtat ataaaagtta aactcattct aattaaatca aacatcgtga 1260 gatgaaagag ttacccattt agacccctcc aaatttaatc caatccgttc actttttggc 1320 acctatacat tatatattga atcaccctaa tttctttgta tatttacctt ttcatatttt 1380 tagtccctta acaaaaaaga tagttctgcc ccgaccatcg gtatatacaa gttaaactca 1440 tttctaatta aatcaaacaa catgagatga aagagttgct accatcaagt acttaagcat 1500 ggccaaattg tttttttttt tgaactctca ttatctcatg gatgtagtaa ttaaaatgta 1560 gctcaggctg gggcaaccat ctaatgtgca acaagaagta ccatttcatg ttgcccacaa 1620 aggacacaat tgcagcttgt gtagagggag gcctaaaaaa caatattggt ggagaaaata 1680 gaagtaagtt gaatttgata gaaatagagg gtcatatgat gcatggtgtg tttcactcta 1740 atggttttgg gcatttgctt tgtatcaatg gctcattgga gattgcttct tctgacttgc 1800 ctggtcactc tatcatggac ttttgggatc gcctttgcat tggacttggt gcaaggtttg 1860 ttattctctt catttcattt taacttatgt cacaatgttt aaagtttgac aaacaaagaa 1920 ttttaaaatt tatggtctta cacttgttgg gacatatttg tagccaggga gggagttggg 1980 atgccgcagg aggtccctca accacgatca ttgttgaaaa aactaaaata tacacacaca 2040 cgcaccaaca ttaattttat gtataatgga tgttgaattt ctttctattt catttgttta 2100 catgtttgta atttgaattt ccttaatgaa aaattcaatt atgctattgt ttgtagcata 2160 acattatttt caaaatatag aaagacgttt ctagttttag aacatactaa acaaatgtca 2220 cataaaatga tatagaatgt ttactaatgt agctttgaac tttattgtca tatcaattat 2280 gtcttaattt atatgctcaa tcaaacatca cataatattt ttttaatcac ttcttatttt 2340 tcgaaaggtc aaatgtttag aaaaagattt aggttatcaa aacgactaat atttgagatc 2400 ggacgcatta atgtcttatg tttcacttgt tttgaaggaa agtgagctta agagatgtct 2460 caacaaagaa aggcatggat ctaaggctac tcaacacagt agcctatggt gagccatggt 2520 ttgggcgatg gggttacaaa tttggccgtg gaagctttgg tgtaactcaa gaaacatacc 2580 aaagtgcaat caatgccata caaaacatgc cattagcctt attggcacat catgtagggg 2640 tcataaatat taatgagata ttaacggtgt tatcgaggta ccaaatgtta tctggtcatt 2700 cattagtcac actttgtgat gccattcatt tcatgttgga gctcaaatcg aggattccga 2760 aggaaagtaa ccttacctca tgttatccgg ggttattggt tgacaccact tgtaggtggt 2820 cacctaaacg cgttgagatg gctattaggg ttgttgtgga agccctaaaa agggccgagt 2880 cacgttgggt gtctaggcaa gaggttcgtg atgctgctcg tgcctatatt ggtgatacag 2940 ggctcctaga tttcgtgctt aagtcattgg gaaatcatat tgttggaaag tacttggttc 3000 gtcgatgctt aaatccagtg accaaagttt tggaatactg tttagaggac atatctaaag 3060 catttcctaa acaagatcaa ggttttaggg ttaatgactc aaaagggaaa caacaataca 3120 aaatcacatg ggtacaactt atgaaggaca tatacttctt gtacaagaat attttaaaag 3180 aggacaaggg attaatgtcc aattatacgg gcgtcttagc tacaattcca gcagcttcta 3240 gaataatcct agacacgaag tacttcctca aagaatacaa agggatagag gcggattcaa 3300 gaattgaagt agacaaatcc aagatttact gcgcgattat gttggcaacc aaggatggat 3360 ttggagtaga agaaaaagta atgaccccat ttgagtgctt cacattaaga aaagatgtca 3420 catttgatga gctcaaaatt gaagtggaaa aaatttttgg ggctatttat cggggactaa 3480 ggaactttgc tacaagatca attaacaatt tgatgagccc gattactgga tcagaattgg 3540 tttttaatgt tatgaaacca gggagcaaag ttgtcctagg aggggtgata atgtcaattg 3600 atcatcatca taataataac aatattaatg gagggatatt tgaaggaatt aagaataata 3660 ttattgtgga ttgtctttgt gggactaaag atgaagaaga tggagaaagg atggtttcat 3720 gtgatatttg tgaagtttgg cagcacacta gatgtgttaa tatcccaaat catgaagaaa 3780 ttccagacat atttctttgt aataagtgtg agcaagatat tttacaattt cagtcattac 3840 cttagatgat ttctatcagc aaaagaaatc tttagaaaca aaaataacat atatgtgtta 3900 caacttttca tgcattacta ctactatttg agtttgaaga aatgttttat tgatatggga 3960 ggtacattat tactttctct ctgtttccct cttccttttt ttctgtttca tattctctaa 4020 ttattaacat ccaggtgaaa ttgaa 4045 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcgatcccaa aagtccatga taga 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggtcatatga tgcatggtgt gttt 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aggcaagtca gaagaagcaa tctccaa 27 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 attttgagtc tatcacgtta cct 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcgctatatt taatgtgtcg tga 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgaattgcca cctggagctt 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acatttctca gagagagttc agt 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgccctcaca agcaactgaa 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agagtgcctt gaaagagttg tca 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tctactggac atccacctgg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aagactcatc tattgcaaca ga 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tggatcacct tgtcgtatac ctc 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tctcttggtc tttgtaggct 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgaagattgt catttgattc ccct 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 actcctccat atcacacccc a 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gaccgagctt taagattctg ct 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttggtacttc ggcatccatt 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tcatgctcac tctcccaaac c 21 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cagttagtga ggatgtctct acca 24 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aggggagtta ttagggactc ga 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tccaacgcat tcacaagatc c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tgattgggct cggtgtactg 20 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tggaagtgtt gcaactagaa acg 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 agcatgtatt tggtgtttgc a 21 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcacagatac tatcgaattt caca 24 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gccttttctt ctattagagc tgt 23 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gtgccaagcg attcaacctc 20 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 agacattcca agaacaataa cga 23 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 acagataaag cacagtctcc t 21 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 tctgttgtac ttgaaggctt ct 22 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 caccattacc caaagtaaat acat 24 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tgtaaggaag tccaacctgt ga 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tgcactcaca tcttagggaa ga 22 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tctcattttg accataaaga cga 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tctttgagaa atctaacaac gct 23 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gctctcagct cttgttcaga 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gatttcaccg atccagcaat 20 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 agaagattat tgctggatcg gtga 24 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ctcttggctt aggcgcagat 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 tttttccaac taccgctgca 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 tgttagaagg gagaggccaa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gccataaccc gccatcattg 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tgggtctttg aaccatgatc a 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 tcagctatcg tctcaatcac a 21 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 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<210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 acaagtgatt cggtccaaaa ct 22 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 tccctcgtga aatcaccatc a 21 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 actctgtata tctggctaga ctga 24 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 tcaagaaccc acgttgaatt gc 22 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 tgaaagaaga tggggcagca 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 aaagcctccc aatgcttagt 20 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 agcaatcgga attcttgttg ct 22 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 aagcctgggg ttgtttcaca 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 agggtactgg ggatctggtc 20 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 tcctatcaac caggtacctt gt 22 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 agattgtgag tagtgatcaa gtct 24 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 actgcttcct cagtatgacc a 21 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 gttcttcttg tctactacgt gcc 23 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 aagttaatct atggtcattg agga 24 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 aagggccttt tccatttgga 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 tcggagcact tctcggtcta 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 acctgtacgt ctggtcatcc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 ttgacgttca ccatttgtgt 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 accaattttg cctcattcga 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 catggtgctt atgcgatgcc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 gggaagttca ccggttagct 20 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 acggtccttg tcctgtttct c 21 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 gcatttcgtc gccaaccatt 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 tcagtggaaa ggcagagaaa 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 tgaaattgct gttgggttca 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 tgggagaatt ggactttcct 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 gtgagcgcac acttaaaccg 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 cctcttggtt cttgcctccc 20 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 tcatgaaatc gagggacttg gt 22 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 cacttcatta caagtcaaga atgt 24 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 tgttcttgag gtggaccaca 20 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 tcaattcatc tatttactac ccca 24 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 tgtacttggg gtagtaaata gatg 24 <210> 98 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 gcgagaaagt gtttccgcg 19 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 agtgtataca tgtaccttat ccct 24 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 ttaatgtgtc cttgaatcga gga 23 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 gcgagagtct atgcaattga tcc 23 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 tgcttttcga atggcaaatt 20 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 atcggtttga tttggatcgc g 21 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 ttgacatgca agtctcatgt 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 ttgcaggcat ggaagggaaa 20 <210> 106 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 tgcataacaa tgtatgggaa tgct 24 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 tgtggaggat atggaaagga aga 23 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 accagcactt tgaaggacca 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 tgctaagacc ccacatgagt 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 ttgcttcgac tgacatcccc 20 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 caacgcgttt aggtgacca 19 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 aggattccga aggaaagtaa cct 23 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 cccggataac atgaggtaag gt 22 <210> 114 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 ttcattagtc acactttgtg atgc 24 <210> 115 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 tgctacaaac aatagcataa ttgaa 25 <210> 116 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 tcatttgttt acatgtttgt aatttga 27 <210> 117 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 catgcatcat atgaccctct attt 24 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 cttgtgtaga gggaggccta aaa 23 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 cttcttgttg cacattagat ggtt 24 <210> 120 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 tcatggatgt agtaattaaa atgtagc 27 <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 atacaaagaa atcaagggga ttca 24 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 acaagttcat gtgaagtccg taaa 24 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 aaaaacaatt tggccatgct ta 22 <210> 124 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 tctaattaaa tcaaacaaca tgagatg 27 <210> 125 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 cgatgtttga tttaattaga atgagtt 27 <210> 126 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 ccttttcata tttttagtcc cttaaca 27

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 변이를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물체는 고추 또는 파프리카인 것을 특징으로 하는 유전자 마커.
  3. 제1항 또는 제2항의 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제제는 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커 특이적인 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 마커 조성물.
  5. 제1항의 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 유전자 마커를 증폭하기 위한 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  6. 제5항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종 판별용 키트.
  9. 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제5항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파프리카 유래의 CA05g06780 유전자의 1790번째 염기의 결손(deletion) 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 유전자적 웅성 불임성 식물체 품종을 판별하는 방법.
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