KR20170068457A - 옥수수에서의 배양 및 형질전환과 연관된 유전자 좌위 - Google Patents

옥수수에서의 배양 및 형질전환과 연관된 유전자 좌위 Download PDF

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라자트 아가왈
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

이 발명은 증가된 배양성 및/또는 형질전환성을 갖는 옥수수 식물의 확인 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 분자 마커를 사용하여 증가된 배양성 및/또는 형질전환성을 갖는 식물을 확인하고 선별하거나, 감소된 배양성 및/또는 형질전환성을 갖는 식물을 확인하고 탈락시킨다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 옥수수 식물은 또한 본 발명의 특징이다.

Description

옥수수에서의 배양 및 형질전환과 연관된 유전자 좌위 {GENETIC LOCI ASSOCIATED WITH CULTURE AND TRANSFORMATION IN MAIZE}
이 출원은 2014년 10월 10일에 미국 특허 상표청에 출원된 가출원 62/062,520에 기초한 우선권을 주장하며, 그의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 옥수수 식물에서 배양성 및 형질전환성을 개선시키는 데 유용한 방법에 관한 것이다.
옥수수 형질전환은 역사적으로 조직 배양 및 유전자 전달 기술을 잘 받아들이는 유전자형을 사용하여 실시되어 왔다. 그러나, 제품 개발 관점에서, 이들 유전자형을 사용한 트랜스제닉 이벤트의 생성은 이들이 종종 농경학적으로 불량하기 때문에 바람직하지 않다. 그러나, 많은 예에서, 우월한 농경학적 형질을 갖는 식물, 예컨대 엘리트 계통은 불량한 배양 및 형질전환성 특징을 나타내는 경향이 있다. 따라서, 옥수수 형질전환에서의 통상적인 사용에 적합한 효율로 배양되고 형질전환될 수 있는 엘리트 계통을 개발할 기회가 있다. 이러한 계통을 갖는 것의 이점은 보다 빠르고 보다 정확한 이벤트 및 형질 평가, 향상된 형질, 수율, 및 조절 시험, 및 보다 빠른 제품 개발을 포함한다.
엘리트 형질전환가능한 순계교배 계통을 개발하기 위한 방법론은 공여자 물질로부터 바람직한 엘리트 계통 내로의 배양성 및 형질전환성 형질의 유전자이입을 포함한다. 이들 형질에 대한 유전자 마커를 갖는다면 이 유전자이입을 보조하기 위해 가치있을 것이다. Hi-II 및 A188 생식질에서의 배양성 및 형질전환성 형질은 널리 연구되었으며, 이들 형질과 관련된 몇몇 분자 마커가 확인되었다 (Armstrong et al. 1992; Lowe and Chomet 2004; Lowe et al. 2006; Zhao et al. 2008). 개선된 배양성 및 형질전환성을 갖는 신규한 계통인 Hi-II는 A188과 B73 사이의 초기 교배로부터 개발되었으며 (Armstrong et al. 1991), 여기서, A188은 배양성 및 형질전환성 형질의 공여자였다.
본 발명은 보다 배양가능하며 형질전환가능한 엘리트 계통에 대한 요구를 다루며, 향상된 배양성 및 형질전환성을 갖는 새로운 농경학적으로 우월한 옥수수 계통의 개발을 용이하게 하는 개선된 방법을 제공한다.
발명의 요약
한 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 증가된 배양성 및 형질전환성을 나타내는 옥수수 식물의 확인 방법이 제공된다. 마커 좌위는, idp8516 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 1.07) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 하기 마커 좌위 PZA01216.1, DAS-PZ-7146, DAS-PZ-12685, 및 magi17761 중 임의의 것, 뿐만 아니라 이들 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택될 수 있다. 마커 좌위는 염색체 1 상에서, PZA01216.1 및 magi17761을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 내에서 발견될 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마커 좌위는 npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 4.04) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 Mo17-100177, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커일 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마커 좌위는 agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 4.05) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 하기 마커 좌위 DAS-PZ-5617, DAS-PZ-2343, PZA03203-2, Mo17-100291, PZA03409, 및 DAS-PZ-19188, 뿐만 아니라 이들 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택될 수 있다. 마커 좌위는 염색체 4 상에서, DAS-PZ-5617 및 DAS-PZ-19188을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 내에서 발견될 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마커 좌위는 umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 4.06) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 DAS-PZ-2043, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커일 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마커 좌위는 php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 4.10) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 DAS-PZ-20570, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커일 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마커 좌위는 bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 5.04) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 PZA02965, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커일 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마커 좌위는 umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 5.06) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 하기 마커 좌위 Mo17-14519 및 DAS-PZ-12236, 뿐만 아니라 이들 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택될 수 있다. 마커 좌위는 염색체 5 상에서, Mo17-14519 및 DAS-PZ-12236을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 내에서 발견될 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마커 좌위는 bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 8.02) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 magi52178, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커일 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마커 좌위는 wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 (Bin 9.03) 내에 위치하고; 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커 좌위는 DAS-PZ-366, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커일 수 있으며, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 적어도 1개의 대립유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 옥수수 식물은 스티프 스토크 (Stiff Stalk) 잡종 군에 속한다. 이 방법에 의해 확인된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형 (haplotype)을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은, 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 1 상에서, idp8516 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 1.07) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은, 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 1 상에서 발견되며, PZA01216.1, DAS-PZ-7146, DAS-PZ-12685, 및 magi17761, 뿐만 아니라 이들 마커에 연결된 임의의 다른 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 4 상에서 npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 4.04) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 4 상에서 발견되며, Mo17-100177, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 4 상에서 agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 4.05) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 4 상에서 발견되며, DAS-PZ-5617, DAS-PZ-2343, PZA03203-2, Mo17-100291, PZA03409, 및 DAS-PZ-19188, 뿐만 아니라 이들 마커에 연결된 임의의 다른 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 4 상에서 umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 4.06) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 4 상에서 발견되며, DAS-PZ-2043, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 4 상에서 php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 4.10) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 4 상에서 발견되며, DAS-PZ-20570, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 5 상에서 bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 5.04) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 5 상에서 발견되며, PZA02965, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 5 상에서 umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 5.06) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 5 상에서 발견되며, Mo17-14519 및 DAS-PZ-12236, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 8 상에서 bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 8.02) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 8 상에서 발견되며, magi52178, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 옥수수 식물의 생식질에서 일배체형을 검출함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 9 상에서 wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 9.03) 내에서 발견되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 1개 이상의 마커 좌위가 염색체 9 상에서 발견되며, DAS-PZ-366, 뿐만 아니라 이 마커에 연결된 임의의 다른 마커로부터 선택되는 것인 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함한다. 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 1 상에서, idp8516 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 1.07) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 4 상에서, npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 4.04) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 4 상에서, agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 4.05) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 4 상에서, umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 4.06) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 4 상에서, php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 4.10) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 5 상에서, bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 5.04) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 5 상에서, umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 5.06) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 8 상에서, bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 8.02) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
추가의 실시양태에서, 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 선별 방법이 제공된다. 한 측면에서, 대립유전자가 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관되는 것인 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖는 제1 옥수수 식물이 얻어진다. 마커 좌위는 염색체 9 상에서, wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 구간 (Bin 9.03) 내에서 발견될 수 있다. 제1 옥수수 식물은 제2 옥수수 식물과 교배될 수 있으며, 교배로부터 초래된 자손은 제1 옥수수 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 옥수수 식물로부터의 대립유전자를 소유하는 자손 식물은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 것으로서 선별될 수 있다. 이 방법에 의해 선별된 옥수수 식물은 또한 관심의 대상이다.
도면의 간단한 설명 및 서열 목록
본 발명은 하기 상세한 설명 및 이 출원의 일부를 형성하는 첨부된 도면 및 서열 목록으로부터 보다 완전히 이해될 수 있다. 서열 목록은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985)] 및 [Biochemical Journal 219 (No. 2): 345-373 (1984)]에 기재된 IUPAC-IUBMB 표준에 따라 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 부호에 대한 1문자 부호, 및 아미노산에 대한 3문자 부호를 함유한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 형식은 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규칙에 따른다.
서열식별번호 (SEQ ID NO): 1은 DAS-PZ-7146 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 2는 DAS-PZ-12685 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 3은 Mo17-100177 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 4는 DAS-PZ-5617 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 5는 DAS-PZ-2343 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 6은 Mo17-100291 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 7은 DAS-PZ-19188 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 8은 DAS-PZ-2043 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 9는 DAS-PZ-20570 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 10은 Mo17-14519 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 11은 DAS-PZ-12236 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 12는 DAS-PZ-366 SNP 및 플랭킹 서열을 함유한다.
서열식별번호: 13은 PZA01216.1의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 14는 PZA01216.1의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 15는 PZA01216.1의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 16은 서열식별번호: 1의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 17은 서열식별번호: 1의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 18은 서열식별번호: 1의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 19는 서열식별번호: 2의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 20은 서열식별번호: 2의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 21은 서열식별번호: 2의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 22는 magi17761의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 23은 magi17761의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 24는 magi17761의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 25는 서열식별번호: 3의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 26은 서열식별번호: 3의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 27은 서열식별번호: 3의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 28은 서열식별번호: 4의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 29는 서열식별번호: 4의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 30은 서열식별번호: 4의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 31은 서열식별번호: 5의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 32는 서열식별번호: 5의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 33은 서열식별번호: 5의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 34는 PZA03203-2의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 35는 PZA03203-2의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 36은 PZA03203-2의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 37은 서열식별번호: 6의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 38은 서열식별번호: 6의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 39는 서열식별번호: 6의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 40은 PZA03409의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 41은 PZA03409의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 42는 PZA03409의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 43은 서열식별번호: 7의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 44는 서열식별번호: 7의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 45는 서열식별번호: 7의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 46은 서열식별번호: 8의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
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서열식별번호: 48은 서열식별번호: 8의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 49는 서열식별번호: 9의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 50은 서열식별번호: 9의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 51은 서열식별번호: 9의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 52는 PZA02965의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 53은 PZA02965의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 54는 PZA02965의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 55는 서열식별번호: 10의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 56은 서열식별번호: 10의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 57은 서열식별번호: 10의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 58은 서열식별번호: 11의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 59는 서열식별번호: 11의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 60은 서열식별번호: 11의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 61은 magi52178의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 62는 magi52178의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 63은 magi52178의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 64는 서열식별번호: 12의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 65는 서열식별번호: 12의 증폭용 정방향 PCR 프라이머이다.
서열식별번호: 66은 서열식별번호: 12의 증폭용 역방향 PCR 프라이머이다.
본 발명은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하고 선별하는 방법을 제공한다. 하기 정의는 본 발명의 이해를 돕는 것으로서 제공된다.
용어 "대립유전자"는 특정 좌위에서 발생하는 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열 중 하나를 지칭한다.
"앰플리콘"은 증폭된 핵산, 예를 들어, 임의의 이용가능한 증폭 방법 (예를 들어, PCR, LCR, 전사 등)에 의해 주형 핵산을 증폭시킴으로써 생성된 핵산이다.
핵산 증폭의 맥락에서 용어 "증폭시킴"은 그에 의해 그의 전사된 형태에 대한 선택된 핵산의 추가적 카피가 생성되는 임의의 공정이다. 전형적인 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 매개 방법, 예컨대 리가제 연쇄 반응 (LCR) 및 RNA 중합효소 기재 증폭 (예를 들어, 전사에 의한) 방법을 비롯한 다양한 중합효소 기재 복제 방법을 포함한다.
용어 "어셈블리하다"는 BAC 및 함께 모여 DNA의 인접한 스트레치를 형성하는 그의 성향에 적용된다. BAC는 BAC가 시퀀싱되는 경우 서열 정렬에 기초하여, 또는 그의 BAC 지문의 다른 BAC의 지문으로의 정렬을 통해 콘티그에 "어셈블리한다". 어셈블리는 인터넷 상에서 공개적으로 이용가능한 메이즈 게놈 브라우저 (Maize Genome Browser)를 사용하여 발견될 수 있다.
대립유전자는 서로 연결되는 경우, 및 대립유전자의 존재가 대립유전자를 포함하는 식물에서 바람직한 형질 또는 형질 형태가 발생할 것인지의 지표인 경우 형질과 "연관된다".
"BAC", 또는 박테리아 인공 염색체는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)의 천연 발생 F 인자로부터 유래된 클로닝 벡터이다. BAC는 DNA 서열의 거대 삽입체를 수용할 수 있다. 옥수수에서, 각각 옥수수 게놈 DNA의 거대 삽입체를 함유하는 다수의 BAC, 또는 박테리아 인공 염색체는 콘티그 (중첩하는 인접한 유전자 단편, 또는 "인접한 DNA")으로 어셈블리되었다.
"역교배"는 그에 의해 잡종 자손이 부모 중 하나와 반복적으로 다시 교배되는 공정을 지칭한다. 역교배 책략에서, "공여"친은 유전자이입되는 바람직한 유전자 또는 좌위를 갖는 부모 식물을 지칭한다. "수용"친 (1회 이상 사용됨) 또는 "반복"친 (2회 이상 사용됨)은 유전자 또는 좌위가 유전자이입되는 부모 식물을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Ragot, M. et al. (1995) Marker-assisted backcrossing: a practical example, in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Vol. 72, pp. 45-56], 및 [Openshaw et al., (1994) Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, pp. 41-43]을 참조한다. 초기 교배는 F1 세대를 발생시키며: 따라서, 용어 "BC1"은 반복친의 두 번째 사용을 지칭하고, "BC2"는 반복친의 세 번째 사용을 지칭하는 등이다.
"Bin"은 염색체 절편을 지칭한다. 유전자 지도는 2개의 고정된 코어 마커 (Core Marker) 사이에 대략 20 센티모르간의 빈 (bin)으로 지칭되는 100개의 절편으로 분할된다 (Gardiner et al. 1993 Genetics 134:917-930). 절편은 염색체 번호, 그 후 2-자리 소수 (예를 들어, 1.00, 1.01, 1.02 등)로 표기된다. 빈은 가장 좌측 또는 상부 코어 마커로부터 다음 코어 마커까지의 모든 좌위를 포함하는 구간이다. 빈으로의 좌위의 배치는 지도화 데이터의 정밀도에 의존하며, 마커가 수적으로 증가하거나 집단이 증가함에 따라 확실성이 증가한다. 배치가 통계적으로 불확실한 경우는 언제나, 'Bin1'은 범위의 시작을 지칭하고, 'Bin2'는 범위의 끝을 지칭한다.
센티모르간 ("cM")은 재조합 빈도의 측정 단위이다. 1 cM은 한 유전자 좌위의 마커가 단일 세대에서의 교차로 인해 제2 좌위의 마커로부터 분리될 가능성 1％와 동등하다.
"염색체 구간"은 단일 염색체 상의 식물에 있는 게놈 DNA의 인접한 선형 범위를 지칭한다. 단일 염색체 구간 상에 위치한 유전 요소 또는 유전자는 물리적으로 연결된다. 염색체 구간의 크기는 특별히 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 단일 염색체 구간 내에 위치한 유전 요소는 전형적으로 예를 들어, 20 cM 이하, 또는 대안적으로 10 cM 이하의 유전자 재조합 거리로 유전적으로 연결된다. 즉, 단일 염색체 구간 내의 2개의 유전 요소는 20％ 또는 10％ 이하의 빈도로 재조합을 겪는다. 용어 "염색체 구간"은 이 발명에 제시된 마커 중 임의의 것에 의해 한정된 임의의 및 모든 구간을 지칭한다. 증가된 배양성 및 형질전환성과 상관되는 염색체 구간이 제공된다.
용어 "보체"는 주어진 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 즉, 서열은 염기-쌍형성 규칙에 의해 관련된다.
용어 "인접한 DNA"는 중첩하는 인접한 유전자 단편을 지칭한다.
용어 "코어 빈 마커 (Core Bin Marker) (CBM)"는 염색체 빈의 경계를 한정하는 고정된 코어 마커를 지칭한다.
용어 "교배된" 또는 "교배"는 수분을 통해 자손 (예를 들어, 세포, 종자 또는 식물)을 생성하는 배우자의 융합을 의미한다. 상기 용어는 생식적 교배 (한 식물의 또 다른 식물에 의한 수분) 및 자가수분 (자가-수분, 예를 들어, 화분 및 배주가 동일한 식물로부터의 것인 경우) 둘 다를 포함한다. 용어 "교배시킴"은 수분을 통해 배우자를 융합시켜 자손을 생성하는 행위를 지칭한다.
"유리한 대립유전자"는 바람직한 표현형, 예를 들어, 증가된 배양성 및 형질전환성을 제공하거나, 이에 기여하는 특정 좌위에서의 대립유전자, 또는 대안적으로, 육종 프로그램 또는 식재로부터 제거될 수 있는 감소된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물의 확인 ("반대선택")을 허용하는 대립유전자이다. 마커의 유리한 대립유전자는 유리한 표현형으로 분리되거나, 대안적으로 불리한 식물 표현형으로 분리되며, 따라서 식물을 확인하는 것의 유익을 제공하는 마커 대립유전자이다.
"단편"은 뉴클레오티드 서열의 부분을 의미하는 것으로 의도된다. 단편은 본원에 개시된 방법을 사용한 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다.
"유전자 지도"는 일반적으로 도표 또는 표 형태로 나타내어지는, 주어진 종 내의 1개 이상의 염색체 (또는 염색체) 상의 좌위 사이의 유전적 연관 관계의 묘사이다. 각각의 유전자 지도에 대해, 좌위 사이의 거리는 그들 사이의 재조합 빈도에 의해 측정되며, 좌위 사이의 재조합은 다양한 분자 유전자 마커 (분자 마커로도 지칭됨)를 사용하여 검출될 수 있다. 유전자 지도는 지도화 집단, 사용되는 마커의 유형, 및 상이한 집단 사이의 각각의 마커의 다형적 잠재성의 산물이다. 레드 (led) 사이의 순서 및 유전자 거리는 유전자 지도마다 상이할 수 있다. 그러나, 정보는 통상적 마커의 일반적 프레임워크를 사용하여 한 지도에서 또 다른 지도까지 상관될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 통상적 마커의 프레임워크를 사용하여 각각의 개별적 유전자 지도 상의 관심의 마커 및 다른 좌위의 위치를 확인할 수 있다.
용어 "유전자 마커"는 제한 단편 길이 다형성 (Restriction Fragment Length Polymorphism) (RFLP), 단순 서열 반복 (Simple Sequence Repeat) (SSR), 무작위 증폭된 다형적 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA) (RAPD), 절단된 증폭된 다형적 서열 (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) (CAPS) (Rafalski and Tingey, 1993, Trends in Genetics 9:275-280), 증폭된 단편 길이 다형성 (Amplified Fragment Length Polymorphism) (AFLP) (Vos et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23:4407-4414), 단일 뉴클레오티드 다형성 (Single Nucleotide Polymorphism) (SNP) (Brookes, 1999, Gene 234:177-186), 서열 특징화된 증폭된 영역 (Sequence Characterized Amplified Region) (SCAR) (Pecan and Michelmore, 1993, Theor. Appl. Genet, 85:985-993), 서열 태깅된 부위 (Sequence Tagged Site) (STS) (Onozaki et al. 2004, Euphytica 138:255-262), 단일 가닥 입체형태 다형성 (Single Stranded Conformation Polymorphism) (SSCP) (Orita et al., 1989, Proc Natl Aced Sci USA 86:2766-2770), 단순 서열간 반복 (Inter-Simple Sequence Repeat) (ISR) (Blair et al. 1999, Theor. Appl. Genet. 98:780-792), 레트로트랜스포존간 증폭된 다형성 (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) (IRAP), 레트로트랜스포존-미세위성 증폭된 다형성 (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) (REMAP) (Kalendar et al., 1999, Theor. Appl. Genet 98:704-711), RNA 절단 생성물 (예컨대 링크스 (Lynx) 태그) 등을 비롯한 그러나 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 핵산 기재 마커를 지칭할 것이다.
"유전자 재조합 빈도"는 2개의 유전자 좌위 사이의 교차 이벤트 (재조합)의 빈도이다. 재조합 빈도는 감수분열 후 마커 및/또는 형질의 분리에 따라 관찰될 수 있다.
"게놈"은 염색체 또는 염색체 세트에 의해 운반된 총 DNA, 또는 유전자의 전체 세트를 지칭한다.
용어 "유전자형"은 관찰가능한 형질 (표현형)과 대비된 바와 같은 1개 이상의 유전자 좌위에서의 개체 (또는 개체의 군)의 유전자 구성이다. 유전자형은 개체가 그의 부모로부터 물려받은 1개 이상의 기지의 좌위의 대립유전자(들)에 의해 한정된다. 용어 유전자형은 단일 좌위에서의, 다중 레드에서의 개체의 유전자 구성을 지칭하는 데 사용될 수 있거나, 보다 일반적으로, 용어 유전자형은 그의 게놈 중의 모든 유전자에 대한 개체의 유전자 구성을 지칭하는 데 사용될 수 있다.
"생식질"은 개체 (예를 들어, 식물), 개체의 군 (예를 들어, 식물 계통, 변종 또는 과), 또는 계통, 변종, 종, 또는 배양물로부터 유래된 클론의 또는 그로부터의 유전 물질을 지칭한다. 생식질은 유기체 또는 세포의 일부일 수 있거나, 유기체 또는 세포로부터 별개일 수 있다. 일반적으로, 생식질은 유기체 또는 세포 배양물의 유전적 특성의 일부 또는 전부에 대한 물리적 근간을 제공하는 특이적 분자 구성을 유전 물질에 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 생식질은 그로부터 새로운 식물이 성장될 수 있는 세포, 종자 또는 조직, 또는 전체 식물로 배양될 수 있는 식물 부분, 예컨대 잎, 줄기, 화분, 또는 세포를 포함한다.
"일배체형"은 복수의 유전자 레이스, 즉, 대립유전자의 조합에서의 개체의 유전자형이다. 전형적으로, 일배체형에 의해 기재되는 유전자 좌위는 물리적으로 및 유전적으로 연결되며, 즉, 동일한 염색체 절편 상에 있다. 용어 "일배체형"은 특정 좌위, 예컨대 단일 마커 좌위에서의 서열 다형성, 또는 주어진 게놈 중의 염색체 절편을 따른 다중 좌위에서의 서열 다형성을 지칭할 수 있다. 전자는 또한 "마커 일배체형" 또는 "마커 대립유전자"로 지칭될 수 있는 반면, 후자는 "긴-범위 일배체형"으로 지칭될 수 있다.
"잡종 군"은 상이한 잡종 군으로부터의 유전자형과 교배되는 경우 성능이 양호한 유전자형의 세트를 포함한다 (Hallauer at al. (1998) Corn breeding, p. 463-564. In G. F. Sprague and J. W. Dudley (ed) Corn and corn improvement). 순계교배 계통은 잡종 군으로 분류되며, 몇몇 기준, 예컨대 혈통, 분자 마커-기재 연관성, 및 잡종 조합에서의 성능에 기초하여 잡종 군 내에서 과로 더 세분된다 (Smith at al. (1990) Theor. Appl. Gen. 80:833-840). 미국에서 2가지 가장 폭넓게 사용되는 잡종 군은 "아이오와 스티프 스토크 신테틱 (Iowa Stiff Stalk Synthetic) (BSSS) 및 "랭커스터 (Lancaster)" 또는 "랭커스터 슈어 크롭 (Lancaster Sure Crop)" (때로 NSS, 또는 아이언-스티프 스토크로 지칭됨)으로 지칭된다.
용어 "이형접합성"은 상이한 대립유전자가 상동성 염색체 상의 상응하는 위치에 있는 유전자 상태를 의미한다.
용어 "동형접합성"은 동일한 대립유전자가 상동성 염색체 상의 상응하는 위치에 있는 유전자 상태를 의미한다.
"혼성화" 또는 "핵산 혼성화"는 상보적 RNA 및 DNA 가닥의 쌍형성 뿐만 아니라 상보적 DNA 단일 가닥의 쌍형성을 지칭한다.
용어 "혼성화하다"는 핵산 가닥의 상보적 영역 사이에 염기 쌍을 형성하는 것을 의미한다.
"IBM 유전자 지도"는 하기 지도 중 임의의 것을 지칭한다: IBM, IBM2, IBM2 네이버즈, IBM2 FPC0507, IBM2 2004 네이버즈, IBM2 2005 네이버즈, IBM2 2005 네이버즈 프레임, 또는 IBM2 2008 네이버즈. IBM 유전자 지도는 초기 교배로부터의 자손이 지도화를 위한 재조합 순계교배 계통을 구축하기 이전에 다중 세대에 대해 무작위 비율이었던 B73 X Mo17 집단에 기초한다. 보다 새로운 형태는 유전자 및 BAC 지도화된 클론의 첨가 뿐만 아니라 다른 유전자 지도로부터 얻어진 정보의 포함으로 인한 향상된 지도 개량을 반영한다.
용어 "삽입결실"은 삽입 또는 결실을 지칭하며, 여기서, 한 계통은 제2 계통에 비해 삽입을 갖는 것으로 지칭될 수 있거나, 제2 계통은 제1 계통에 비해 결실을 갖는 것으로 지칭될 수 있다.
용어 "유전자이입" 또는 "유전자이입시킴"은 한 유전자 배경으로부터 또 다른 것으로 유전자 좌위의 바람직한 대립유전자의 전달을 지칭한다. 예를 들어, 특정된 좌위에서의 바람직한 대립유전자의 유전자이입은 동일한 종의 2개의 부모 사이의 생식적 교배를 통해 적어도 1개의 자손으로 전달될 수 있으며, 여기서, 부모 중 적어도 1개는 그의 게놈에 바람직한 대립유전자를 갖는다. 대안적으로, 예를 들어, 대립유전자의 전달은 예를 들어, 융합된 원형질체 중의 2개의 공여자 게놈 사이의 재조합에 의해 발생할 수 있으며, 여기서, 공여자 원형질체 중 적어도 1개는 그의 게놈에 바람직한 대립유전자를 갖는다. 바람직한 대립유전자는 예를 들어, 마커, QTL, 트랜스진 등의 선택된 대립유전자일 수 있다. 어느 경우에도, 바람직한 대립유전자를 포함하는 자손은 바람직한 유전자 배경을 갖는 계통으로 반복적으로 역교배되고, 바람직한 대립유전자에 대해 선택되어, 선택된 유전자 배경에서 고정되게 되는 대립유전자를 초래할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 염색체 1 좌위는 문제가 있는 녹색 스냅을 갖는 반복친 내로 유전자이입될 수 있다. 그러면, 유전자이입된 유전자 또는 좌위를 갖는 반복친 계통은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "연관"은 하나의 마커 좌위가 또 다른 마커 좌위 또는 일부 다른 좌위 (예를 들어, 배양성 및 형질전환성 좌위)와 연관되는 정도를 기재하는 데 사용된다. 분자 마커와 표현형 사이의 연관 관계는 "확률" 또는 "조정된 확률"로서 주어진다. 연관은 바람직한 한계 또는 범위로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 임의의 마커는, 마커가 cM으로 50, 40, 30, 25, 20, 또는 15 지도 단위 미만 분리된 경우, 임의의 다른 마커에 (유전적으로 및 물리적으로) 연결된다. 일부 측면에서, 연관의 묶은 범위, 예를 들어, 10 내지 20 cM, 10 내지 30 cM, 또는 10 내지 40 cM을 한정하는 것이 유리하다. 마커가 제2 좌위에 보다 가깝게 연결될 수록, 마커가 제2 좌위가 되는 것에 대한 보다 양호한 지표이다. 따라서, "가깝게 연결된 좌위", 예컨대 마커 좌위 및 제2 좌위는 10％ 이하, 바람직하게는 약 9％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 8％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 7％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 6％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 5％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 4％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 3％ 이하, 및 보다 더 바람직하게는 약 2％ 이하의 좌위간 재조합 빈도를 나타낸다. 매우 바람직한 실시양태에서, 관련 좌위는 약 1％ 이하, 예를 들어, 약 0.75％ 이하, 보다 바람직하게는 약 0.5％ 이하, 또는 보다 더 바람직하게는 약 0.25％ 이하의 재조합 빈도를 나타낸다. 동일한 염색체에 국재화된, 및 2개의 좌위 사이의 재조합이 10 미만 (예를 들어, 약 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.75％, 0.5％, 0.25％ 이하)의 빈도로 발생하는 그러한 거리에 있는 2개의 좌위는 또한 서로"에게 근접"하다고 한다. 1 cM은 1％ 재조합 빈도를 나타내는 2개의 마커 사이의 거리이기 때문에, 임의의 마커는 가깝게 근접한, 예를 들어, 10 cM 미만의 거리에 있는 임의의 다른 마커에 (유전적으로 및 물리적으로) 가깝게 연결된다. 동일한 염색체 상의 2개의 가깝게 연결된 마커는 서로로부터 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5 또는 0.25 cM 이하에 위치될 수 있다.
용어 "연관 불평형"은 유전자 좌위 또는 형질 (둘 다에 대해)의 비-무작위 분리를 지칭한다. 어느 경우에도, 연관 불평형은 관련 좌위가 염색체의 길이를 따라 충분한 물리적 근접성 내에 있어서, 이들이 무작위보다 더 큰 (즉, 비-무작위) 빈도로 함께 분리되는 것을 암시한다 (공동-분리 형질의 경우, 형질의 근간을 이루는 좌위는 서로 충분히 근접함). 연관 불평형을 나타내는 마커는 연결된 것으로 간주된다. 연결된 좌위는 시간의 50％ 초과, 예를 들어 시간의 약 51％ 내지 약 100％ 공동분리된다. 다시 말해서, 공동분리되는 2개의 마커는 50％ 미만의 재조합 빈도를 갖는다 (그리고 정의상, 동일한 염색체 상에 50 cM 미만 분리된다). 본원에 사용된 바와 같은 연관은 2개의 마커 사이, 또는 대안적으로 마커와 표현형 사이일 수 있다. 마커 좌위는 형질, 예를 들어, 감소된 녹색 스냅"과 연관될" (그에 연결될) 수 있다. 표현형적 형질에 대한 분자 마커의 연관의 정도는 예를 들어 그 분자 마커와 표현형의 공동-분리의 통계적 확률로서 측정된다.
연관 불평형은 가장 통상적으로 문헌 [Hill, W. G. and Robertson, A, Theor Appl. Genet 38:226-231 (1988)]에 의해 기재된 공식을 사용하여 계산되는 단위 r2을 사용하여 측정된다. r2=1인 경우, 완전 LD는 2개의 마커 좌위 사이에 존재하며, 이는 마커가 재조합에 의해 분리되지 않았으며, 동일한 대립유전자 빈도를 가짐을 의미한다. 1/3 초과의 r2에 대한 값은 지도화에 유용한 충분히 강한 LD를 지시한다 (Ardlie at al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)). 따라서, 대립유전자는 쌍별 마커 좌위 사이의 r2 값이 0.33, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1.0 이상인 경우 연관 불평형에 있다.
본원에 사용된 "연관 평형"은 2개의 마커가 독립적으로 분리되는, 즉, 자손 사이에 무작위로 구분되는 상황을 기재한다. 연관 평형을 나타내는 마커는 비연결된 것으로 간주된다 (이들이 동일한 염색체 상에 놓여 있든지 그렇지 않든지).
"공산의 로그 (LOD) 값" 또는 "LOD 점수" (Risch, Science 255:803-804 (1992))는 구간 지도화에서 2개의 마커 좌위 사이의 연관의 정도를 기재하는 데 사용된다. 2개의 마커 사이에 3의 LOD 점수는 연관이 없는 것보다 1000배 더 연관이 가능성 있음을 지시하는 반면, 2의 LOD 점수는 연관이 없는 것보다 100배 더 연관이 가능성 있음을 지시한다. 2 이상의 LOD 점수는 연관을 검출하는 데 사용될 수 있다.
"좌위"는 유전자 또는 마커가 위치하는 염색체 상의 위치이다.
"옥수수 (maize)"는 제아 마이스 엘. 아종 마이스 (Zea mays L. ssp. mays)의 식물을 지칭하며, 또한 "옥수수 (corn)"로도 알려져 있다.
용어 "옥수수 식물"은 전체 옥수수 식물, 옥수수 식물 세포, 옥수수 식물 원형질체, 그로부터 옥수수 식물이 재생될 수 있는 옥수수 식물 세포 또는 옥수수 조직 배양물, 옥수수 식물 캘러스, 및 옥수수 식물 또는 옥수수 식물의 부분, 예컨대 옥수수 종자, 옥수수 콥, 옥수수 꽃, 옥수수 자엽, 옥수수 잎, 옥수수 줄기, 옥수수 눈, 옥수수 뿌리, 옥수수 근단 등에서 무손상인 옥수수 식물 세포를 포함한다.
"마커"는 참조 기준으로서 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 코딩된 생성물 (예를 들어, 단백질)이다. 마커가 재조합을 검출하는 데 유용한 것이 되기 위해, 이는 모니터링되는 집단 내의 차이, 또는 다형성을 검출할 필요가 있다. 분자 마커에 대해, 이는 폴리뉴클레오티드 서열 차이로 인한 DNA 수준에서의 차이 (예를 들어 SSR, RFLP, FLP, SNP)를 의미한다. 게놈 가변성은 임의의 기원, 예를 들어, 삽입, 결실, 중복, 반복 요소, 점 돌연변이, 재조합 이벤트, 또는 전위성 요소의 존재 및 서열의 것일 수 있다. 분자 마커는 게놈 또는 발현된 핵산 (예를 들어, EST)으로부터 유래될 수 있으며, 또한 PCR-기재 방법의 사용을 통해 서열 단편을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로서 사용되는 핵산을 지칭할 수 있다. 다수의 옥수수 분자 마커가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 다양한 출처, 예컨대 메이즈 GDB 인터넷 (Maize GDB Internet) 리소스 및 유니버시티 오브 아리조나 (University of Arizona)에 의해 운영되는 아리조나 게노믹스 인스티튜트 인터넷 (Arizona Genomics Institute Internet) 리소스로부터 공개되어 있거나 이용가능하다.
집단의 구성원 사이의 유전자 다형성에 상응하는 마커는 관련 기술분야에서 널리 확립된 방법에 의해 검출될 수 있다. 이들로는 예를 들어, DNA 시퀀싱, PCR-기재 서열 특이적 증폭 방법, 제한 단편 길이 다형성 (RFLP)의 검출, 이소자임 마커의 검출, 대립유전자 특이적 혼성화 (ASH)에 의한 폴리뉴클레오티드 다형성의 검출, 식물 게놈의 증폭된 가변 서열의 검출, 자기-유지 서열 복제의 검출, 단순 서열 반복 (SSR)의 검출, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)의 검출, 또는 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP)의 검출을 들 수 있다. 발현된 서열 태그 (EST) 및 EST 서열로부터 유래된 SSR 마커 및 무작위로 증폭된 다형적 DNA (RAPD)의 검출에 대한 널리 확립된 방법도 또한 공지되어 있다.
"마커 대립유전자", 대안적으로 "마커 좌위의 대립유전자"는 마커 좌위에 대해 다형적인 집단에서의 마커 좌위에서 발견되는 복수의 다형적 뉴클레오티드 서열 중 하나를 지칭할 수 있다.
"마커 보조 선별 (MAS)"은 표현형을 마커 유전자형에 기초하여 선별하는 공정이다.
"마커 보조 반대-선별"은 마커 유전자형을 사용하여 선별되지 않을 것인 식물을 확인하여, 그들이 육종 프로그램 또는 식재로부터 제거되게 하는 공정이다.
"마커 일배체형"은 마커 좌위에서의 대립유전자의 조합, 예를 들어 PZA01216 대립유전자 1을 지칭한다.
"마커 좌위"는 특이적 마커가 발견될 수 있는 경우 종의 게놈에서의 특이적 염색체 위치이다. 마커 좌위는 제2 연결된 좌위, 예를 들어, 표현형적 형질의 발현을 코딩하거나 그에 기여하는 연결된 좌위의 존재를 추적하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 마커 좌위는 마커 좌위에 유전적으로 또는 물리적으로 연결된 좌위, 예컨대 QTL 또는 단일 유전자에서의 대립유전자의 분리를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
"마커 프로브"는 마커 좌위의 존재를 확인하는 데 사용될 수 있는 핵산 서열 또는 분자이며, 예를 들어, 핵산 혼성화를 통해 마커 좌위 서열에 상보적인 핵산 프로브이다. 마커 좌위 (마커 좌위 서열의 "전부 또는 일부")의 30개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 마커 프로브는 핵산 혼성화에 사용될 수 있다. 대안적으로, 일부 측면에서, 마커 프로브는 마커 좌위에 존재하는 특정 대립유전자를 구별할 수 있는 임의의 유형 (즉, 유전자형)의 프로브를 지칭한다.
용어 "분자 마커"는 연결된 좌위를 확인할 때 참조 기준으로서 사용되는 상기 정의된 바와 같은 유전자 마커, 또는 그의 코딩된 생성물 (예를 들어, 단백질)을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터 (예를 들어, 스플라이싱된 RNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 상기 용어는 또한 마커 서열에 상보적이거나 플랭킹되는 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로서 사용되는 핵산을 지칭한다.
"분자 마커 프로브"는 마커 좌위의 존재를 확인하는 데 사용될 수 있는 핵산 서열 또는 분자, 예를 들어, 마커 좌위 서열에 상보적인 핵산 프로브이다. 대안적으로, 일부 측면에서, 마커 프로브는 마커 좌위에 존재하는 특정 대립유전자를 구별할 수 있는 임의의 유형 (즉, 유전자형)의 프로브를 지칭한다. 핵산은 이들이 예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성 규칙에 따라 용액에서 특이적으로 혼성화되는 경우 "상보적"이다. 본원에 기재된 마커 중 일부는 또한 삽입결실 영역, 예컨대 본원에 기재된 비-동일선상 영역 상에 위치하는 경우 혼성화 마커로 지칭된다. 이는 삽입 영역이 정의상 삽입이 없는 식물에 관한 다형성이기 때문이다. 따라서, 마커는 단지 삽입결실 영역이 존재하는지 부재하는지 여부만을 지시할 필요가 있다. 임의의 적합한 마커 검출 기술은 이러한 혼성화 마커를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, SNP 기술은 본원에 제공된 실시예에서 사용된다.
"뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열", 및 "핵산 단편"은 호환적으로 사용되며, 임의로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는 단일- 또는 이중-가닥인 RNA 또는 DNA의 중합체를 지칭한다. "뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 중합체가 구축되는 단량체 단위이며, 퓨린 또는 피리미딘 염기, 5탄당, 및 인산 기로 이루어진다. 뉴클레오티드 (통상적으로 그의 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 그의 단일 문자 명칭에 의해 하기와 같이 지칭된다: 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트에 대해 (각각 RNA 또는 DNA에 대해) "A", 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트에 대해 "C", 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트에 대해 "G", 우리딜레이트에 대해 "U", 데옥시티미딜레이트에 대해 "T", 퓨린 (A 또는 G)에 대해 "R", 피리미딘 (C 또는 T)에 대해 "Y", G 또는 T에 대해 "K", A 또는 C 또는 T에 대해 "H", 이노신에 대해 "I", 및 임의의 뉴클레오티드에 대해 "N".
용어 "표현형", 또는 "표현형적 형질" 또는 "형질"은 유기체의 1개 이상의 형질을 지칭한다. 표현형은 맨눈으로, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 평가 수단, 예를 들어, 현미경검사, 생화학적 분석, 또는 전기기계적 검정에 의해 관찰가능할 수 있다. 일부의 경우, 표현형은 단일 유전자 또는 유전자 좌위에 의해 직접적으로 제어되며, 즉, "단일 유전자 형질"이다. 다른 경우, 표현형은 몇몇 유전자의 결과이다.
게놈의 "물리적 지도"는 염색체 DNA 상의 확인가능한 랜드마크 (유전자, 마커 등을 포함함)의 선형 순서를 나타내는 지도이다. 그러나, 유전자 지도와 대조적으로, 랜드마크 사이의 거리는 절대적이며 (예를 들어, 염기 쌍 또는 단리되고 중첩하는 인접한 유전자 단편에서 측정됨), 유전자 재조합에 기초하지 않는다.
"식물"은 전체 식물, 그의 임의의 부분, 또는 식물로부터 유래된 세포 또는 조직 배양물일 수 있다. 따라서, 용어 "식물"은 전체 식물, 식물 성분 또는 기관 (예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 식물 조직, 종자, 식물 세포, 및/또는 그의 자손 중 임의의 것을 지칭할 수 있다. 식물 세포는 식물로부터 취해지거나, 식물로부터 취해진 세포로부터의 배양을 통해 유래된 식물의 세포이다.
"식물 조직 배양"은 공지된 조성의 양분 배양 배지 상에서 멸균 조건 하에서 식물 세포, 조직 또는 기관을 유지하거나 성장시키는 데 사용되는 기술의 집합을 지칭한다. 식물 조직 배양은 많은 식물 세포가 전체 식물을 재생시키는 능력을 갖는다는 사실에 의존한다. 식물 조직 배양에서의 여러가지 기술은 전통적 증식 방법에 비해 특정 이점을 제공할 수 있다.
"다형성"은 단지 새로운 돌연변이로 인한 것이라기에는 너무나 통상적인 DNA의 변이이다. 다형성은 집단에서 적어도 1％의 빈도를 가져야 한다. 다형성은 단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 SNP, 또는 본원에서 "삽입결실"로도 지칭되는 삽입/결실 다형성일 수 있다.
"확률 값" 또는 "p-값"은 표현형의 특정 조합 및 특정 마커 대립유전자의 존재 또는 부재가 무작위일 통계적 가능성이다. 따라서, 확률 점수가 보다 낮을 수록, 표현형 및 특정 마커가 공동분리될 가능성은 더 크다. 일부 측면에서, 확률 점수는 "유의한" 또는 "비유의한" 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 무작위 모음의 0.05의 확률 점수 (p=0.05, 또는 5％ 확률)는 공동-분리의 유의한 지시로 간주된다. 그러나, 허용가능한 확률은 50％ (p=0.5) 미만의 임의의 확률이다. 예를 들어, 유의한 확률은 0.25 미만, 0.20 미만, 0.15 미만, 0.1 미만, 0.05 미만, 0.01 미만, 또는 0.001 미만일 수 있다.
용어 "자손"은 교배로부터 생성된 자손을 지칭한다.
"자손 식물"은 2개의 식물 사이의 교배로부터 생성된다.
"참조 서열"은 서열 비교에 대한 기준으로서 사용되는 한정된 서열이다. 참조 서열은 좌위에서의 다수의 계통을 유전자형분석하고, 서열 정렬 프로그램 (예를 들어 시켄처 (Sequencher))에서 뉴클레오티드 서열을 정렬한 후, 정렬의 컨센서스 서열을 얻음으로써 얻어진다.
"재생"은 식물 세포 (예를 들어, 식물 원형질체, 캘러스 또는 외식편)로부터 식물을 성장시키는 공정이다.
"스티프 스토크" 잡종 군은 북부 미국 및 캐나다 옥수수 성장 지역에서의 주요 잡종 군을 나타낸다. 이는 또한 BSSS 잡종 군에 대해 아이오아 스티프 스토크 신테틱으로 지칭될 수 있다.
용어 "형질전환"은 외인성 DNA가 염색체 내로 혼입되거나, 자율적 복제를 할 수 있는 세포 또는 원형질체 내로 DNA 서열 또는 구축물 (예를 들어, 벡터 또는 발현 카세트)을 도입하는 공정을 지칭한다.
어구 "엄격한 조건 하에서"는 그 하에서 프로브 또는 폴리뉴클레오티드가 전형적으로 핵산의 복합체 혼합물 중에서 특이적 핵산 서열에 혼성화하지만, 본질적으로 다른 서열에는 혼성화하지 않을 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다.
보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 농도, pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50％가 평형에서 표적 서열에 혼성화하는 (한정된 이온 농도, pH, 및 핵산 농도 하에서의) 온도이다 (표적 서열은 Tm에서 과량으로 존재하며, 프로브의 50％는 평형에서 점유됨). 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 소듐 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M 소듐 이온 농도 (또는 다른 염)이며, 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이고, 긴 프로브 (예를 들어 50 뉴클레오티드 초과)에 대해 적어도 약 60℃인 것들일 것이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 적어도 2배 배경, 바람직하게는 10배 배경 혼성화이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 대개 50％ 포름아미드, 5xSSC, 및 1％ SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5xSSC, 1％ SOS, 65℃에서 인큐베이션, 0.2xSSC, 및 0.1％ SDS에서 65℃에서 세척이다. PCR을 위해, 약 36℃의 온도는 낮은 엄격성 증폭에 대해 전형적이지만, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃에서 다양할 수 있다. 혼성화 파라미터의 결정을 위한 추가의 지침은 다수의 참고문헌에 제공되어 있다.
서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 LASERGENE.RTM. 생물정보학 컴퓨팅 스위트의 MEGALIGN.RTM 프로그램 (디엔에이스타.알티엠. 인코포레이티드 (DNASTAR.RTM. Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨)을 비롯한 그러나 이에 제한되지 않는, 상동성 서열을 검출하도록 설계된 다양한 비교 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 달리 언급되지 않는다면, 본원에 제공된 서열의 다중 정렬은 디폴트 파라미터 (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)를 갖는 클러스탈 (Clustal) V 정렬 방법 (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989))을 사용하여 수행하였다. 클러스탈 V 방법을 사용한 단백질 서열의 쌍별 정렬 및 퍼센트 동일성의 계산을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다. 핵산에 대해 이들 파라미터는 KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 및 DIAGONALS SAVED=4이다. 서열의 정렬 후, 클러스털 V 프로그램을 사용하여, 동일한 프로그램 상에서 "서열 거리" 표를 봄으로써 "퍼센트 동일성" 및 "차이성" 값을 얻을 수 있으며; 달리 언급되지 않는다면, 본원에 제공되고 청구된 퍼센트 동일성 및 차이는 이 방식으로 계산하였다.
"벡터"는 숙주 세포에서 복제될 수 있고/거나, 부착된 절편의 복제를 야기하도록 또 다른 DNA 절편이 작동적으로 연결될 수 있는 DNA 분자이다. 플라스미드는 예시적인 벡터이다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 이 발명은 특정 실시양태에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하는 목적을 위한 것이며, 제한인 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 본원에 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수의 용어 및 단수 형태 (예를 들어, "a", "an" 및 "the")는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 복수 언급대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "식물 (plant)", "식물 (the plant)" 또는 "식물 (a plant)"에 대한 언급은 또한 복수의 식물을 포함한다. 맥락에 따라, 용어 "식물"의 사용은 또한 그 식물의 유전적으로 유사하거나 동일한 자손을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"의 사용은 임의로 그 핵산 분자의 많은 카피를 포함한다.
유전자 지도화
꽤 오랫동안, 특정 표현형, 예컨대 증가된 배양성 및 형질전환성과 상관되는 특이적 유전자 좌위는 유기체의 게놈에서 지도화될 수 있다고 인식되어 왔다. 식물 육종가는 연관 불평형으로서 나타난, 바람직한 표현형과의 통계적으로 유의한 확률의 공동-분리를 나타내는 마커 대립유전자를 검출함으로써 바람직한 개체를 확인하는 데 분자 마커를 유리하게 사용할 수 있다. 관심의 형질과 공동분리되는 분자 마커 또는 분자 마커의 클러스터를 확인함으로써, 육종가는 적절한 분자 마커 대립유전자에 대해 선별함으로써 바람직한 표현형을 빠르게 선별할 수 있다 (마커-보조 선별, 또는 MAS로 지칭되는 공정).
관심의 형질, 예컨대 증가된 배양성 및 형질전환성과 공동분리되는 분자 마커 또는 분자 마커의 클러스터를 검출하는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 방법이 이용가능하다. 이들 방법의 근간을 이루는 기본 개념은 그에 대해 대안적 유전자형 (또는 대립유전자)가 유의하게 상이한 평균 표현형을 갖는 마커의 검출이다. 따라서, 대안적 유전자형 (또는 대립유전자) 사이의 차이의 규모 또는 그 차이의 유의성의 수준의 비교를 마커 좌위 사이에 행한다. 형질 유전자는 가장 큰 연관된 유전자형 차이를 갖는 마커(들) 가장 가까이 위치하는 것으로 추론된다.
관심의 형질 좌위를 검출하는 데 사용되는 이러한 방법 2가지는: 1) 집단 기재 연관성 분석 및 2) 전통적 연관 분석이다. 집단-기재 연관성 분석에서, 계통은 다중 시조, 예를 들어 엘리트 육종 계통을 갖는 기존의 집단으로부터 얻어진다. 집단-기재 연관성 분석은 연관 불평형 (LD)의 쇠퇴, 및 비구조화된 집단에서, 관심의 형질을 제어하는 유전자와 그들 유전자에 가깝게 연결된 마커 사이의 상관성만이 무작위 교배의 아주 많은 세대 후에 남아 있을 것이라는 개념에 의존한다. 사실, 대부분의 기존의 집단은 집단 하위구조를 갖는다. 따라서, 구조화된 연관성 접근법의 사용은 게놈을 통해 무작위로 분포된 마커로부터 얻어진 데이터를 사용하여 개체를 집단으로 할당함으로써, 개별적 집단 (하위집단으로도 지칭됨) 내의 집단 구조로 인한 불평형을 최소화함으로써, 집단 구조를 제어하는 것을 돕는다. 표현형적 값은 하위집단에서 각각의 계통에 대한 각각의 마커 좌위에서의 유전자형 (대립유전자)과 비교된다. 유의한 마커-형질 연관성은 마커 좌위와 그 형질의 발현에 관여하는 1개 이상의 유전자 좌위 사이의 가까운 근접성을 지시한다.
동일한 원리가 전통적 연관 분석의 근간을 이루지만; 그러나, LD는 소수의 시조로부터 집단을 생성함으로써 생성된다. 시조는 구축된 집단 내의 다형성의 수준을 최대화하도록 선택되며, 다형적 부위는 주어진 표현형과의 그의 공동분리의 수준에 대해 평가된다. 유의한 마커-형질 연관성을 확인하기 위해 다수의 통계적 방법이 사용되어 왔다. 이러한 방법 중 하나는 구간 지도화 접근법 (Lander and Botstein, Genetics 121:185-199 (1989))이며, 여기서, 유전자 지도를 따르는 많은 위치의 각각 (말하자면, 1 cM 구간에서)을 관심의 형질을 제어하는 유전자가 그 위치에 위치할 가능성에 대해 시험한다. 유전자형/표현형 데이터를 사용하여 각각의 시험 위치에 대해 LOD 점수 (가능성 비의 로그)를 계산한다. LOD 점수가 역치 값을 초과하는 경우, 유전자 지도 상의 그 위치 (2개의 특정 마커 좌위 사이에 해당할 것임)에서의 관심의 형질을 제어하는 유전자의 위치에 대한 유의한 증거가 있다.
상기 기재된 바와 같이, 관심의 형질, 예컨대 증가된 배양성 및 형질전환성과 공동분리되는 분자 마커 또는 분자 마커의 클러스터를 검출하는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법이 이용가능하다. 그러나, 특정 실험적 공정, 예컨대 배양, 형질전환 및 재생의 행위는 식물의 유전자 분리 집단에 대한 선택압을 가하므로, 단지 관심의 형질에 대한 유전자 영역을 함유하는 식물만이 생존하고, BC1 식물이 될 수 있다. 이어서, 유전자 좌위가 관심의 형질에 중요할 경우, 부모 중 하나에 의해 운반된 대립유전자가 선택될 것이다. 따라서, 선택압이 가해진 후에 게놈이 조사되는 경우, 관심의 형질에 중요한 대립유전자는 50％ 초과의 빈도로 발생한다. 50％ 초과로 유의한 편차를 나타내는 마커는 선택의 양성 효과를 나타내는 좌위를 나타내며, 카이-제곱 검정 (p < 0.05)을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 분자 마커 검출을 위한 방법은 본원 내에 기재되어 있다.
증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커.
증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커는 본원에서 확인된다. 상기 방법은 옥수수 식물의 생식질의 증강과 연관된 적어도 1개의 마커 대립유전자의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 마커 좌위는 PZA01216.1, DAS-PZ-7146, DAS-PZ-12685, magi17761, Mo17-100177, DAS-PZ-5617, DAS-PZ-2343, PZA03203-2, Mo17-100291, PZA03409, DAS-PZ-19188, DAS-PZ-2043, DAS-PZ-20570, PZA02965, Mo17-14519, DAS-PZ-12236, magi52178, 및 DAS-PZ-366, 및 이들 마커에 연결된 임의의 다른 마커 (연결된 마커는 메이즈 GDB 리소스로부터 결정될 수 있음)를 비롯한, 표 1에 제공된 마커 좌위 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.
단일 염색체 상의 게놈 DNA의 인접한 선형 범위 상에 위치하는 유전 요소 또는 유전자는 물리적으로 연결된다. 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 마커 asg62 및 magi87535는 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. asg62 및 magi87535, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 asg62와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 magi87535, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 magi87535와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
게다가, 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 npi386a 및 gpm174b는 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. npi386a, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 npi386a와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 gpm174b, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 gpm174b와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
게다가, 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 agrr37b 및 nfa104는 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. agrr37b, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 agrr37b와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 nfa104, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 nfa104와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
게다가, 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 umc156a 및 pco061578은 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. umc156a, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 umc156a와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 pco061578, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 pco061578과 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
게다가, 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 php20608a 및 idp6638은 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. php20608a, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 php20608a와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 idp6638, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 idp6638과 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
게다가, 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 bnl4.36 및 umc1482는 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. bnl4.36, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 bnl4.36과 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 umc1482, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 umc1482와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
게다가, 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 umc126a 및 idp8312는 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. umc126a, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 umc126a와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 idp8312, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 idp8312와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
게다가, 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 bnl9.11a 및 gpm609a는 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. bnl9.11a, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 bnl9.11a와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 gpm609a, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 gpm609a와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
게다가, 둘 다 배양성 및 형질전환성과 매우 연관된 wx1 및 bnlg1209는 배양성 및 형질전환성 QTL을 기술한다. wx1, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 wx1과 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열, 및 bnlg1209, 또는 클러스탈 V 정렬 방법에 기초하여 bnlg1209와 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 및 이를 포함하는 인접한 DNA에 어셈블리하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 배양성 및 형질전환성과 연관된 마커 좌위를 수용할 수 있다. 공개적으로 이용가능한 마커의 서열은 메이즈 GDB 리소스를 사용하여 발견될 수 있다.
연관의 통상적인 측정은 형질이 그와 공동분리되는 빈도이다. 이는 공동분리의 백분율 (재조합 빈도)로서 또는 센티모르간 (cM)으로 표현될 수 있다. cM은 유전자 재조합 빈도의 측정 단위이다. 1 cM은 1개의 유전자 좌위의 형질이 단일 세대에서의 교차로 인해 또 다른 좌위의 형질로부터 분리될 가능성 1％와 동등하다 (형질들이 99％의 확률로 함께 분리함을 의미함). 염색체 거리는 형질 사이의 교차 이벤트의 빈도에 대략 비례하기 때문에, 재조합 빈도와 상관되는 대략적 물리적 거리가 있다.
마커 좌위는 그 자신이 형질이며, 표준 연관 분석에 따라 분리 동안 마커 좌위를 추적함으로써 평가될 수 있다. 따라서, 1 cM은 마커 좌위가 단일 세대에서의 교차로 인해 또 다른 좌위로부터 분리될 가능성 1％와 동등하다.
표 2에 열거된 마커에 연결된 다른 마커는 옥수수 식물에서 배양성 및 형질전환성을 예측하는 데 사용될 수 있다. 이는 PZA01216.1, DAS-PZ-7146, DAS-PZ-12685, magi17761, Mo17-100177, DAS-PZ-5617, DAS-PZ-2343, PZA03203-2, Mo17-100291, PZA03409, DAS-PZ-19188, DAS-PZ-2043, DAS-PZ-20570, PZA02965, Mo17-14519, DAS-PZ-12236, magi52178, 및 DAS-PZ-366의 50 cM 내에 임의의 마커를 포함하며, 마커는 배양성 및 형질전환성과 연관된다. 마커가 관심의 형질을 제어하는 유전자에 보다 가까울 수록, 그 마커는 바람직한 형질에 대한 지표로서 보다 효과적이고 유리하다. 가깝게 연결된 좌위는 약 10％ 이하, 바람직하게는 약 9％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 8％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 7％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 6％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 5％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 4％ 이하, 보다 더 바람직하게는 약 3％ 이하, 및 보다 더 바람직하게는 약 2％ 이하의 좌위간 교차 빈도를 나타낸다. 매우 바람직한 실시양태에서, 관련 좌위 (예를 들어, 마커 좌위 및 표적 좌위)는 약 1％ 이하, 예를 들어, 약 0.75％ 이하, 보다 바람직하게는 약 0.5％ 이하, 또는 보다 더 바람직하게는 약 0.25％ 이하의 재조합 빈도를 나타낸다. 따라서, 좌위는 약 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0.75 cM, 0.5 cM 또는 0.25 cM 이하 떨어져 있다. 바꿔 말하면, 동일한 염색체에 국재화된, 및 2개의 좌위 사이의 재조합이 10％ 미만 (예를 들어, 약 9％, 8％ 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％ 1％, 0.75％, 0.5％, 0.25％, 또는 그 이하)의 빈도로 발생하는 그러한 거리에 있는 2개의 좌위는 서로에게 "근접"하다고 한다.
특정 마커 대립유전자는 증가된 배양성 및 형질전환성과 함께 공동분리를 나타낼 수 있지만, 마커 좌위는 반드시 배양성 및 형질전환성 표현형의 발현의 원인이 되지는 않음을 주목하는 것이 중요하다. 예를 들어, 마커 폴리뉴클레오티드 서열이 증가된 배양성 및 형질전환성을 부여하는 유전자의 일부인 것 (예를 들어, 유전자 오픈 리딩 프레임의 일부인 것)이 요건은 아니다. 특이적 마커 대립유전자와 증가된 배양성 및 형질전환성 표현형 사이의 연관성은 그로부터 대립유전자가 기원하는 조상 옥수수 계통에서의 대립유전자와 마커 대립유전자 사이의 원래 "커플링" 연관 단계에 기인한다. 결국, 반복된 재조합으로, 마커와 유전자 좌위 사이의 교차 이벤트는 이 방향을 변화시킬 수 있다. 이러한 이유로, 유리한 마커 대립유전자는 분리하는 집단을 생성하는 데 사용된 저항성 부모 내에 존재하는 연관 단계에 따라 변화될 수 있다. 이는 마커가 표현형의 분리를 모니터링하는 데 사용될 수 있다는 사실을 변화시키지 않는다. 이는 단지 어느 마커 대립유전자가 주어진 분리하는 집단에서 유리한 것으로 간주되는지만을 변화시킨다.
용어 "염색체 구간"은 이 발명에 제시된 마커 중 임의의 것에 의해 한정된 임의의 및 모든 구간을 지칭한다. 배양성 및 형질전환성과 상관되는 염색체 구간이 제공된다. 염색체 1 상에 위치한 한 구간은 asg62 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된다. 염색체 구간 asg62 및 magi87535의 하위구간은 PZA01216.1 및 magi17761이다. 염색체 4 상에 위치한 또 다른 구간은 npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹되고, Mo17-100177을 포함한다. 염색체 4 상에 위치한 또 다른 구간은 agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된다. agrr37b 및 nfa104의 하위구간은 DAS-PZ-5617 및 DAS-PZ-19188이다. 염색체 4 상에 위치한 또 다른 구간은 umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹되고, DAS-PZ-2043을 포함한다. 염색체 4 상에 위치한 또 다른 구간은 php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹되고, DAS-PZ-20570을 포함한다. 염색체 5 상에 위치한 또 다른 구간은 bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹되고, PZA02965를 포함한다. 염색체 5 상에 위치한 또 다른 구간은 umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된다. 염색체 구간 umc126a 및 idp8312의 하위구간은 Mo17-14519 및 DAS-PZ-12236이다. 염색체 8 상에 위치한 또 다른 구간은 bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹되고, magi52178을 포함한다. 염색체 9 상에 위치한 또 다른 구간은 wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹되고, DAS-PZ-366을 포함한다.
염색체 구간을 확인하는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 방법이 이용가능하다. 이러한 염색체 구간의 경계는 관심의 형질을 제어하는 유전자에 연결될 마커를 포함하도록 그려진다. 다시 말해서, 염색체 구간은 그 구간 (구간의 경계를 한정하는 말단 마커를 포함함) 내에 놓인 임의의 마커가 배양성 및 형질전환성에 대한 마커로서 사용될 수 있도록 그려진다. 상기 기재된 구간은 배양성 및 형질전환성과 공동분리되는 마커의 클러스터를 포함한다. 마커의 클러스터화는 염색체 상의 상대적으로 작은 도메인에서 발생하며, 이는 그들 염색체 영역에서 관심의 형질을 제어하는 유전자의 존재를 지시한다. 구간은 배양성 및 형질전환성과 공동분리되는 마커를 포함하도록 그려진다. 구간은 구간 내에 지도화하는 마커 뿐만 아니라 말단을 한정하는 마커를 포함한다. 예를 들어, asg62 및 magi87535는 스티프 스토크 하위집단에서 배양성 및 형질전환성과 공동분리되는 마커의 클러스터를 포함하는 염색체 구간을 한정한다. 두 번째 예는 하위구간, PZA01216.1 및 magi17761을 포함하며, 이들은 스티프 스토크 하위집단에서 배양성 및 형질전환성과 공동분리되는 마커의 클러스터를 포함하는 염색체 구간을 한정한다. 구간의 종점을 한정하는 말단 마커에 의해 기재된 구간은, 그들 마커가 현재 공지되어 있든지 미공지되어 있든지, 말단 마커 및 그 염색체 도메인 내에 국재화된 임의의 마커를 포함할 것이다.
염색체 구간은 또한 관심의 마커에 연결된 (그와 연관 불평형을 나타내는) 마커에 의해 한정될 수 있으며, 연관성 연구의 맥락에서 연관 불평형 (LD)의 통상적인 측정이다. asg62 및 magi87535의 구간, PZA01216.1 및 magi17761의 하위구간, 또는 asg62 및 magi87535의 임의의 다른 하위구간 내에 놓인 임의의 염색체 1 마커 좌위와, 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 대립유전자를 갖는 그 구간 내의 확인된 마커 사이의 LD의 r2 값이 1/3 초과인 경우 (Ardlie et al. Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)), 좌위는 연결된다. 마찬가지로, 본원에 기재된 임의의 구간 내의 임의의 마커에 대해서도 동일한 것이 적용된다.
본 발명의 마커는 또한 다르게는 일배체형으로 공지된 마커 좌위에서의 대립유전자의 조합일 수 있다. 통상의 기술자는 본원에서 확인된 염색체 1, 4, 5, 8, 및 9 마커 중의 및 주위의 마커 좌위에 추가적 다형적 부위가 있을 수 있으며, 여기서, 1개, 또는 그 이상의 다형적 부위는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 대립유전자와 연관 불평형 (LD)에 있음을 예상할 것이다. 부위 중 하나에서의 대립유전자의 존재가 동일한 염색체 상의 다른 부위에서의 대립유전자의 존재를 예측하는 경향이 있는 경우, 상이한 다형적 부위에서의 2개의 특정 대립유전자는 LD에 있다고 한다 (Stevens, Mol. Diag. 4:309-17 (1999)).
마커 보조 선별
분자 마커는 다양한 식물 육종 적용에 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Staub et al. (1996) Hortscience 729-741]; [Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1: 3-8] 참조). 관심의 주요 영역 중 하나는 마커-보조 선별 (MAS)을 사용하여 역교배 및 유전자의 유전자이입의 효율을 증가시키는 것이다. 바람직한 표현형적 형질에 영향을 미치는 좌위와의 연관을 입증하는 분자 마커는 식물 집단에서 형질의 선별을 위한 유용한 도구를 제공한다. 이는 표현형을 검정하기 곤란한 경우, 예를 들어 많은 질환 저항성 형질의 경우, 또는 식물 발달의 후기 단계에서 발생하는 경우, 예를 들어 인(kernel) 특징의 경우, 특히 사실이다. DNA 마커 검정은 밭 또는 온실 표현형분석보다 덜 힘들고 보다 적은 물리적 공간을 차지하기 때문에, 훨씬 더 많은 집단을 검정할 수 있으며, 수용자 계통으로 이동된 공여자 계통으로부터의 표적 절편과의 재조합을 발견할 가능성을 증가시킨다. 연관이 보다 가까울수록, 허위 양성을 초래할 수 있는 형질을 유발하는 유전자와 마커 사이에 재조합이 일어날 가능성이 보다 적기 때문에, 마커는 보다 유용하다. 플랭킹 마커를 갖는 것은, 이중 재조합 이벤트가 필요할 것이기 때문에, 허위 양성 선택이 발생할 가능성을 감소시킨다. 이상적인 상황은 재조합이 마커와 유전자 사이에 발생할 수 없도록 유전자 자체에 마커를 갖는 것이다. 이러한 마커는 '완벽한 마커'로 지칭된다.
유전자가 MAS에 의해 유전자이입되는 경우, 유전자 뿐만 아니라 플랭킹 영역도 도입된다 (Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780-1790). 이는 "연관 끌림"으로 지칭된다. 공여자 식물이 수용자 식물과 매우 비관련된 경우, 이들 플랭킹 영역은 농경학적으로 바람직하지 않은 형질을 코딩할 수 있는 추가적 유전자를 운반한다. 이 "연관 끌림"은 또한 심지어 엘리트 옥수수 계통으로의 역교배의 다중 사이클 후에도 감소된 산출 또는 다른 부정적 농경학적 특징을 초래할 수 있다. 이는 또한 때로 "산출 끌림"으로 지칭된다. 플랭킹 영역의 크기는 추가적 역교배에 의해 감소될 수 있지만, 육종가는 영역의 크기 또는 재조합 중단점에 대한 제어를 갖지 않기 때문에, 이는 항상 성공적이지는 않다 (Young et al, (1998) Genetics 120:579-585). 고전적 육종에서, 이는 통상적으로 단지 공여자 절편의 크기의 감소에 기여하는 재조합이 선택되는 가능성에 의한 것이다 (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257-264). 심지어 이 유형의 역교배에서 20회의 역교배 후에도, 선택되는 유전자에 여전히 연결된 상당한 조각의 공여자 염색체를 발견할 것을 예상할 수 있다. 그러나, 마커로는, 관심의 유전자 부근에서 재조합을 경험한 그러한 드문 개체를 선별할 수 있다. 150개의 역교배 식물에서, 적어도 1개의 식물이 단일 감수분열 지도 거리를 기준으로 1 cM의 유전자 내에서 교차를 경험할 가능성이 95％ 있다. 마커는 그들 개체의 명백한 확인을 공언할 것이다. 300개의 식물의 한 추가적 역교배로는, 단일 감수분열 지도 거리를 기준으로 2 cM 미만의 표적 유전자 주위의 절편을 생성하는, 유전자의 다른 측의 1 cM 단일 감수분열 지도 거리 내에 교차의 가능성이 95％ 있을 것이다. 이는 마커로는 2개의 세대에서 달성될 수 있는 반면, 마커 없이는 평균 100개의 세대가 요구되었을 것이다 (Tanksley et al., 상기 문헌 참조). 유전자의 정확한 위치가 공지된 경우, 유전자 주위의 플랭킹 마커는 상이한 집단 크기에서의 재조합에 대해 선별하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 보다 작은 집단 크기에서, 재조합은 유전자로부터 더 떨어질 것으로 예상될 수 있으며, 따라서 보다 원위의 플랭킹 마커가 재조합을 검출하는 데 요구될 것이다.
증가하는 밀도의 공개적 옥수수 마커를 함유하는 옥수수 게놈의 통합된 연관 지도의 이용가능성은 옥수수 유전자 지도화 및 MAS를 용이하게 하였다. 예를 들어 메이즈 GDB 상에서 온라인으로 이용가능한 IBM2 네이버즈 지도를 참조한다.
MAS의 실행에 대한 핵심적 성분은 (i) 분리하는 집단, 또는 무작위 또는 구조화된 집단일 수 있는, 그의 내에서 마커-형질 연관성이 측정되는 집단을 한정하는 것: (ii) 형질에 비해 다형적 마커의 분리 또는 연관성을 모니터링하고, 통계적 방법을 사용하여 연관 또는 연관성을 측정하는 것: (iii) 통계적 분석의 결과에 기초하여 바람직한 마커의 세트를 한정하는 것, 및 (iv) 마커-기반 선별 결정이 행해지는 것을 가능하게 하는 육종 생식질의 현재 세트에 대한 이 정보의 사용 및/또는 외삽이다. 이 개시내용에 기재된 마커, 뿐만 아니라 다른 마커 유형, 예컨대 SSR 및 FLP는 마커 보조 선별 프로토콜에 사용될 수 있다.
SSR은 6 bp 이하의 길이를 갖는 나란히 반복된 DNA의 상대적으로 짧은 런으로 정의될 수 있다 (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; Wang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1-6). 다형성은 아마도 DNA 복제 동안 미끄러짐에 의해 유발되는 반복 단위의 수의 변이로 인해 발생한다 (Levinson and Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203-221). 반복 길이의 변이는 보존된 비-반복적 플랭킹 영역에 대한 PCR 프라이머를 설계함으로써 검출될 수 있다 (Weber and May (1989) Am J Hum Genet. 44:388-396). SSR은 이들이 다중-대립유전자성이고, 공동우성이고, 복제가능하며, 고처리량 자동화를 잘 받아들이기 때문에 지도화 및 MAS에 매우 적합하다 (Rafalski et al. (1996) Generating and using DNA markers in plants. In Non-mammalian genomic analysis: a practical guide. Academic press, pp 75-135).
다양한 유형의 SSR 마커가 생성될 수 있으며, 저항성 계통으로부터의 SSR 프로파일은 증폭 생성물의 겔 전기영동에 의해 얻어질 수 있다. 마커 유전자형의 점수화는 증폭된 단편의 크기에 기초한다. 옥수수에 대한 SSR 서비스는 캐나다 퀘벡셍-쟝-슈흐-히슐리유의 DNA 랜드마크스 (DNA Landmarks)에 의한 계약에 기초하여 공중에게 이용가능하다.
다양한 유형의 FLP 마커가 또한 생성될 수 있다. 가장 통상적으로, 증폭 프라이머는 단편 길이 다형성을 생성하는 데 사용된다. 이러한 FLP 마커는 프라이머에 의해 증폭되는 영역이 전형적으로 매우 반복적 영역이 아니라는 점을 제외하고는 여러모로 SSR 마커와 유사하다. 여전히, 증폭된 영역, 또는 앰플리콘은 종종 삽입 또는 결실로 인해 생식질 사이에 충분한 가변성을 가질 것이므로, 증폭 프라이머에 의해 생성된 단편은 다형적 개체 사이에 구별될 수 있으며, 이러한 삽입결실은 옥수수에서 빈번히 발생하는 것으로 공지되어 있다 (Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539-547; Rafalski (2002b), 상기 문헌).
SNP 마커는 단일 염기 쌍 뉴클레오티드 치환을 검출한다. 모든 분자 마커 유형 중에서, SNP는 가장 풍부하며, 따라서 가장 높은 유전자 지도 해상도를 제공하는 잠재성을 갖는다 (Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539-547). SNP는 SSR보다 훨씬 더 높은 수준의 처리량으로, 소위 '초고처리량' 방식으로 검정될 수 있는데, 이는 이들이 많은 양의 DNA를 요구하지 않으며, 검정의 자동화가 간단할 수 있기 때문이다. SNP는 또한 상대적으로 저-비용 시스템이라는 유망성을 갖는다. 이들 3가지 인자는 함께 SNP가 MAS에 사용하기에 매우 매력적이게 만든다. 혼성화, 프라이머 연장, 올리고뉴클레오티드 라이게이션, 뉴클레아제 절단, 미니시퀀싱 및 코딩된 구를 비롯한 그러나 이에 제한되지 않는 몇몇 방법이 SNP 유전자형분석에 이용가능하다. 이러한 방법은 문헌 [Gut (2001) Hum Mutat 17 pp, 475-492]; [Shi (2001) Clin Chem 47, pp. 164-172]; [Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, pp. 95-100]; [Bhattramakki and Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants. In: R, J Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Vallingford]에서 검토되었다. 매스코드 (Masscode)™ (퀴아젠 (Qiagen)), 인베이더? (써드 웨이브 테크놀로지즈 (Third Wave Technologies)), 스냅샷? (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)), 택맨? (어플라이드 바이오시스템즈) 및 비드어레이즈™ (일루미나 (Illumina))를 비롯한 폭넓은 범위의 시판되는 기술은 SNP를 탐구하기 위해 이들 및 다른 방법을 이용한다.
다수의 SNP는 서열 내에서 함께, 또는 연결된 서열에 걸쳐, 임의의 특정 유전자형에 대한 일배체형을 기재하는 데 사용될 수 있다 (Ching et al. (2002), BMC Genet. 3:19 pp Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329-333). 일배체형은 단일 SNP보다 더 정보적일 수 있으며, 임의의 특정 유전자형을 보다 잘 기재할 수 있다. 예를 들어, 단일 SNP는 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 특이적 계통 또는 변종에 대한 대립유전자 'T'일 수 있지만, 대립유전자 'T'는 또한 반복친에 대해 이용되는 옥수수 육종 집단에서 발생할 수 있다. 이 경우, 일배체형, 예를 들어 연결된 SNP 마커에서의 대립유전자의 조합은 보다 정보적일 수 있다. 고유한 일배체형이 공여자 염색체 영역으로 할당되었다면, 일배체형을 사용하여 집단 또는 그의 임의의 하위집합에서 개체가 특정 유전자를 갖는지 여부를 측정할 수 있다. 예를 들어, WO2003054229를 참조한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 자동화된 고처리량 마커 검출 플랫폼을 사용하는 것은 이 공정을 매우 효율적이고 효과적이게 만든다.
표 2에 열거된 서열은 이 개시내용에 열거된 QTL 구간 내의 추가적 다형적 SNP (및 다른 마커)를 얻는 데 용이하게 사용될 수 있다. 기재된 지도 영역 내의 마커를 BAC 또는 다른 게놈 라이브러리에 혼성화하거나, 게놈 서열과 전기적으로 정렬하여, 기재된 마커와 동일한 대략적 위치에서 새로운 서열을 발견할 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 SSR, FLP 및 SNP 외에, 발현된 서열 태그 (EST)로부터 개발된 마커, EST 서열로부터 유래된 SSR 마커, 무작위로 증폭된 다형적 DNA (RAPD), 및 다른 핵산 기재 마커를 비롯한 그러나 이에 제한되지 않는 다른 유형의 분자 마커가 또한 폭넓게 사용된다.
이소자임 프로파일 및 관련된 형태학적 특징은 일부의 경우 또한 간접적으로 마커로서 사용될 수 있다. 이들이 DNA 차이를 직접적으로 검출하지 않는 경우에도, 이들은 종종 특이적 유전자 차이에 의해 영향을 받는다. 그러나, DNA 변이를 검출하는 마커는 이소자임 또는 형태학적 마커보다 훨씬 더 많으며, 다형적이다 (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1:3-8).
서열 정렬 또는 콘티그는 또한 본원에 열거된 특이적 마커의 상류 또는 하류의 서열을 발견하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 마커와 가까운 이들 새로운 서열은 그 후 기능적으로 등가의 마커를 발견하고 개발하는 데 사용된다. 예를 들어, 상이한 물리적 및/또는 유전자 지도를 정렬하여 이 개시내용 내에 기재되지 않지만, 유사한 영역 내에 있는 등가의 마커의 위치를 찾아낸다. 이들 지도는 옥수수 종 내에, 또는 심지어 옥수수로 유전적으로 또는 물리적으로 정렬된 다른 종, 예컨대 벼, 밀, 보리 또는 수수에 걸쳐 있을 수 있다.
일반적으로, MAS는 배양성 및 형질전환성과 공동-분리의 유의한 가능성을 갖는 것으로 확인된 다형적 마커를 사용한다. 이러한 마커는 식물에게 그의 배양성 및 형질전환성 표현형을 제공하는 유전자 또는 유전자들 부근에 지도화되는 것으로 추정되며, 바람직한 형질에 대한 지표, 또는 마커로 간주된다. 식물은 마커에서의 바람직한 대립유전자의 존재에 대해 시험되며, 1개 이상의 좌위에 바람직한 유전자형을 함유하는 식물은 바람직한 표현형과 함께 바람직한 유전자형을 그의 자손에게 전달할 것으로 예상된다. PZA01216.1, DAS-PZ-7146, DAS-PZ-12685, magi17761, Mo17-100177, DAS-PZ-5617, DAS-PZ-2343, PZA03203-2, Mo17-100291, PZA03409, DAS-PZ-19188, DAS-PZ-2043, DAS-PZ-20570, PZA02965, Mo17-14519, DAS-PZ-12236, magi52178, 및 DAS-PZ-366을 비롯한 본원에 기재된 마커 좌위 중 어느 하나에 특정된 대립유전자를 갖는 식물을 확인함으로써 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물을 확인하는 수단이 본원에 제시된다.
본원에 제시된 구간은 증가된 배양성 및 형질전환성을 입증하는 식물을 선별하기 위한 MAS에서 용도를 발견한다. asg62 및 magi87535에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 1 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, asg62 및 magi87535에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 1 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
npi386a 및 gpm174b에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 4 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, npi386a 및 gpm174b에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 4 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
agrr37b 및 nfa104에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 4 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, agrr37b 및 nfa104에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 4 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
umc156a 및 pco061578에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 4 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, umc156a 및 pco061578에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 4 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
php20608a 및 idp6638에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 4 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, php20608a 및 idp6638에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 4 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
bnl4.36 및 umc1482에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 5 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, bnl4.36 및 umc1482에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 5 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
umc126a 및 idp8312에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 5 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, umc126a 및 idp8312에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 5 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
bnl9.11a 및 gpm609a에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 8 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, bnl9.11a 및 gpm609a에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 8 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
wx1 및 bnlg1209에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 9 구간 내에 지도화된 임의의 마커는 이 목적에 사용될 수 있다. 또한, wx1 및 bnlg1209에 의해 한정되며 이를 포함하는 염색체 9 구간 내의 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 옥수수 계통 또는 변종 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 대립유전자와 연관 불평형에 있는 임의의 대립유전자 또는 일배체형은 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 식물을 선별하기 위한 MAS에 사용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 첨부된 청구범위를 예시하지만, 이를 제한하지 않도록 제공된다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 정신 또는 첨부된 청구의 범위로부터 벗어나지 않고 변경될 수 있는 다양한 시약 또는 파라미터를 인식할 것임이 이해된다.
실시예 1: 식물 물질
고도로 형질전환가능한 계통 A188과 다우 아그로사이언시즈 (Dow AgroSciences) (DAS) 엘리트 순계교배 계통 D046358 및 SLB24 사이에 초기 교배를 행하였다. 그 후, 이들 집단으로부터의 F1 식물을 엘리트 계통과 역교배시키고, 미성숙 BC1 (역교배 1) 배아를 수확하고, 배양하고, BC1 식물로 재생시켰다. 재생된 식물로부터의 잎 조직을 수집하고, DNA를 바이오셀 (Biocel) 1800 로봇식 플랫폼 (아질런트 테크놀로지즈 (Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 및 퀴아젠 맥어트랙트 (Qiagen MagAttract) 프로토콜 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아)을 사용하여 추출하였다.
실시예 2: 배아 수집
D046358 및 SLB24 집단으로부터의 이삭을 차아염소산나트륨 (5％) 및 2 방울의 트윈 (Tween) 20의 20％ 용액에 20 내지 30분 동안 침지시킨 후, 멸균수에서 3회 세정함으로써 표면-멸균하였다. 미성숙 접합성 배아 (1.0 내지 2.0 mm)를 각각의 이삭으로부터 무균적으로 절개하고, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 감염을 위해 미세-원심분리 튜브로 무작위로 분포시켰다. 다중 이삭이 동일한 계통으로부터 이용가능한 경우 배아를 풀링하였다.
실시예 3: 재생 능력에 대한 스크리닝 상이한 계통 및 교배로부터의 배아를 배양에서 재생하는 그의 능력에 대해 스크리닝하였다. 형질전환에 사용된 이삭 각각으로부터의 소수의 배아 (5 내지 30개)를 선택제가 결여된 2가지 유형의 배지 (ZM00002234 또는 ZM00001341, 표 1.5 또는 1.4) 상에 플레이팅하였다. 배양물을 암실에서 14일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 증식한 배아를 동일한 유형의 배지 상에서 계대배양하고, 암실에서 추가의 14일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 배형성 캘러스를 재생 배지 (ZM00002388, 표 1.8)로 옮기고, 80 내지 100 제곱미터 당 초 당 마이크로몰 (μmol m-2 s-1 )의 광 강도를 갖는 16/8 시간 (h) 명/암 하에서 10 내지 14일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 싹이 개시된 캘러스를 제2 유형의 재생 배지 (ZM00002242, 표 1.10)로 옮기고, 80 내지 100 μmol m-2 s-1의 광 강도를 갖는 16/8 h 명/암 하에서 10 내지 14일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 적어도 1개의 싹을 재생시킨 배아의 수를 플레이팅된 배아의 수로 나눈 것으로서 재생 빈도를 추정하였다.
실시예 4: 형질전환
실시예 4.1: 아그로박테리움 균주 및 구축물
수퍼 바이너리 벡터 pDAB1405를 운반하는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 LBA4404를 모든 형질전환 실험에 사용하였다. pDAB1405 구축물은 ZmUbi1 프로모터 및 그의 인트론의 제어 하의 GFP 유전자 v.2 및 OsActin1 프로모터 및 그의 인트론의 제어 하의 PAT 유전자 v.3을 함유한다. 2가지 유전자 및 프로모터는 RB7 MAR 서열에 의해 플랭킹되었다 (도 1).
Figure pct00001
도 1. 형질전환 실험에 사용된 pDAB1405에 대한 지도.
실시예 4.2: 아그로박테리움 배양 개시
숙주 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404 중의 수퍼바이너리 벡터 pDAB1405의 글리세롤 스톡을 DAS 리서치 컬쳐 콜렉션 (DAS Research Culture Collection)으로부터 얻었다. 스트리킹된 플레이트를 100 mg/L 스펙티노마이신, 250 mg/L 스트렙토마이신, 및 10 mg/L 테트라시클린을 함유하는 AB 최소 배지 (AT00002172, 표 1.13)를 사용하여 제조하고, 20℃에서 3 내지 4일 동안 성장시켰다. 그 후, 단일 콜로니를 피킹하고, 동일한 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 (AT0002170, 표 1.14) 상으로 플레이팅하고, 28℃에서 1 내지 2일 동안 인큐베이션하였다.
실시예 4.3: 아그로박테리움 공동-배양
실험일에, 아그로박테리움 콜로니를 YEP 플레이트로부터 취하고, 50 ml 튜브에서 7 내지 10 ml의 감염 배지 (ZM00002231, 표 1.1)에 현탁시키고, 세포 밀도를 분광광도계를 사용하여 OD550 = 1.2 내지 1.4로 조정하였다. 아그로박테리움 배양물을 회전 진탕기 상에 100 분 당 회전수 (rpm)로 정치시키면서 배아 절개를 수행하였다. 크기 1.5 내지 2.0 mm의 미성숙 접합성 배아를 멸균된 옥수수 인으로부터 단리하고, 1 ml의 감염 배지에 정치시킨 후 (2.0 ml 에펜도르프 튜브 중 약 30 내지 130개의 배아), 동일한 배지로 1회 세척하였다. 아그로박테리움 현탁액 (1.0 ml)을 각각의 튜브에 첨가하고; 튜브를 20회 뒤집은 후, 실온에서 5분 동안 두었다. 그 후, 배아를 공동-배양 배지 (ZM00002232 또는 ZM00001358, 표 1.2 또는 1.3) 상으로 옮겼다. 그 후, 배아를 현미경을 사용하여 반상체가 앞면이 위로 가게 배향시켰다. 20℃에서 3일 공동-배양 후, 녹색 형광 단백질 (GFP) 트랜스진의 일시적 발현을 관찰하여 아그로박테리움 감염을 입증하였다.
실시예 4.4: 트랜스제닉 이벤트의 캘러스 선별 및 재생
공동-배양 기간 후, 배아를 항생제 세포탁심을 함유하는 휴지 배지 (ZM00002234 또는 ZM00001341, 표 1.5 또는 1.4)로 옮기고, 암실에서 7일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배아를 도입된 pat 유전자에 대한 선택제로서 3 mg/L 비알라포스 (Bialaphos)를 함유하는 선택 1 배지 (ZM00002240 또는 ZM00002180, 표 1.6 또는 1.7) 상으로 옮기고, 암실에서 14일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. GFP를 발현하는 증식하는 배형성 캘러스를 입체현미경 하에서 보다 작은 조각 (2 내지 3 mm)으로 커팅하고, 3 mg/L 비알라포스를 함유하는 선택 배지 상으로 옮기고, 암실에서 추가의 10 내지 14일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 1개의 배아로부터 커팅된 모든 조각은 흑색 마커로 원형화되었으며, 1개의 이벤트로 간주되었다. 이 선별 단계는 캘러스가 추가로 증식하도록 하였으며, 안정한 GFP 발현의 균일성을 향상시켰다. 캘러스 선별 기간은 대략 4 내지 6주 동안 지속되었다. GFP를 발현하는 증식하는 배형성 캘러스를 3 mg/L 비알라포스를 함유하는 재생 1 배지 (ZM00002254, 표 1.9) 상으로 옮기고, 암실에서 7 내지 10일 동안 28℃에서 배양하였다. 이 기간은 배형성 캘러스의 성숙에 필수적이었다.
싹이 개시된 배형성 캘러스를 비알라포스가 없는 재생 2 배지 (ZM00002242 또는 ZM00002255, 표 1.10 또는 1.11) 상으로 옮겼다. 배양물을 80 내지 100 μmol m-2 s-1의 광 강도를 갖는 16/8 h 명/암 하에서 10 내지 14일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 1차 뿌리를 갖는 작은 싹을 마젠타 (Magenta) 박스 중의 싹 신장 및 발근 배지 (ZM00002238, 표 1.12)로 옮기고, 16/8 h 명/암 하에서 7 내지 10일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 추정상의 묘목을 GFP 발현에 대해 확인한 후, 트랜스제닉 이벤트로서 점수화하였다.
<표 1> 배지 제제
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 5: BC 1 식물의 유전자형분석
SLB24 집단에 대해, 173개의 BC1 식물이 독립적 배양물로부터 재생된 반면, D046358 집단에 대해서는 117개의 BC1 식물이 재생되었다. 케이바이오사이언스 경쟁적 대립유전자 특이적 (KBioscience Competitive Allele Specific) PCR 시스템, 또는 KASPar™ (케이바이오사이언시즈 (KBiosciences), 영국 하트퍼드셔)를 사용하여 재생된 식물로부터의 잎 조직으로부터의 DNA를 SLB24 및 D046358 집단에 대해 각각 256개 및 235개의 다형적 마커를 사용하여 유전자형분석하였다. KASPar™ 시스템은 2가지 성분 (1) SNP 특이적 검정 (3가지 비표지된 프라이머의 조합), 및 (2) 유니버셜 형광 보고 시스템 및 특별히 개발된 Taq 중합효소를 포함하는 모든 다른 요구되는 성분을 함유하는 유니버셜 반응 믹스로 구성된다. 3가지 프라이머, 즉, 대립유전자-특이적 1 (A1), 대립유전자-특이적 2 (A2), 및 통상적 (C1), 또는 역방향은 워크플로우 매니저, 크라켄 (Kraken) (케이바이오사이언시즈, 영국 하트퍼드셔)의 검정 설계 알고리듬을 사용하여 설계하였다.
12 μM의 각각의 A1 및 A2 및 30 μM의 C1로 이루어진 3가지 프라이머의 검정 믹스를 제조하였다. 유니버셜 1536 반응 믹스를 1x로 희석하였다. 맥어트랙트 추출된 DNA로부터의 1:20으로 희석된 2.0 μl의 DNA의 부피를 액체 취급 로봇을 사용하여 PCR 플레이트 내로 분배시키고, 65℃에서 2시간 동안 건조시켰다.　 다음으로, 1.3 μl의 1x KASP 1536 반응 믹스를 PCR 플레이트에 첨가하였다.　 플레이트를 퓨전 (Fusion) 열 밀봉기 (케이바이오사이언스, 영국 하트퍼드셔)를 사용하여 밀봉하였다. 열 사이클링을 히드로사이클러 (Hydrocycler) 수조 열 사이클러 (케이바이오사이언스, 영국 하트퍼드셔)에서 하기 조건으로 완료하였다: 초기 변성 및 94℃에서 15분 동안 고온-시작 효소 활성화, 그 후 94℃에서 20초 동안 10 사이클의 변성 및 65 내지 57℃에 걸쳐 60초 동안 터치다운 (사이클 당 0.8℃ 강하시킴). 그 후, 94℃에서 20초 동안의 변성 및 57℃에서 60초 동안 어닐링의 29 사이클을 수행하였다.
KASPar™는 유전자형의 구별을 위해 형광단 FAM 및 VIC를 사용한다. 수동 참조 염료 ROX는 또한 웰-대-웰 액체 부피의 차이에 의해 유발되는 신호의 변이를 정규화하는 데 사용된다. 크라켄에서, FAM 및 VIC 데이터는 각각 x- 및 y- 축 상에 플롯팅된다. 그 후, 유전자형을 샘플 클러스트에 따라 측정할 수 있다.
실시예 6: 통계적 분석
배양, 형질전환 및 재생의 행위는 배아의 유전자 분리 집단에 대한 선택압을 가하였으므로, 단지 조직 배양, 형질전환 및 재생에 중요한 유전자 영역을 함유하는 배아만이 생존하고, BC1 식물이 될 수 있었다. 이어서, 유전자 좌위가 배양, 형질전환 또는 재생에 중요한 경우, 부모 중 하나에 의해 운반된 대립유전자가 선택될 것이다. 따라서, 게놈을 배양 및 식물 재생 후에 조사하는 경우, 배양성 및 형질전환성에 중요한 대립유전자는 50％ 초과의 빈도로 발생한다. 50％ 초과로 유의한 편차를 나타내는 마커는 선택의 양성 효과를 나타내는 좌위를 나타내며, 카이-제곱 검정 (p < 0.05)을 사용하여 확인되었다.
카이-제곱 분석 결과는 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 9개의 유전자 영역을 밝혀내었다 (표 2). 이들 유전자 영역은 염색체 1, 4, 5, 8, 및 9 상에 위치하였으며, 배양성 및 형질전환성과 연관된 것으로 이전에 보고되지 않은 신규한 영역을 나타낸다. Bin 경계는 메이즈 GDB 웹사이트 상에서 IBM2 2008 네이버즈 지도를 사용하여 결정되었다.
<표 2>
BC1 집단의 배양 및 형질전환에 중요한 유전자 영역
Figure pct00007
코어 빈 마커 (CBM)
실시예 7: 마커 프레임워크 및 마커 보조 선별을 위한 사용
통상적 마커의 세트를 사용하여 염색체 구간에서 마커를 확인하기 위한 프레임워크를 확립할 수 있다. 표 3은 B73 참조 게놈, 버전 2 상에 서로에 대해 상대적인 일치하는 위치에 있는 마커를 나타낸다. DAS 등록상표가 붙은 마커의 물리적 위치를 DAS 등록상표가 붙은 지브라우저 (GBrowser)를 사용하여 측정하였다. 공개적 마커의 물리적 위치를 공개적으로 이용가능한 메이즈 GDB 웹사이트 상에서 B73 참조 게놈, 버전 2를 사용하여 측정하였다.
그 좌위에서의 유리한 대립유전자와 연관 불평형에 있는 대립유전자를 갖는 관심의 형질과 연관된 가깝게 연결된 마커는 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 자손 식물에 대해 선별하는 데 유효하게 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 마커, 예컨대 표 3에 열거된 것들, 뿐만 아니라 동일한 염색체 구간으로 유전적으로 또는 물리적으로 지도화된 다른 마커는 증가된 배양성 및 형질전환성을 갖는 옥수수 식물에 대해 선별하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, 이들 마커의 세트는 관심의 형질과 연관된 영역에서 사용될 것이다 (예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상). 임의로, 실제 유전자 및/또는 좌위 내의 마커가 사용될 수 있다. 증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 게놈 영역을 증폭시키고 검출하기 위한 예시적인 프라이머를 표 4에 나타낸다.
<표 3>
증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 SNP 마커 및 그의 유리한 또는 공여자 대립유전자.
Figure pct00008
<표 4>
증가된 배양성 및 형질전환성과 연관된 게놈 영역을 증폭시키고 검출하기 위한 예시적인 프라이머.
Figure pct00009
참고문헌:
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Coram, Tristan Jayne, Susan Aggarwal, Rajat <120> Genetic Loci Associated with Culture and Transformation in Maize <130> 74666-WO-PCT[2] <160> 66 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Zea mays <400> 1 acagtctgta tcgagtcttg taattagtat agtatacatc ttctccataa acacagagga 60 aaacagaagt tgatgaggtt gacaatttac atgtgctacc wacctaccga ctagtatagc 120 tagcatcaga gtatacatga tcattcctaa cattcaggca cagccagggg attctttctt 180 ttcttttctt ttcttttctt t 201 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> Zea mays <400> 2 agctaccacc gaccgctgac ctgctgcttt gtatgtagtg taggtgtagg tcctcaacta 60 ataaattaaa gaactgaaag gtaaaccgat gatagcttag rtgatgggga tccaaatcct 120 ccaatagtcc aatgtatgat attgcagtca gctgaaagtt gaatcgatgc gctgcatgca 180 ccgcgggtta aattaactag t 201 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Zea mays <400> 3 tcgtagtaaa acactagcgg accagaaaac gcctctctat ctctctttcc tcgtcagtcc 60 mtctctctcg gcgtgtggtg ggcatagctt ccctgcctcc acttgtcttc tttgtttcct 120 c 121 <210> 4 <211> 201 <212> DNA <213> Zea 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30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> magi17761 reverse <400> 24 ccagcatttc gtttacaatg catacaagtt 30 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-100177 forward A1 <400> 25 gaaggtgacc aagttcatgc tatctctctt tcctcgtcag tcca 44 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-100177 forward A2 <400> 26 gaaggtcgga gtcaacggat tctctctttc ctcgtcagtc cc 42 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-100177 reverse <400> 27 aaagaagaca agtggaggca gggaa 25 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-5617 forward A1 <400> 28 gaaggtgacc aagttcatgc tgcacggcct cgtcttagta aaca 44 <210> 29 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-5617 forward A2 <400> 29 gaaggtcgga gtcaacggat tcacggcctc gtcttagtaa acc 43 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-5617 reverse <400> 30 gcgatgccac gtcaggagta ctt 23 <210> 31 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-2343 forward A1 <400> 31 gaaggtgacc aagttcatgc ttgagctagt agtagcacaa caca 44 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-2343 forward A2 <400> 32 gaaggtcgga gtcaacggat tgagctagta gtagcacaac acg 43 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-2343 reverse <400> 33 gccattgggc gctgcagact tt 22 <210> 34 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA03203-2 forward A1 <400> 34 gaaggtgacc aagttcatgc tagtgcattt gtacttttta atctgccatt 50 <210> 35 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA03203-2 forward A2 <400> 35 gaaggtcgga gtcaacggat tgtgcatttg tactttttaa tctgccatc 49 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA03203-2 reverse <400> 36 tctacgttgt gaaggaaggg gagat 25 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-100291 forward A1 <400> 37 gaaggtgacc aagttcatgc tcgaaaagca gaggtcgtgc tct 43 <210> 38 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-100291 forward A2 <400> 38 gaaggtcgga gtcaacggat tcgaaaagca gaggtcgtgc tca 43 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-100291 reverse <400> 39 gtggctgcat aggacttttc ctgta 25 <210> 40 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA03409 forward A1 <400> 40 gaaggtgacc aagttcatgc tggtgcaatt ggtgttcaga ccaaat 46 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA03409 forward A2 <400> 41 gaaggtcgga gtcaacggat tgtgcaattg gtgttcagac caaag 45 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA03409 reverse <400> 42 ctttgcttgg atctcaaaag ctcatcaat 29 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-19188 forward A1 <400> 43 gaaggtgacc aagttcatgc tactaacgca acggcacgat caaaa 45 <210> 44 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-19188 forward A2 <400> 44 gaaggtcgga gtcaacggat tactaacgca acggcacgat caaat 45 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-19188 reverse <400> 45 ctgtaagtag acgaagcatt aatgtccaa 29 <210> 46 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-2043 forward A1 <400> 46 gaaggtgacc aagttcatgc tgtgatcgac ctgttggtga ttagat 46 <210> 47 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-2043 forward A2 <400> 47 gaaggtcgga gtcaacggat tgatcgacct gttggtgatt agac 44 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-2043 reverse <400> 48 ataaggtggc gaaactatcc attgagaat 29 <210> 49 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-20570 forward A1 <400> 49 gaaggtgacc aagttcatgc tacagacgat ggattccttt acacag 46 <210> 50 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-20570 forward A2 <400> 50 gaaggtcgga gtcaacggat tacagacgat ggattccttt acacac 46 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-20570 reverse <400> 51 cgaacacata tggccatacg agcaa 25 <210> 52 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA02965 forward A1 <400> 52 gaaggtgacc aagttcatgc taaggtcact tggttctggc tttctt 46 <210> 53 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA02965 forward A2 <400> 53 gaaggtcgga gtcaacggat tggtcacttg gttctggctt tctc 44 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZA02965 reverse <400> 54 agaacccgaa tgcctgttct ctgat 25 <210> 55 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-14519 forward A1 <400> 55 gaaggtgacc aagttcatgc tcaaacaata taatgacttt agcaaaccac ta 52 <210> 56 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-14519 forward A2 <400> 56 gaaggtcgga gtcaacggat taaacaatat aatgacttta gcaaaccact g 51 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mo17-14519 reverse <400> 57 gtgcctgttg tacttgcgga cgaa 24 <210> 58 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-12236 forward A1 <400> 58 gaaggtgacc aagttcatgc taaccaacat catcgatgca gtcc 44 <210> 59 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-12236 forward A2 <400> 59 gaaggtcgga gtcaacggat tagaaccaac atcatcgatg cagtct 46 <210> 60 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-12236 reverse <400> 60 ccttctcacc aaggtagtaa tgatcaatt 29 <210> 61 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> magi52178 forward A1 <400> 61 gaaggtgacc aagttcatgc tgttatgtta agtatccaat gtctgtcg 48 <210> 62 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> magi52178 forward A2 <400> 62 gaaggtcgga gtcaacggat tggttatgtt aagtatccaa tgtctgtca 49 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> magi52178 reverse <400> 63 aaagctttca agccatgtca gatgtcaa 28 <210> 64 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-366 forward A1 <400> 64 gaaggtgacc aagttcatgc tccgagtgat acagtcacga ctc 43 <210> 65 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-366 forward A2 <400> 65 gaaggtcgga gtcaacggat tccgagtgat acagtcacga ctg 43 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAS-PZ-366 reverse <400> 66 gtcgtgcctg gggtcttcta caa 23

Claims (12)

  1. 증가된 배양성 및/또는 형질전환성을 나타내는 옥수수 식물의 확인 방법이며,
    상기 방법은
    a) 옥수수 식물의 생식질에서, 적어도 9개의 마커 좌위를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 적어도 1개의 마커 좌위는 각각의 하기 염색체 구간 (i) 내지 (ix):
    (i) asg62 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (ii) npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iii) agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iv) umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (v) php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vi) bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vii) umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (viii) bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간; 및
    (ix) wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간
    내에 위치하며;
    b) 적어도 1개의 대립유전자는 증가된 배양성 및/또는 형질전환성과 연관된 것인, 확인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 1개의 마커 좌위가
    (i) PZA01216.1, DAS-PZ-7146, DAS-PZ-12685, 및 magi17761;
    (ii) Mo17-100177;
    (iii DAS-PZ-5617, DAS-PZ-2343, PZA03203-2, Mo17-100291, PZA03409, 및 DAS-PZ-19188;
    (iv) DAS-PZ-2043;
    (v) DAS-PZ-20570;
    (vi) PZA02965;
    (vii Mo17-14519 및 DAS-PZ-12236;
    (viii) magi52178; 및
    (ix) DAS-PZ-366
    으로 이루어진 군 (i) 내지 (ix)의 각각으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 옥수수 식물이 스티프 스토크 (Stiff Stalk) 잡종 군에 속하는 것인 방법.
  4. 제1항의 방법에 의해 확인된 옥수수 식물.
  5. 증가된 배양성 및/또는 형질전환성을 나타내는 옥수수 식물의 확인 방법이며,
    상기 방법은 옥수수 식물의 생식질에서 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 일배체형을 검출하는 것을 포함하고, 여기서
    a) 1개 이상의 마커 좌위는 각각의 하기 염색체 구간 (i) 내지 (ix):
    (i) asg62 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (ii) npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iii) agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iv) umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (v) php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vi) bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vii) umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (viii) bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간; 및
    (ix) wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간
    내에 위치하며;
    b) 일배체형은 증가된 배양성 및/또는 형질전환성과 연관된 것인, 확인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 1개 이상의 마커 좌위가 각각의 하기 염색체 구간 (i) 내지 (ix):
    (i) asg62 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (ii) npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iii) agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iv) umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (v) php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vi) bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vii) umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (viii) bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간; 및
    (ix) wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간
    내에 위치하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 옥수수 식물이 스티프 스토크 잡종 군에 속하는 것인 방법.
  8. 제5항의 방법에 의해 확인된 옥수수 식물이며,
    상기 옥수수 식물은 그의 생식질 내에 증가된 배양성 및/또는 형질전환성과 연관된 일배체형을 포함하고, 상기 일배체형은 각각의 하기 염색체 구간 (i) 내지 (ix):
    (i) asg62 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (ii) npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iii) agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iv) umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (v) php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vi) bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vii) umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (viii) bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간; 및
    (ix) wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간
    내에 위치한 1개 이상의 마커 좌위에 대립유전자를 포함하는 것인 옥수수 식물.
  9. a) 적어도 1개의 마커 좌위가 각각의 하기 염색체 구간 (i) 내지 (ix):
    (i) asg62 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (ii) npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iii) agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iv) umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (v) php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vi) bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vii) umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (viii) bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (ix) wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간 내에 위치하고, 마커 좌위의 대립유전자는 증가된 배양성 및/또는 형질전환성과 연관되는 것인 적어도 9개의 마커 좌위를 갖는 제1 옥수수 식물을 얻고;
    b) 제1 옥수수 식물을 제2 옥수수 식물과 교배하고;
    c) 자손을 적어도 1개의 대립유전자에 대해 평가하고;
    d) 적어도 1개의 대립유전자를 소유하는 자손 식물을 선별하는 것
    을 포함하는, 마커 보조 선별 방법.
  10. 제9항에 있어서, 적어도 1개의 마커 좌위가
    (i) PZA01216.1, DAS-PZ-7146, DAS-PZ-12685, 및 magi17761;
    (ii) Mo17-100177;
    (iii DAS-PZ-5617, DAS-PZ-2343, PZA03203-2, Mo17-100291, PZA03409, 및 DAS-PZ-19188;
    (iv) DAS-PZ-2043;
    (v) DAS-PZ-20570;
    (vi) PZA02965;
    (vii Mo17-14519 및 DAS-PZ-12236;
    (viii) magi52178; 및
    (ix) DAS-PZ-366
    으로 이루어진 군 (i) 내지 (ix)의 각각으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 옥수수 식물이 스티프 스토크 잡종 군에 속하는 것인 방법.
  12. 제9항의 방법에 의해 선별된 옥수수 자손 식물이며,
    상기 식물은 마커 좌위의 적어도 1개의 대립유전자를 갖고,
    적어도 1개의 마커 좌위는 각각의 하기 염색체 구간 (i) 내지 (ix):
    (i) asg62 및 magi87535를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (ii) npi386a 및 gpm174b를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iii) agrr37b 및 nfa104를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (iv) umc156a 및 pco061578을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (v) php20608a 및 idp6638을 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vi) bnl4.36 및 umc1482를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (vii) umc126a 및 idp8312를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간;
    (viii) bnl9.11a 및 gpm609a를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간; 및
    (ix) wx1 및 bnlg1209를 포함하며 이에 의해 플랭킹된 염색체 구간
    내에 위치하는 것인 옥수수 자손 식물.
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