KR102261419B1 - 토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 caps 마커 및 이의 용도 - Google Patents

토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 caps 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 CAPS 마커는 해충 저항성에 중요한 역할을 하는 모용체가 있는 토마토 식물체와 모용체가 없는 토마토 식물체를 정확하게 구별할 수 있으므로, 토마토의 분자육종 연구 및 해충 저항성 토마토의 육종 산업에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도{CAPS marker for discriminating presence or absence of trichome in tomato plant and uses thereof}
본 발명은 토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
모용체(털, trichome)는 식물 표피세포의 변형된 형태로서 식물의 종류에 따라 그 형태가 매우 다양하며 주로 자외선, 곤충, 증산(蒸散) 등으로부터 식물을 보호하는 역할을 한다. 식물 호르몬 중에서 자스몬산(jasmonic acid)이 털의 발달에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 모용체 발달의 시작 후 모용체의 크기와 형태를 갖추기 위해 내재복제(endoreduplication)와 세포골격(cytoskeleton) 유전자가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 한 개의 세포로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물체의 모용체와 달리 토마토(Lycopersicon esculentum)를 포함한 가지과(Solanaceae) 식물은 여러 형태의 털을 가지고 있고 이들 각각은 여러 개의 세포로 이루어져 있다. 토마토 모용체의 경우 기저 세포(base cell) 및 자루 세포(stalk cell)의 수와 정단 세포(tip cell)의 head 유무에 따라 형태학적으로 선모(glandular trichome, head cell이 있음; type I, IV, VI, VII)와 비선모(non-glandular trichome, head cell이 없음; type II, III, V)로 나뉘어 진다. 토마토의 선모는 병충해 저항성 물질인 다양한 종류의 이차대사물질을 합성 및 저장하고, 비선모는 물리적 장벽(physical barrier)의 역할을 하여 곤충의 접근을 방해하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 type I과 IV는 아실 글루코오스(acyl glucose)와 아실 수크로오스(acyl sucrose), type VI는 테르페노이드(terpenoid)와 플라보노이드(flavonoid)를 많이 합성하는데, 특히 type VI의 head 크기가 가장 크고 가장 많이 분포하고 있어 type VI에서 합성되는 이차대사물질에 대한 연구가 활발하다.
토마토의 해충 저항성 관련 연구를 통해 모용체가 파밤나방 애벌레(Spodoptera exigua), 박각시나방 애벌레(Manduca sexta) 등에 대해 물리적 및 화학적 방어의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 모용체의 기능에 대한 연구는 많이 알려져 있으나 모용체의 발달에 관여하는 유전자나 이와 연관된 유용마커의 개발이 미비하므로, 토마토 모용체 돌연변이를 활용하여 다양한 모용체 유전자원을 확보하고 이들로부터 모용체 관련 유전자의 동정과 분자 마커의 개발이 절실하다.
한편, 한국등륵특허 제1673431호에는 애기장대 유래 At3g54390 유전자의 '모상체 특이적 프로모터'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1745071호에는 '잎곰팡이병 저항성 토마토 판단용 SNP 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토마토 줄기에 모용체가 거의 없는 host(hairless on stems) 돌연변이체와 모용체를 가지고 있는 야생 토마토인 솔라눔 핌피넬리폴리움(Solanum pimpinellifolium)을 교잡하여 얻어진 F2 집단을 이용하여 Host 유전자와 매우 가깝게 연관된 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences) 마커를 개발하였고, 상기 개발된 CAPS 마커를 이용하여 PCR을 수행한 결과 증폭 산물의 크기를 통해 모용체가 있는 토마토 식물체와 모용체가 없는 토마토 식물체를 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 토마토 식물체의 모용체(trichome) 유무 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는 토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 토마토 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 제한효소 절단 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 토마토 식물체의 모용체 유무를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 CAPS 마커는 해충 저항성에 중요한 역할을 하는 모용체가 있는 토마토 식물체와 모용체가 없는 토마토 식물체를 정확하게 구별할 수 있으므로, 토마토의 분자육종 연구 및 해충 저항성 토마토의 육종 산업에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 야생형 토마토(Solanum pimpinellifolium, WT) 및 모용체가 없는 돌연변이 토마토 식물체(host)의 잎(leaf), 줄기(stem) 및 하배축(hypocotyl)을 대상으로 동결 전자현미경법(Cryo-scanning electron microscope, Cryo-SEM)을 수행하여 모용체 존재 유무를 관찰한 사진(A) 및 모용체 type Ⅰ의 길이를 측정하여 나타낸 그래프(B)이다.
도 2는 host(hairless on stems) 돌연변이체의 염색체 9번에 대한 유전자 지도에서 본 발명의 분자마커(표 1) 위치를 나타낸 그림이다. 괄호 안의 숫자는 재조합 빈도를 의미하며, 모용체가 없는 형질을 나타내는 Host 유전자는 Solyc09g074970과 Solyc09g075360 마커 사이에 위치한다.
도 3은 host 돌연변이체 및 야생형 토마토(S. pimpinellifolium)의 게놈 서열 간 단일염기다형성(SNP)과 상기 SNP 위치 염기를 포함하는 제한효소 EcoRV의 인식자리를 나타낸 그림(A)과 본 발명의 CAPS 마커를 이용하여 host 돌연변이체, 야생형 토마토, F2 집단 중 모용체가 없는 토마토 및 모용체가 있는 토마토를 대상으로 PCR을 수행한 결과이다. 410 bp 크기의 증폭 산물: 동형접합(homozygosis) 상태의 Host 열성 대립유전자를 가지는 모용체가 없는 F2 토마토 식물체, 132/278 bp 크기의 증폭 산물: 동형접합 상태의 Host 우성 대립유전자를 가지는 모용체가 있는 F2 토마토 식물체, 410/132/278 bp 크기의 증폭 산물: 이형접합(heterozygosity) 상태의 Host 우성 대립유전자를 가지는 모용체가 있는 F2 토마토 식물체.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 토마토 식물체의 모용체(trichome) 유무 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 9 및 10의 서열 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 9의 프라이머(22개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 9의 서열 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 9 및 10의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 9로 나타낸 염기서열은 정방향 프라이머를 나타내며, 서열번호 10으로 나타낸 염기서열은 역방향 프라이머를 나타낸다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 바람직하게는 CAPS 프라이머 세트이다. 상기 용어 "CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)"는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 단형성 PCR(Polymerase chain reaction) 산물에 제한효소를 처리하여 생성된 다형성 단편을 의미한다. 사전에 품종 간 염기서열의 차이가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 표지에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차이가 없으나, 유전자 내부의 서열은 다르기 때문에 그 서열의 차이를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 품종과 절단되지 않는 DNA를 보유한 품종과의 차이를 구별할 수 있으며, 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는 토마토 식물체의 모용체 유무 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 상기 제한효소는 바람직하게는 EcoRV일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
토마토 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
상기 제한효소 절단 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 토마토 식물체의 모용체 유무를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 토마토 식물체의 모용체 유무를 판별하는 방법에 있어서, 상기 토마토 식물 시료는 토마토 식물체의 잎, 줄기 또는 하배축(hypocotyl) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 토마토 식물체의 모용체 유무를 판별하는 방법에 있어서, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하면 모용체가 거의 없는 host 돌연변이 토마토 식물체와 야생형 토마토(Solanum pimpinellifolium)의 F2 집단의 모용체 유무를 판별할 수 있다. 야생형 토마토의 줄기에는 type I, VI 및 V의 모용체가 다량 존재하는 반면, 본 발명에서 사용된 host 돌연변이체의 줄기에는 야생형 토마토와 비교하여 다양한 타입(예컨대, type I, type V)의 모용체가 확인되지 않으며, type VI의 모용체가 면적 1cm2 당 1~2개로 매우 적은 수로 존재하고 있어, 동일 면적 1cm2 당 2,000개의 type VI의 모용체가 존재하는 야생형 토마토와 비교하였을 때 host 돌연변이체는 줄기에 거의 모용체가 없는 토마토 식물체인 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하면 바람직하게는 토마토의 줄기 부분에 존재하는 모용체의 유무를 판단할 수 있다.
본 발명의 방법은 토마토 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 토마토 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명에서 용어, "제한효소"란 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 제한효소는 바람직하게는 EcoRV일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 토마토 식물체의 모용체 유무를 판별하는 방법에 있어서, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물이 제한효소 EcoRV 처리에 의해 절단되면 모용체가 있는 토마토로 판별될 수 있고, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물이 EcoRV 제한효소 처리에 의해 절단되지 않으면 모용체가 없는 토마토로 판별될 수 있다(도 4 참고).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료 및 재배 조건
host(hairless on stems) 돌연변이체의 종자(seed number: n7242)는 Dr. Dani Zamir(The Hebrew University of Jerusalem, 이스라엘)에서, 야생형 토마토(S. pimpinellifolium) 종자(LA1589)는 C.M. Rick Tomato Genetics Resource Center(University of California, 미국)에서 제공받았다. 종자는 지피 포트(jiffy pot; Hummert International, 미국)에 파종하여 생장상(growth chamber) 안에서 재배하였다. 재배 조건은 27℃에서 17시간 명배양과 18℃에서 7시간 암배양의 주기로 설정하였고 습도는 60%로 유지하였다.
2. host 돌연변이체의 유전자지도 작성 및 Host 유전자 관련 CAPS 분자마커 개발
host 돌연변이체와 야생형 토마토를 교배하여 F1을 만들고, 이를 자가수분하여 F2 집단을 확보한 후 토마토의 유전체 서열 정보를 이용하여 host의 유전자 지도 작성을 수행하였다. 구체적으로 F2 집단의 211 개체를 이용하여 모용체 표현형(줄기의 모용체 유무)을 관찰하고, PCR 기반의 COS(conserved ortholog set) 표지와 S. pimpinellifolium 및 S. lycopersicum 간에 상동성을 가진 유전자의 DNA 염기서열을 비교함으로써 새로운 PCR 기반의 마커를 개발(Tomato-EXPEN 2000 map; http://solgenomics.net)한 후(표 1), 상기에서 관찰된 F2 집단의 각 개체별 표현형과 상기 PCR 기반의 마커에 의해 증폭된 DNA 크기 차이를 이용한 유전자형 분석을 통해, map-based cloning을 수행하여 Host 유전자의 위치를 확인하였다. 그리고 상기 Host 유전자 정보와 PCR 기반 마커간의 유전자 빈도를 계산하여 Host 유전자 지도를 작성하였다.
그리고, Host 유전자가 host 돌연변이체 염색체 9번의 Solyc09g074970 마커와 Solyc09g075360 마커 사이에 위치함을 확인한 후(도 2), 상기 두 마커 사이에 존재하는 Solyc09g075270 마커 주변부를 기준으로 하여 host 돌연변이체와 S. pimpinellifolium의 게놈 서열 간의 SNP에 기반한 CAPS 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트(서열번호 9 및 10)를 제작하였다.
Figure 112020045803871-pat00001
3. 모용체 형태 및 길이
모용체 유무와 길이를 조사하기 위해서 조직 동결 및 고정에 필요한 DEBEN coolstage(Deben, 영국)가 장착된 탁상 현미경 TM3030plus(Hitachi High-Technologies Corporation, 일본)를 사용하여 동결 전자현미경법(Cryo-scanning electron microscope, Cryo-SEM)을 수행하였다. 모용체의 표면 전하를 최소화하기 위해 15 kV로 관찰하였고, 이미지는 응용 프로그램 소프트웨어 TM3030plus(ver. 01-05-02)를 사용하여 Photoshop Imaging Suite로 얻었다. 모용체 길이는 type I 모용체의 base cell부터 head 끝부분까지 측정하였다.
host 돌연변이체 및 야생형 토마토의 잎, 줄기 및 하배축에 존재하는 모용체를 관찰한 결과, host 돌연변이체의 잎 및 하배축과 야생형 토마토의 잎, 줄기 및 하배축에는 다양한 타입(type Ⅰ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ)의 모용체들이 존재하였으나, host 돌연변이체의 줄기에서는 타입 Ⅵ의 모용체만 존재하는 것을 확인하였다(도 1A). 또한, host 돌연변이체 및 야생형 토마토의 타입 Ⅰ 모용체의 길이를 측정한 결과, 야생형 토마토에 비해 host 돌연변이체의 잎 및 하배축에 존재하는 타입 Ⅰ 모용체의 길이가 각각 69%, 56% 정도 감소한 것을 확인하였다(도 1B).
4. PCR 분석
host 돌연변이체, 야생형 토마토(S. pimpinellifolium) 및 host 돌연변이체×야생형 토마토의 F2 개체를 대상으로 상기 표 1의 마커를 이용하여 PCR(T100™ Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국)을 수행하였고, 2㎕ cDNA 주형, 각각 1㎕의 10 μM 프라이머 및 10㎕의 Solg™ 2X Taq PCR Smart mix 2(Solgent, 한국)를 혼합하여 총 20㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 전변성 95℃ 2분; 변성(denaturation) 95℃ 20초, 결합(annealing) 60℃ 40초, 신장(extension) 72℃ 30초~3분의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. CAPS 마커의 경우 증폭 산물 10 ㎕에 해당 제한효소 EcoRV를 0.3 ㎕를 첨가하고 37℃에서 5시간 이상 배양하였다. 증폭 산물은 2~3% 아가로스 겔에서 분리하였다.
실시예 1. 토마토 모용체 발달에 관여하는 Host 유전자 연관 마커의 개발
host 돌연변이체 및 야생형 토마토 F2 집단의 211 개체로부터 모용체 유무를 조사한 결과, F2 155 개체에서는 줄기에 모용체가 존재하고 F2 56 개체에서는 줄기에 모용체가 존재하지 않음을 확인하였으며, F2 집단 내 모용체 유무의 비율이 약 2.8:1로 Host 유전자가 열성 유전자임을 확인하였다. 상기에서 관찰된 F2 집단의 표현형과 상기 표 1의 마커를 이용하여 Host의 유전자지도를 작성하였다. 이를 통해, Host 유전자가 host 돌연변이체 염색체 9번의 Solyc09g074970과 Solyc09g075360 마커 사이에 위치하고, 두 마커간의 유전적 거리가 1.9 cM임을 알 수 있었다. 상기 Solyc09g074970과 Solyc09g075360 사이에 존재하는 마커는 'Solyc09g075270'으로, F2 211 개체에서 재조합이 일어나지 않음을 확인하였다(도 2).
상기 Solyc09g075270 마커 주변부를 기준으로 하여 host 돌연변이체와 S. pimpinellifolium의 게놈 서열 간의 SNP 기반 CAPS 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트(서열번호 9 및 서열번호 10)를 제작하였고, 상기 CAPS 마커는 제한효소 EcoRV를 이용하여 야생형 토마토(S. pimpinellifolium) 게놈 서열에서 다형성을 보이는 SNP의 탐지가 가능한 분자마커로, 5'-GATATC-3'의 염기서열을 인식하여 절단하는 제한효소 EcoRV로 인해 SNP 염기가 'A'인 야생형 토마토의 PCR 증폭 산물은 2개의 절편(132 bp 및 278 bp)으로 절단되고, host 돌연변이체에는 제한효소 인식자리가 존재하지 않아 410 bp 크기의 단일 절편만을 가지고 있어 모용체가 없는 토마토 식물체와 모용체가 있는 토마토 식물체의 구별이 가능하다(도 3A).
이를 검증하기 위해 본 발명의 CAPS 마커를 host 돌연변이체, 야생형 토마토, F2 집단 내 모용체가 없는 토마토 및 모용체가 있는 토마토에 적용한 결과, host 돌연변이체 및 모용체가 없는 F2 토마토 식물체에서는 410 bp 크기의 증폭 산물을 생성하였으나, 야생형 토마토 및 모용체가 있는 F2 토마토 식물체에서는 132/278 bp 크기의 증폭 산물을 생성하였다(도 3B).
그리고, 모용체가 있는 F2 개체 중에서 132/278 bp 및 410 bp 크기의 증폭 산물이 생성된 개체가 있었는데, 이는 F2 집단의 표현형 비율이 약 3:1이고 Host 유전자가 열성 유전자인 점을 통해 설명할 수 있다. 구체적으로, host 돌연변이체의 유전자형을 hh(열성 동형접합 유전자형), 야생형 토마토의 유전자형을 HH(우성 동형접합 유전자형)라고 했을 때 이들 F1의 유전자형은 Hh이고, F1의 자가교배에 의해 생성된 F2의 유전자형은 HH, Hh 및 hh임을 알 수 있다. F2 개체 중 우성 이형접합 유전자형(Hh)를 가지는 개체의 경우 하나의 대립 유전자는 제한효소 인식자리가 존재하지 않고 다른 하나의 대립 유전자에는 제한효소 인식자리가 존재하기 때문에 132/278 bp 및 410 bp 크기의 증폭 산물이 모두 생성될 수 있는 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> CAPS marker for discriminating presence or absence of trichome in tomato plant and uses thereof <130> PN20049 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagacgatga acttgaaatg tcatg 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 taagaatcaa gctgtttcaa tctgc 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atttacgaat tagtatcgtt ggatgg 26 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 accatgacat accgcaatgt ac 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aatgcagatc ccttggcgg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 accgtgacca tttgtgtggc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tactagtgta tgatgtgtta aggg 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atggtgttaa caaagtaggc ctc 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tcgagcaaac cttgaatatg gg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aatcctacct gattctgacg ac 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgacatgttt agttgtaaag ggag 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aacccaagtt caggattcta cc 22

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 EcoRV 제한효소를 포함하는 토마토 식물체의 모용체(trichome) 유무 판별용 키트.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 토마토 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭 단계의 산물을 EcoRV 제한효소로 절단하는 단계; 및
    상기 제한효소 절단 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 토마토 식물체의 모용체(trichome) 유무를 판별하는 방법.
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