KR20160098900A - 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트, 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법, 및 잎마름역병 저항성 토마토 판단키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍, 및 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트, 그를 이용한 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법, 및 잎마름역병 저항성 토마토 판단키트를 제공한다. 본 발명은 잎마름역병 저항성 토마토를 판단할 수 있어, 육종 등에 활용할 수 있다는 효과를 갖는다.

Description

잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트, 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법, 및 잎마름역병 저항성 토마토 판단키트{Primer set to judge tomato resitant to late blight disease, Method to judge tomato resitant to late blight disease, and Kit to judge tomato resitant to late blight disease}

본 발명은 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트, 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법, 및 잎마름역병 저항성 토마토 판단키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 잎마름역병 저항성 관련 유전자를 갖는 토마토를 판단할 수 있는 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트, 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법, 및 잎마름역병 저항성 토마토 판단키트에 관한 것이다.

토마토 잎마름역병(Late blight)은 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 의해 발생하며, 19세기 기아의 원인이 되었던 아일랜드 대기근으로 유명한 감자역병과 동일한 병원균이다(Song et al. 2003). 이런 역병은 감자와 토마토에서 빈번하게 발생하며, 매년 수십억 달러의 막대한 손실을 주고 있으며, 토마토 재배에서 큰 문제가 되고 있는 병해 중 하나이다(Kamoun 2001). 일반적으로 역병 방제는 살균제를 사용하지만 농약 값이 비싸고, 인간과 환경에 부정적인 영향을 미칠 뿐 아니라, 농약에 대한 병원체의 내성을 갖는 등의 문제점이 있다(Abreu et al. 2008; Goodwin 1996; Zhang et al. 2014). 따라서, 토마토 잎마름역병과 같은 질병에 대해 내병성을 갖는 토마토 품종육성을 위해서는, 토마토 잎마름역병에 내병성을 갖는 토마토를 판단하는 기술 개발이 필요하다.

잎마름역병 저항성 Ph3는 염색체 9번에 위치해 있으며(Chunwongse et al. 2002), 최근 연구에서는 Coiled-coil nucleotide-binding leucine-rich repeat (CC-NBS-LRR) protein으로 동정되었다(Zhang et al. 2014). 토마토잎마름역병에 대한 저항성과 관련된 유전자로 알려진 Ph3 등에 대한 연구와, 그와 같은 유전자를 보유하는 토마토 판단 기술 개발이 필요한 실정이다.

한편, 단편증폭다형성서열(CAPS; Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 분석은 유전적 마커 분석을 위한 기술로, RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)와 같이 보다 빠른 분석을 위해 PCR을 이용하는 방법이다. 이 방법은 내병성을 갖는 개체(품종)와 이병성을 갖는 개체(품종)간 유전적 차이에 의해 제한효소 처리 위치를 만들거나 없애게 되는 경우, 이와 같은 차이를 소화(digestion)에 의해 생성된 DNA 절편의 길이로부터 알 수 있다는 논리에 근거한다.

또한, HRM(High Resolution Melting) 분석은 PCR 수행시 intercalating fluorescent dye를 첨가하여 PCR 과정에서 생성되는 앰플리콘(amplicon)에 결합시키고, 이후 온도 상승을 시켜 타겟 부위의 염기서열에 따라서 각기 다른 형태로 나타나는 fluorescence signal의 변화특성을 분석하는 방법이다. 이와 같은 방법은 PCR 타겟 부위에서의 변이를 보다 빠르고 손쉽게 구별할 수 있다.

토마토 품종 육성에 이와 같은 병저항성 유전자와 CAPS 분석, HRM 분석 등을 활용함으로써, 품종 선발 효율을 극대화시키고 육종연한을 단축할 수 있으므로, 관련 기술 개발이 필요한 실정이다.

Abreu FB, da Silva DJH, Cruz CM and Mizubuti ESG (2008) Inheritance of resistance to Phytophthora infestans (Peronosporales, Pythiaceae) in a new source of resistance in tomato (Solanum sp. (formerly Lycopersicon sp.), Solanales, Solanaceae). Genetics and Molecular Biology 31:493-497 Chunwongse J, Chunwongse C, Black L and Hanson P (2002) Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77:281-286 Goodwin SB, Sujkowski SL and Fry WE (1996) Widespread distribution and probable origin of resistance to metalaxyl in clonal genotypes of Phytophthora infestans in the United States and Western Canada. Journal Phytopathology 86:793-800 Kamoun S (2001) Nonhost resistance to Phytophthora: novel prospects for a classical problem. Current Opinion Plant Biology 4:295-300 Song J, Bradeen JM, Naess SK, Raasch JA, Wielgus SM, Haberlach GT, Liu J, Kuang H, Austin-Phillips S, Buell CR, Helgeson JP and Jiang J (2003) Gene RB cloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potato late blight. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100:9128-9133 Zhang C, Liu L, Wang X, Vossen J, Li G, Li T, Zheng Z, Gao J, Guo Y, Visser RG, Li J, Bai Y and Du Y (2014) The Ph-3 gene from Solanum pimpinellifolium encodes CC-NBS-LRR protein conferring resistance to Phytophthora infestans. Theoretical and applied genetics 127:1353-1364

본 발명이 해결하려는 하나의 과제는 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하려는 또 하나의 과제는 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하려는 다른 하나의 과제는 잎마름역병 저항성 토마토 판단키트를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍, 및 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트는, 서열번호 5의 염기서열 중 434번째 염기를 기준으로, 상기 서열번호 5의 염기서열에 대응하는 토마토 시료의 게놈 DNA 염기서열에서 상기 434번째 염기에 대응하는 대응위치에서 상기 기준이 되는 염기와 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위한 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍은 토마토의 단편증폭다형성서열(CAPS)의 증폭을 위한 것이고, 상기 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍은 하이레졸루션멜팅(High resolution melting)분석을 위한 것일 수 있다.

상기 토마토의 단편증폭다형성서열(CAPS)은 서열번호 6의 염기서열을 갖는 CAPS 마커에 포함되는 것일 수 있다.

상기 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍은 HRM 마커 증폭을 위한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 프라이머세트를 이용하여 잎마름역병 저항성 토마토 여부를 판단하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법을 제공한다.

상기 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법은 (A1) 토마토 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 증폭한 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 시료처리물을 준비하는 시료처리단계, 및 (B1) 상기 제한효소로 절단하여 얻은 시료 처리물을 전기영동하여 얻어지는 패턴을 분석하는 패턴분석단계를 포함하거나, (A2) 토마토 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 증폭하여 시료처리물을 준비하는 시료처리단계; 및 (B2) 상기 (A2)단계의 시료처리물을 하이레졸루션멜팅 분석법에 의해 얻어지는 패턴을 분석하는 패턴분석단계를 포함할 수 있다.

상기 패턴분석은 표준 토마토 품종의 패턴과 비교 분석하는 것일 수 있다.

상기 표준 토마토 품종은 표 3에 기재된 30개 토마토 품종 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 프라이머 세트, 및 증폭반응수행시약을 포함하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트를 제공한다.

상기 키트는 제한효소를 더 포함할 수 있다.

상기 제한효소는 표 2에 기재된 제한효소일 수 있다.

상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다.

상기 키트는 형광염료를 더 포함할 수 있다.

상기 형광염료는 인터컬레이팅 형광염료(intercalating fluorescent dye)일 수 있다.

본 발명에 의해 잎마름역병 저항성 토마토를 판단할 수 있어, 육종 등에 활용할 수 있다는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예인 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법을 설명하기 위한 도이다.
도 2는 Ph3 유전자 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용한 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을 이용한 HRM 분석결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다. 또한, "및/또는"은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

"프라이머세트"는 복수의 프라이머를 의미한다. 또한, 프라이머세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다.

또한, "판단"은 잎마름역병 저항성 토마토 여부를 판단하는 의미로, 선별, 선택, 선발 등을 포괄하는 의미이다.

또한, "잎마름역병 저항성"은 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 대한 저항성을 포함하는 의미이다.

또한, "저항성"은 완전 저항성 뿐만 아니라, 불완전 저항성을 포함하는 의미이며, "불완전 저항성"은 하나의 저항성 유전자 만으로는 저항성을 나타내는 것이 완전하지는 않은 것을 의미한다.

또한, "저항성"은 이병성과 저항성을 함께 갖는 것도 포함하며, 표현형이 저항성인 것을 포함하는 의미이다.

본 발명의 일 실시예에 의한 프라이머세트는 표 1에 기재된 프라이머를 포함할 수 있다.

[표 1]

표 1에서, 프라이머세트는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 한 쌍으로 이루어진 프라이머쌍을 포함하여 이루어지며, F는 정방향, R은 역방향을 의미한다.

프라이머세트를 이루는 하나의 프라이머쌍(서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머)은 토마토의 단편증폭다형성서열(CAPS)의 증폭을 위한 것일 수 있으며, 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭된 CAPS가 제한효소에 의해 처리되고, 효소처리된 PCR산물은 특징적인 밴드 패턴을 나타내게 된다. 이와 같은 패턴을 분석하여, 토마토가 잎마름역병 저항성인지 여부를 판단할 수 있다. 일 예로, 토마토 시료가 보유하고 있는 잎마름역병에 대한 내병성 유전자(Ph) 또는 이병성 유전자(ph) 간의 밴드 패턴 차이로 부터 잎마름역병 저항성 토마토 여부의 판단이 가능한 것이다.

또한, 프라이머세트를 이루는 하나의 프라이머쌍(서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머)은 HRM 분석용일 수 있다. 후술하는 바와 같이, 프라이머를 이용한 HRM 분석에 의해, 토마토가 잎마름역병 저항성인지 여부를 판단할 수 있다. HRM 분석과 관련하여서는 후술하는 구체예 등을 통해 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예의 용도는 잎마름병 저항성 토마토 판단용일 수 있다.따라서, 본 발명의 다른 실시예는 본 발명의 일 실시예인 프라이머세트를 포함하는 잎마름병 저항성 토마토 판단용 조성물일 수 있다. 잎마름병 저항성 토마토는 잎마름병 저항성을 나타내는 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 것일 수 있다. 이 때, 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 5의 염기서열을 갖는 유전자는 예를 들어, 표 2에 기재된 제한효소에 의해 절단되는 절단부위를 갖는다. 따라서, 이와 같은 절단부위를 갖지 않는 이병성 유전자와 구분이 가능하게 된다.

[표 2]

이병성 유전자는 절단부위에서 저항성 유전자와 차이를 나타낸다. 절단부위는 서열번호 5의 염기서열 중 434번째 염기와 관련된다.

이와 같은, 서열번호 5의 염기서열 중 434번째 염기의 다형성을 이용하여, HRM 분석을 통해, 토마토 시료가 잎마름역병저항성인지 여부를 판단할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 실시예는 서열번호 5의 염기서열 중 434번째 염기를 기준으로, 상기 서열번호 5의 염기서열에 대응하는 토마토 시료의 게놈 DNA 염기서열에서 상기 434번째 염기에 대응하는 대응위치에서 상기 기준이 되는 염기와 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위한 것일 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 5의 염기서열에 대응하는 토마토 시료의 게놈 DNA 염기서열은 상기 서열번호 5의 염기서열과 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 98%이상 상동성을 나타내는 것일 수 있다.

잎마름역병 저항성 토마토 판단의 대상이 되는 토마토 품종(토마토 시료)은 이로써 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 표 3에 기재된 토마토 품종 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

[표 3] 토마토

프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이트 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

프라이머는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 헥산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 삽입물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있음은 물론이다.

프라이머세트에 의해 증폭의 대상이 되는 염기서열이 CAPS 마커일 수 있으며, CAPS 마커는 하기 표 4에 기재된 염기서열을 가질 수 있다.

CAPS 마커는 도 2에 도시된 바와 같이, CAPS를 가질 수 있다. 즉, 잎마름역병 저항성 토마토 또는 잎마름역병 이병성 토마토인지에 따라 나타나는 다형성에 의해, 제한효소에 의해 절단되거나 절단되지 않을 수 있다. 도 2는 프라이머세트를 설명하기 위한 도이다. 도에서 R은 잎마름역병 저항성 토마토의 유전자를 나타내고, S는 잎마름역병 이병성 토마토의 유전자를 나타낸다. 잎마름역병 저항성 토마토의 유전자는 MspI과 같은 제한효소에 의한 절단 부분(CCG)을 갖고, 잎마름역병 이병성 토마토의 유전자는 저항성과 달리 이와 같은 제한효소에 의한 절단 부분을 갖지 않는다.

이는 서열번호 5의 염기서열 중 434번째 염기를 기준으로, 상기 서열번호 3의 염기서열에 대응하는 토마토 시료의 게놈 DNA 염기서열에서 상기 434번째 염기 대응위치에서 상기 기준이 되는 염기와 차이가 나는 것에 기인한다.

이와 같은 차이는 저항성 유전자와 이병성 유전자간 다형성에 의해 일어날 수 있으며, 예를 들어, 상기 434번째 염기 대응위치에서 나타내는 차이는 단일염기치환다형성일 수 있다.

상기 단일염기치환다형성은 상기 434번째 염기는 구아닌이고, 상기 434번째 염기 대응위치의 염기는 아데닌으로 나타나는 것일 수 있다. 즉, 이병성 유전자는 저항성 유전자의 염기서열 중 하나의 특정 유전자가 치환된 것일 수 있다. 이와 같은 다형성으로 인해, 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지게 되는 점을 이용하여 토마토 시료의 잎마름역병 저항성 여부를 판단할 수 있게 된다.

이 때, 서열번호 5의 염기서열에 대응하는 토마토 시료의 게놈 DNA 염기서열은 서열번호 5의 염기서열과 90% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상 상동성을 나타내는 것일 수 있다. 이와 같이, 다형성에 의해 차이 나는 부분을 제외하고 상동성이 높은 경우, 다형성에 의한 차이를 이용하여 목적하는 토마토 판단이 보다 용이하게 된다.

표 4에 기재된 서열번호 6의 염기서열은 표 1에 기재된 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍에 의해 증폭되고, 표 2에 기재된 제한효소에 의해 절단되는 부위를 갖는 염기서열일 수 있다. 잎마름역병 이병성 토마토는 이와 달리 제한효소절단부위를 갖지 않는 것일 수 있다. 즉, CAPS 마커는 제한효소에 의한 절단 여부에 따라 잎마름역병에 대한 저항성 품종과 이병성 품종을 구분할 수 있도록 하는 것이다.

[표 4] CAPS 마커 서열

또한, 표 5에 기재된 서열번호 7의 염기서열은 표 1에 기재된 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍에 의해 증폭되고, HRM 분석시 잎마름역병 저항성 토마토가 이병성과는 상이한 패턴을 나타내는 염기서열일 수 있다. 이와 같은 염기서열을 HRM 마커로 지칭할 수 있다. HRM 분석시에도, CAPS마커와 동일하게 서열번호 5의 염기서열 중 434번째 염기를 타겟으로 한다.

[표 5] HRM 마커 서열

또한, 본 발명의 일 실시예인 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법은 서열번호 5의 염기서열 중 434번째 염기를 기준으로, 상기 서열번호 5의 염기서열에 대응하는 토마토 시료의 게놈 DNA 염기서열에서 상기 434번째 염기 대응위치에서 상기 기준이 되는 염기와 차이를 나타내는지 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 차이 여부를 확인하여, 차이가 나타나지 않는 토마토를 잎마름역병 저항성 토마토로 판단하고, 차이가 나타나는 토마토는 잎마름역병 저항성이 아닌 이병성으로 판단할 수 있다.

이 때, 표준이 되는 염기서열과 시료의 염기서열 간 차이를 본 발명의 프라이머세트를 이용하여 확인할 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시예인 프라이머세트를 이용하여 잎마름역병 저항성 토마토인지 여부를 판단하는, 본 발명에 따른 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법의 일 실시예를 실시하는 방법에 대하여 보다 상세히 설명한다.

구체적으로, 도 1에 도시된 (A) 시료처리단계, 와 (B) 패턴분석단계를 포함하는 방법에 의해 잎마름역병 저항성 토마토인지 여부를 판단할 수 있다.

(A) 시료처리단계는 토마토 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예인 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 증폭 산물을 얻는 단계를 포함하여 시료처리물을 준비하는 단계로, 예를 들어, (A1) 토마토 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 증폭한 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 시료처리물을 준비하는 단계이거나, (A2) 토마토 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 증폭하여 시료처리물을 준비하는 단계일 수 있다.

또한, (B) 패턴분석단계는 시료처리물로부터 잎마름역병 저항성 또는 이병성인지 여부에 따라 나타나는 패턴을 분석하는 단계로, (B1) 상기 제한효소로 절단하여 얻은 시료 처리물을 전기영동하여 얻어지는 패턴을 분석하는 단계이거나, (B2) (A2)단계의 시료처리물을 하이레졸루션멜팅 분석법에 의해 얻어지는 패턴을 분석하는 단계일 수 있다.

토마토 시료의 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, CTAB 방법, 시판되는 wizard prep 키트(Promega 사) 등을 이용할 수 있다. 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예인 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이 때, (A1), (B1) 단계와 관련된 표적 서열은 CAPS 마커일 수 있으며, (A2), (B2) 단계와 관련된 표적 서열은 HRM 마커일 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산서열기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 방법일 수 있다. 이 중 PCR은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에서 일반적이며, 상용의 키트를 이용할 수 있다.

(A1)단계의 제한효소는 표 2에 기재된 것일 수 있다.

(B1)단계의 패턴 분석은 제한효소에 의해 절단되는 증폭산물이 나타내는 패턴인지 여부를 판단하는 것일 수 있다.

또한, (B1)단계의 패턴분석단계는 제한효소에 의해 절단되는 증폭산물이 나타내는 패턴을 갖는 토마토 시료를 잎마름역병 저항성 토마토로 판정하는 판정단계를 포함할 수 있다.

또한, 패턴 분석은 표준 토마토 품종의 패턴과 비교 분석하는 것일 수 있으며, 표준 토마토 품종은 표 3에 기재된 토마토 품종 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 표준 토마토 품종은 LA1269, LA4285, LA4286, LA1932, LA1938, LA1969, LA2779, LA4285, LA4286, LA1269, IT229371, IT229370, Dunne. Ollety, 또는 Unicorn 중에서 선택된 하나 이상, 보다 바람직하게는 LA1269, LA4285, 또는 LA4286 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 이와 같은 품종은 구체예에서 저항성 토마토로 확인된 것이다.

표준 토마토 품종의 패턴은 표준 토마토 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예인 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 증폭산물을 제한효소로 처리하여 얻어진 시료 처리물을 전기영동하여 얻어진 것일 수 있다.

이와 같이 제한효소 처리 후, 전기영동하여 얻어진 패턴은 저항성인지 이병성인지 여부에 따라 상이한 패턴을 나타내므로, 이를 기준으로 잎마름역병 저항성 토마토인지 여부를 판단할 수 있다.

즉, 제한효소로 처리한 후 얻어진 단편을 겔 전기영동 장치를 이용하여 분리하였을 때 나타나는 밴드 패턴을 분석함으로써, 잎마름역병 저항성 토마토인지 여부를 판단할 수 있다.

(A2), (B2) 단계와 관련된, 하이레졸루션멜팅(HRM) 분석법은 PCR 수행시 끼어들기형광염료(intercalating fluorescent dye)를 첨가하여 PCR 과정에서 생성되는 앰플리콘(amplicon)에 결합시키고, 이후 온도 상승을 시켜 타겟 부위의 염기서열에 따라서 각기 다른 형태로 나타나는 fluorescence signal의 변화특성을 분석하는 방법이다. 이와 같은 방법에 의해, PCR 타겟 부위에서의 변이를 보다 빠르고 손쉽게 구별할 수 있다. (A2)단계와 (B2)단계는 이와 같은 하이레졸루션멜팅(HRM) 분석법을 활용하여 실시할 수 있다. 이 때, 패턴분석은 멜팅커브가 나타내는 패턴을 분석하는 것일 수 있으며, 앞서 설명한 표준 토마토 품종이 나타내는 멜팅커브의 패턴과 비교분석하는 것을 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예인 프라이머세트는 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트에 포함될 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트의 일 실시예에 대하여 보다 상세히 설명한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트의 일 실시예는 본 발명의 일 실시예인 프라이머 세트, 및 증폭반응수행시약을 포함할 수 있다.

또한, 제한효소를 더 포함할 수 있으며, 제한효소는 표 2에 기재된 제한효소일 수 있다.

또한, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다.

또한, 형광염료, 예를 들어, 끼어들기형광염료((intercalating fluorescent dye)를 더 포함하도록 하여, 하이레졸루션멜팅(HRM) 분석이 가능하도록 할 수 있다.

또한, 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 키트 사용법, 예를 들어, PCR 완충액 제조방법, 반응 조건 등을 설명하는 기록매체일 수 있다.

본 발명의 일 실시예인 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트, 잎마름역병 저항성 토마토 판단 방법 및 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트에서 각각 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 서로 동일성 범위에서 적용된다.

이하에서는 구체예를 통해, 본 발명의 일 실시예인 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트, 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트, 및 잎마름역병 저항성 토마토 판단 방법에 대해 보다 상세히 설명한다.

구체예에서 사용한 토마토는 표 3에 기재된 것이다. 이와 같은 토마토는 별도의 언급이 없는 한, 표 3에 기재된 출처에서 입수한 것이다.

<구체예 A> 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머세트 및 그를 이용한 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법

A-1. 실험재료

표 3의 토마토를 사용하였으며, 그 중 4종(M82, E6203, LA1269, LA4285)을 Ph3 유전자 클로닝 및 염기서열 분석에 사용하였다.

A-2. Genomic DNA 추출

토마토 DNA 추출은 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 방법 (Murray and Thompson 1980)을 사용하였으며, 생육 중 4-5엽기에 stainless bead가 들어있는 2 ml 튜브에 길이 2 cm미만의 어린 잎을 채취하여 액체질소(LN₂)로 급속 냉동을 시켰다. Vortex를 이용하여 곱게 마쇄한 다음, 0.2% Sodium bisulfite가 든 CTAB buffer (1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.2% (v/v) 2-mercaptoethanol)를 300ul 넣어준 후 잘 섞어주었다. 섭씨 65도 항온수조에 30분 처리 후, chloroform 150ul을 첨가 후 잘 섞어주었다. 이후 섭씨 4도에 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 층 분리를 유도하였다. 층 분리된 상등액 200 ul를 새 튜브로 옮기고, pre-chilling된 100% isopropanol 200ul을 첨가한 후, 천천히 섞어주었다. 13,000 rpm으로 30초간 원심분리하여 DNA 팰렛만 남기고, 튜브에 든 액체를 제거해주었다. 70% ethanol 750ul를 넣어준 후, 이전과 동일하게 천천히 섞어준 후 13,000 rpm으로 30초간 원심분리 하였다. 이후 튜브의 액체를 완전히 제거한 후 DNA 팰렛만 남은 튜브에 DNase-free water 100ul를 넣어 DNA 팰렛을 녹였다. 추출한 genomic DNA는 Nanodrop 1000 Spectrophotpmeter (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하였고, 섭씨 -20도에 보관하여 사용하였다.

A-3. Ph3 증폭용 프라이머 제작

Ph3 증폭용 프라이머 제작은 Ph3 유전자의 염기서열 정보(Sol Genomics Network, Solyc09g092310)를 활용하여, genomic DNA에서 Ph3 유전자 증폭이 가능한 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 표 5에 기재되어 있으며, 제작한 프라이머와 genomic DNA를 사용해서 Ph3 유전자 증폭에 사용되었다. 프라이머로 사용된 DNA oligomer는 Bioneer사(한국)에 의뢰하여 합성하였으며, Koster에 의해 개발된 cyanoethyl phosphoramidite를 이용하여 phosphodiester 결합을 연결하는 'phosphite triester'방법을 적용하여 합성하였다.

[표 6]

A-4. PCR 분석

PCR은 정량한 gDNA 1 ul, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl, 2 mM MgSO₄, 0.1% 0.2 mM each dNTP, 0.4 uM forward와 reverse primer, 5 units Taq polymerase(TaKaRa, Janpan)로 총 25 ul 맞춰주었다. PCR 반응을 위해 T-100 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)을 이용하였으며, PCR 조건은 섭씨 94도에서 10분간 초기 변성시키고, 섭씨 94도에서 1분(denaturing), 섭씨 55도에서 1분(annealing), 섭씨 72도에서 1분(extension) 과정을 35회 반복 후 섭씨 72도에서 10분간 반응시켰다.

A-5. Ph3 유전자 클로닝 및 염기서열 분석

증폭된 PCR 산물을 이용하여, TOPO TA Cloning^® Kit (Invitrogen, USA)을 사용하여 클로닝하고, Chemically Competent Cell (Invitrogen, USA)을 이용하여 heat-shock 방법으로 형질전환을 실시하였으며, 실험방법은 제조회사에서 제공한 방법에 따라 수행하였다. plasmid DNA 추출은 Plasmid DNA prep kit (SolGent, Korea)을 사용하여 DNA을 분리하고, 인서트 존재를 확인 후 SolGent사에 의뢰하여 염기서열을 해독하였다.

Ph3에 대한 저항성 토마토와 이병성 토마토 간의 유전자 시작코돈에서부터 정지코돈까지의 염기서열 상의 차이를 SeqMan program (DNASTAR, USA)을 통해 분석하였다.

그 결과, Ph3 유전자는 intron이 존재하지 않는 하나의 큰 exon으로 이루어져 있었으며(도 2), 총 길이는 2556 bp이다. 저항성 토마토 Ph3와 이병성 토마토 ph3 유전자를 비교분석해본 결과, 1곳의 SNP를 확인할 수 있었다. 확인된 1개의 SNP는 434 bp 위치에서 저항성Ph3는 구아닌(G), 이병성 ph3는 아데닌(A)으로 차이를 발생시켰다. Ph3 유전자의 염기서열은 표 7과 같다.

[표 7]

A-6. CAPS 마커 설계 및 분석

Ph3 저항성토마토와 이병성토마토 간의 염기서열 상 SNP를 이용하여 CAPS 마커를 설계하였다. CAPS 마커 설계는 SeqBuilder program (DNASTAR, USA)을 이용하여 Ph3 저항성토마토와 이병성토마토를 비교 분석하여 실시하였다.

즉, CAPS 마커는 434 bp 위치의 SNP를 목표로 MspI 제한효소를 사용할 수 있도록 설계되었고, Ph3 저항성인 경우 300 bp, 100 bp로 구분되며, 이병성인 경우 400 bp의 밴드로 확인할 수 있도록 설계되었다. 설계된 CAPS마커의 염기서열은 표 4와 같다.

서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여, PCR을 실시하였다. 프라이머로 사용된 DNA oligomer는 Bioneer사(한국)에 의뢰하여 합성하였으며, Koster에 의해 개발된 cyanoethyl phosphoramidite를 이용하여 phosphodiester 결합을 연결하는 'phosphite triester'방법을 적용하여 합성하였다. PCR은 다음과 같은 조건으로 실시하였다. 정량한 gDNA 1 ul, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl, 2 mM MgSO₄, 0.1% 0.2 mM each dNTP, 0.4 uM forward와 reverse primer, 5 units Taq polymerase (TaKaRa, Janpan)로 총 25 ul 맞춰주었다. PCR 반응을 위해 T-100 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA) 을 이용하였다, PCR 온도조건은 섭씨 94도에서 10분간 초기 변성시키고, 섭씨 94도에서 1분(denaturing), 섭씨 55도에서 1분(annealing), 섭씨 72도에서 1분(extension) 과정을 35회 반복 후 섭씨 72도에서 10분간 반응시켰다.

제한효소 처리는 MspI 제한효소를 사용하며, PCR product 15 ul, MspI 2 ul, 10 x M Buffer 2 ul, BSA 0.1 ul, 증류수로 총 20.1 ul 맞춰주었다. 반응조건은 섭씨 37도에서 1시간 처리 후 2.5% agarose gel을 EtBr로 염색하고 전기영동 후 Gel Doc 2000 (BIO-RAD, USA)을 통해 밴드를 확인하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용한 전기영동 결과를 나타낸 도이다. 도 3에서 M은 분자 사이즈 마커를 나타내고, 자연수는 일련번호를 나타낸다. 도 3의 일련번호는 표 3의 일련번호-3을 나타낸다.즉, 도 3의 토마토는 표 3의 일련번호 4~30에 해당하는 토마토를 나타낸다.

도 3에서와 같이, 종래 저항성을 나타내는 것으로 알려진, LA1269, LA4285, LA4286 등을 저항성으로 판별한 것으로 부터, 본 발명의 프라이머세트가 효과적으로 잎마름역병 저항성 토마토를 판단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 그 이외의 토마토 중에서도 잎마름역병 저항성 토마토(LA1932, LA1938, LA1969, LA2779, LA4285, LA4286, LA1269, IT229371, IT229370, Dunne. Ollety, Unicorn)를 선발할 수 있었다. 또한, Ty250과 Titichal은 이형접합상태이나, Ph3 유전자가 우성이므로, 저항성으로 선발되었다.

A-7. HRM 분석

HRM 마커는 DNA 다형성과 앰플리콘의 크기를 고려하여 설계하였다. 설계된 HRM 마커는 표 5의 염기서열을 갖는다. 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여, PCR을 실시하였다. 프라이머로 사용된 DNA oligomer는 Bioneer사(한국)에 의뢰하여 합성하였으며, Koster에 의해 개발된 cyanoethyl phosphoramidite를 이용하여 phosphodiester 결합을 연결하는 'phosphite triester'방법을 적용하여 합성하였다. PCR은 다음과 같은 조건으로 실시하였다.

20ul의 10Xh-Taq Reaction 20X reaction mixtures{10Xh-Taq Reaction Buffer (25 mM MgCl₂ mix), 10 mM 각각 dNTP Mix, 10 pmol 각각 primer, 2.5 U/ul DNA polymerase, 1ul의 20X EvaGreen^TM(Solgent, Daejeon, Korea), 10 ng genomic DNA}를 사용하여, CFX Connect^TM Real-Time PCR Detection system (BIO-RAD, Hercules, USA)으로 HRM 분석을 실시하였다. 싸이클링 조건은 섭씨 95도로 15분 이후, 섭씨 95도로 20초, 섭씨 60도로 15초, 섭씨 72도로 30초 싸이클을 40회 반복하였다. HRM 분석은 섭씨 60도와 95도 사이를 섭씨 0.2도씩 증가되도록 하여 실시하였다.

HRM 분석을 위한 시료는 표 3에 기재된 토마토 중 일련번호 4~30에 해당하는 토마토의 genomic DNA를 사용하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도시된 바와 같이, G/A 변이가 명확하게 구별됨을 알 수 있다. 107bp 앰플리콘은 섭씨 ~78도와 섭씨 ~81도 사이의 온도에서 두 유전형을 구분하였다. 도에서 R과 S로 각각 표시된 커브가 이병성과 저항성 토마토를 구분하여 나타냄을 알 수 있다.

이와 같이, 저항성 토마토가 나타내는 패턴을 잎마름역병 저항성 표준 토마토 품종의 패턴으로 하여, 미지의 토마토 시료에 대하여 구체예에 개시된 방법을 활용하여 얻어진 패턴을 대비함으로써, 토마토 시료가 잎마름역병 저항성인지 여부를 판단할 수도 있다. 이와 같은 판단결과를 활용하여, 토마토 육종 등에 활용할 수 있음은 물론이다.

또한, 구체예에 기재된 프라이머를 포함하도록 하여, 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트 내지 잎마름역병 저항성 토마토 판단키트를 제조할 수 있다.

이와 같은 결과로부터, 본 발명의 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머세트, 방법 및 키트에 의해 잎마름역병 저항성 토마토를 용이하게 판단할 수 있음을 알 수 있다.

<110> Andong National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set to judge tomato resitant to late blight disease, Method to judge tomato resitant to late blight disease, and Kit to judge tomato resitant to late blight disease <130> GP15008 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer of 14IY138 F <400> 1 tcgatcgtat gtagacgatg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY139 R <400> 2 aggcaaatct tgaagaagca 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of Ph3HRM-HJ-F <400> 3 caacatcacg gatacaagta acaa 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of Ph3HRM-HJ-R <400> 4 catgatccaa accgatgacc 20 <210> 5 <211> 2556 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 5 atggctgata ttcttcttac tgcagtcgtc aataaatctg ttgaaatagc tgcaaatcta 60 ctcgtgcaag aaggtacgcg tttacattgg ttgagggagg acatcgattg gctccagaga 120 gaaatgagac acattcgatc gtatgtagac gatgcaaagg caaaggaagt tggaggtgat 180 tcaagggtca aaaacctatt agaagatatt caacaactgg caggtgatgt ggaggatcta 240 ttagatgagt tccttccaaa aattcaacaa tccaataagt tcatttgttg ccttaagact 300 gtttcttttg cggataagtt tgctatggag attgagaaga taaaaagaag agttgctgat 360 attgaccgtg taaggacaac ttacaacatc acggatacaa gtaacaataa tgatgattgc 420 attccaatgg accggagaag acgattcctt catgctaatg atgaaacaga ggtcatcggt 480 ttggatcatg acttcaacaa gctccaacac aaattgcttc ttcaagattt gccttacgga 540 gttgtttcaa tagttggcat gcccggtttg ggaaaaacta ctcttgccaa gaaactttat 600 aggcacgtcc gtcatcaatt tgaatgttct ggattggtct atgtctcgca gcagccaagg 660 gcgggagaaa tcttgcttaa catagccaaa caagttggac tgacggaaga agaaaggaaa 720 gagaacttgg aacacaacct aagatcactc ttgaaaataa aaaggtacgt tatcctttta 780 gatgacattt gggatgttga aatttgggat gatctaaaac tcgtccttcc tgaatctgat 840 tcaaaaattg gcagtaggat aattataacc tctcgaaata gtaatgtagg cagatacatc 900 ggaggggatt tctcaatcca cgagttgcaa cctctagact cagagaacag ttttgaactc 960 tttaccaaga aaatctgtaa ttttgttgat gataattggg ccaatacttc accagacttg 1020 gtaaatattg gtagatgtat agttgagaga tgtggaggta taccgctagc gattgtggtg 1080 actgcaggta tgttaagggc aagaggaaga acagaacatg catggaacag agtacttgac 1140 agtatgactc ataaaattca agagggatgt gctaaggtat tggctttgag ttacaatgat 1200 ttgcctattg cattaaggcc atgtttcttg tactttggcc ttttccccga ggaccatgaa 1260 attcgtgctt ttgatttgat aaatatgtgg attgctgaga agctcatagt tgtaaatagt 1320 ggtaatacgc gagaagctga aagtaaggcg gaggatttcc taaatgattt ggtttctaga 1380 aacttgatcc aagttgccaa aaggagatat gatggaagaa tttcaacttg tcgcatacat 1440 gacttgttac atagtttgtg tgtggagttg ggcaaggaaa gtaacttctt tcacaccgag 1500 cacaatgcat ttggtgatcc cggcaatgtt tctagggtgc gaaggattac attctactct 1560 gatattaatg ccatgaatga gttcctccgt tcaaatccta atcctaagaa acttcgtgca 1620 cttttctgtt ttataggtga tagttgccta ttttctcaac tggctcgtca tgacttcaaa 1680 ttattgcaag tgttggttgt agtcatagct tatgattatt ttttaagtta catgggaatc 1740 ccaaacacgt ttgggaagac gagttgctta cgctatctgc aattggaggg gaatatgcgt 1800 gggaaattgc caaatagtat ggtcaaacat atgcagaccc taaatattga aaatagctgc 1860 actgaacttc ctactgttgt ttgggagtct aaacaattga gacatgttcg ttatagagtt 1920 ggttttgaag catctaactg ttgcttttcg ataagccgaa aaatttactc attgcctcct 1980 aataatatac aaactttgat gtgtgtgtat gataagtttg ttgaacagat attatttcac 2040 cggttgatca acttaagaaa actgggtcta tggatagtat cagatttcac cgttcagata 2100 ttgtcaacat tgccaaaaga gttggaggat ctgaagctca tattttcgtg tcaaccgagt 2160 gagcaaatga acttgtcgtc ctatccatat attgttaagt tgcatttgag cggaaacgtg 2220 catttgaact ctgttacatt ccctccaaat ctcgtcaagc ttactcttcg cttaattatg 2280 gtagagggtt atgtagtggc attgcttaag aaattgtcca aattaagaat acttaaaatg 2340 atttggtgca aacataagga agaaaagatg gatctctctg gtgatggtga tagctttctg 2400 caacttgaag ttctgtatat tcaagaacca tccgggttgt ctgaagtaga gtgcacagat 2460 gatgtgagta tgcctaaatt gaaaaagcta ttacttaaag aaatacctaa ttccaacctt 2520 aggctctcga aacgtcttgc aaagctgaga gtatga 2556 <210> 6 <211> 400 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 6 tcgatcgtat gtagacgatg caaaggcaaa ggaagttgga ggtgattcaa gggtcaaaaa 60 cctattagaa gatattcaac aactggcagg tgatgtggag gatctattag atgagttcct 120 tccaaaaatt caacaatcca ataagttcat ttgttgcctt aagactgttt cttttgcgga 180 taagtttgct atggagattg agaagataaa aagaagagtt gctgatattg accgtgtaag 240 gacaacttac aacatcacgg atacaagtaa caataatgat gattgcattc caatggaccg 300 gagaagacga ttccttcatg ctaatgatga aacagaggtc atcggtttgg atcatgactt 360 caacaagctc caacacaaat tgcttcttca agatttgcct 400 <210> 7 <211> 107 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 7 caacatcacg gatacaagta acaataatga tgattgcatt ccaatggacc ggagaagacg 60 attccttcat gctaatgatg aaacagaggt catcggtttg gatcatg 107 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY136 F <400> 8 gacttggtcg ttgactccaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY139 R <400> 9 aggcaaatct tgaagaagca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY207 F <400> 10 atgattgcat tccaatggac 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY208 R <400> 11 catggcctta atgcaatagg c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY209 F <400> 12 agcgattgtg gtgactgcag g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY210 R <400> 13 ctctataacg aacatgtctc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY211 F <400> 14 gttgtagtca tagcttatga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of 14IY163 R <400> 15 tcatactctc agctttgcaa 20

Claims (8)

1. 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍, 및
   서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서, 상기 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트는, 서열번호 5의 염기서열 중 434번째 염기를 기준으로, 상기 서열번호 5의 염기서열에 대응하는 토마토 시료의 게놈 DNA 염기서열에서 상기 434번째 염기에 대응하는 대응위치에서 상기 기준이 되는 염기와 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위한 것인 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트.
3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍은 토마토의 단편증폭다형성서열(CAPS)의 증폭을 위한 것이고,
   상기 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍은 하이레졸루션멜팅(High resolution melting)분석을 위한 것인 잎마름역병 저항성 토마토 판단용 프라이머 세트.
4. 제1항의 프라이머세트를 이용하여 잎마름역병 저항성 토마토 여부를 판단하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법은
   (A1) 토마토 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 증폭한 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 시료처리물을 준비하는 시료처리단계, 및
   (B1) 상기 제한효소로 절단하여 얻은 시료 처리물을 전기영동하여 얻어지는 패턴을 분석하는 패턴분석단계를 포함하거나,
   (A2) 토마토 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 증폭하여 시료처리물을 준비하는 시료처리단계; 및
   (B2) 상기 (A2)단계의 시료처리물을 하이레졸루션멜팅 분석법에 의해 얻어지는 패턴을 분석하는 패턴분석단계를 포함하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단방법.
6. 제1항의 프라이머 세트, 및 증폭반응수행시약을 포함하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트.
7. 제6항에 있어서, 제한효소를 더 포함하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트.
8. 제6항에 있어서, 형광염료를 더 포함하는 잎마름역병 저항성 토마토 판단 키트.

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