KR102141619B1

KR102141619B1 - 신규한 분질배유 유전자

Info

Publication number: KR102141619B1
Application number: KR1020190021974A
Authority: KR
Inventors: 정지웅; 권순욱; 헝 왕; 장성규; 이아림
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2020-08-05

Abstract

본 발명은 벼의 분질배유 특성을 결정하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 규명한 벼의 분질배유 형질을 결정하는 신규한 유전자는 분질배유 특성을 갖는 식물체의 개발에 주요 목적 유전자로서 활용될 수 있다. 본 발명의 유전자로 형질전환된 벼는 분질배유 특성을 갖는바, 본 발명은 벼를 주 원료로 하는 가공 생산품에도 확대적용 될 수 있다.

Description

신규한 분질배유 유전자{A NEW FLOURY ENDOSPERM GENE}

본 발명은 쌀의 분질배유 형질을 결정하는 신규한 서열의 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

쌀은 국내 농업소득의 70%에 달하는 농가 주요 소득원이나, 식생활의 서구화, 기능성 잡곡류 소비 증가 등으로 인하여 소비량이 지속적으로 감소하고 있다. 2017년도 통계청 발표에 따르면, 국민 1인당 연간 쌀 소비량은 1970년 136.4kg에서 2016년 61.9kg로 감소하였으며, 벼 재배면적 역시 1975년 121.8만 ha에서 2016년 77.9만 ha로 줄어들어 생산기반이 취약해지고 있는 실정이다.

쌀과 함께 주요 식량작물인 밀은 제분과정을 통해 밀가루가 원료로 제공되고 이를 2차 가공하여 식품으로 생산된다. 즉, 밀 산업은 품종육성과 제분공정 등의 '원료산업'과 다양한 가공품을 개발하고 공급하는 '식품산업'의 구분이 명확해 시장 확충 및 부가가치 창출 잠재력이 매우 높은 작물로 평가받고 있다. 쌀의 경우 떡류를 제외하고도 약 300여 종에 달하는 가공식품 형태가 존재하지만, 국내에서 가공용으로 소비되는 쌀은 생산량의 5%에도 미치지 못하는 약 22만 톤 (수입10만, 국내생산 12만)에 불과한 실정이다. 대부분의 업체가 직접 정백미를 구입하여 자체적으로 쌀가루를 제조하여 사용하기 때문에 쌀가루의 품질이 균일하지 않을뿐더러, 그 매출규모는 49조원에 육박하는 음료, 식료품 제조업 매출규모 대비 2% (2006년 현재 약 1조원) 수준에 불과한 실정이다.

쌀은 낟알의 단단함 정도 (곡립경도)가 매우 높기 때문에 현재 국내에서 가장 보편적으로 사용되는 쌀 제분방식은 물에 불려 분쇄하는 습식제분 방식이다. 그러나 습식제분은 100kg의 쌀가루를 생산하는데 약 500리터의 쌀뜨물을 발생시켜 환경오염을 유발하는 문제점을 가지고 있다. 또한, 쌀가루를 유통시키기 위해서는 쌀가루를 살균건조시키는 별도의 공정을 추가하여야 한다. 이런 까닭에 습식제분 방식을 이용한 쌀가루 가공비용 (500~700원/kg)은 건식제분 방식을 사용한 밀가루 생산비용 (200~300원/kg)보다 2배 이상 높은 실정이다. 최근 대량 생산설비가 갖추어지면서 반 습식제분 기술이 부분적으로 운용되고는 있으나 생산비 상승 요인이 완전히 해소되지는 못했다.

경쟁력을 겸비한 고품질 쌀가루 생산을 위해 제분방식과 함께 중요하게 고려되는 것이 분쇄된 가루의 크기(입도)이다. 반죽이나 가공품의 물리화학적 성정이 입도분포에 의해 크게 지배되기 때문에 용도에 맞게 쌀가루의 입도를 어떻게 구성하고 유지하는가는 매우 중요한 문제이다. 일반적으로 쌀가루의 물리성은 미세한 가루일수록 단자(團子)의 경도변화가 적으며 반죽을 만들 때 물의 흡수율도 좋아진다. 그러므로 미세하게 분쇄된 쌀가루일수록 고품질로 인식되어 유통가격이 높아진다. 그러나 생산비가 절감되는 건식제분으로 미세한 입자를 얻으려면 쌀의 높은 곡립경도로 인해 기계적 힘이 커지게 되어 손상된 전분립의 비율이 급격히 올라가게 된다. 손상된 전분립은 반죽의 이화학적 특성변화를 초래하므로 결국 쌀가루의 품질저하를 야기한다. 최근 쌀가루를 보다 미세하게 분쇄할 수 있는 제트 밀 (Jet Mill), 터보 밀 (Turbo Mill) 등의 기술이 개발되어 검토되고 있으나, 초기 설비 투자비용 및 생산단가 증가 등의 부담이 큰 편이다.

결론적으로, 국내에서 쌀가루 중심의 대량 원료 공급체계를 원활히 구축하여 쌀 가공식품의 개발과 소비를 촉진시키기 위해서는 1) 쌀가루 생산에서 발생하는 오폐수처리와 유통 전 건조 및 살균처리 등에 소요되는 비용을 획기적으로 절감할 수 있어야 하며, 2) 미세한 입자 수준으로 분쇄하더라도 전분립의 손상을 줄일 수 있는 구체적 방안이 제시되어야 할 것이다. 생산비를 고려한다면 1) 공정이 간단하고 2) 분쇄시간 짧으며 3) 오폐수 발생이 거의 없는 건식제분 방식이 유리하다. 더욱이 국내에는 밀 제분을 위한 건식제분 설비가 상당한 규모로 갖추어져 있으므로 생산설비 구축에 소요되는 비용도 크게 절감할 수 있다.

이러한 기술적 배경 하에서, 분질배유 특성을 지닌 벼 품종의 개발 및 이를 위한 유전적 마커에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 (한국등록특허 10-1226485), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 벼의 분질배유 형질을 결정하는 신규한 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 식물체, 벼의 종자 또는 형질전환용 조성물, 그리고 상기 유전자 또는 재조합 벡터를 분질배유 형질을 갖는 벼를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 벼의 분질배유 형질을 결정하는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자를 제공한다.

본 발명은 다른 일 양태로, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 양태로, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 형질전환체는 벼일 수 있다.

본 발명은 또 다른 일 양태로, 상기 유전자 또는 재조합 벡터를 포함하는 식물체를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 양태로, 상기 유전자 또는 재조합 벡터를 포함하는 벼 또는 벼의 종자를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 양태로, 서열번호 2로 표시되는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자를 벡터에 재조합하는 것; 및 상기 재조합된 벡터로 식물체를 형질전환시키는 것을 포함하는 분질배유 형질을 갖는 벼를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 양태로, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 뉴클레오티드; 상기 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 벼에 분질배유 형질을 부여하기 위한 형질전환용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 양태로, 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 상기 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자에 의한 분질배유 형질 판별용 조성물을 제공한다.

상기 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치에 존재하는 SNP 마커는 염기가 A 또는 T일 수 있다.

상기 단일 염기 다형성을 검출할 수 있는 제제는 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치의 염기를 포함하는 10개 내지 300개의 연속적인 핵산서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브; 또는 이를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

상기 단일 염기 다형성을 검출할 수 있는 제제는 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 외부 정방향 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 외부 역방향 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 내부 정방향 프라이머, 및 서열번호 8로 표시되는 내부 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명은 또 다른 일 양태로, 상기 분질배유 형질 판별용 조성물을 포함하는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자에 의한 분질배유 형질 판별용 키트를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일 양태로, 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP) 마커를 확인하는 것을 포함하는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자에 의한 분질배유 형질 판별방법을 제공한다.

상기 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP)은 염기가 A 또는 T일 수 있다.

상기 분질배유 형질 판별방법은, (a) 시료로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치의 염기를 포함하는 10개 내지 300개의 연속적인 핵산서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브; 또는 이를 증폭할 수 있는 프라이머와 반응시키는 것; 및 (b) 상기 반응물을 확인하는 것을 더 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 외부 정방향 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 외부 역방향 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 내부 정방향 프라이머, 및 서열번호 8로 표시되는 내부 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트일 수 있다.

상기 분질배유 형질 판별방법은 (b)의 반응물에 제한효소를 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 제한효소는 Hinf I일 수 있다.

상기 분질배유 형질 판별방법은, (a) 시료로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치의 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위를 포함하는 10개 내지 300개의 연속적인 핵산서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 프라이머와 반응시켜 증폭시키는 것; 및 (b) 상기 증폭된 반응물을 확인하는 것을 더 포함할 수 있다.

상기 분질배유 형질 판별방법은 (a') 시료로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치의 염기를 포함하는 10개 내지 300개의 연속적인 핵산서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 프로브와 혼성화 반응시키는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 규명한 벼의 분질배유 형질을 결정하는 신규한 유전자는 분질배유 특성을 갖는 식물체의 개발에 주요 목적 유전자로서 활용될 수 있고, 본 발명의 유전자로 형질전환된 벼는 분질배유 특성을 갖는바 본 발명은 벼를 주 원료로 하는 가공 생산품에도 확대적용 될 수 있다.

다음의 도면들에서 제시되는 수원542호(Suweon542, 혹은 S542)는 Namil(SA)-flo2 벼 식물체에 대한 우량계통명으로 동일한 식물체를 지칭한다.
도 1a는 지도 기반의 FLO4 -4 변이 복제를 나타내는 것으로, (A) FLO4 -4 유전자좌의 정밀 유전자 지도로 분자 마커 및 재조합체의 수를 보여준다. 2 개의 BAC 클론이 중첩된 부분으로 구성된 33kb 가상 컨티그 (contig)는 참조 벼 게놈 (IRGSP Reference 1.0) 상의 두 개의 중요한 마커의 e-Landings에 의해 구분지어 표시된다. (B) FLO4 -4 유전자 구조 및 cDNA 서열 비교는 엑손 8에서 G->A의 염기 변이를 보이고, 여기서 야생형의 Gly-404가 FLO4 -4에서는 Asp-404로 유도된다. 흰색 상자는 번역되지 않은 지역을 나타내고, 검은 상자는 코딩 지역을 나타내며, 실선은 인트론을 나타낸다.
도 1b는 남일벼와 Namil(SA)-flo2의 PPDK1 (OS05G0405000-02) 유전자 염기서열 비교함으로써, 단일 염기 다형성 부위를 확인한 결과이다.
도 2는, dCAPS Finder 2.0에서 탐색된 남일벼, 또는 Namil(SA)-flo2의 단일 염기 다형성 부위의 증폭을 위한 dCAPs 프라이머 세트 후보군의 서열을 나타낸 도이다.
도 3은, 본 발명에 따른 dCAPs 프라이머 세트에 의해 증폭되는 단편의 염기서열 및 제한효소 (Hinf I) 처리 부위를 나타낸 도이다.
도 4는, 본 발명에 따른 dCAPs 프라이머 세트 및 제한효소를 이용한 방법으로서, 밀양 23호, 남일벼, 및 Namil(SA)-flo2 (S542)의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명에 따른 Tetra-primer ARMS PCR 프라이머 세트에 의해 증폭되는 단편의 염기서열 위치를 도식화한 도이다.
도 6은, 발명에 따른 Tetra-primer ARMS PCR 프라이머 세트에 의해 (a) 증폭되는 단편의 염기서열, 및 (b) 밀양 23호, 남일벼 및 Namil(SA)-flo2(S542)의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명에 따른 dCAPs 프라이머 세트 및 제한효소를 이용한 방법으로서, 밀양23호와 Namil(SA)-flo2 교배 후대들의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 제한효소를 이용한 방법으로서, 유전적 배경이 유사한 자포니카 품종들의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다 (1. 안미, 2. 아랑향찰, 3. 백진주1, 4. 백옥찰, 5. 보람찰, 6. 보람찬, 7. 보라미, 8. 보석, 9. 보석찰, 10. 보석흑찰, 11. 청남, 12. 친들, 13. 추청, 14. 다보, 15. 단미, 16. 단평, 17. 드래찬, 18. 도담쌀, 19. 동진, 20. 동진1, 21. 동진찰, 22. 건강홍미, 23. 건양2, 24. 고아미, 25. 고아미2, 26. 고아미4, 27. 해품, 28. 하이아미, 29. 하남, 30. 한마음, 31. 흑진미, 32. 흑향, 33. 흑진주, 34. 흑남, 35. 흑설, 36. 홍진주, 37. 호품, 38. 황금누리, 39. 화성, 40. 화왕, 41. 화영, 42. 향남, 43. 현품, 44. 일미, 45. 일품, 46. 적진주, 47. 적진주찰, 48. 흑향찰).
도 9는, 본 발명에 따른 Tetra-primer ARMS PCR 프라이머 세트를 이용한 방법으로서, 밀양23호와 Namil(SA)-flo2 교배 후대들의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명에 따른 Tetra-primer ARMS PCR 프라이머 세트를 이용한 방법으로서, 유전적 배경이 유사한 자포니카 품종들의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다 (1. 안미, 2. 아랑향찰, 3. 백진주1, 4. 백옥찰, 5. 보람찰, 6. 보람찬, 7. 보라미, 8. 보석, 9. 보석찰, 10. 보석흑찰, 11. 청남, 12. 친들, 13. 추청, 14. 다보, 15. 단미, 16. 단평, 17. 드래찬, 18. 도담쌀, 19. 동진, 20. 동진1, 21. 동진찰, 22. 건강홍미, 23. 건양2, 24. 고아미, 25. 고아미2, 26. 고아미4, 27. 해품, 28. 하이아미, 29. 하남, 30. 한마음, 31. 흑진미, 32. 흑향, 33. 흑진주, 34. 흑남, 35. 흑설, 36. 홍진주, 37. 호품, 38. 황금누리, 39. 화성, 40. 화왕, 41. 화영, 42. 향남, 43. 현품, 44. 일미, 45. 일품, 46. 적진주, 47. 적진주찰, 48. 흑향찰).
도 11은 본 발명에 따른 Namil(SA)-flo2 (S542)와 남일 (Namil)의 표현형 분석 결과를 보여준다. Namil(SA)-flo2와 남일의 현미 및 횡단면을 나타낸다. 또한, 성숙한 배유의 전자 현미경 시각화. 적색 화살표로 표시된 바와 같이, Namil(SA)-flo2는 전분 과립으로 느슨하게 채워져 있다. 노란색 상자(500㎛ 비율 사진에서 상자표시)는 확대된 영역을 나타낸다.
도 12는 10 DAF에 남일과 Namil(SA)-flo2 사이의 FLO4 -4 발현을 분석한 결과로, 표시된 값은 평균 ± SD (n = 3)이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 벼의 분질배유 형질을 결정하는 신규한 서열의 유전자를 제공한다. 상기 본 발명의 신규한 서열의 유전자는 서열번호 2로 표시되는 벼의 분질배유 형질을 결정하는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자일 수 있다.

본 발명에서 사용되되는 용어 "형질을 결정하는 것"은 식물체에 특정 형질, 즉 표현형을 부여하는 것을 의미하는 것으로, 유전적으로 특정 표현형을 갖거나 또는 갖도록 하는 것을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "분질배유 (floury endosperm)"는, 배유를 조성하는 전분립들의 배열이 치밀하지 않아 현미의 외관이 찰벼와 유사하게 뿌옇고 불투명한 외관을 지니는 형질을 의미한다. 쌀가루 제조에는 건식 및 습식제분이 활용되고 있으며, 건식제분은 공정이 간단하나 손상전분이 증가하는 문제가 있는 반면, 습식제분은 가공성은 향상되지만 수침과 건조에 소요되는 시간과 비용이 제한요인으로 작용한다. 쌀 가공산업 활성화에 기여하기 위해서는 각 용도에 적합한 특성을 갖춘 가공용 품종의 다양화와 제분성이 뛰어난 품종의 개발이 요구되며, 이러한 분질배유 특성은 종래 건식제분의 문제점을 극복할 수 있는 중요한 특성 중 하나이다.

한편, 본 발명의 Namil(SA)-flo2 벼 식물체는, 남일벼 종자를 화학적 돌연변이원인 아지드화나트륨(Sodium azide; NaN₃) 희석 용액에 침지하는 방법으로 돌연변이를 유발하고, 이를 발아 및 육모 단계를 거쳐 식물체(M1)를 전개하고, M1 식물체로부터 M2 종자를 수확하고 이후부터는 계통육종법으로 세대를 M7까지 전진시켜 유전적으로 고정된 돌연변이 계통들을 확립한 계통이다. 상기 Namil(SA)-FLO2는, 기존의 남일벼와 아밀로스-아밀로펙틴 함량 조성이 유사하지만, 일반 벼에 비하여 곡립경도가 낮아 건식제분으로도 입자가 고우며 전분립 손상이 적은 고품질의 쌀가루를 획득할 수 있는 특징이 있다. 다만, 이러한 품종을 육종 단계의 초기에 간단하고 정확하게 판별할 수 있는 기술, 구체적으로, 관련 유전자 마커에 대해서는 알려진 바가 없었다.

이에, 본 발명자들은 Namil(SA)-flo2 벼 품종의 염기서열 분석을 통해 분질배유 형질을 결정하는 유전자를 규명하고 (실험예 1), 상기 분질배유 형질과 밀접한 관련성을 나타내는 단일 염기 다형성 부위를 규명하였다 (실험예 2). 또한, 상기 단일 염기 다형성 부위를 타겟으로하는 프라이머 세트를 최초로 개발하여, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 기술이 자포니카 (Japonica) 계통 벼 품종의 분질배유 특성을 판별함에 유용함을 실험적으로 입증하였다.

본 발명의 분질배유 특성은 신규한 서열의 PPDK 유전자에 의하여 결정된다. 상기 PPDK(Pyruvate orthophosphate dikinase)는 피루브산염 (pyruvate), ATP 및 오르토인산염 (orthophosphate)을 가역적으로 전환시키고 다양한 식물 세포에서 다양한 기능을 수행하는 것으로, 사이토졸 및 엽록체-표적화 PPDK 단백질 (각각, cyOsPPDK 및 chOsPPDK)을 암호화한다. chOsPPDK mRNA는 광합성 기관에서 구성적으로 발현되며, cyOsPPDK는 수분된 후 발달하는 벼의 종자 (grain)에서만 발현된다. 통상적으로, 벼에서 cyOsPPDK는 종자 발달시기 중 유숙기에 높은 수준으로 발현되고, 수분 후 10일 정도 경과되어 cyOsPPDK 단백질이 최고 수준에 도달하면, cyOsPPDK 단백질 수준과 활성 모두 트레오닐-인산화 (threonyl-phosphorylation)와 단백질 분해의 번역 후 메커니즘의 조합에 의하여 빠르게 하향 조절된다. 니폰바레 (Nipponbare) 벼에서 cyOsPPDK의 전장 게놈은 7656bp이고, cDNA는 19개의 엑손을 포함하고 2649bp이며, 882개 아미노산 단백질을 암호화한다.

그러나, 본 발명의 cyOsPPDK는 야생형 cyOsPPDK 유전자에 대하여 변이를 포함하며, 이를 통해 벼에서 분질배유 형질을 결정한다. 본 발명의 cyOsPPDK 유전자는 대립유전자로서, 열성 유전자이다. 본 발명의 변이유전자 cyOsPPDK는 유숙기 이후 (수분 후 10일 이후), 등숙기 (grain filling stage) 동안 야생형과 비교해서 높은 수준으로 발현이 유지되는 특성을 갖는다.

특히, 본 발명의 cyOsPPDK 유전자의 엑손 8 부위에 G->A로 단일 염기 다형성 (SNP)이 존재하며 (대립유전자에서는 C에서 T로 변이), 이에 의하여 본 발명의 cyOsPPDK 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열에서 글리신 (G, Gly)에서 아스파르트산 (D, Asp)으로의 변이가 존재한다 (상기 단일 염기 다형성에 상응하는 아미노산 404 위치). 이에 의하여 벼의 등숙기 동안 단백질 발현 및 활성이 유지되면서 벼에서 종자의 발달에 관여하여 분질배유 형질을 나타내게 한다. 이러한 측면에서 본 발명의 cyOsPPDK는 변이 cyOsPPDK 유전자, 변이 cyOsPPDK 단백질 또는 변이 cyOsPPDK mRNA를 의미하는 것 일 수 있다. 본 발명에서 분질배유 형질을 결정하는 변이 유전자는 cyOsPPDK, Namil(SA)-flo2, flo7 또는 FLO4 -4로 명명되었고, 상기 명칭은 상호 교환적으로 지칭될 수 있다.

본 발명의 cyOsPPDK 유전자는 서열번호 2로 표시되며, GenBank에 기탁되었고, 등록번호 MG267058로 표시된다.

본 발명의 cyOsPPDK 유전자의 위치는 RAP-DB (Rice Annotation Project Database,http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/?name=chr02%3A1..105000)를 기초로 그 위치를 나타낼 수 있다. 본 발명의 cyOsPPDK 유전자좌는 BAC 클론 OSJNBb0006J12 와 OJ1174_H11 사이에 존재하며, 분질배유 특성은 변이 cyOsPPDK 유전자의 엑손 8에 있는 단일 염기 다형성 (G->A)에 의하여 결정된다.

상기 단일 염기 다형성은 벼의 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)와 비교하여 나타내면, 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응되는 위치에 존재하며, 이는 서열번호 1의 유전자 서열에서 4055번째 염기와 상응하는 위치이다.

본 발명에서 용어 “유전자”는 형질을 결정하는 인자로서 유전정보의 단위를 의미하는 것으로, 단백질을 암호화하는 핵산분자 또는 폴리뉴클레오티드로도 지칭될 수 있다. 본 발명의 유전자는 상기한 서열번호 2의 염기서열과 실질적인 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기의 실질적인 상동성은 상술한 본 발명의 염기서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 프로그램 (예: DNASIS 및 ClustalX)을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 본 발명의 유전자에 존재하는 단일 염기 다형성을 포함하면서, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 염기서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 " 서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

본 발명에서 상기 벡터는 외래 유전자를 도입된 식물체 내에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 형질전환용 바이너리 벡터로서, 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 벡터일 수 있다.

본 발명에 따른 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream) 쪽으로 목적 단백질을 코딩하는 염기서열 (유전자)을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 목적 유전자의 발현을 위해 특정 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 유전자 또는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어 “형질전환체”는 유전공학적인 방법으로 본 발명의 유전자가 외래 유전자로서 숙주로 삽입된 것 외에, 본 발명의 유전자에 의하여 결정되는 분질배유 형질을 포함하는 자손 개체를 육종하기 위해, 본 발명의 유전자를 포함하는 개체를 적어도 하나와 다른 개체를 교배하여 본 발명의 유전자를 갖게된 후대 계통의 개체도 포함하는 의미이다.

본 발명의 형질전환체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다.

상기 형질전환체는 형질전환된 식물세포 및 상기 식물세포로부터 분화된 식물체를 포함한다. 상기 식물체는 식물의 줄기, 잎, 뿌리, 및 종자를 포함한다. 상기 식물체는 바람직하게 벼의 종자일 수 있다.

상기 식물은 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 벼 일 수 있다. 따라서, 이러한 측면에서 본 발명은 돌연변이 cyOsPPDK 유전자; 또는 서열번호 2의 서열을 갖는 벼 또는 벼의 종자를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 형질전환체, 즉, 벼의 종자는 종래의 벼와 달리 배유가 분질 특성을 갖고, 곡립경도가 낮아 제분성이 뛰어나며, 건식제분을 위해 사용되는 다양한 제분설비로도 가공에 적합한 쌀가루를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 서열번호 2로 표시되는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자를 벡터에 재조합하는 것; 및 상기 재조합된 벡터로 식물체를 형질전환시키는 것을 포함하는 분질배유 형질을 갖는 벼를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 식물체 또는 식물세포를 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법 (microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

분질배유 형질을 갖는 벼를 제조하는 방법은 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 재분화는 본 발명의 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 본 발명의 기술분야에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.)

본 발명의 일 구체예에서, 벼의 분질배유 형질을 결정하는 유전자가 변이 cyOsPPDK 이며, 분질배유 특성은 변이 cyOsPPDK 유전자의 엑손 8에 있는 단일 염기 다형성 (G->A 또는 C->T)에 의하여 결정됨을 확인하였다. 이러한 측면에서, 본 발명은 또 다른 양태에 따라, 본 발명의 분질배유 형질을 결정하는 신규한 서열의 유전자에 대한 단일 염기 다형성을 제공한다.

구체적으로, 벼 표준 유전체 (IRGSP Reference 1.0) 정보를 바탕으로 5번 염색체에 위치한 후보 유전자 PPDK1 (Pyruvate, phosphate dikinase1)의 전사체 정보를 기반으로, OS05G0405000-02 (19,718,538-19,737,605bp)의 염기서열을 바탕으로 남일벼와 본 발명의 FLO4 -4(Namil(SA)-flo2)의 PPDK1 내 19,718,785-19,726,340 (7,556bp)의 염기서열을 분석하여 표준 유전체인 Nipponbare(IRGSP Reference 1.0)와 비교한 결과, 남일벼와 Namil(SA)-flo2 간에는 1개의 SNP가 탐색되었고, 상기 SNP는 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응되는 위치에 존재하며, 이는 서열번호 1 (남일벼 유래 폴리뉴클레오티드 서열, ch5:19,726,340-19,718,785)또는 서열번호 2의 서열에서 4055번째 염기, 서열번호 9의 4093번째 염기와 상응한다.

보다 구체적으로, 상기 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치에 존재하는 SNP 마커는 염기가 A인 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에서 4055번째 위치; 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열에서 4093번째 위치에 존재하는 G가 A로 치환되는 것이며, 이에 따라, 상기 유전자에 의해 코딩되나 단백질의 서열에서 아미노산 Glycine (Gly, G)이 Aspartic acid (Asp, D)로 변이되어, 분질배유 형질을 나타나게 한다.

따라서, 상기 단일 염기 다형성은, 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 4055번째 위치의 G가 A 또는 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 4093번째 위치의 G가 A인 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "단일 염기 다형성 (Single Nucleotide polymorphism, SNP)는, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 “다형성”이라 하고, 상기 다형성 부위 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 또한, 상기 용어, “대립유전자(allele)”는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 형태를 말하며, SNP는 두 종류의 대립유전자(biallele)를 갖는다.

상기 본 발명의 단일 염기 다형성을 분질배유 특성을 판별하는데 사용할 수 있다는 측면에서, 본 발명은 다른 양태에 따라, 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 제1항의 유전자에 의한 분질배유 형질 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 분질배유 특성 판별용 조성물은 자포니카 (Japonica) 계통을 포함하는 모든 벼 품종의 분질배유 특성을 판별하기 위하여 사용될 수 있으며, 일 구현예로서, 남일 돌연변이 후대 계통 Namil(SA)-flo2의 분질배유를 판별할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 조성물은 둘 이상의 벼 품종간 교잡에 따른 후대 계통에도 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 전술한 벼 품종을 주원료로 제조된 가공 생산품에도 확장 적용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 프라이머는 분질배유 특성과 밀접한 관련성을 나타내는 단일 염기 다형성 부위를 증폭시키며, 예컨데, 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 외부 정방향 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 외부 역방향 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 내부 정방향 프라이머, 및 서열번호 8로 표시되는 내부 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또는, 상기 단일 염기 다형성을 검출할 수 있는 제제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 4055번째 위치, 또는 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 4093번째 위치에 존재하는, 단일 염기 다형성 부위를 포함하는 10개 내지 300개의 연속적인 핵산서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브; 또는 이를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 제제는 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 외부 정방향 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 외부 역방향 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 내부 정방향 프라이머, 및 서열번호 8로 표시되는 내부 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트일 수 있다.

또는, 상기 프라이머 세트는 바람직하게, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 각각의 염기서열과 바람직하게 80% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게 95%의 이상의 서열 상동성, 가장 바람직하게 99% 이 상의 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 전술한 단일 염기 다형성을 부위를 증폭시킬 수 있다면, 제한없이 포함될 수 있다.

상기 프라이머 세트는 바람직하게, 서열번호 5 내지 서열번호 8로 표시되는 각각의 염기서열과 바람직하게 80% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게 95%의 이상의 서열 상동성, 가장 바람직하게 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 어느 하나의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 전술한 단일 염기 다형성을 부위를 증폭시킬 수 있다면, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또한, 본 발명은 또 다른 양태에 따라서, 상기 분질배유 형질 판별용 조성물을 포함하는 벼의 분질배유 형질을 결정하는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자에 의한 분질배유 형질 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트는, 상기 조성물 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행하게 하는 DNA 중합효소, dNTP, 및 PCR 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, 이 뿐만 아니라, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기 영동 수행에 필요한 구성 성분, 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 프로브에 의한 반응을 효과적으로 수행하기 위한 공지의 구성을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 또 다른 양태에 따라서, 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP) 마커를 확인하는 것을 포함하는 제1항의 유전자에 의한 분질배유 형질 판별방법을 제공한다.

상기 단일 염기 다형성은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 4055번째 위치; 또는 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 4093번째 위치에 존재하는 것 일 수 있다.

본 발명의 분질배유 특성 판별방법은 상술한 분질배유 특성 판별용 조성물에서 기술한 바 있는 구성 성분을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

상기 다형성 부위의 염기는 시료로부터 분리된 핵산 시료로부터, 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브와 혼성화하여 다형성 부위의 염기를 확인할 수 있다.

예를 들어, 중합효소연쇄반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)을 이용하여 다형성 부위를 증폭할 수 있다.

다형성 부위의 염기의 확인은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석, TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ 및 SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadChip (Illumina의 HumanOmni2.5-8) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, SNP 칩을 이용하여 다형성 부위의 염기를 확인할 수 있다. SNP 칩은 수십만개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 G에서 A로 치환된 경우, 상기 G를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 G인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 A로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향에 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 분질배유 형질 판별방법은 (a) 시료로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치의 염기를 포함하는 10개 내지 300개의 연속적인 핵산서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것; 및 (b) 상기 PCR에 의해 증폭된 반응물을 확인하는 것을 더 포함하여, 시료의 개체의 분질배유 형질 여부를 판별할 수 있다. 상기 PCR 반응물이 cyOsPPDK 유전자를 갖는 개체(Namil(SA)-flo2)와 동일한 결과를 나타내면, 상기 시료의 식물 개체는 분지 배유 특성을 갖는다고 할 수 있다.

또는, 본 발명의 다른 구현예로서 상기 분질배유 형질 판별방법은 (a') 시료로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 벼 표준유전체(IRGSP Reference 1.0)에서 5번 염색체의 19,722,254bp에 대응하는 위치의 염기를 포함하는 10개 내지 300개의 연속적인 핵산서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 프로브로 반응시키는 것을 더 포함할 수 있다.

상기 분질배유 형질 판별 방법은 상기 (b)의 증폭된 산물에 제한효소를 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 제한효소는 Hinf I 일 수 있다. 상기 제한효소 처리에 의하여 PCR 증폭된 반응물이 2개 이상의 단편으로 절단된 경우 분질 배유 특성을 갖는다고 분리될 수 있다. 그러나, 이는 프라이머의 설계 특성에 따라 제한효소의 종류 및 이에 따른 반응 양상이 달라질 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 (a)에서 단일 염기 다형성을 검출할 수 있는 제제는 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 외부 정방향 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 외부 역방향 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 내부 정방향 프라이머, 및 서열번호 8로 표시되는 내부 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트 일 수 있다.

본 발명에서 시료는 자포니카 (Japonica) 계통을 포함하는 모든 벼 품종 (후보 품종), 또는, 남일 돌연변이 후대 계통 Namil(SA)-flo2로부터 수득될 수 있고, 이 뿐만 아니라, 전술한 벼 품종을 주원료로 제조된 가공 생산품으로부터도 수득될 수 있다.

본 발명에서, 시료로부터 분리된 게놈 DNA는 당업계에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법, CTAB 분리법 (Cetyl trimethyl Ammonium Bromide) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명에서의 PCR은, real-time PCR, qRT-PCR 또는 multiplex PCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 수행될 수 있으나, 후보 품종 또는 시료 내 전술한 단일 염기 다형성 부위를 증폭할 수 있는 방법이라면, 제한없이 포함될 수 있다. 이와 함께, 상기 PCR 산물에 제한 효소를 추가로 처리할 수 있으며, 여기서 상기 제한효소는 Hinf I 일 수 있으나, 이 역시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서의 PCR에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계는, DNA 칩, 겔 전기영도, 방사성 측정, 형광 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중 하나로, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기 영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기 영동 또는 아크릴이미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

[ 준비예 ] 실험 준비 및 방법

준비예 1. 실험 식물체 및 재료

남일벼 및 분질배유 특성을 지닌 Namil(SA)-flo2의 DNA는, 각각의 어린 잎을 채취한 뒤, CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) 방법 (Murray & Thomason, 1980)을 이용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 0.8% agarose gel 전기영동을 통해 확인하였으며, NanoDrop spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 정량 후 5ng/㎕로 희석하여 PCR에 이용하였다.

Namil(SA)-flo2와 밀양 23 간의 교잡에서 유래된 F2 자식집단과 부모계통은 부산대학교 실험 지역에서 재배되었고, 분질배유 유전자의 정밀 유전자 지도를 위해서 F_3:4 계통군을 양성하였다. 제조사의 지침에 따라 NucleoSpin® Plant II 키트 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.KG, Germany)를 사용하여 모든 유전형의 신선한 잎에서 총 게놈 DNA를 추출하였다.

준비예 2. 재시퀀싱 및 분자 마커 개발

Namil(SA)-flo2와 밀양 23의 전체 게놈은 Illumina HiSeq 2500 시퀀싱 시스템 플랫폼 (Illumina Inc. USA)을 사용하여 평균 75 배의 커버리지로 재신퀀싱되었다. 로우 (raw) 서열 리드(read)를 벼 표준 유전체 (IRGSP 1.0)에 대해 정렬하였다 (Kawahara et al., 2013). 분질배유 관련 유전자지도를 작성하기 위해서 결측값 (missing value)없는 SNP, 대립유전자형빈도 (MAF: minor allele frequency) > 0.05, 두 부모 서열에 대한 유전자형 콜 (genotype call)이 사용되었다. 표적 부위를 좁히기 위해서, Oligo7.0 소프트웨어를 이용해 SNP를 선택하여, 8개의 절단 증폭된 다형 서열 (CAPS: amplified polymorphic sequence) 마커를 개발하였다.

준비예 3. 정교한 분질배유 결정 유전자 지도의 작성

후보 영역을 찾기 위해, RM18624와 RM18639 사이의 게놈 영역이 헤테로인 F2세대를 F3세대로 성장시켰다. 그 다음, F3 식물체를 자가교배시켜 F_3:4 종자를 얻었다. 부모 계통과 무작위로 선발된 96개의 F_3:4 재조합체의 껍질을 벗겨, 배유를 육안으로 검사하였고, 8 개의 CAPS 마커로 유전자형을 확인하였다. 해당 영역의 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 해당 영역에서 기능성은 MSU Rice Genome Annotation Project Database (http : //rice.plant biolo gy.msu.edu/)에 개시되어 있다.

PCR은 10 ng의 DNA 주형, 10 pmol의 각 프라이머, 1xPCR 버퍼 [50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.1% Triton X-100, 및 1.5mM MgCl₂], 0.2mM의 dNTP, 1 unit의 Taq DNA 중합 효소 (Nurotics, Korea) 1 unit를 포함하는 20-㎕(부피)의 용액에서 수행되었다. PCR은 다음 조건에서 MJ Research PTC-100 thermocycler (Waltham, MA, USA)로 수행하였다: 94℃에서 5분간의 초기 변성, 94℃에서 30초간의 변성 36사이클, 58℃에서의 30초간 어닐링, 및 1분 동안 72℃에서 신장과 10분 동안 72 ℃에서 최종 신장. PCR 산물은 제한효소 (New England Biolabs)로 절단되었다. CAPS 마터를 포함하는 PCR 산물의 절단은 WatCut 프로그램 (http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)을 사용하여 탐지되었다. 절단 산물은 6M 요소와 1X TAE를 사용하여 3% 폴리아크릴아미드 겔에서 80V로 분리되었고, Molecular Imager® Gel Doc™ XR System (Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)을 사용하여 시각화했다.

준비예 4. 유전자 클로닝 및 변이 위치 동정

Namil(SA)-flo2와 남일 (Namil)에서 cyOsPPDK의 코딩 서열을 CLC Sequence Viewer 7을 사용하여 비교하였다. 변이위치를 확인하기 위해서, dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/)을 이용하여 분질 배유 변이체 Namil(SA)-flo2에서 HinfI 제한효소 자리를 넣었다.

돌연변이 부위를 함유하는 161bp 단편을 Namil(SA)-flo2 및 남일로부터 프라이머 F (CCCAGGTGATGCAGGTGAG; 서열번호 32) 및 R (GCACAGGTCTTGGACATTGC; 서열번호 33)을 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 산물은 5㎕의 PCR 산물, 1.5㎕의 10X NEBuffer, 0.5㎕ HinfI 및 8㎕ 초순수를 포함하는 15㎕(부피) 용액 상에서 HinfI (New England Biolabs)로 절단되었고, 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 절단 산물은 4% 아가 로즈겔에서 분리되었다. dCAPS 마커는 F_3:4 패밀리와 각각의 배유 표현형을 지닌 48종의 한국에서 육성한 벼 품종의 동시-분리 분석에도 사용되었다. 니폰바레(Nipponbare)의 cyOsPPDK 유전자 서열에 기초하여 설계된 프라이머를 사용하여 3 개의 중첩된 부분에서 CyOsPPDK 유전자의 완전한 게놈 DNA가 클로닝되었다.

프라이머		서열(5' -> 3')
1	1F (서열번호 26)	caacaaggccatgaagga
1	1R (서열번호 27)	gatatcaccaagacaatgctcg
2	2F (서열번호 28)	gctcttcactaggaacccaag
2	2R (서열번호 29)	cgttgcatctacactagaacaatc
3	3F (서열번호 30)	ctaaggtcaaggctacctagttc
3	3R (서열번호 31)	cagctagcctagcaattgg

준비예 5. 총 RNA 분리 및 qRT-PCR 분석

RNeasy Plant Mini 키트 (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 개화 10 일 후 (DAF) 남일 및 Namil(SA)-flo2의 쌀 알곡에서 총 RNA를 분리했다. DNase I (QIAGEN, Hilden, Germany)로 게놈 DNA를 제거하고, RNA to cDNA EcoDry Premix 키트 (Clontech, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

qRT-PCR은 Rotor-Gene Q 장비 (QIAGEN, Hilden, Germany)를 갖는 QuantiNova SYBR Green RT-PCR 키트 (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여, 다음 PCR 조건으로 수행되었다. 95℃에서 10분 후, 95℃에서 10 초 (40 사이클), 60℃에서 20초. 폴드 변화는 남일에 대하여 상대적으로 계산되었다. 접힌 유도 결과는 세 번의 반복 실험의 평균±표준편차를 나타내며, 벼의 Actin 1 (OsACT1; Os03g0718150)이 내부 대조군으로 사용되었다. qRT-PCR 프라이머 (qOsPPDKB)는 FLO4 -4의 코딩서열에 기초하여 설계되었고, 표 1의 프라이머를 사용하였다.

[ 실험예 1] 분질배유 형질 결정하는 유전자 규명

실험예 1-1. 분질배유 관련 유전자좌 지도

준비예에서 재-시퀀싱 된 Namil(SA)-flo2의 전체 게놈을 인디카 재배종 밀양 23을 참조로 얼라인하였다. 모든 타겟 영역에서 총 2,604개의 SNP가 확인되었다. RM18624와 RM18639 사이의 게놈 서열을 템플릿으로 사용하여 8개의 CAPS 마커를 설계하고(표 2), F_3:4 재조합 패밀리에서 유래된 60개의 분질배유 개체와 36개의 정상개체를 유전자형 분석에 사용하였다. 상기 재조합체의 유전자형과 그들의 자손의 표현형 사이에 다양한 비교를 수행하였다.

서열번호	마커명	프라이머 (5'-3')		제한효소	PCR반응물 크기 (bp)	변이형 에서 절단(bp)	야생형 에서 절단(bp)
10	CAPS1	F	ACG GAC ATG GGT AGT GGT TAC	ScaI	455	157+298	455
11		R	AGT AAT GCG GTG CCA AAA G
12	CAPS2	F	GGA CGG AGG GAG TAT GTG	SsBI	374	289+85	374
13		R	CGA TCA CGA CCA GGA TAA G
14	CAPS3	F	CGT TTC AGT GTC AGA TTC	BclI	459	159+300	459
15		R	CTA AAG CTA TCA GAG GAT TG
16	CAPS4	F	CAC ACA CAC ACT GAC AGT TG	BsrBI	674	342+332	674
17		R	TCT CCC TCG CTA TCA CTG
18	CAPS5	F	ACG GGC ACG GAT AGT GAC TAC	SacII	159	55+56+48	55+104
19		R	GTG AGT TTG TGA CAG GTA AACGC
20	CAPS6	F	AAC GCA AAG CCC CAA AAG	BsrBI	566	314+252	566
21		R	CAC TGC CAC CCA CAT GAA G
22	CAPS7	F	AGC TCC TTC TCA ATC TTG G	StuI	360	115+245	360
23		R	CAT CTC TTC CAC CAT CTC TC
24	CAPS8	F	TGA ACC ATG GTG AAG ACT C	DraI	446	162+284	446
25		R	AGC TCA GGC CTT GTT AGG

본 발명의 분질배유 관련 후보 유전자는 열성 유전자에 의해 조절되는 것으로 확인되었으므로, 만약 분질배유 개체의 CAPS 마커 유전자형이 밀양 23 또는 이형접합체 유전자형과 일치한다면, 상기 CAPS 마커 플래킹 영역은 표적 유전자의 위치가 아닌 것으로 판단하였다. 또한, 야생형 배유를 갖는 개체들 중에서, CAPS 마커 유전자형이 Namil(SA)-flo2와 동일하다면, 해당 유전자의 위치도 표적 유전자의 위치가 아닌 것으로 판단하였다.

도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, CAPS 5-8에 대하여 헤테로 유전자형과 분질 배유를 갖는 개체;와 CAPS 1-4에 대해 Namil(SA)-flo2 유전자형과 정상 배유를 갖는 개체가 동정되었다. 표적 영역을 CAPS 8 마커와 RM18639로 양 끝을 표시한 33kb 영역에서 BAC 클론 OJ1174_H11과 OSJNBb0006J12로 지도에 표시하였다.

실험예 1-2. 분질 배유에 대한 후보 유전자 분석

RAP-DB (Rice Annotation Project Database, http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/?name=chr02%3A1..105000)를 기초로 상기 33kb 영역에서 4개의 유전자를 표적유전자 후보로 예측하였다 (도 2a). 이 중 Os05g0404500이 가설 단백질 (hypothetical)을 암호화하는 것, Os05g0404700은 메틸-결합 단백질 유전자 MBD1과 유사한 기능 유전자였고, Os05g0404901은 보존된 가설 단백질을 코딩하였고, Os05g0405000은 PPDK 유전자였다.

Namil(SA)-flo2에서 4가지 후보 유전자와 야생형 Namil의 시퀀싱에서 PPDK의 엑손 8에서 G/A SNP가 확인되었다 (도 1b의 (B)). 벼의 등숙기에 종자에서 PPDK의 전사체 유형을 분석하기 위해서, Namil(SA)-flo2와 Namil의 PPDK를 PF2/PR3 (cyOsPPDK)와 PF3/PR3 ( chOsPPDK ) 프라이머 조합 (Kang et al . 2005)과 추가로 표 1의 3개의 프라이머 쌍을 이용해서 서열을 확인하였다.

Namil(SA)-flo2와 Namil의 cyOsPPDK 염기서열을 니폰바레 (Nipponbare) 염기서열과 비교 한 결과, Namil(SA)-flo2 사이의 코딩 영역의 SNP를 제외하고는 인트론 영역에 9 개의 SNP;와 인트론 영역 및 동질성 돌연변이를 갖는 코딩 영역의 2 개의 SNP에서 6 개의 InDel (삽입 및 결실)이 탐색되었다. 본 발명에 따른 새로운 서열의 열성 분질배유 관련 유전자를 Floury4 -4 (FLO4 - 4)로 명명하였다. Namil(SA)-flo2 및 Namil의 FLO4 -4의 전장 코딩 서열은 GenBank에 기탁하였고, 각각 MG267058 및 MG267056의 등록번호를 부여받았다.

실험예 1-3. 분질배유 관련 유전자의 발현 특성 분석

dCAPS 마커를 사용하여 Namil(SA)-flo2와 남일 (Namil) (Mo et al. 2013)의 교배에 의한 94개의 F2 시료에서 분질 벼(grain)의 비율 변화에 대한 FLO4 -4 유전자의 영향을 확인하였다.

qRT-PCR을 사용해서 등숙기의 벼에서 FLO4 -4의 전사체 유형을 조사하였다. Namil(SA)-flo2에서 FLO4 -4의 상대적인 발현 수준이 Namil 보다 훨씬 높았으며 (도 11), 이는 FLO4 -4의 발현이 등숙과 관련이 있고, 낟알의 분질 질감의 차이는 FLO4 -4 대립유전자로부터 기인한다는 것을 의미한다. 이러한 결과를 모두 종합하면, FLO4-4가 벼에서 분질배유에 원인이되는 유전자 좌 (locus)라는 것을 시사한다.

실험예 2. 분질배유 특성과 관련된 단일 염기 다형성 부위의 규명

실험예 2-1. 남일벼와 Namil ( SA )- flo2의 PPDK1 ( OS05G0405000 -02) 유전자 염기서열 비료를 통한 단일 염기 다형성 부위의 규명

벼 표준 유전체 (IRGSP Reference 1.0) 정보를 바탕으로 5번 염색체에 위치한 후보 유전자 PPDK1 (Pyruvate, phosphate dikinase1)의 전사체 정보를 확인하였고, OS05G0405000-02 (19,718,538-19,737,605bp, http://ensembl.gramene.org/Oryza_sativa/Transcript/Summary?db=core;g=OS05G0405000;mr=5:19725828-19725829;r=5:19718000-19733014;t=OS05T0405000-02;tl=FRpMRF4sd5cjSKwa-7218-3304471)의 염기서열을 바탕으로 시퀀싱 프라이머 (sequencing primer)를 합성하여 남일벼와 Namil(SA)-flo2의 PPDK1 내 19,718,785-19,726,340 (7,556bp)의 염기서열을 분석하였다. 구체적으로, 하기 표 1의 프라이머 세트를 이용하여 3개 영역으로 구분하여 DNA 단편을 증폭하였고, 이후, 17개 시퀀싱 프라이머를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.

남일벼와 Namil(SA)-flo2의 PPDK1내 OS05G0405000-02(reverse strand)의 대응 영역(7,556bp)에 대한 염기서열을 분석한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 표준 유전체인 Nipponbare(IRGSP Reference 1.0)와 비교하여 남일벼는 6개의 InDel과 11개 SNP가 탐색되었고, Namil(SA)-flo2는 6개 InDel과 12개의 SNP가 탐색되었으며, 남일벼와 Namil(SA)-flo2 간에는 1개의 SNP가 탐색되었다.

또한, 상기 탐색된 분질배유 특성과 관련된 SNP는, 도 1b에 나타낸 바와 같이, IRGSP 표준 유전체에서 19,722,254bp에 해당하는 위치로, 남일벼에서는 'G', Namil(SA)-flo2에서는 'A'임을 확인할 수 있었다. 이는 OS05G0405000-02 (reverse strand)의 아미노산 서열에서 Glycine (Gly, G)에서 Aspartic acid (Asp, D)로 변경되는 변이를 유발함을 확인할 수 있었다.

실험예 2- 2. Namil(SA) - flo2의 분질배유 특성 판별용 프라이머 세트 제작

가. dCAPs 프라이머 세트의 제작

상기 실시예 1에서 규명한 SNP에 대해 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)를 사용하여 dCAPs 프라이머를 제작하였다. 탐색된 SNP 주변의 60bp 염기서열 정보를 활용하였고, 1bp mismatch 프라이머를 탐색하였으며, 이에 따라 도 2에 나타낸 바와 같이, dCAPS Finder 2.0에 의해 남일벼의 forward sequence를 절단하는 14개 프라이머, 남일벼의 reverce sequence를 절단하는 7개의 프라이머가 확인되었다. 또한 Namil(SA)-flo2의 forward sequence를 절단하는 프라이머 4개와 Namil(SA)-flo2의 reverse sequence를 절단하는 5개의 프라이머가 탐색되었다. 최종적으로 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 분질배유 특성을 지닌 Namil(SA)-FLO2의 절단이 제한효소 (Hinf I)와의 안정적인 반응으로 진행될 수 있는 프라이머 세트를 선정하였다.

PCR은 10 ng의 DNA와 5 pmol의 forward 및 reverse 프라이머, 0.2 mM dNTP mix, 1X PCR buffer[50 mM KCl,10 mM Tris-HCl(pH 9.0), 0.1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl₂] 및 1 unit의 Taq polymerase (Nurotics, Korea)를 이용하여 총부피 20 ul로 실시하였다. PTC-100^ⓡ thermocycler(Waltham,USA)를 사용하여, 95℃에서 5분간 초기 변성 후 95℃에서 20초, 61℃에서 30초, 72℃에서 60초로 총 35회 반복하고, 72℃에서 10분간 반응시켰다.

한편, 제한효소는 5'...GAGTC...3' 부위를 절단하는 Hinf I 을 사용하였고, 도 3에 나타낸 바와 같이, 남일벼는 제한효소에 의해 절단되지 않는 반면, Namil(SA)-flo2는 SNP에 의해 GAGTC 의 서열을 가지므로 상기 제한효소에 의해 절단되도록 설계하였다. 제한효소의 처리는 1X enzyme buffer[50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate, 100 μg/ml BSA], 10ng의 PCR product, 5U Hinf I (NEB,UK)을 이용하여, 총부피 15 ㎕로 실시하였다. PTC-100^ⓡ thermocycler(Waltham,USA)를 사용하여, 37℃에서 120분간 반응시켰다. 결과물은 FA(Flagment analyzer)를 이용하여 전기영동한 후, 이에 따라 유전자형을 판정하였다.

그 결과, 표 5 및 도 4에 나타낸 바와 같이, Namil(SA)-flo2, 남일벼, 및 표준 유전체 (IRGSP Reference 1.0, Nipponbare)는 161bp가 증폭되었으나, 상기 Hinf I 제한효소에 의해 Namil(SA)-flo2는 17, 154bp의 형태로 절단되고, 남일벼와 표준 유전체 (IRGSP 1.0, Nipponbare)는 절단되지 않았음을 확인할 수 있었다.

즉, 이러한 차이를 통해, 남일 돌연변이 후대 계통의 분질배유 특성을 효과적으로 판별할 수 있음을 알 수 있었다.

나. Tetra - primer ARMS 프라이머 세트의 제작

탐색된 SNP에 대해 제한효소 처리 단계를 생략할 수 있는 프라이머를 제작하기 위해 Primer1(Primer Design for Tetra-Primer ARMS-PCR, http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html)서비스를 이용하여 Tetra- Primer ARMS-PCR 프라이머를 개발하였다. 상기 실시예 1에서 규명한 SNP를 포함한 940bp의 염기서열 정보와 SNP(G/A) 정보를 활용하여,(Andrew Collins and Xizyi Ke. The Open Bioinformatics Journal, 2012, 55-58.) 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 제한효소의 처리없이, 분질배유 특성을 지닌 Namil(SA)-flo2의 SNP를 판별할 수 있는 프라이머 세트를 선정하였다.

구체적으로, Flo2 Tetra-Primer ARMS-PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행할 경우, 표 7 및 도 5에 나타낸 바와 같이, G allele를 지닌 남일벼는 FLO2-outer-F와 FLO2-outer-R에 의해 635bp의 PCR 단편과 G allele에 결합하는 FLO2-inner-F(G) 와 FLO2-outer-R 에 의해 307bp의 단편을 갖는 반면, A allele를 갖는 FLO2는 FLO2-outer-F와 FLO2-outer-R에 의해 635bp의 단편과, A allele에 결합하는 FLO2-inner-R(A)와 FLO2-outer-F에 의해 368bp의 단편을 나타낼 것으로 예상하였다.

PCR은 10 ng의 DNA와 5 pmol의 총 4개의 프라이머, 0.2 mM dNTP mix, 1X PCR buffer[50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), 0.1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl₂] 및 1 unit의 Taq polymerase (Nurotics, Korea)를 이용하여 총부피 20 ul로 실시하였다. PTC-100ⓡ thermocycler(Waltham,USA)를 사용하여, 95℃에서 5분간 초기 변성 후 95℃에서 20초, 59℃에서 30초, 72℃에서 60초로 총 35회 반복하고, 72℃에서 10분간 반응시켰다. 과물은 4% 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동 한 후 유전자형을 판정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 그 결과, 상기 제작된 FLO2 Tetra-Primer ARMS-PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, Namil(SA)-flo2 특이적인 단편을 얻을 수 있었다. 즉, 이러한 차이를 통해서도 남일 돌연변이 후대 계통의 분질배유 특성을 효과적으로 판별할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 2-3. Namil(SA)-flo2의 분질배유 특성 판별용 프라이머의 효과 검증

가. dCAPs 프라이머 세트의 효과 검증

Namil(SA)-flo2 밀양23호 교배 후대 F₂개체 중 선행 연구에서 보고된 5번 염색체 연관부위가 이형접합형태인 개체에서 수확된 종자를 포장에 전개하여 후대 분리집단을 육성하였다. 수확 후 종자의 배유 특성을 평가하고, 이들을 파종하여 식물체로부터 DNA를 추출하여 유전자형 평가에 이용하였다. 또한, 유전적 배경이 유사한 집단 내에서 선발효과를 확인하기 위해 국내에서 육성된 자포니카 품종 48점의 DNA를 국립식량과학원에서 분양받아 사용하였다 (1. 안미, 2. 아랑향찰, 3. 백진주1, 4. 백옥찰, 5. 보람찰, 6. 보람찬, 7. 보라미, 8. 보석, 9. 보석찰, 10. 보석흑찰, 11. 청남, 12. 친들, 13. 추청, 14. 다보, 15. 단미, 16. 단평, 17. 드래찬, 18. 도담쌀, 19. 동진, 20. 동진1, 21. 동진찰, 22. 건강홍미, 23. 건양2, 24. 고아미, 25. 고아미2, 26. 고아미4, 27. 해품, 28. 하이아미, 29. 하남, 30. 한마음, 31. 흑진미, 32. 흑향, 33. 흑진주, 34. 흑남, 35. 흑설, 36. 홍진주, 37. 호품, 38. 황금누리, 39. 화성, 40. 화왕, 41. 화영, 42. 향남, 43. 현품, 44. 일미, 45. 일품, 46. 적진주, 47. 적진주찰, 48. 흑향찰).

밀양 23호와 Namil(SA)-flo2 교배 후대 F_2:4 식물체 38개체에 대하여, 모·부본으로 이용한 밀양 23호 및 Namil(SA)-flo2와, 돌연변이 원 품종인 남일벼를 비교 품종으로 이용하여, 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 분석하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 제한효소 Hinf I에 의해 절단되지 않는 형태를 A형으로, 제한효소 Hinf I에 의해 17bp와 154bp로 절단되는 형태를 B 형으로 규정하였을 때, 밀양 23호와 돌연변이 원품종인 남일벼는 A 형을 나타내었고, 분질배유인 Namil(SA)-flo2만 B 형을 나타내었다. 또한, 교배 후대 F_2:4 식물체의 유전자형은 정상배유를 보인 19개체에서는 이형접합(헤테로)과 A형의 결과를 보였는바, F_2:4 식물체 중 표현형이 정상인 것이 분질배유에 대해 우성인 것을 알 수 있었다. 아울러, 배유가 분질특성을 보인 19개체의 유전자형은 모두 B형으로 나타남을 확인할 수 있었다.

또한, 자포니카(japonica) 육성 품종 48종에 대하여, 모·부본으로 이용한 밀양 23호 및 Namil(SA)-flo2와, 돌연변이 원 품종인 남일벼를 비교 품종으로 이용하여, 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 분석하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 분질배유 특성을 보이는 Namil(SA)-flo2만이 B 형을 나타내고, 나머지 47 종은 모두 A 형을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 SNP 및 이에 대한 dCAPs 프라이머는 효과적인 분질형질 판별에 적용할 수 있음을 알 수 있었다.

나. Tetra-primer ARMS 프라이머 세트의 효과 검증

Namil(SA)-flo2와 밀양23호 교배 후대 F2개체 중 선행 연구에서 보고된 5번 염색체 연관부위가 이형접합형태인 개체에서 수확된 종자를 포장에 전개하여 후대 분리집단을 육성하였다. 수확 후 종자의 배유 특성을 평가하고, 이들을 파종하여 식물체로부터 DNA를 추출하여 유전자형 평가에 이용하였다. 또한, 유전적 배경이 유사한 집단 내에서 선발효과를 확인하기 위해 국내에서 육성된 자포니카 품종 48점 (실시예 3-1과 동일)의 DNA를 국립식량과학원에서 분양 받아 사용하였다.

Namil(SA)-flo2와 밀양 23호 교배 후대 F_2:4 식물체 38개체에 대하여, 모·부본으로 이용한 밀양 23호 및 Namil(SA)-flo2와, 돌연변이 원 품종인 남일벼를 비교 품종으로 이용하여, 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 분석하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상배유를 보인 개체에서는 밀양 23호 type(307bp + 635bp) 또는 이형접합(307bp + 368bp + 635bp)의 결과를 보였고, 분질배유 특성을 지닌 개체는 모두 Namil(SA)-flo2 type (368bp + 635bp)의 단편을 보였다.

또한, japonica 육성 품종 48종에 대하여, 모·부본으로 이용한 밀양 23호 및 Namil(SA)-flo2와, 돌연변이 원 품종인 남일벼를 비교 품종으로 이용하여, 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 분석하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 분질배유 특성을 보이는 Namil(SA)-flo2만이 368bp + 635bp의 단편이 관찰되었다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 SNP 및 이에 대한 Tetra-primer ARMS 프라이머는 효과적인 분질배유 형질 판별에 적용할 수 있음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Republic of Korea <120> A NOVEL FLOURY ENDOSPERM GENE <130> P19R12C0128/2019-0012-10-B <160> 33 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 7519 <212> DNA <213> cyOsPPDK of Oryza sativa Namil <400> 1 atggctccgg ctcaatgtgc tcgtgtgcag agggtgttcc acttcggcaa gggcaagagc 60 gagggcaaca aggccatgaa ggacctggta aaaataatcg ctgttgatac gagatgatga 120 tgttatgaac ttggaatttt gattgttttt tacactggtt ttggttggtt gggggggggg 180 gggggtgtac agctgggagg gaagggggcg aacttggcgg agatggcgag catcgggctg 240 tcggtgccgc cggggttcac ggtgtcgacg gaggcgtgcc agcagtacca ggcggcgggg 300 aagacgctgc cggcggggct gtgggaggag atcgtcgagg ggctccagtg ggtggaggag 360 tacatggcgg cgcgcctcgg tgaccccgcc cgccctctcc tcctctccgt ccgctccggc 420 gccgccgtgc gtatcactta cttatattta ctctctctct cttcctctct gccacgccgg 480 cgatgtgaca gatcgattga tctccgttgc tgatcgatcc gtgcgtgcgt gtgtgtgcag 540 gtgtcgatgc cggggatgat ggacacggtg ctgaacctgg ggctgaacga cgaggtggcg 600 gcgggactgg cggccaagag cggcgaccgc ttcgcgtacg actcctaccg ccgtttcctc 660 gacatgttcg gcaacgtggt acgtactcct catcagatca cactctcccg gctcgctgac 720 tcggcagcta gctgcctagc tcgtcggagc tcacgagctt aattttactt gttctctgct 780 actttcgtgt gcgtcaacac tgccacggct gcatcgacgt ggtgggtaag ttatttatgc 840 tgcgtcagcg acgcgacggt ggtggctgcg gatgcgcata cttttgtgcg ttgggtgggg 900 cccggttctt ccgtctcatc ctatgtgggg ggaatttgtc cgcactagag tcactccaac 960 ttcccaaagc ttattgttct tttgtggctc tattttacta ttagaaaata gggaataatt 1020 ttagtagtat ttgactttag aaaagttaca aggagaatat tttagtattg tgtcaagaaa 1080 aaaaaggaaa aaaaaacaag agatagtatg tccctctcga tcgtatatgc gattatgtgc 1140 tagcaaggga ttaacatgga acttgctgtc aatatttgat ctcctcgtac aaagaataca 1200 agatgttttc ttaggagacc tgtacggcac tattgccgta ttttgaccat agttctttaa 1260 ttttattgga aaggatgact ggtgaaggcg atgggtggtt agcagtacaa tttgacactc 1320 cttactagct cagctcacat atactcctat ttcatgtaat aattaaatta atcagtacag 1380 ggtcctccaa catagtacct gataacatct gcaatatgga aatatctgtc ttcctagaag 1440 ttcaaagaca agttggttgc tactccagtc atacaaccaa ttactttttt ttcacctata 1500 ttcatcaaag cttatttttt ttggaaaaaa tgttcttaat tttattcttt tttagcaaat 1560 ttaatttaga gtaaaaaaca gtaagtttta ttatattttt caagcgcacc gttcaccaca 1620 ccggtctcgg cggtctgcac aacttttgcc ctttgcttgg ggtgcgcaac cggtcggtcg 1680 gtcaccttgc accggaccgg accggtccgg tcgctggagt cgaagtggtt cgaactccac 1740 tgcgccccga gccctcgacc acctccctcc tcctaccaat cccagccatg gttcgactca 1800 tcacaagcgc cgccgccgcc gccgcggacc gcgcctgagc ccatcatgga tgctagacct 1860 ataccagctt cgattgcctt ggccgcgatt cgctggtaag ataaggccag agggtttcgg 1920 taggatgtcg caaggatgag ccgcagaatc gtgaatttgt gatgggtgtt agttgttact 1980 caatagaggg gaattttgcc tttattcagc ccaaaaattg gttacaggtc atgaatgctt 2040 cctggttctt gaatgctaca gagatcagtt cttagaattt ttttctctct cttttccagg 2100 tcatggacat tcctcatgca ctgttcgagg agaagctcga agccatgaaa gcagtcaagg 2160 ggctgcacaa cgacactgac ctgactgcca ctgacctcaa agaactagtg gcacagtaca 2220 aggatgtcta tgttgaagct aagggagagc catttccctc tggtatgccc atagagtttc 2280 actcttcgtg atatctgaaa ttaattagtg ttttgatgaa actgagcctt ttcttttggc 2340 gtctgaatgc taatgtactg 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taattttcat gtataatgca ggatattgaa tttactgttc 3240 aggaaaatag gctttggatg cttcagtgca gaacaggaaa gcgcacagga aaaggtgctg 3300 taaagattgc tgtagacatg gttaacgagg gccttgttga gcgccgcaca gcacttaaga 3360 tggtagaacc aggtcacctg gatcagcttc ttcatcctca ggtattgtat aactaagagg 3420 ctctaatggt ctataaactc atgcaccaca taaatggaca cgtacaattt cataatacct 3480 ctgttatccc aaaatgccgt gttgctcttt tagaacaatt ttgttgggtt ggtgtattga 3540 tgtcatagaa gttaccacat cgattgcgtg cttagaataa atcagttaat acttaatagt 3600 aagctagaat aatcaaagat taaatgtgtg tttgcgatct attagtgaaa tttgatacgc 3660 atgtctgctt taattctgaa catcaaaatc tttatgttat atttttccac aaaataggta 3720 gagtgtttgt tacttgaact ctgagcattt tgaattattt ggaatgagtt ttagcaaaca 3780 acagagatta tctcattacg tcttgtgtag taaagtataa tactattatc ataactaaca 3840 aatatcaaac ataatcacac aagtattgat gttggtaact gttgttttaa aattttgttg 3900 cctgctagtt tctgcacagg tcttggacat tgcgtacttg agtttcagtt cacaactaaa 3960 ttaatggcag ttattgatat ctcactttta atcttttgtt atgaaaacca gtttgagaac 4020 ccatcagggt ataaagacaa 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ctgttgcacc agcatcaata aaaaatgctt attgtgagta 4920 tgttccatgt tctaggttat ggcaaatgct gatacccccg aggatgcaac aacagccaga 4980 cagaatgggg cagaaggaat tgggctatgc cggactgaac atatggtgtg tattaacttt 5040 gtttgttaat gctctttttt ttttctcttt tttgctagga tgatatgtgc ctgaactttt 5100 tagttgagtt taacatttag aagctagatt catggatgca actcttctct tctagtcaat 5160 gcagataatt tcatgccctc ttctcttttt cttctcttca tagttcttcg cttcagacga 5220 gaggattaag gctgtcaggc agatgattat ggcttcaagt cttgaactga ggcagaaagc 5280 actagatcgc cttttgcctt atcagaggtc tgactttgaa ggcatcttcc gtgcaatgga 5340 tggtatgcga aatttttacc ataataatat atatgtctta atgaatttag atgcactagt 5400 gtttaattga aggaaacaaa aacagttttg ctttcttaaa tataagttaa ttgattgttc 5460 tagtgtagat gcaacgttat aaatttgcaa aagggatgca atatactttt agaagattgc 5520 ctatattatc ttaacatatt atgcatcatg taagttaatg ggcacgattc tgctatgatt 5580 cttcttttat ggaaaggggt acattgatgg atgtatgatt cattcaacat agtcttaatt 5640 cattgcatct tgcacacaac atgcttggtc atacaggcgt ttaaaaatgg ttttttgttg 5700 cattccaggg cttccggtaa ctattagact cttggatcct ccacttcatg agttccttcc 5760 agaaggccat gttgaggata tggtgcgtga gctatgctct gaaactggag cagctcagga 5820 tgatgtcctt gcaagagtag aaaaactttc cgaagtaaat ccaatgcttg gtttccgtgg 5880 gtgcaggttg gtttttgcac tttgctattc agtgttgaat taggtctttc cttttccaga 5940 gcatttactt ggttattgtc ctactttatt tgaggttgca gcaacaatct acatttgcat 6000 cattttcctt tactaatgct gggaccactc aatttcaggc ttggtatatc ataccctgaa 6060 ttgactgaaa tgcaagcccg tgccatcttt gaagctgcta taaccatgac caaccagggt 6120 attcaagtct ttccggagat aatggttccc cttgttggaa ctcctcaggt atgtgtttgc 6180 tttcttcttt tcattcatag tacctgactt gtgtaattgg ctgtctgtga aggtgctgca 6240 atttagatga taacttatat ttacatgaat tccaatttct agaatcatgc aagtattaaa 6300 tcacgtgtga atggaacatt gacttcatcc gggaaatggt tcattccatt tcttcatatt 6360 taccttcttt gatgttctaa tatatttgat tacattgttc ttttcggttg gttttcaaac 6420 aattgacatt tgagtatttt gctgtgacag gaattagggc atcaagtgga tgttatccgt 6480 caaattgcca acaaggtgtt cacagacatg ggaaaaacta ttggctacaa agttggaact 6540 atgattgaaa ttcccagggc 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ttgagtgatg aaaatcgaga actctactca taaattcaca 7440 gaacaatcac taactgttat taactctctt tggcagggtc ccaattgcta ggctagctgc 7500 agctcaggtg ctcctctga 7519 <210> 2 <211> 7519 <212> DNA <213> cyOsPPDK of Oryza sativa Namil(SA)-flo2 <400> 2 atggctccgg ctcaatgtgc tcgtgtgcag agggtgttcc acttcggcaa gggcaagagc 60 gagggcaaca aggccatgaa ggacctggta aaaataatcg ctgttgatac gagatgatga 120 tgttatgaac ttggaatttt gattgttttt tacactggtt ttggttggtt gggggggggg 180 gggggtgtac agctgggagg gaagggggcg aacttggcgg agatggcgag catcgggctg 240 tcggtgccgc cggggttcac ggtgtcgacg gaggcgtgcc agcagtacca ggcggcgggg 300 aagacgctgc cggcggggct gtgggaggag atcgtcgagg ggctccagtg ggtggaggag 360 tacatggcgg cgcgcctcgg tgaccccgcc cgccctctcc tcctctccgt ccgctccggc 420 gccgccgtgc gtatcactta cttatattta ctctctctct cttcctctct gccacgccgg 480 cgatgtgaca gatcgattga tctccgttgc tgatcgatcc gtgcgtgcgt gtgtgtgcag 540 gtgtcgatgc cggggatgat ggacacggtg ctgaacctgg ggctgaacga cgaggtggcg 600 gcgggactgg cggccaagag cggcgaccgc ttcgcgtacg actcctaccg ccgtttcctc 660 gacatgttcg gcaacgtggt acgtactcct catcagatca cactctcccg gctcgctgac 720 tcggcagcta gctgcctagc tcgtcggagc tcacgagctt aattttactt gttctctgct 780 actttcgtgt gcgtcaacac tgccacggct gcatcgacgt ggtgggtaag ttatttatgc 840 tgcgtcagcg acgcgacggt ggtggctgcg gatgcgcata cttttgtgcg ttgggtgggg 900 cccggttctt ccgtctcatc ctatgtgggg ggaatttgtc cgcactagag tcactccaac 960 ttcccaaagc ttattgttct tttgtggctc tattttacta ttagaaaata gggaataatt 1020 ttagtagtat ttgactttag aaaagttaca aggagaatat tttagtattg tgtcaagaaa 1080 aaaaaggaaa aaaaaacaag agatagtatg tccctctcga tcgtatatgc gattatgtgc 1140 tagcaaggga ttaacatgga acttgctgtc aatatttgat ctcctcgtac aaagaataca 1200 agatgttttc ttaggagacc tgtacggcac tattgccgta ttttgaccat agttctttaa 1260 ttttattgga aaggatgact ggtgaaggcg atgggtggtt agcagtacaa tttgacactc 1320 cttactagct cagctcacat atactcctat ttcatgtaat aattaaatta atcagtacag 1380 ggtcctccaa catagtacct gataacatct gcaatatgga aatatctgtc ttcctagaag 1440 ttcaaagaca agttggttgc tactccagtc atacaaccaa ttactttttt ttcacctata 1500 ttcatcaaag cttatttttt ttggaaaaaa tgttcttaat tttattcttt tttagcaaat 1560 ttaatttaga gtaaaaaaca gtaagtttta ttatattttt caagcgcacc gttcaccaca 1620 ccggtctcgg cggtctgcac aacttttgcc ctttgcttgg ggtgcgcaac cggtcggtcg 1680 gtcaccttgc accggaccgg accggtccgg tcgctggagt cgaagtggtt cgaactccac 1740 tgcgccccga gccctcgacc acctccctcc tcctaccaat cccagccatg gttcgactca 1800 tcacaagcgc cgccgccgcc gccgcggacc gcgcctgagc ccatcatgga tgctagacct 1860 ataccagctt cgattgcctt ggccgcgatt cgctggtaag ataaggccag agggtttcgg 1920 taggatgtcg caaggatgag ccgcagaatc gtgaatttgt gatgggtgtt agttgttact 1980 caatagaggg gaattttgcc tttattcagc ccaaaaattg gttacaggtc atgaatgctt 2040 cctggttctt gaatgctaca gagatcagtt cttagaattt ttttctctct cttttccagg 2100 tcatggacat tcctcatgca ctgttcgagg agaagctcga agccatgaaa gcagtcaagg 2160 ggctgcacaa cgacactgac ctgactgcca ctgacctcaa agaactagtg gcacagtaca 2220 aggatgtcta tgttgaagct aagggagagc catttccctc tggtatgccc atagagtttc 2280 actcttcgtg atatctgaaa ttaattagtg ttttgatgaa actgagcctt ttcttttggc 2340 gtctgaatgc taatgtactg tgttgtttgc ttgccataga tcccaagaag caactgcagc 2400 tggccgtgtt ggccgtgttc aactcatggg atagcccaag agcaatcaag tacagaagca 2460 taaacaagat cactgggctg aagggcactg ctgtaaacgt gcagaccatg gtgtttggaa 2520 acatggggaa cacctctggc acgggtgtgc tcttcactag gaacccaagc actggagaga 2580 agaagcttta cggcgaattc cttgtgaatg ctcaggtatg gctcacaccc tgttgctcct 2640 atttgcatct agctgctaac tgttgcacac ctgtggtttg tgtgtatgaa tcaatgtatg 2700 agcaatatgt ttcctgctga tcgtattggg ttatgcaagc ggcgataatt catatatacc 2760 cgaacgattt cttataatgc aatattattt cttctgcagg gtgaagatgt ggttgctgga 2820 atcagaactc cagaggatct tgatgctatg agggaccaca tgccggagcc ttatgaagag 2880 ctcgttgaga actgcaaaat tttggagagt cactataaag aaatgatggt acaatattct 2940 aatttgcttt atgcatcaat accttattag ataatgggat taaggcagtt ctagaggcat 3000 aagtgtccta cttttccctc aaactgaaac ttaaaaggaa gcacgatcgt ctcatcatat 3060 actcgagcat tgtcttggtg atatctcatt acctccaata gcttgcacac agaaataagt 3120 gatttgaaac gatcttgatc atgctcttgg tttagcaact aggtaatgtg cctccattat 3180 ttttttttgg 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ctacctagtt ctgttgcacc agcatcaata aaaaatgctt attgtgagta 4920 tgttccatgt tctaggttat ggcaaatgct gatacccccg aggatgcaac aacagccaga 4980 cagaatgggg cagaaggaat tgggctatgc cggactgaac atatggtgtg tattaacttt 5040 gtttgttaat gctctttttt ttttctcttt tttgctagga tgatatgtgc ctgaactttt 5100 tagttgagtt taacatttag aagctagatt catggatgca actcttctct tctagtcaat 5160 gcagataatt tcatgccctc ttctcttttt cttctcttca tagttcttcg cttcagacga 5220 gaggattaag gctgtcaggc agatgattat ggcttcaagt cttgaactga ggcagaaagc 5280 actagatcgc cttttgcctt atcagaggtc tgactttgaa ggcatcttcc gtgcaatgga 5340 tggtatgcga aatttttacc ataataatat atatgtctta atgaatttag atgcactagt 5400 gtttaattga aggaaacaaa aacagttttg ctttcttaaa tataagttaa ttgattgttc 5460 tagtgtagat gcaacgttat aaatttgcaa aagggatgca atatactttt agaagattgc 5520 ctatattatc ttaacatatt atgcatcatg taagttaatg ggcacgattc tgctatgatt 5580 cttcttttat ggaaaggggt acattgatgg atgtatgatt cattcaacat agtcttaatt 5640 cattgcatct tgcacacaac atgcttggtc atacaggcgt ttaaaaatgg ttttttgttg 5700 cattccaggg cttccggtaa ctattagact cttggatcct ccacttcatg agttccttcc 5760 agaaggccat gttgaggata tggtgcgtga gctatgctct gaaactggag cagctcagga 5820 tgatgtcctt gcaagagtag aaaaactttc cgaagtaaat ccaatgcttg gtttccgtgg 5880 gtgcaggttg gtttttgcac tttgctattc agtgttgaat taggtctttc cttttccaga 5940 gcatttactt ggttattgtc ctactttatt tgaggttgca gcaacaatct acatttgcat 6000 cattttcctt tactaatgct gggaccactc aatttcaggc ttggtatatc ataccctgaa 6060 ttgactgaaa tgcaagcccg tgccatcttt gaagctgcta taaccatgac caaccagggt 6120 attcaagtct ttccggagat aatggttccc cttgttggaa ctcctcaggt atgtgtttgc 6180 tttcttcttt tcattcatag tacctgactt gtgtaattgg ctgtctgtga aggtgctgca 6240 atttagatga taacttatat ttacatgaat tccaatttct agaatcatgc aagtattaaa 6300 tcacgtgtga atggaacatt gacttcatcc gggaaatggt tcattccatt tcttcatatt 6360 taccttcttt gatgttctaa tatatttgat tacattgttc ttttcggttg gttttcaaac 6420 aattgacatt tgagtatttt gctgtgacag gaattagggc atcaagtgga tgttatccgt 6480 caaattgcca acaaggtgtt cacagacatg ggaaaaacta ttggctacaa agttggaact 6540 atgattgaaa ttcccagggc agctttagtg gctgatgagg taagaaacaa ctgatagctc 6600 ccttcttttt tgaaaatctt cagtatggtt attgtcattc aacatgtaga cagaactgta 6660 catgcaacat ggctagtaat agaatcttgg atattaccct aaaggatatt ttgatcttga 6720 aatagtgaat gattataaaa atattcaaag ttcaaatgat gagtttatgt tttctttaaa 6780 cctataagct gacagtgctg tgttggctgc acatttattg acagatagca gagcaggctg 6840 agttcttctc ctttggaaca aacgacctaa cacagatgac atttggttac agtagggatg 6900 atgtggggaa gttccttccc atctatctgt ctcagggtat cctccagcat gacccctttg 6960 aggtaaattt gtacagccaa aatggcctcc cttgataaac acccctattt cccaacattt 7020 acagatgtga gcaactcatc tgcatattct tttcccaact ctcgagtcct gacttctgat 7080 ttggtgcaat ctgaccaatt tctatcatgt aacatacctg ttgatgaata tattaggtgc 7140 ttgatcagag gggagttggg gagctggtta agctggctac agagagaggc cgcaaagcta 7200 ggcctaactt gaaggttagc ctttcactgg agcttagagg acatcacctt gtatagaatc 7260 catggtttct tatattgaaa tgtttttctt tttttgtaaa caggtgggca tctgtggtga 7320 acatggtgga gagcctctgt cagtcgcttt ctttgcgaag gctgggctgg actatgtttc 7380 ttgttcgcct ttcaggtcgg ttgagtgatg aaaatcgaga actctactca taaattcaca 7440 gaacaatcac taactgttat taactctctt tggcagggtc ccaattgcta ggctagctgc 7500 agctcaggtg ctcctctga 7519 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Flo2-Hinf I-F <400> 3 cccaggtgat gcaggtgag 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Flo2-Hinf I-R <400> 4 gcacaggtct tggacattgc 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Flo2-outer-F <400> 5 tccacaaaat aggtagagtg tttg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Flo2-outer-R <400> 6 cacctttaca ttcataatgg acag 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Flo2-inner-F <400> 7 agacaaagtt attgccactg g 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Flo2-inner-R <400> 8 ccaggtgatg caggtacgt 19 <210> 9 <211> 7556 <212> DNA <213> cyOsPPDK of Oryza sativa Nipponbare <400> 9 atggctccgg ctcaatgtgc tcgtgtgcag agggtgttcc acttcggcaa gggcaagagc 60 gagggcaaca aggccatgaa ggacctggta aaaataatcg ctgttgatac gagatgatga 120 tgttatgaac ttggaatttt gattgttttt tacactggtt ttggttggtt gggggggggg 180 gggggtgtac agctgggagg gaagggggcg aacttggcgg agatggcgag catcgggctg 240 tcggtgccgc cggggttcac ggtgtcgacg gaggcgtgcc agcagtacca ggcggcgggg 300 aagacgctgc cggcggggct gtgggaggag atcgtcgagg ggctccagtg ggtggaggag 360 tacatggcgg cgcgcctcgg cgaccccgcc cgccctctcc tcctctccgt ccgctccggc 420 gccgccgtgc gtatcactta cttatattta ctctctctct ctcttcctct ctgccacgcc 480 ggcgatgtga cagatcgatt gatctccgtt gctgatcgat ccgtgcgtgc gtgtgtgtgc 540 aggtgtcgat gccggggatg atggacacgg tgctgaacct ggggctgaac gacgaggtgg 600 cggcgggact ggcggccaag agcggcgacc gcttcgcgta cgactcctac cgccgtttcc 660 tcgacatgtt cggcaacgtg gtacgtactc ctcatcagat cacactcgcc cggctcgctg 720 actcggcagc tagctgccta gctcgtcgga gctcacgagc ttaattttac tttttctctg 780 ctactttcgt gtgcgtcaac actgccacgg ctgcatcgac gtggtgggta agttatttat 840 gctgcgtcag cgacgcgacg gtggtggctg cggatgcgca tacttttgtg cgttgggtgg 900 ggcccggttc ttccgtctca tcctatgtgg ggggaatttg tccgcactag agtcactcca 960 acttcccaaa gcttattgtt cttttgtggc tctattttac tattagaaaa tagggaataa 1020 ttttagtagt atttgacttt agaaaagtta caaggagaat attttagtat tgtgtcaaga 1080 aaaaaaagga aaaaaaaaca agagatagta tgtccctctc gatcgtatat gcgattatgt 1140 gctagcaagg gattaacatg gaacttgctg tcaatatttg atctcctcgt acaaagaata 1200 caagatgttt tcttaggaga cctgtacggc actattgccg tattttgacc atagttcttt 1260 aattttattg gaaaggatga ctggtgaagg cgatgggtgg ttagcagtac aatttgacac 1320 tccttactag ctcagctcac atatactcct atttcatgta ataattaaat taatcagtac 1380 agggtcctcc aacatagtac ctgataacat ctgcaatatg gaaatatctg tcttcctaga 1440 agttcaaaga caagttggtt gctactccag tcatacaacc aattactttt ttttcaccta 1500 tattcatcaa agcttatttt ttttggaaaa aatgttctta attttattct tttttagcaa 1560 atttaattta gagtaaaaaa cagtaagttt tattatattt ttcaagcgca ccgttcacca 1620 caccggtctc ggcggtctgc acaacttttg ccctttgctt ggggtgcgca accggtcggt 1680 cggtcacctt gcaccggacc ggaccggtcc ggtcgctgga gtcgaagtgg ttcgaactcc 1740 actgcgtccc gagccctcga ccacctccct cctcctacca atcccagcca tggttcgact 1800 catcacaagc gccgccgcgg cggcggcggc ggcggcgacg gcggcgcgga ggagagcgcc 1860 ctgcggaccg cgcctgagcc catcatggat gctagaccta taccagcttc gattgccttg 1920 gccgcgattc gctggtaaga taaggccaga gggtttcggt aggatgtcgc aaggatgagc 1980 cgcagaatcg tgaatttgtg atgggtgtta gttgttactc aatagagggg aattttgcct 2040 ttattcagcc caaaaattgg ttacaggtca tgaatgcttc ctggttcttg aatgctacag 2100 agatcagttc ttagaatttt tttctctctc ttttccaggt catggacatt cctcatgcac 2160 tgttcgagga gaagctcgaa gccatgaaag cagtcaaggg gctgcacaac gacactgacc 2220 tgactgccac tgacctcaaa gaactagtgg cacagtacaa ggatgtctat gttgaagcta 2280 agggagagcc atttccctct ggtatgccca taaagtttca ctcttcgtga tatctgaaat 2340 taattagtgt tttgatgaaa ctgagccttt tcttttggcg tctgaatgct aatgtactgt 2400 gttgtttgct tgccatagat cccaagaagc aactgcagct ggccgtgttg gccgtgttca 2460 actcatggga tagcccaaga gcaatcaagt acagaagcat aaacaagatc actgggctga 2520 agggcactgc tgtaaacgtg cagaccatgg tgtttggaaa catggggaac acctctggca 2580 cgggtgtgct cttcactagg aacccaagca ctggagagaa gaagctttac ggcgaattcc 2640 ttgtgaatgc tcaggtatgg ctcacaccct gttgctccta tttgcatcta gctgctaact 2700 gttgcacacc tgtggtttgt gtgtatgaat caatgtatga gcaatatgtt tcctgctgat 2760 cgtattgggt tatgcaagcg gcgataattc atatataccc gaacgatttc ttataatgca 2820 atattatttc ttctgcaggg tgaagatgtg gttgctggaa tcagaactcc agaggatctt 2880 gatgctatga gggaccacat gccggagcct tatgaagagc tcgttgagaa ctgcaaaatt 2940 ttggagagtc actataaaga aatgatggta caatattcta atttgcttta tgcatcaata 3000 ccttattaga taatgggatt aaggcagttc tagaggcata agtgtcctac ttttccctca 3060 aactgaaact taaaaggaag cacgatcgtc tgatcatata ctcgagcatt gtcttggtga 3120 tatctcatta cctccaatag cttgcacaca gaaataagtg atttgaaacg tcttgatcat 3180 gctcttggtt tagcaactag gtaatgtgcc tccattattt ttttttggga gactaactta 3240 attttcatgt ataatgcagg atattgaatt tactgttcag gaaaataggc tttggatgct 3300 tcagtgcaga acaggaaagc gcacaggaaa aggtgctgta aagattgctg tagacatggt 3360 taacgagggc cttgttgagc gccgcacagc acttaagatg gtagaaccag gtcacctgga 3420 tcagcttctt catcctcagg tattgtataa ctaagaggct ctaatggtct ataaactcat 3480 gcaccacata aatggacacg tacaatttca taatacctct gttatcccaa aatgccgtgt 3540 tgctctttta gaacaatttt gttgggttgg tgtattgatg tcatagaagt taccacatcg 3600 attgcgtgct tagaataaat cagttaatac ttaatagtaa gctagaataa tcaaagatta 3660 aatgtgtgtt tgcgatctat tagtgaaatt tgatacgcat gtctgcttta attctgaaca 3720 tcaaaatctt tatgttatat ttttccacaa aataggtaga gtgtttgtta cttgaactct 3780 gagcattttg aattatttgg aatgagtttt agcaaacaac agagattatc tcattacgtc 3840 ttgtgtagta aagtataata ctattatcat aactaacaaa tatcaaacat aatcacacaa 3900 gtattgatgt tggtaactgt tgttttaaaa ttttgttgcc tgctagtttc tgcacaggtc 3960 ttggacattg cgtacttgag tttcagttca caactaaatt aatggcagtt attgatatct 4020 cacttttaat cttttgttat gaaaaccagt ttgagaaccc atcagggtat aaagacaaag 4080 ttattgccac gggcttacct gcatcacctg gggctgctgt gggccaaatt gtattcactg 4140 ccgaggatgc tgaagcatgg catgcccaag ggaaagatgt tattctggta cgtcctgatc 4200 atctgtcttt ctaggacaaa tttgtttgtt tcgtccatgt tagaatatta aacagctgct 4260 tataggaaaa aaaatagatt tatcacagct ttattcaagc tgcacttgaa aactccacat 4320 tgcatcgttg catttggtgt atcttgacat tttcctgtcc attatgaatg taaaggtgag 4380 gacagagacc agcccagagg atgttggtgg catgcatgca gctgttggaa ttcttacagc 4440 aagaggtggt atgacctctc acgctgctgt tgttgcgcgc ggatggggca aatgttgtgt 4500 gtcaggatgc tcaagcgtcc gtgtaaatga tgcgtccaag gtgattatac tagattcttg 4560 caccacacaa acatttaaga gttctcttat gtacaaaggc tgcctttcac acatcgagtt 4620 tgcaattacc attttatact gcagatagtt gcttaatttg ctgtgtctct acagattgta 4680 gtgattgaag acaaggcgct gcatgaaggt gagtggctat cgttgaatgg atcaactggt 4740 gaagtgatca ttggcaagca gccactctgc ccaccagccc ttagtggtga tttggaaact 4800 ttcatgtctt gggtggatga agttaggaaa ctcaaggtaa gcaaaatatg tttcaagttg 4860 aagtcagctg aaaaagggac attagtttta tttactcact aaggtcaagg ctacctagtt 4920 ctgttgcacc agcatcaata aaaaatgctt attgtgagta tgttccatgt tctaggttat 4980 ggcaaatgct gatacccccg aggatgcaac aacagccaga cagaatgggg cagaaggaat 5040 tgggctatgc cggactgaac atatggtgtg tattaacttt gtttgttaat gctctttttt 5100 tttctctttt ttgctaggat gatatgtgcc tgaacttttt agttgagttt aacatttaga 5160 agctagattc atggatgcaa ctcttctctt ctagtcaatg cagataattt catgccctct 5220 tctctttttc ttctcttcat agttcttcgc ttcagacgag aggattaagg ctgtcaggca 5280 gatgattatg gcttcaagtc ttgaactgag gcagaaagca ctagatcgcc ttttgcctta 5340 tcagaggtct gactttgaag gcatcttccg tgcaatggat ggtatgcgaa atttttacca 5400 taataatata tatgtcttaa tgaatttaga tgcactagtg tttaattgaa ggaaacaaaa 5460 acagttttgc tttcttaaat ataagttaat tgattgttct agtgtagatg caacgttata 5520 aatttgcaaa agggatgcaa tatactttta gaagattgcc tatattatct taacatatta 5580 tgcatcatgt aagttaatgg gcacgattct gctatgattc ttcttttatg gaaaggggta 5640 cattgatgga tgtatgattc attcaacata gtcttaattc attgcatctt gcacacaaca 5700 tgcttggtca tacaggcgtt taaaaatggt tttttgttgc attccagggc ttccggtaac 5760 tattagactc ttggatcctc cacttcatga gttccttcca gaaggccatg ttgaggatat 5820 ggtgcgtgag ctatgctctg aaactggagc agctcaggat gatgtccttg caagagtaga 5880 aaaactttcc gaagtaaatc caatgcttgg tttccgtggg tgcaggttgg tttttgcact 5940 ttgctattca gtgttgaatt aggtctttcc ttttccagag catttacttg gttattgtcc 6000 tactttattt gaggttgcag caacaatcta catttgcatc attttccttt actaatgctg 6060 ggaccactca atttcaggct tggtatatca taccctgaat tgactgaaat gcaagcccgt 6120 gccatctttg aagctgctat aaccatgacc aaccagggta ttcaagtctt tccggagata 6180 atggttcccc ttgttggaac tcctcaggta tgtgtttgct ttcttctttt cattcatagt 6240 acctgacttg tgtaattgac tgtctgtgaa ggtgctgcaa tttagatgat aacttatatt 6300 tacatgaatt ccaatttcta gaatcatgca agtattaaat cacgtgtgaa tggaacattg 6360 acttcatccg ggaaatggtt cattccattt cttcatattt accttctttg atgttctaat 6420 atatttgatt acattgttct tttcggttgg ttttcaaaca attgacattt gagtattttg 6480 ctgtgacagg aattggggca tcaagtggat gttatccgtc aaattgccaa caaggtgttc 6540 acagacatgg gaaaaactat tggctacaaa gttggaacta tgattgaaat tcccagggca 6600 gctttagtgg ctgatgaggt aagaaacaac tgatagctcc cttctttttt gaaaatcttc 6660 agtatggtta ttgtcattca acatgtagac agaactgtac atgcaacatg gctagtaata 6720 gaatcttgga tattacccta aaggatattt tgatcttgaa atagtgaatg attataaaaa 6780 tattcaaagt tcaaatgatg agtttatgtt ttctttaaac ctataagctg acagtgctgt 6840 gttggctgca catttattga cagatagcag agcaggctga gttcttctcc tttggaacaa 6900 acgacctaac acagatgaca tttggttaca gtagggatga tgtggggaag ttccttccca 6960 tctatctgtc tcagggtatc ctccagcatg acccctttga ggtaaatttg tacagccaaa 7020 atggcctccc ttgataaaca cccctatttc ccaacattta cagatgtgag caactcatct 7080 gcatattctt ttcccaactc tcgagtcctg acttctgatt tggtgcaatc tgaccaattt 7140 ctatcatgta acatacctgt tgatgaatat attaggtgct tgatcagagg ggagttgggg 7200 agctggttaa gctggctaca gagagaggcc gcaaagctag gcctaacttg aaggttagcc 7260 tttcactgga gctgaggaca tcaccttgta tagaatccat ggtttcttat attgaaatgt 7320 ttttcttttt ttgtaaacag gtgggcatct gtggtgaaca tggtggagag cctctgtcag 7380 tcgctttctt tgcgaaggct gggctggact atgtttcttg ttcgcctttc aggtcggttg 7440 agtgatgaaa atcgagaact ctactcataa attcacagaa caatcactaa ctgttattaa 7500 ctctctttgg cagggtccca attgctaggc tagctgcagc tcaggtgctc ctctga 7556 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS1 Forward primer <400> 10 acggacatgg gtagtggtta c 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS1 Reverse primer <400> 11 agtaatgcgg tgccaaaag 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS2 forward primer <400> 12 ggacggaggg agtatgtg 18 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS2 reverse primer <400> 13 cgatcacgac caggataag 19 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS3 forward primer <400> 14 cgtttcagtg tcagattc 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS3 reverse primer <400> 15 ctaaagctat cagaggattg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS4 forward primer <400> 16 cacacacaca ctgacagttg 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS4 reverse primer <400> 17 tctccctcgc tatcactg 18 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS5 forward primer <400> 18 acgggcacgg atagtgacta c 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS5 reverse primer <400> 19 gtgagtttgt gacaggtaaa cgc 23 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS6 forward primer <400> 20 aacgcaaagc cccaaaag 18 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS6 reverse primer <400> 21 cactgccacc cacatgaag 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS7 forward primer <400> 22 agctccttct caatcttgg 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS7 reverse primer <400> 23 catctcttcc accatctctc 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS8 forward primer <400> 24 tgaaccatgg tgaagactc 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAPS8 reverse primer <400> 25 agctcaggcc ttgttagg 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1F primer <400> 26 caacaaggcc atgaagga 18 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1R primer <400> 27 gatatcacca agacaatgct cg 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2F primer <400> 28 gctcttcact aggaacccaa g 21 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2R primer <400> 29 cgttgcatct acactagaac aatc 24 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3F primer <400> 30 ctaaggtcaa ggctacctag ttc 23 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3R primer <400> 31 cagctagcct agcaattgg 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for Namil(SA)-flo2 <400> 32 cccaggtgat gcaggtgag 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for Namil(SA)-flo2 <400> 33 gcacaggtct tggacattgc 20

Claims

서열번호 2로 표시되는 벼의 분질배유 형질을 결정하는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자.
제1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제1항의 유전자 또는 제2항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 식물체.
제1항의 유전자 또는 제2항의 재조합 벡터를 포함하는 벼의 종자.
서열번호 2로 표시되는 cyOsPPDK (cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase) 유전자를 벡터에 재조합하는 것; 및
상기 재조합된 벡터로 식물체를 형질전환시키는 것을 포함하는 분질배유 형질을 갖는 벼를 제조하는 방법.
서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 상기 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 벼에 분질배유 형질을 부여하기 위한 형질전환용 조성물.