JP5545793B2 - イネいもち病圃場抵抗性遺伝子Pi35(t)とその利用 - Google Patents
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Description
真性抵抗性は、過敏感反応に基づく抵抗性であり、効果が大きくレースに対する特異性が高い質的な抵抗性である。しかしながら、1個の抵抗性遺伝子を導入した品種はその遺伝子に親和性の菌が出現することによって数年で効果を失うことが経験的に知られる。一方、圃場抵抗性は真性抵抗性が機能しない条件下で観察される量的な抵抗性の品種間差と定義される。それぞれのレースへの抵抗性効果は真性抵抗性に比べると小さいものの、レースに対する特異性が低いため、効果の持続性の点で実用性が高い。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、イネいもち病圃場抵抗性遺伝子Pi35(t)、および該遺伝子を利用した植物にいもち病に対する圃場抵抗性を付与する方法を提供することにある。
〔1〕 いもち病に対する圃場抵抗性を有するイネ由来のタンパク質をコードする、下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNA;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、および
(d)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
〔2〕 前記〔1〕に記載のDNAを含むベクター。
〔3〕 前記〔1〕に記載のDNAまたは〔2〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
〔4〕 植物がイネ、コムギ、オオムギ、エンバク、トウモロコシ、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビである、前記〔3〕に記載の形質転換植物細胞。
〔5〕 前記〔3〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔6〕 前記〔5〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔7〕 前記〔5〕または〔6〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔8〕 前記〔5〕または〔6〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、前記〔1〕に記載のDNAまたは〔2〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、概植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔9〕 前記〔1〕に記載のDNAを植物の細胞内で発現させる工程を含む、植物の細胞内で発現させる工程を含む、植物にいもち病に対する圃場抵抗性を付与する方法。
〔10〕 植物がイネ、コムギ、オオムギ、エンバク、トウモロコシ、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビである、前記〔9〕に記載の方法。
〔11〕 前記〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
〔12〕 前記〔11〕に記載のタンパク質を認識する抗体。
〔13〕 配列番号:1または2に記載の塩基配列の全部または一部を増幅するプライマーセット。
〔14〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物がいもち病圃場抵抗性であると判定する方法;
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から前記〔1〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、前記〔1〕に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔15〕 以下の(d)および(e)の工程をさらに含む、前記〔14〕に記載の方法。
(d)被検植物における配列番号:2に記載のDNA領域に相当する部位、またはその周辺配列に存在する多型部位の塩基種を決定する工程、
(e)(d)で決定された多型部位の塩基種において、配列番号:2またはその周辺配列と同じアレルが検出された場合に、いもち病圃場抵抗性を有する植物であると判定する工程。
〔16〕 多型部位が配列番号:2に記載の塩基配列における3157から3159位の間または、3163から3165位の間に存在する多型部位である、前記〔15〕に記載の方法。
〔17〕 配列番号:2に記載の塩基配列において、3157から3159位がアスパラギン酸をコードするコドンである場合、または3163から3165位がセリンをコードするコドンである場合に、被検植物がいもち病圃場抵抗性であると判定する前記〔15〕に記載の方法。
Pi35(t)遺伝子によって、日本国内の複数のいもち病菌株に対して抵抗性を高めた植物を作出することが可能となる。すなわち、日本国内のイネ品種の中で、Pi35(t)遺伝子を持たない品種に対して、単離したPi35(t)遺伝子を導入する、またはPi35(t)遺伝子を保持するイネを育種することによって、幅広いいもち病レースに対して抵抗性を付与することが可能になると考えられる。
本発明は、イネいもち病圃場抵抗性遺伝子Pi35(t)、および該遺伝子を利用した植物にいもち病に対する圃場抵抗性を付与する方法を提供する。
本発明者らによりいもち病に対する圃場抵抗性を有することが明らかにされた、イネ由来のPi35(t)遺伝子のゲノムDNAの塩基配列を配列番号:1に、cDNAの塩基配列を配列番号:2に、これら遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:3に示す。
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、および
(d)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
本発明のベクターとしては、形質転換体作製のために細胞内で本発明のDNAを発現させるベクター、例えば形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明のDNAを発現させるためのベクターが含まれる。植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えばプラスミド、ファージ、またはコスミドなどを例示することができる。
植物体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法(Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に準じて実施することができる。
上述のように、本発明のDNAもしくはベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法もまた本発明に含まれる。
上記育種法としては、例えば、本発明のDNAを有する品種と交雑させることを特徴とする一般的な育種法(交雑育種法等)を挙げることができる。該方法によって、圃場抵抗性を有する植物体もしくはその種子を作出することができる。
(a)植物Aと、本発明のDNAを有する他の植物Bを交雑させ、F1を作出する工程
(b)前記F1と前記植物Aを交雑させる工程
(c)前記DNAを有する植物を選抜する工程
(d)工程(c)によって選抜された植物と、前記植物Aを交雑させる工程
ここで「相補鎖」とは、A:T(ただしRNAの場合はU)、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは当業者に周知のものを使用すればよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料からPi35(t)遺伝子に相当するDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、Pi35(t)遺伝子のそれと比較する工程。
上記電気泳動分析は、常法にしたがって行えばよい。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドのゲル中で電圧をかけて電気泳動し、分離したDNAパターンを分析する。
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からPi35(t)遺伝子またはPi35(t)遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程
(d)分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、Pi35(t)遺伝子のそれと比較する工程
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からPi35(t)遺伝子またはPi35(t)遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程
(d)解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(e)分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、Pi35(t)遺伝子のそれと比較する工程
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料かPi35(t)遺伝子またはPi35(t)遺伝子の領域を増幅する工程
(c)調製したDNA試料を制限酵素により切断する工程
(d)DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e)検出されたDNA断片の大きさを、Pi35(t)遺伝子のそれと比較する工程
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からPi35(t)遺伝子またはPi35(t)遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
(d)分離したDNAのゲル上での移動度と、Pi35(t)遺伝子のそれと比較する工程
また、本発明の判定方法を利用すれば、いもち病圃場抵抗性であると識別される植物(例えばイネ)を早期に選抜することが可能となる。
(a)いもち病圃場抵抗性である植物(例えばイネ)と任意の機能を有する植物(例えばイネ)とが交配された品種を作製する工程
(b)本明細書に記載の、被検植物がいもち病圃場抵抗性であるか否かを判定する方法により、工程(a)で得られた植物がいもち病圃場抵抗性であるか否かを判定する工程
〔実施例1〕遺伝地図作成
Pi35(t)は、これまでの研究から、PCRマーカーRM1216 と RM1003との間にあることがわかっていた(Nguyen et al Theoretical and Applied Genetics 113 697-704)。そこで、その領域内に、PCRマーカーを作成し、上記文献の遺伝解析集団を用いて解析を進めたところ、PCRマーカーP31065(プライマー配列aaggctcacaggctcacagt(配列番号:4)、 cgacggcgagattagacatt(配列番号:5))とRM1003間の領域(日本晴の塩基配列で892kbの範囲)にあることがわかった。次に、マップベースクローニングに不可欠な大規模分離集団によるPi35(t)領域の詳細な連鎖解析を行った。連鎖解析用の集団は、上記文献の遺伝解析集団の後代系統を用いた。すなわち、病斑進展を抑制する対立遺伝子Pi35(t)を持つ品種北海188号に、病斑を抑制しない対立遺伝子pi35(t)を持つ罹病性品種Danghang-Shaliを戻し交雑して得たF5集団3112個体を用いた。P31035とRM1003間の領域におけるPi35(t)近傍の染色体領域で組み換えのある個体(124個体)のうち、56個体について、後代固定系統について、いもち病圃場抵抗性をガラス室検定によって評価し、連鎖解析を行った結果、Pi35(t)はP33688 (プライマー配列acgtccacttctgtcgatcc(配列番号:6)、ttgattgtgccaagaacagg(配列番号:7))とRM111744間の領域に存在することがわかった(図1A)。さらに、以下の取り組みにおいてPi35(t)領域詳細な連鎖地図作成を行った。
Pi35(t)を持つ品種北海188号のBACクローンライブラリー(19082クローン、平均インサート長115Kb)を作成し、Pi35(t)遺伝子領域を含むゲノムクローンHO188-07L09をPCRマーカーP33688、RM1003を用いて選抜した。さらに特定したBACクローンの塩基配列をショットガン法によって決定した。その結果、合計195120bpの4個のコンティグからなる塩基配列を得た。そのうち、Pi35(t)が存在するP33688とRM111744間の領域について、Pi35(t)遺伝子を持たない品種日本晴と比較したところ、北海188号において20637bpの欠失変異を含むほかに、17カ所(上流6、候補遺伝子内8、下流3)の変異があった。これらの変異の中でアミノ酸置換が予想されるのは、日本晴において予測される6個の遺伝子のうち、Os01g782100のみであった(図1B)。この遺伝子はNBS-LRRという病害抵抗性遺伝子(以下単にNBS-LRR遺伝子と記載することがある)に共通する構造を持っていた。特に、アミノ酸置換変異の大半は病原体の遺伝子産物の認識特異性に関わることが知られるLRRドメインに集中していた(図2)。以上の結果から、日本晴のOs01g0782100の対立遺伝子がPi35(t)遺伝子である可能性が示唆された。
Pi35(t)遺伝子の候補として特定された5’上流予測プロモーター領域を含む北海188号のゲノム領域SpeI-XhoI 13.1kb断片(日本晴ゲノム上での位置、chr1:34869531…34903270)を、アグロバクテリウムを介して形質転換可能なベクターpPZP2H-lacに組み込んだ。この断片を導入したベクターならびにベクターのみを用い、土岐の方法(文献 Plant Mol. Biol. Rep. 15:16-21、 1997)により形質転換を行なった。形質転換する系統には罹病性品種愛知旭を用いた。SpeI-XhoI 13.1kb断片の形質転換実験から131個体、ベクターのみからは60個体のハイグロマイシン耐性個体を得た。候補遺伝子に特異的なプライマー(センス鎖5'- ATTGGTGAGCTGAAGCACCT-3'(配列番号:8))および (アンチセンス鎖5'- TGATATGGGAAGCGAATTCC-3'(配列番号:9))を用いて増幅したDNA断片を制限酵素BamHIで切断し、これによって切断される導入した領域が組み込まれたか否かをPCR法により調査した。その結果、調査した117個体のうち、112個体の形質転換体について、候補遺伝子が組み込まれていることが判明した。これらの個体に対し、移植後1〜2週間後に、4種類のいもち病菌株[007.0(北1)、037.3(愛79-142)、303.1(P-2b),337.3(Mu183)]のいずれかを噴霧接種によって接種し病斑の形成を調査した。これらの菌株は我が国において優先して存在するいもち病菌レースを包含するものであり、我が国で利用されている真性抵抗性遺伝子のいずれかを侵すものである。これら全ての菌株に対して抵抗性を示せば、我が国のいもち病菌に対して幅広く抵抗性を示すことが期待できる。解析の結果、ベクターのみを導入した個体に比べて、候補遺伝子を導入した系統では全ての菌株に対して病斑の面積は低く、抵抗性が向上した(図3)。以上の結果から、候補遺伝子領域(SpeI-XhoI 13.1kb)には、愛知旭の抵抗性のレベルを複数の菌株に対して向上させる機能を有することが明らかとなり、候補遺伝子がPi35(t)遺伝子であると判断した。
Pi35(t)の特性に重要と予想されるLRR領域(日本晴での配列位置2989-3408、図2) について、世界のイネの遺伝的多様性を包含するコアコレクション69品種のDNA変異を検索し、アミノ酸配列変異を推定した。次に、Pi35(t)を持たない日本晴とPi35(t)をもつ北海188号との間でこの領域に見られる4個のアミノ酸変異E/D(3160-62)、R/S(3166-68)、P/Q(3217-19)、N/W(3247-49)(いずれも、日本晴/北海118号)のイネ品種における分布を調べた。その結果、P/Q(3217-19)については、66品種がアミノ酸Pを持ち、その中にはいもち病に対して罹病性を示す多くの品種が含まれたことから、このアミノ酸変異とPi35(t)の特性との間に関連は認められなかった。また、R/S(3166-68)およびN/W(3247-49)を保有しているのは1品種のみだった。その品種は、いもち病菌レース077.1および337.3に対して罹病性を示し、Pi35(t)の特性は認められなかった。一方、3160-62については、Dを持つ品種は供試材料にはなく、北海188号に特異的であった。以上のことから、D(3160-62)はPi35(t)の特性に関連性が高いアミノ酸変異である可能性が高い。あるいは、D(3160-62)、S(3166-68)は同一のLRRドメインに存在する(図2)ことから、D(3160-62)とS(3166-68)の両方を持つことがPi35(t)に関連する可能性がある。
Claims (13)
- イネいもち病に対する圃場抵抗性を有するタンパク質をコードする、下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAであって、配列番号:2の3157から3159位に相当する位置がアスパラギン酸をコードする、前記DNA。
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜8個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAと99%以上の配列同一性を有するDNA。 - 請求項1に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項1に記載のDNAまたは請求項2に記載のベクターを保持する形質転換イネ植物細胞。
- 請求項3に記載の形質転換イネ植物細胞を含む形質転換イネ植物体。
- 請求項4に記載の形質転換イネ植物体の子孫またはクローンである、形質転換イネ植物体。
- 請求項4または5に記載の形質転換イネ植物体の繁殖材料。
- 請求項4または5に記載の形質転換イネ植物体の製造方法であって、請求項1に記載のDNAまたは請求項2に記載のベクターをイネ植物細胞に導入し、該植物細胞から該植物体を再生させる工程を含む方法。
- 請求項1に記載のDNAをイネ植物の細胞内で発現させる工程を含む、イネ植物にいもち病に対する圃場抵抗性を付与する方法。
- 請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
- 配列番号:2に記載の塩基配列における3157から3159位の間または、3163から3165位の間に存在する多型部位を増幅するプライマーセット。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む方法であって、配列番号:2の3157から3159位に相当する位置がアスパラギン酸をコードする塩基配列であるときに、被検イネ植物がいもち病圃場抵抗性であると判定する方法;
(a)被検イネ植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から請求項1に記載のDNAにおける配列番号:2の3157から3159位に相当する位置を含む領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNA断片の塩基配列を、請求項1に記載のDNAのそれと比較する工程。 - 以下の(d)および(e)の工程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
(d)被検イネ植物における配列番号:2に記載のDNA領域に相当する部位、またはその周辺配列に存在する多型部位の塩基種を決定する工程、
(e)(d)で決定された多型部位の塩基種において、配列番号:2またはその周辺配列と同じアレルが検出された場合に、いもち病圃場抵抗性を有するイネ植物であると判定する工程。 - 配列番号:2に記載の塩基配列において、さらに3163から3165位がセリンをコードするコドンである場合に、被検イネ植物がいもち病圃場抵抗性であると判定する請求項12に記載の方法。
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