KR101471029B1 - 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법 - Google Patents

양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101471029B1
KR101471029B1 KR1020120138123A KR20120138123A KR101471029B1 KR 101471029 B1 KR101471029 B1 KR 101471029B1 KR 1020120138123 A KR1020120138123 A KR 1020120138123A KR 20120138123 A KR20120138123 A KR 20120138123A KR 101471029 B1 KR101471029 B1 KR 101471029B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
male
sequence
pcr
seq
product
Prior art date
Application number
KR1020120138123A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140070073A (ko
Inventor
김성길
Original Assignee
전남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교산학협력단 filed Critical 전남대학교산학협력단
Priority to KR1020120138123A priority Critical patent/KR101471029B1/ko
Publication of KR20140070073A publication Critical patent/KR20140070073A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101471029B1 publication Critical patent/KR101471029B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열 내지 제5서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 웅성-가임(Male-fertility) 선별용 핵산분자, 및 (a) 양파의 gDNA(genomic DNA)을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 gDNA 중 서열목록 제1서열 내지 서역목록 제5서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 단계를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법을 제공한다. 본 발명은 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임과 관련된 다형성(polymorphism)을 짧은 시간에 판별할 수 있어 양파의 F1 잡종품종개발을 위한 웅성-불임 양파의 대량생산이 가능하며, 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임에 특이적인 분자 표지를 통하여 정확한 유전형질 분석이 가능하다.

Description

양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법{Molecular Markers related a Restorer-of-Fertility gene and Method for Selecting of Male-Fertility or Male-Sterility in Onion}
본 발명은 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법에 관한 것이다.
세포질 웅성-불임성(Cytoplasmic male-sterility; CMS)은 생존 가능한 화분립을 생산할 수 없다. 세포질 웅성-불임성은 140 종 이상의 식물에서 보고되고 있으며, 양파(Hanson 1991)를 포함하는 많은 작물에서 F1 잡종 종자 생산에 활용되어왔다. 세포질 웅성-불임성은 작물학 분야에서의 중요성뿐 아니라, 식물 종의 핵 및 미토콘드리아 게놈 간의 커뮤니케이션을 연구하는데 이상적인 모델이다(Budar et al. 2003; Hanson and Bentolila 2004; Knoop 2004; Kudo and Newton 2008). 종래의 보고에 따르면, 세포질 웅성-불임성은 미토콘드리아 게놈으로부터 유도된다고 알려져 있다. 세포질 웅성불임성-유도 유전자의 가장 확실한 특징은 그 구조의 키메릭(chimeric)한 성질이다. 흔히, 이는 발생기 미토콘드리아 유전자의 부분서열 및 미지의 서열로 구성된다(Budar et al. 2003; Hanson and Bentolila 2004).
키메릭 유전자는 식물 미토콘드리아 게놈의 동적배열에 의해 제조된다(Small et al. 1989; Kmiec et al. 2006). 안정적인 원형 구조를 갖는 동물의 미토콘드리아 게놈과 달리(Boore 1999), 식물의 미토콘드리아 게놈은 크고(200-11300 kb) 불안정한 형태이다(Palmer and Herbon 1987; Sloan et al. 2012). 식물 미토콘드리아 게놈의 정확한 배열 형태는 아직 규명되지 않았다(Backert et al. 1997; Oldenburg and Bendich 2001; Allen et al. 2007). 잦은 반복 서열-매개 재조합으로 인해 식물에서 미토콘드리아 DNA 셔플링(shuffling)이 일어나는 것으로 생각되고 있다. 1 kb 미만의 상대적으로 짧은 반복서열은 서브게놈의 다양성과 관련이 있다(Small et al. 1989; Kmiec et al. 2006).
흥미롭게도, 서브게놈의 특이적 화학양론은 세대를 통해서 유지되나, 화학양론은 때때로 아화학양론적 변이(shifting)에 의해서 변화된다(Sakai and Imamura 1993; Bellaoui et al. 1998; Janska et al. 1998; Kim et al. 2007).
화학양론을 유지하는데 조직 배양 또는 핵 내 유전자의 돌연변이는 변이를 유발할 수 있다. Msh1(Abdelnoor et al. 2006), RecA(Shedge et al. 2007) 및 OSB1(Zaegel et al. 2006)과 같은 핵 내 유전자는 mtDNA 재조합의 억제 및 서브게놈 전달의 조절과 관련이 있다. Sandhu et al.(2007)은 담배 및 토마토에서 RNAi에 의한 Msh1 유전자의 비활성은 아화학양론 변이 및 웅성-불임을 유도한다고 보고하였다.
많은 식물 종에서 세포질성 웅성-불임은 핵 내 Rf(Restorer-of-Fertility, 임성회복) 유전자에 의해 회복될 수 있다. 피튜니아(petunia, Bentolila et al., 2002), 무(Brown et al., 2003; Desloire et al. 2003; Koizuka et al. 2003), 쌀(Komori et al. 2004) 및 수수(Klein et al. 2005)에서 분리된 Rf 유전자는 보통 PPR(Pentatricopeptide Repeat) 단백질을 암호화한다. PPR 단백질은 애기장대의 핵 내 게놈(Small and peeters 2000)에서 규명되었다. PPR 단백질을 암호화하는 Rf 유전자에 의한 CMS-유도 미토콘드리아 유전자의 불활성화가 최근 연구되었다(Wang et al. 2006; Gillman et al. 2007; Fujii et al. 2011; Hu et al. 2012). 그러나, 미지의 기능 단백질(Fujii and Troyama 2009) 또는 글라이신-풍부 단백질(Itabashi et al. 2011)을 암호화하는 Rf 유전자가 최근에 쌀에서 규명됨으로써, 식물 종의 CMS의 임성 회복에 다양한 기작이 존재함을 말해준다.
양파의 웅성-불임은 CMS-S(Jones and Emsweller 1936) 및 CMS-T(Berninger 1965)의 두가지 CMS 시스템에 의해 나타난다. CMS-S의 생식력 회복은 단일의 Rf 유전자좌(Ms)에서 조절되나, CMS-T는 세가지 독립적인 유전자좌가 생식력 회복에 관여한다(Jones and Clarke 1943; Schweisguth 1973). CMS-S 시스템은 생식력 회복의 유전이 단순하고 다양한 환경 조건 하에서 웅성-불임은 상대적으로 안정 때문에 F1 잡종을 선호한다(Havey 2000). 그러나, 두 CMS의 웅성-불임 표현형은 육안으로 구분하기 어렵고 구분하기 위해서는 자손 분석으로 4년 이상 소요된다. 양파의 세포질을 구분하기 위한 mtDNA 또는 엽록체 DNA(cpDNA)의 다양성에 근거한 몇몇의 분자 마커가 개발되어있다(Havey 1995; Sato 1998; Engelke et al. 2003; Kim et al. 2009).
양파의 분자유전학 연구는 1C 핵 당 15,290 Mb에 달하는 거대한 게놈 사이즈(Arumuganathan and Earle 1991), 2년의 긴 세대 시간 및 엄격한 근교약세로 인해 다른 식물종에 비해 상당히 뒤떨어져있다. 최초의 양파 유전자 지도(King et al. 1998)가 보고된 이후에, 몇몇의 저밀도 유전자 지도가 구성되었고(van Heusden et al. 2000; Martin et al. 2005; McCallum et al. 2012) 프룩탄 함량(McCallum et al. 2006) 및 자극적인 맛(McCallum et al. 2007)과 같은 중요한 특성의 QTL(Qualitative Trait Locus) 분석이 수행되었다. 또한, 양파의 핵내 Rf 유전자와 관련된 분자 마커가 개발되었다(Gke et al. 2002; Bang et al. 2011). Gke et al.(2002)은 0.9 및 8.6 cM의 위치에 Ms 유전자좌와 인접하는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 마커를 규명하였고, Bang et al.(2011)은 이러한 두 종류의 RFLP 마커를 PCR(Polymerase Chain Reaction) 마커로 전환하였다. 그러나, 이러한 마커 중 하나는 너무 먼 연계성을 갖고 다른 마커는 Ms 대립형질과 연관평형을 나타낸다(Gke and Havey 2002).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다
본 발명자들은 양파의 임성회복 유전자(Ms locus, a restorer-of-fertility gene)와 관련된 신규한 유전자 마커를 규명하고, 이를 이용하여 양파의 웅성-가임(Male-fertility) 또는 웅성-불임(Male-sterility)을 판정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 양파의 임성회복 유전자와 물리적으로 밀접하게 연관된 5종의 분자 표지를 규명하고, 상기 분자 표지의 서열이 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임과 연관성이 매우 크다는 것을 확인하였고 이를 분자 표지로 이용하는 경우, 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임을 간편하게 판정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 웅성-가임 선별용 핵산분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 웅성-가임(Male-fertility) 선별용 핵산분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 웅성-가임 선별용 핵산분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 웅성-가임 선별용 핵산분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 웅성-가임 선별용 핵산분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 웅성-가임 선별용 핵산분자를 제공한다.
본 발명자들은 양파의 임성회복 유전자(Ms locus, a restorer-of-fertility gene)와 관련된 신규한 유전자 마커를 규명하고, 이를 이용하여 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임(Male-sterility)을 판정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 양파의 임성회복 유전자와 물리적으로 밀접하게 연관된 5종의 분자 표지를 규명하고, 상기 분자 표지의 서열이 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임과 연관성이 매우 크다는 것을 확인하였고 이를 분자 표지로 이용하는 경우, 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임을 간편하게 판정할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제5서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 예컨대 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl. Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
상기 서열목록 제1서열 내지 제5서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자는 양파의 F1 하이브리드 육종 프로그램에서 개체의 분리(segregation) 즉 웅성-가임 및 웅성-불임의 개체를 분리하는 데 있어서 마커-기반 선별(marker-assisted selection)에 유용한 분자 마커로 이용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 서열목록 제1서열 내지 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 마커이다.
상기 “CAPS 마커”는, 개체 간의 유전적 차이를 제한효소를 이용하여 DNA를 분해하고 결과물을 분석하는 CAPS 방법에 이용될 수 있는 표현 형질에 따른 유전적 차이를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 상기 CAPS 방법은 개체 간의 다른 제한효소 부위를 포함하는 PCR 증폭을 실시하고, 상기 PCR 증폭의 산물을 제한효소로 분해한다. 분해된 산물을 아가로즈 또는 아크릴아마이드 젤에 전기영동하여 분해된 산물의 밴드 패턴을 분석한다.
바람직하게는, 본 발명의 서열목록 제5서열 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 심플 PCR 마커이다.
상기 “심플 PCR 마커”는 개체 또는 종을 확인하는데 사용할 수 있는 염색체 상에 공지된 위치의 DNA 서열을 의미한다. 심플 PCR 마커는 유전자좌(genomic loci) 내 돌연변이(mutation) 또는 변화(alteration)에 의해 유도되는 차이(variation)에 기인한다.
본 발명의 명세서에서, 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임을 판별하기 위한 ‘분자 마커’는 상기 ‘CAPS 마커’ 및 ‘심플 PCR 마커’를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 jnurf05이고, 상기 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 jnurf06이며, 상기 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 jnurf10이고, 상기 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 jnurf17이며, 상기 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 jnurf20이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, (a) 양파의 gDNA(genomic DNA)을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 gDNA 중 서열목록 제1서열 내지 서역목록 제5서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 단계를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법을 제공한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법은 양파로부터 gDNA를 수득하고, 상기 gDNA 중 본 발명의 신규한 5종의 분자 마커, 즉 서열목록 제1서열 내지 제5서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드를 분석함으로써 실시된다.
바람직하게는, 단계 (b)의 분석은 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), PCR(Polymerase Chain Reaction), RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), RFLP(Restriction Fragment Lennth Polymorphism), DAF(DNA Amplification Fingerprinting), AP-PCR(Arbitrarily primed PCR), PCR-SSCP(Single-strand Conformation Polymorphism), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), ISSR(Inter-simple Sequence Repeat Amplication), STS(Sequence Tagged Site), EST(Expressed sequence tag), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), DNA 시퀀싱, 마이크로어레이(Microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern Blot) 또는 서던 블럿(Southern blot)이고, 보다 바람직하게는, 상기 단계 (b)의 분석은 CAPS, PCR, RAPD, AFLP 또는 RFLP이고, 가장 바람직하게는, 상기 단계 (b)의 분석은 CAPS 또는 PCR이다.
본 발명의 상기 CAPS는 PCR 방법을 통해 유전자를 증폭하고, 증폭된 산물에 제한효소를 처리하여 분해시키며, 분해된 산물을 전기영동하여 밴드 패턴을 분석하는 유전자 분석 방법이다.
상기의 PCR 방법은 하기 상세하게 설명한다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 본 발명의 분자 마커의 뉴클레오티드 서열을 분석한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 양파 웅성-가임 또는 웅성-불임을 선별한다.
바람직하게는, 상기 CAPS 또는 PCR은 서열목록 제6서열 내지 제15서열 중 한 쌍의 프라이머 세트를 이용하여 실시한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제1서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제6서열 및 제7서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 DraⅠ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 888 bp(base pair)인 제1분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 519 bp인 제2분해물 및 크기가 378 bp인 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하며, (ⅲ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제1분해물, 상기 제2분해물 및 상기 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제2서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제8서열 및 제9서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 사물에 TaqⅠ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 425 bp인 제1분해물 및 크기가 150 bp인 제2분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제1분해물 및 크기가 341 bp인 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하며, (ⅲ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제1분해물, 상기 제2분해물 및 상기 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제3서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제10서열 및 제11서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 PvuⅡ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 251 bp인 제1분해물 및 크기가 117 bp인 제2분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 368 bp인 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하며, (ⅲ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제1분해물, 상기 제2분해물 및 상기 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제4서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제12서열 및 제13서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제12서열 및 서열목록 제13서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 XhoⅠ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 575 bp인 제1분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 427 bp인 제2분해물 및 크기가 148 bp인 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하며, (ⅲ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제1분해물, 상기 제2분해물 및 상기 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제5서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제14서열 및 제15서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제14서열 및 서열목록 제15서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물을 전기영동을 통해 밴드 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 915 bp인 제1산물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 제1산물이 존재하지 않는 경우에는 웅성-불임으로 판단한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열에 상보적으로 결합하는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이스 서열에 상보적으로 결합하는 역방향 프라이머; 및 (c) 제한효소 DraⅠ을 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제6서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제7서열이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에 상보적으로 결합하는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이스 서열에 상보적으로 결합하는 역방향 프라이머; 및 (c) 제한효소 TaqⅠ을 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제8서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제9서열이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열에 상보적으로 결합하는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이스 서열에 상보적으로 결합하는 역방향 프라이머; 및 (c) 제한효소 PvuⅡ을 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제10서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제11서열이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열에 상보적으로 결합하는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이스 서열에 상보적으로 결합하는 역방향 프라이머; 및 (c) 제한효소 XhoⅠ을 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제12서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제13서열이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열에 상보적으로 결합하는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이스 서열에 상보적으로 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제14서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제15서열이다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트는 PCR 키트로 이용할 수 있으며, PCR 및 상기 키트에 포함되는 프라이머에 대한 서술은 공통된 내용으로 명세서의 복잡성을 피하기 위해 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 양파의 임성회복 유전자(Ms locus, a restorer-of-fertility gene)와 관련된 신규한 유전자 마커를 제공한다.
(b) 본 발명은 간편한 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법을 제공한다.
(c) 본 발명은 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임과 관련된 다형성을 짧은 시간에 판별할 수 있어 양파의 F1 잡종품종개발을 위한 웅성-불임 양파의 대량생산이 가능하다.
(d) 본 방명은 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임에 특이적인 분자 표지를 통하여 정확한 유전형질 분석이 가능하다.
도 1은 Ms 유전자위와 연계돈 단순 PCR 및 CAPS 마커를 나타낸다. 1열 내지 5열은 이형접합체의 우성 웅성-가임 F2 개체를 나타내고, 6열 내지 10열은 이형접합체인 웅성-가임 F2 개체를 나타내며, 11열 내지 15열은 이형접합체의 열성 F2 개체를 나타낸다. F2 개체의 Ms 유전자형은 연계된 분자마커의 유전자형을 통해 추정하였다.
도 2는 Ms 유전자좌 및 인접 분자 마커의 연계지도를 나타낸다. 왼쪽의 연계지도는 McCallum et al.(2012)에 의해 보고된 염색체 지도이다. 오른쪽의 연계지도는 110 본의 F2 집단을 을 이용하여 본 발명에서 구축한 연계지도이다. 같은 유전자부위에서 유래한 마커를 수평선으로 연결하여 나타낸다.
도 3은 Ms 유전자좌 및 jnurf17 마커 사이에 교차가 일어난 5 재조합형의 웅성-가임 표현형 및 마커 유전자형을 나타낸다. F는 웅성-가임 표현형을 나타내고, H는 이형접합체 유전자형을 나타내며, S는 웅성-불임 표현형 및 이형접합체 열성 유전자형을 나타낸다. 웅성-가임 유전자형 및 표현형은 음영으로 나타내었다.
도 4는 3 군데 양파 재배 연구소에서 재배된 재배주에서 분자마커와 연계된 Ms 대립형질 유전자 및 유전자형 사이의 연계관계를 나타낸다. Ms 유전자좌 및 마커 유전자형의 웅성-가임 표현형을 음영 박스로 나타내었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 실험 방법
식물체
CMS-S 세포질 및 웅성-가임 이배반수체(doubled haploid) 종(H6)으로 구성된 웅성-불임 재배 계열(506L) 간의 이종교배에서 유래한 유전자 지도를 구성하는데 분리집단을 사용하였다. 이전의 연구에 따라 잡종 F1 및 잡종 F2를 제조하였다(Kim et al. 2004). Ms 유전자좌의 초기 지도 작성에 총 110 본의 F2 집단(population)을 사용하였다. 이전의 연구에서 F2 집단의 웅성-가임 표현형은 보고되었다(Bang et al. 2011). F2:3 분리집단을 생산하기 위해, Ms 유전자좌 및 연계된 모든 관련 분자 마커에 대해 이형접합체인 15 본의 F2를 꽃가루 매개자로서 파리를 이용하여 무작위로 교배하였다. F2:3 집단의 종자를 2010년 8월에 발아하고 2개월 뒤에 묘목을 이식하였다. 종자는 종래의 파종시기보다 일찍 발아하였기 때문에, 대부분의 묘목은 동절기에 개화하였고 2011년 봄에 웃자랐다. 그러나, F2:3 집단의 거의 절반은 동절기의 추위로 인해 말라죽었다. F2:3 집단의 웅성-가임 표현형을 시각적으로 판단하였다. 분리할 식물을 더 생산하기 위해, Ms 유전자좌 및 연계된 모든 분자 마커에 대해 이형접합체인 F2:3 15 본을 작년과 같이 수분하였다. 4,000 이상의 F2:4 종자를 발아시켜 F2:4 대부분이 웃자랐다. 2012년에 웅성-가임 표현형을 조사하였다.
Ms 이형 접합체 및 밀접하게 연계된 분자 마커 간의 연관평형의 연구를 위해 3 군데의 양파 육성 연구소에서 유지된 26 재배 주를 사용하였다. 웅성-가임 표현형을 시각적으로 조사하고, 세포질 형태를 분자 마커를 이용하여 확인하였다(Kim et al. 2009).
RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA) 및 BSA(Bulked Segregant Analysis)
Ms 유전자좌와 연계된 분자 마커를 확인하기 위해 BSA(Michelmore et al. 1991)법을 이용하였다. 두 DNA 군을 생산하기위해 각 웅성-가임 및 웅성-불임 F2 개체 7 본을 선별하였다. 또한, 열성 Ms 대립 형질유전자와 연계된 분자 마커를 확인하기 위해 두 연계된 분자 마커(OPT 및 PSAO)에 대한 웅성-가임 이형접합체를 선별하였다. 800 데카머(decamer) 올리고뉴클레오타이드(브리티시 콜롬비아 대학, 캐나다)로 RAPD 분석을 실시하였다. 0.05 ㎍ 주형, 1 ㎕ 10×PCR 완충액, 0.2 ㎕ 프라이머(10 μM), 0.2 ㎕ dNTPs(각 10 mM) 및 0.25 U Taq 폴리머라제(프라임 태그 DNA 폴리머라제, 제넷바이오, 대한민국)를 포함하는 10 ㎕ 반응혼합물로 PCR를 실시하였다. 초기 변성은 95℃에서 5분 동안 실시하고 95℃에서 1분, 37℃에서 1분 및 72℃에서 2분을 40회 반복하고, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 신장하는 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 산물을 이티디움 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색한 1% 아가로즈 겔 또는 9% 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 가시화하였다.
RAPD 마커를 단순 PCR 또는 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 마커로의 전환
연계된 RAPD 밴드를 1% 아가로즈 젤 또는 9% 폴리아크릴아마이드 젤에서 절단하고 PCR 산물을 PCR 정제 키트(Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 시퀀싱하기 위해 TOPO TA 클로닝 벡터(인비트로젠, 미국)에 클로닝을 실시하였다. 클로닝한 PCR 산물을 Big Dye(Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 설명서에 따라 시퀀싱을 실시하고 ABI 3700 제네틱 아날라이저(Applied Biosystems)를 이용하여 서열을 구하였다.
RAPD 마커의 인접 서열을 얻기 위해, 부모주(H6)로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 게놈 워킹(genome walking)을 실시하였다. 유니버살 게놈 워커 키트(클론테크, 미국)를 이용하여 설명서에 따라 게놈 워킹 라이브러리를 구축하였다. 우성 및 열성 Ms 대립 형질 유전자에 연계된 서열 간의 다형성을 근거로 하여 단순 PCR 또는 CAPS 마커를 개발하였다.
단순 PCR 또는 CAPS 마커의 PCR 증폭
F2:3 및 F2:4 분리집단의 신선한 잎 또는 꽃가루 조직으로부터 CTAB(Cetyl Trimethylammonium Bromide)법을 이용하여 총 게놈 DNA를 추출하였다(Doyle and Doyle 1987). 본 발명에서 개발된 분자 마커의 마커 지노타이핑을 실시하기 위해 0.05 ㎍ 주형, 1 ㎕ 10×PCR 완충액, 0.2 ㎕ 정방향 프라이머(10 μM), 0.2 ㎕ 역방향 프라이머(10 μM), 0.2 ㎕ dNTPs(각 10 mM) 및 0.25 U Taq 폴리머라제(프라임 태그 DNA 폴리머라제, 제넷바이오, 대한민국) 또는 0.1 ㎕ 폴리머라제 믹스(어드벤티지 2 폴리머라제 믹스, 클론테크, 미국)을 포함하는 10 ㎕ 반응혼합물로 PCR를 실시하였다. 초기 변성은 95℃에서 5분 동안 실시하고 95℃에서 30초, 65-67℃(매 회에서 0.8℃ 감소)에서 30초 및 72℃에서 2분을 10회 반복하고, 95℃에서 30초, 57-59℃에서 30초 및 72℃에서 2분을 30회 반복하여, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 신장하는 PCR 증폭을 수행하였다. 각 마커의 어닐링 온도를 표 1에 나타내었다. jnurf20 마커의 PCR 증폭은 95℃에서 5분의 초기 변성 단계, 94℃에서 30초, 65℃에서 60초 및 72℃에서 60초를 40회 반복하고 72℃에서 10분 동안 반응하였다. CAPS 마커의 지노타이핑하기 위해, PCR 산물을 각각의 제한효소로 37℃ 또는 60℃에서 3시간동안 반응하였다. PCR 산물 또는 제한효소 처리된 PCR 산물을 1.5% 아가로즈 젤 상에서 이티디움 브로마이드 염색하여 가시화하였다. 분자 마커의 지노타이핑에 이용된 프라이머 서열 및 제한효소를 표 1에 나타내었다.
마커 프라이머 서열(5’→3’)
정?항/역방향		 어닐링 온도 제한효소
jnurf05 AACAAATCAATCGCCTGAAAA
ATTATGGCCGATTTCTCAGC		 57℃ DraI
jnurf06 GGTTCTTCGCAAAGTTCTCG
TGTGAAAAGATTGGACATACTGC		 57℃ TaqI
jnurf10 CCTCACCAAAGCTGATTTTGA
TGCCTTGATCAGTCGTGATG		 57℃ PvuII
jnurf17 GAGCCCACTGCTATTGAGGA
CCTGGAATGTATAGCAAGCCTAA		 59℃ XhoI
jnurf20 GGTGAAGATGGCATGTGGGAGATCAAA
TAGATGATGTTCTCAGGCGGCGGAGTT		 65℃ 단순 PCR 마커
jnurf63 GGGGTGGAAATAGATGTAGCC
TCCTTTGACGCTTGGTATCC		 57℃ EcoRV
연계 분석( Linkage Analysis )
Ms 유전자좌 및 분자 마커 간의 연계 관계를 조인맵 버전4.0(Stam 1993)을 이용하여 계산하였다. 지도 거리(map distance, cM)를 코삼비 펀션법(Kosambi function, Kosambi 1944)을 이용하여 재조합 빈도로 계산하였다.
결과
Ms 유전자좌와 연계된 분자 마커의 개발
CMS-S 세포질에 부여된 웅성-불임의 임성 회복을 조절하는 Ms 유전자좌와 연계된 분자 마커를 개발하기 위해, CMS-S 세포질로 구성된 웅성-불임주 및 웅성-가임주 간의 F2 집단을 이용하여 BSA 및 RAPD 분석을 수행하였다. 800 무작위 데카머 스크리닝으로 웅성-불임 및 웅성-가임 사이의 다형성 RAPD 밴드를 규명하였다. 수십개의 당형성을 보이는 RAPD 밴드 중에서, F2 집단 내 웅성-가임 표현형의 공동-분리 및 RAPD 밴드의 패턴을 확인한 후에 Ms 유전자좌와 연계된 5 RAPD 마커(N20, N10, L06, E17 및 T05)를 개발하였다.
RAPD 마커를 단순 PCR 마커로 전환하기 위해, 시퀀싱 벡터에 정제된 PCR 산물을 클로닝하여 다형성 RAPD 밴드의 서열을 구하였다. RAPD 절편의 서열에 근거하여 프라이머를 디자인하여 웅성-불임 및 웅성-가임 F2 개체의 PCR 증폭을 실시하였다. 직접 시퀀싱을 통해 웅성-가임 및 웅성-불임 F2의 서열을 구하였다. 우성 및 열성 Ms 대립 형질 유전자-연계 서열 간의 뉴클레오타이드 서열 유사성 범위는 93% 내지 98%였다. 그러나 N20 RAPD 절편을 근거로 디자인한 프라이머 쌍을 PCR 증폭에 사용한 경우, PCR 산물이 증폭되지 않았다. N10 및 L06 RAPD 절편에 대한 제한효소의 인식부위를 근거로 한 다형성 CAPS 마커를 개발하였다. 그 후, N10 및 L06 서열로부터 전환된 CAPS 마커를 jnurf10 및 jnurf06로 각각 명명하였다.
적당한 다형성 인식 부위가 확인되지 않거나 RAPD 절편의 크기는 너무 작아서 프라이머로 적절하지 않은 다른 RAPD 절편의 인접 서열을 구하기 위해 게놈 워킹을 수행하였다. E17 및 T05 RAPD 절편의 인접서열로부터 확인된 제한효소의 적당한 다형성 인식 부위를 이용하여 CAPS 마커를 개발하였다. 이러한 CAPS 마커를 각각 jnurf17 및 jnurf05로 명명하였다. 그러나, N20 RAPD 절편의 인접서열로 디자인한 다양한 프라이머 조합을 이용하여 PCR 증폭을 실시한 경우, 웅성-불임 내 어떠한 PCR 산물도 증폭되지 않았다. 이러한 결과는 열성 Ms 대립 형질 유전자와 연계된 N20 절편의 서열이 완전히 제거되지 않았다는 것을 의미한다. 따라서, N20 서열에 대한 우성 단순 PCR 마커를 개발하였다.
CAPS 마커와 단순 PCR 마커의 Ms 유전자좌의 유전자형은 완전히 구별되었다(도 1). N20 서열의 양성 PCR 산물은 우성-가임 식물체에서만 증폭되었고, 모든 F2 식물체에서 양성 PCR 산물보다 사이즈가 약간 큰 PCR 산물이 증폭되었다(도 1). 이러한 PCR 산물의 서열은 우성 Ms 대립 형질 유전자-연계 서열과 79%의 상동성을 나타내었고, 121-bp 삽입을 포함하였다. 모든 F2 개체는 이러한 상동 서열로 정확하게 증폭되었기 때문에, 상기 PCR 산물은 상기 우성 마커의 PCR 증폭을 확인하는데 내부 대조군으로 사용할 수 있다.
분자 마커와 연계된 Ms 유전자좌의 연계 지도의 구축
웅성-불임 및 웅성-가임 부모 사이에서 교배된 총 F2 110 본을 본 발명에서 개발된 5가지 분자마커 및 이전에 개발된 2가지 단순 PCR 마커인 OPT 및 PSAO(Bang et al. 2011)로 분석하였다. 연계지도는 OPT, jnurf17 및 jnurf05 마커는 Ms 유전자좌와 밀접하게 연관되어 있음을 보여주며, Ms 유전자좌 및 두 마커, jnurf17 및 jnurf05 간에 어떠한 재조합도 없음을 확인하였다(도 2).
이전에 보고된 양파 염색체 표준지도(McCallum et al. 2012)와 본 발명에서 구축된 연계지도 내 마커 간의 연계 관계를 비교하였다. Ms 유전자좌는 염색체 표준지도의 2번 염색체에 위치하고 염색체 표준지도 상에 RFLP 마커인 AOB272 및 AGF136는 이전에 단순 PCR 마커인 OPT 및 PSAO로 각각 전환되었다(도 2). 염색체 표준지도 상에 4가지 밀접하게 관련된 마커(AOB210-LH3, ACAEA07, API63 및 API64)를 본 발명의 연계지도로 통합하기 위해, GenBank에 대입하여 상응하는 클론 서열을 사용하여 프라이머를 디자인하였다. 그러나, 본 발명의 분리집단에서 AOB210-LH3 및 ACAEA07의 서열은 단일형이였고, API64는 이용할 수 없었다. API63 서열로부터 다형성을 확인하였고, CAPS 마커를 개발하여 본 발명의 연계지도에 통합하였다(도 2). 상기 CAPS 마커를 jnurf63으로 명명하였다(표 1).
연계지도의 정확성을 높이기 위해, 2011년에 다수의 F2:3 분리집단을 분석하였다. 두 인접 마커 간의 재조합을 확인하기 위해, 총 1,346 본 묘목을 jnurf10 및 PSAO 마커를 이용하여 분석하였다(표 2). 그러나, 웅성-가임 표현형은 날씨 조건이 불리하여 단 403 웃자란 개체에서 확인되었다. 총 347 재조합형이 확인되었고, 상기 재조합형의 대부분은 jnurf10 및 OPT 마커 사이, 및 PSAO 및 jnurf17 마커 사이가 교차되었다. 상기 OPT 및 jnurf17 마커 사이에 교차는 32 재조합형에서 발생하였다. OPT 및 jnurf17 마커 사이에 단 두 재조합형(11-246 및 11-798)이 확인되었고(도 3), Ms 유전자좌 및 jnurf05 마커 사이의 매우 밀접한 연계를 나타내는 jnurf05 및 Ms 유전자좌 사이의 재조합형은 발견되지 않았다.
연도 개체 수 웅성-가임의 분리 χ 2 p
분석 개체 웃자란 개체 가임 불임
2011 1,346 403 293 110 1.13 0.29
2012 2,927 2,927 2,129 798 8.00 0.0046
매우 밀접하게 연계된 마커 및 Ms 유전자좌 사이의 연계관계를 더 상세하게 설명하기 위해, 더 많은 F2:4 분리집단을 생산하여 분석하였다. 총 2,927 본을 재배하여 다양한 시각적 관찰을 통해 웅성-가임 표현형을 조사하였다. 웅성-가임 및 웅성-불임 식물의 비는 3:1에 가까웠으나, 예상보다 웅성-불임이 더 관찰되었다(표 2). 또한, 웅성-불임 식물의 수는 2011년의 결과보다 약간 높았다. 2012년에는 대량의 샘플을 분석하였기 때문에, 멘델비의 편차는 분리변형에 의해 유발된 것일 것이다. 대립 형질 유전자 또는 접합성 분리변형에 의해 유도되는 분리변형인지 확인하기 위해, Ms 유전자좌의 유전자형을 두 인접 마커(2011년의 jnurf10 및 PSAO, 2012년의 OPT 및 jnurf06)의 유전자형에 의해 예측한 후에 Lorieux et al.(1995)에 의해 제안된 두 카이제곱검정(chi-square test)을 실시하였다. 이러한 결과는 분리변형이 열성 Ms 대립 형질 유전자에 의한 분별로 유도되고 이는 Ms 유전자좌의 인접 부위의 유해 유전자를 암시할 것이다(표 3). 하기 표 3의 윗첨자 a는 두 인접 마커의 유전자형으로 Ms 유전자좌의 유전형을 예측한 것이다.
연도 개체 수 대립형질 빈도 대립형질의 표준편차에 대한 χ 2 검정 접합 표준편차에 대한 χ 2 검정
Ms/Ms a Ms/ms ms/ms 총 Ms ms χ 2 p χ 2 p
2011 231 531 237 999 0.49 0.51 0.072 0.79 3.98 0.14
2012 550 1,244 657 2,451 0.48 0.52 8.54 0.0034 1.77 0.41
2,927 본으로부터 추출한 DNA을 두 연계 마커(OPT 및 jnurf06) 사이의 재조합형을 선별하기 위해 두 연계　마커로 분석하였다. 총 443 본의 재조합형을 확인하였고, 상기 재조합형을 jnurf05 및 jnurf17 마커로 분석하였다. jnurf05 및 jnur17 마커 사이가 재조합된 하나의 재조합형 및 Ms 유전자좌 및 jnurf05 마커 사이의 재조합된 두 재조합형을 확인하였다(도 3). 따라서, Ms 유전자좌 및 jnurf05 마커 사이의 유전적 거리는 대략 0.05 cM으로 예상할 수 있고, 이는 Ms 유전자좌 및 jnurf05 마커 사이의 상당히 밀접한 연계관계가 있음을 알 수 있다.
다양한 묘목 주에서 Ms 유전자좌 및 밀접히 연계된 마커 사이의 연계 평형의 평가
jnur05 마커는 Ms 유전자좌와 밀접하게 연계되어 있기 때문에, 양파 생식질 내 두 유전자좌 사이의 강한 연계 불균형이 있을 수 있다. 두 유전자좌 사이의 연계 불균형의 정도를 평가하기 위해, 웅성-가임 표현형과 함께 연계된 분자 마커로 26 재배 주를 분석하였다. 모든 재배 주의 세포질형은 CMS-S로 확인되었다. 결과는 Ms 유전자좌 및 jnurf05 마커 사이에 강한 연계 불균형이 없음을 보여주고(도 4), 이는 양파 재배 프로그램 내 잦은 이종교배로 두 밀접한 유전자좌 사이의 연계 불균형이 감쇠된 것으로 사료된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Molecular Markers related a Restorer-of-Fertility gene and Method for Selecting of Male-Fertility or Male-Sterility in Onion <130> PN120532 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 999 <212> DNA <213> jnurf05 <400> 1 aaaaaaaatc ctttagcaac taaaataatt aatcatgttt tttttaacaa atcaatcgcc 60 tgaaaataaa ctagtaagtt aaaaaatgtg tttatctata tttgttttat tatatttttt 120 ttccactttt gaaaacacac ctatatatgt agaaatgagc tgtagatttc aataatctaa 180 ccttttcata aattcgtata tcttccaaga gccaatatgt acatatgtgt tgtttattca 240 catacatatt tatttattta tattttttat aaacaaaata aattaaaagt ttttaactga 300 cctatcctta aatcaaaatg tttgaacgga ttaagttgcc ttaggatata tctctaaatt 360 taacagtaag ttaaacatgt gtgtacatat atgtatatat aatccccttt tcaattctag 420 tttagacttg attacaataa acaatataaa accccattta caattccttc tatattttca 480 aaaaaaaatg ttcaaccaaa tcgacagtcg aacccaattt tgggaactgc aattaacacg 540 caaacaaaaa tcagacgagg tgcttaccaa catcgctgac gacaacctac gaggcagcac 600 gaccaaagca gtctatcgaa gtcgctgcgc ctcccctcga gaaatgcttc tgacgttcaa 660 cgcttcacac acgaccgaac tccaccaccc ctcaccgctg atagcctcaa atcacgcgtg 720 tgcttccctt gcatcgagca tctcgccttg aaagataacc ctagctcaac ccaaagtcga 780 gcacaaaaat cgaagcttcc actatgatga tcccccaatc acaagtgaac cctagccact 840 tcgacccctc ctcctcgcat acgagttcac cttcgcgttc gaacgcgacc cctccccctc 900 ttttttttct tcctgctgag aaatcggcca taattttttt cgtatgtttc gttcgaattg 960 atttttactg aaagaaaaaa aaaggaaaac ttgattttt 999 <210> 2 <211> 838 <212> DNA <213> jnurf06 <400> 2 gagggaagag cacgttattc atcttgggga ggttcttcgc aaagttctcg aagtgtcact 60 tttggtgtaa ggaggtgcgt ttcttggggc atgtagtctc aacagagggt ttagttgtgg 120 atcccgctaa gatagtggta gtacaagatt ggaaggtccc caaaaacgct accaaagtta 180 gaagcttcca aggtttaggt agttattata tgaagtttat cgaagatttt gctaagattt 240 cagcacttga ggttaagcct actctcatag atcagattgg cacaaggcag cgagaggatt 300 cagagcttgt ggatattctg gataggatta gcagaagaga ggtctctaga catctccaat 360 gttattccat cgatggtaaa gggtggctaa ggagagatgg aagattttgt gttccccgca 420 ctagtgattt gatgaaagca gttctagcag aagcacacca ttctgaatga ctattcatcc 480 gagtgatgat aagatgtata gggacatgaa aagagtgttt tgttggagtg gcatgaagaa 540 ggacgtagca gagtttgtgg ctaagtatct tgtattacaa agagtcaagg cgaagcagta 600 gaggcctggc ggattaattc aaccattgaa tgtacccaaa tggaagtatg atggtgtttc 660 ggtagacttc ataaatggtt tactctgata taggaagggg aataccatta ttgttgttat 720 cacttctttg actgttgttg ttgtgattag agtaacggaa atatcatttt actgcagtat 780 gtccaatctt ttcacaaatt tggcattttg gtctgttgtt gtatctgcct cttccctc 838 <210> 3 <211> 443 <212> DNA <213> jnurf10 <400> 3 acaactgggg gatgttaatg ccctaaatct tcttgattac ctcaccaaag ctgattttga 60 agtcctaatg aaggaacaac tcctgatgaa ggaactgctt gatagctatc aatagctcaa 120 tcagcaaata tatgccaata ttgacttgat taacagctga aagactaatg tatcaagata 180 aggagagagc cctctccata ctccgggtca gagaactcct cttcatctga cgactgtcat 240 aggaatagat ggcacaagac ggatgcatat aaaggtagaa tcttaaagag aactaaaagg 300 ctgactacca ttgttctaca tggatcggca ccgaaccctc caatcaagga ggagccatca 360 agctagtgga ggaactaact ctgaacacat cacgactgat caaggcatag gaacttaggc 420 aaatgtgaat gggccccagt tgt 443 <210> 4 <211> 675 <212> DNA <213> jnurf17 <400> 4 aagcgagccc actgctattg aggattctat tgataaggca atataggcac ttaaaagaaa 60 aacgagtgac aattcttttg tggatattcc acttccttcc ctaatgaaaa tcctaagtcg 120 gtgggtgatt acccatgtta ttgtgaaaga ggaggcacat gtgaatattg actcaagcca 180 ttatattgtc aatctggaat ctcttgggca aaaagtttca agaataatat gaggtggctt 240 attctttaga tcccctcctt aggatttctc ttcctacttc tctaatagct cttagtttct 300 tatatgttaa tcttggtctg cctccttttc caaatgatcc tcttccttca atagcctagg 360 cccgctctcc ggtggcaagt tttgatgatc ttattcgatt ggctatgcaa tctcctttta 420 ttacctctct cgagtcatca caacctttaa tttattccaa ggatcatttt ttcattattc 480 ttaaacaact cttatcggta tgtactatat ttccttttgt ttattaaatt tttagccttt 540 tagatctcat tattacttag gcttgctata cattccaggt aggaaagcat atatttcttc 600 ttcaagaggc ttcttaaagg ccttttagtg aagtggtcga gctcaaagga cggatctctt 660 tgattaatca tagta 675 <210> 5 <211> 1014 <212> DNA <213> jnurf20 <400> 5 ggtgctccgt tgccggtgaa gatggcatgt gggagatcaa attgacagat aatgttgcgt 60 accacaaagt tgatcgcttt ctttgttatg atagtagcaa ggggctcaga ttccgcccat 120 ttggtaaagt aatcaactgc aacgatgatg tactttgcaa cacctttggc taaaggtaga 180 aaaccaataa tgtcaatgcc ctatattgaa aatgaccatg gactgaccat ctgagttatt 240 tcgataggtg gggctcttgg aattcgagca tgtttatgac atctattaca ttttctagct 300 taatccgatg catcacgatt tacagtcagc caataatatc catgacggag cactttcttg 360 aatccattct aaatagtgaa ccgcgaagcc tttcgaagaa cttgcctttt tttactccta 420 cgctcctaca ggtacccttg ctcgagatag tttttgaacg gggtcatcca tgactcctta 480 tcgagaatga cttcaaatac gcagtccatt tccatctgat cgatgcttgg ggaagataat 540 gtctccacgg gaacgattgt catttgctat acctcacctg tactagctaa ctttgccagg 600 gaatcggcct tctgattact tttttggagt atgcaataga tggcataata atcgaaatgg 660 ttcaatattt cctgaacccg gacaagataa tcagccagcc ttcggtcttt ggcctggtac 720 tccccctgaa tttgacacac gacaaattgt gaatcatagt aaatctccac aataataatt 780 cttaaatctc tgacaaatct taatacgatg agccaggctt tgtattcggc ctcgttgctt 840 gtcgcatgaa aattaaactt taaggcatag cagatagatt ggccttcaag agtttcaact 900 acaactccgc cgcctgagaa catcatctag gtcaaaatgg atatgtacga aagtatctct 960 tacgaaatta ataaaaataa gtttggggaa aattgatggt ttcagaacca tcta 1014 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> forward primer for jnurf05 <400> 6 aacaaatcaa tcgcctgaaa a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer for jnurf05 <400> 7 attatggccg atttctcagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for jnurf06 <400> 8 ggttcttcgc aaagttctcg 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> reverse primer for jnurf06 <400> 9 tgtgaaaaga ttggacatac tgc 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> forward primer for jnurf10 <400> 10 cctcaccaaa gctgattttg a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer for jnurf10 <400> 11 tgccttgatc agtcgtgatg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for jnurf17 <400> 12 gagcccactg ctattgagga 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> reverse primer for jnurf17 <400> 13 cctggaatgt atagcaagcc taa 23 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> forward primer for jnurf20 <400> 14 ggtgaagatg gcatgtggga gatcaaa 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> reverse primer for jnurf20 <400> 15 tagatgatgt tctcaggcgg cggagtt 27

Claims (20)

  1. 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-가임(Male-fertility) 선별용 핵산분자.
  2. 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-가임(Male-fertility) 선별용 핵산분자.
  3. 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-가임(Male-fertility) 선별용 핵산분자.
  4. 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-가임(Male-fertility) 선별용 핵산분자.
  5. 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-가임(Male-fertility) 선별용 핵산분자.
  6. 다음의 단계를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법:
    (a) 양파의 gDNA(genomic DNA)을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 gDNA 중 서열목록 제1서열 내지 서역목록 제5서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 단계;
    상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 경우, 서열목록 제6서열 및 제7서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 DraⅠ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다, (1-ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 888 bp(base pair)인 제1분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (1-ⅱ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 519 bp인 제2분해물 및 크기가 378 bp인 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하며, (1-ⅲ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제1분해물, 상기 제2분해물 및 상기 제3분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다;
    상기 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 경우, 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 TaqⅠ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다, (2-ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 425 bp인 제4분해물 및 크기가 150 bp인 제5분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (2-ⅱ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제4분해물 및 크기가 341 bp인 제6분해물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하며, (2-ⅲ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제4분해물, 상기 제5분해물 및 상기 제6분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다;
    상기 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 경우, 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 PvuⅡ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (3-ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 251 bp인 제7분해물 및 크기가 117 bp인 제8분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (3-ⅱ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 368 bp인 제9분해물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하며, (3-ⅲ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제7분해물, 상기 제8분해물 및 상기 제9분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다;
    상기 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 경우, 서열목록 제12서열 및 서열목록 제13서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 XhoⅠ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다, (4-ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 575 bp인 제10분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (4-ⅱ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 427 bp인 제11분해물 및 크기가 148 bp인 제12분해물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하며, (4-ⅲ) 상기 PCR 산물의 절단 후 상기 제10분해물, 상기 제11분해물 및 상기 제12분해물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다;
    상기 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 경우, 서열목록 제14서열 및 서열목록 제15서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물을 전기영동을 통해 밴드 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다, (5-ⅰ) 상기 PCR 산물의 절단 후 크기가 915 bp인 제13산물이 존재하는 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (5-ⅱ) 상기 제13산물이 존재하지 않는 경우에는 웅성-불임으로 판단한다.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 분석은 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), PCR(Polymerase Chain Reaction), RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), RFLP(Restriction Fragment Lennth Polymorphism), DAF(DNA Amplification Fingerprinting), AP-PCR(Arbitrarily primed PCR), PCR-SSCP(Single-strand Conformation Polymorphism), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), ISSR(Inter-simple Sequence Repeat Amplication), STS(Sequence Tagged Site), EST(Expressed sequence tag), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), DNA 시퀀싱, 마이크로어레이(Microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern Blot) 또는 서던 블럿(Southern blot)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 분석은 CAPS 또는 PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제1서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제1서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머; 및 (c) 제한효소 DraⅠ을 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제6서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제7서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  13. (a) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제2서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제2서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머; 및 (c) 제한효소 TaqⅠ을 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제8서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제9서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  15. (a) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제3서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제3서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머; 및 (c) 제한효소 PvuⅡ을 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제10서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제11서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  17. (a) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제4서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제4서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머; 및 (c) 제한효소 XhoⅠ을 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제12서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제13서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  19. (a) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제5서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제5서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 정?향 프라이머는 서열목록 제14서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제15서열인 것을 특징으로 하는 키트.
KR1020120138123A 2012-11-30 2012-11-30 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법 KR101471029B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120138123A KR101471029B1 (ko) 2012-11-30 2012-11-30 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120138123A KR101471029B1 (ko) 2012-11-30 2012-11-30 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140070073A KR20140070073A (ko) 2014-06-10
KR101471029B1 true KR101471029B1 (ko) 2014-12-09

Family

ID=51125055

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120138123A KR101471029B1 (ko) 2012-11-30 2012-11-30 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101471029B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101871806B1 (ko) * 2017-09-01 2018-06-28 주식회사 에프앤피 유채의 웅성불임성 회복 유전자형 판별용 마커 및 이를 이용한 판별방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100435152B1 (ko) * 2001-06-25 2004-06-14 대한민국 Ｐｃｒ－ｒｆｌｐ를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별방법
KR20070030598A (ko) * 2005-09-13 2007-03-16 대한민국(관리부서:농촌진흥청) Ｒａｐｄ 표지인자를 이용한 양파의 웅성불임회복 유전자판별 방법
KR20100026082A (ko) * 2008-08-29 2010-03-10 전남대학교산학협력단 신규한 양파 웅성불임 세포질 특이적 키메라 유전자와 이를이용하여 개발된 상기 양파 계통 식물체 선발용 ｄｎａ 표지 인자
KR20120074956A (ko) * 2010-12-28 2012-07-06 전남대학교산학협력단 양파의 웅성불임 다형성 마커

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100435152B1 (ko) * 2001-06-25 2004-06-14 대한민국 Ｐｃｒ－ｒｆｌｐ를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별방법
KR20070030598A (ko) * 2005-09-13 2007-03-16 대한민국(관리부서:농촌진흥청) Ｒａｐｄ 표지인자를 이용한 양파의 웅성불임회복 유전자판별 방법
KR20100026082A (ko) * 2008-08-29 2010-03-10 전남대학교산학협력단 신규한 양파 웅성불임 세포질 특이적 키메라 유전자와 이를이용하여 개발된 상기 양파 계통 식물체 선발용 ｄｎａ 표지 인자
KR20120074956A (ko) * 2010-12-28 2012-07-06 전남대학교산학협력단 양파의 웅성불임 다형성 마커

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140070073A (ko) 2014-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sargent et al. A microsatellite linkage map for the cultivated strawberry (Fragaria× ananassa) suggests extensive regions of homozygosity in the genome that may have resulted from breeding and selection
Tamura et al. Identification of self-incompatibility genotypes of almond by allele-specific PCR analysis
JP5281392B2 (ja) エリートイベントａ５５４７−１２７、ならびに生物サンプル中の該イベントを同定するための方法およびキット
CN108366539B (zh) 与大豆的疫霉根腐病相关联的遗传基因座
JP2021502096A (ja) 新規な粉質胚乳遺伝子、分子マーカー及びその用途
Campbell et al. Development of co-dominant amplified polymorphic sequence markers in rice that flank the Magnaporthe grisea resistance gene Pi7 (t) in recombinant inbred line 29
i Martí et al. The almond Sf haplotype shows a double expression despite its comprehensive genetic identity
KR101471029B1 (ko) 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법
KR20160096755A (ko) 토마토 잎곰팡이병 저항성 선별용 분자마커 및 그를 이용한 선별방법
JP4581101B2 (ja) Ｄｎａマーカーを用いるパパイアの性識別方法
KR102154701B1 (ko) 수박 왜성 개체 선발용 신규 유전자 마커 및 이의 이용
KR101961855B1 (ko) 식물의 화분 발달에 관여하는 phd 유전자 및 이를 이용한 유전자적 웅성불임성의 판별방법
JP2000139465A (ja) イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子近傍に位置するｄｎａマーカーおよびこれを用いた細胞質雄性不稔回復遺伝子の判別方法
Heng et al. Identification of S-genotypes and novel S-RNase alleles in Prunus mume
KR101500613B1 (ko) 벼 유전자원 판별방법 및 아밀로스 함유 벼 판별용 프라이머
KR101639764B1 (ko) 변이 폴리뉴클레오타이드 및 이를 이용한 벼 유전자원 판별방법
KR102261419B1 (ko) 토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 caps 마커 및 이의 용도
CN114854712B (zh) 玉米ZmWAK02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用
KR102141619B1 (ko) 신규한 분질배유 유전자
CN114717350B (zh) 水稻株型的分子标记及其应用
KR102380677B1 (ko) 오이 흰가루병 저항성 개체 선별용 마커 및 이를 이용한 선별 방법
JPH09313187A (ja) イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子の近傍に位置するｄｎａマーカーおよびｄｎａ診断法
WO2023176983A1 (ja) コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方に関する分子マーカー、及びその利用
EP3690064B1 (en) Determination method for onion
KR101785084B1 (ko) 노균병 저항성 양파 선별용 마커

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant