TW201617457A - 在玉米中與培養及轉形有關的基因座 - Google Patents

在玉米中與培養及轉形有關的基因座 Download PDF

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Abstract

本發明有關一種用於辨識具有增加可培養性和/或可轉形性之玉米植物之方法。該方法使用分子標記來辨識以及選擇具有增加可培養性和/或可轉形性之植物，或辨識以及取消選擇具有減低可培養性和/或可轉形性之植物。用本發明之方法產生之玉米植物，亦為本發明之特徵。

Description

在玉米中與培養及轉形有關的基因座
此申請案請求基於在2014年10月10日於美國專利與商標局提申之臨時申請案62/062,520之優先權，其之完整揭示內容在此併入本案以為參考。
發明領域
本發明有關一種可用於改善玉米植物之可培養性以及可轉形性之方法。
發明背景
以往，玉米轉形實務上係使用可順從於組織培養以及基因傳遞技術之基因型。然而，站在產品開發之角度，使用此等基因型製造轉基因事件是不合宜的，因為其等在農藝表現上往往不佳。然而，在許多情況下，具優良農藝性狀之植物，諸如優良品系，易出現不良的培養以及轉形特性。因此，這是一個很好的機會去開發能有效率的培養以及轉形，適合常規地用於玉米轉形之優良品系。擁有此一品系之優點，包括更快以及更精確的事件以及性狀評估、增強性狀、產率以及監管試驗以及更快的產品開發。
開發優良可轉形自交系之方法，涉及將從供體材 料而來之可培養性以及可轉形性性狀，漸滲進入所欲的優良品系。具有針對此等性狀之基因標記，可能有利於幫助此漸滲作用。Hi-II以及A188種原中之可培養性以及可轉形性性狀，已經過充分的研究，且已經辨識出許多與此等性狀連鎖之分子標記(Armstrong et al.1992；Lowe and Chomet 2004；Lowe et al.2006；Zhao et al.2008)。Hi-II，一具有改善可培養性以及可轉形性之新品系，是從A188與B73間初始雜交發展出來(Armstrong et al.1991)，其中A188是可培養性以及可轉形性性狀之供體。
本發明滿足更具培養性以及轉形性之優良品系之需求，以及提供改良的方法，用以幫助開發具有提高可培養性以及可轉形性之新的、農藝上優良的玉米品系。
發明概要
在一具體例中，提供一種辨識會展現增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法，其包含檢測玉米植物之種原中，至少一種標記基因座之對偶基因。該標記基因座是位在包含且兩側為idp8516以及magi87535之染色體區間(Bin 1.07)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可擇自於下列任一個標記基因座：PZA01216.1、DAS-PZ-7146、DAS-PZ-12685以及magi17761，以及任何其它與此等標記連鎖之標記。該標記基因座可在染色體1中，位在包含且兩側為PZA01216.1以及magi17761之區間內找到，以及包含至少一種與增加可培養 性以及可轉形性有關之對偶基因。
在本發明之其它具體例中，該標記基因座是位在包含且兩側為npi386a以及gpm174b之染色體區間(Bin 4.04)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可為Mo17-100177，以及任何其它與此標記連鎖之標記，以及包含至少一種與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因。
在本發明之其它具體例中，該標記基因座是位在包含且兩側為agrr37b以及nfa104之染色體區間(Bin 4.05)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可擇自於下列標記基因座：DAS-PZ-5617、DAS-PZ-2343、PZA03203-2、Mo17-100291、PZA03409以及DAS-PZ-19188，以及任何其它與此等標記連鎖之標記。該標記基因座可在染色體4中，位在包含以及兩側為DAS-PZ-5617以及DAS-PZ-19188之區間內找到，以及包含至少一種與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因。
在本發明之其它具體例中，該標記基因座是位在包含且兩側為umc156a以及pco061578之染色體區間(Bin 4.06)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可為DAS-PZ-2043，以及任何其它與此標記連鎖之標記，以及包含至少一種與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因。
在本發明之其它具體例中，該標記基因座是位在包含且兩側為php20608a以及idp6638之染色體區間(Bin 4.10)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可為DAS-PZ-20570，以及任何其它與此標記連鎖之標記，以及包含至少一種與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因。
在本發明之其它具體例中，該標記基因座是位在包含且兩側為bnl4.36以及umc1482之染色體區間(Bin 5.04)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可為PZA02965，以及任何其它與此標記連鎖之標記，以及包含至少一種與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因。
在本發明之其它具體例中，該標記基因座是位在包含且兩側為umc126a以及idp8312之染色體區間(Bin 5.06)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可擇自於下列標記基因座：Mo17-14519以及DAS-PZ-12236，以及任何其它與此等標記連鎖之標記。該標記基因座可在染色體5中，位在包含以及兩側為Mo17-14519以及DAS-PZ-12236之區間內找到，以及包含至少一種與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因。
在本發明之其它具體例中，該標記基因座是位在包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a之染色體區間(Bin 8.02)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可為magi52178，以及任何其它與此標記連鎖之標記，以及包含至少一種與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因。
在本發明之其它具體例中，該標記基因座是位在包含且兩側為wx1以及bnlg1209之染色體區間(Bin 9.03)內；以及至少一種對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可為DAS-PZ-366，以及任何其它與此標記連鎖之標記，以及包含至少一種與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因。
在一些具體例中，該玉米植物屬於硬桿(Stiff Stalk)雜種優勢群。在此亦關注利用此方法辨識之玉米植物。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體1中，包含且兩側為idp8516以及magi87535之區間(Bin 1.07)內找到。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體1中找到，且可擇自於由下列所構成之群組：PZA01216.1、DAS-PZ-7146、DAS-PZ-12685及magi17761，以及任何其它與此等標記連鎖之標記。該單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體4中，包含且兩側為npi386a以及gpm174b之區間(Bin 4.04)內找到。 該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體4中找到，且可擇自於由下列所構成之群組：Mo17-100177，以及任何其它與此等標記連鎖之標記。該單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體4中，包含且兩側為agrr37b以及nfa104之區間(Bin 4.05)內找到。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體4中找到，且可擇自於由下列所構成之群組：DAS-PZ-5617、DAS-PZ-2343、PZA03203-2、Mo17-100291、PZA03409以及DAS-PZ-19188，以及任何其它與此等標記連鎖之標記。該單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體4中，包含且兩側為umc156a以及pco061578之區間(Bin 4.06)內找到。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體4中找到，且可擇自於DAS-PZ-2043，以及任何其它與此標記連鎖之標記。該 單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體4中，包含且兩側為php20608a以及idp6638之區間(Bin 4.10)內找到。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體4中找到，且可擇自於DAS-PZ-20570，以及任何其它與此標記連鎖之標記。該單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體5中，包含且兩側為bnl4.36以及umc1482之區間(Bin 5.04)內找到。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體5中找到，且可擇自於PZA02965，以及任何與此標記連鎖之標記。該單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體5中，包含且兩側為umc126a以及idp8312之區間(Bin 5.06)內找到。 該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體5中找到，且可擇自於Mo17-14519以及DAS-PZ-12236，以及任何其它與此等標記連鎖之標記。該單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體8中，包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a之區間(Bin 8.02)內找到。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體8中找到，且可擇自於magi52178，以及任何其它與此標記連鎖之標記。該單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在另一具體例中，提供一種藉由檢測玉米植物之種原中之單倍型，辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體9中，包含且兩側為wx1以及bnlg1209之區間(Bin 9.03)內找到。該單倍型包含在一或多種標記基因座處之對偶基因，其中該一或多種標記基因座可在染色體9中找到，且可擇自於DAS-PZ-366，以及任何其它與此標記連鎖之標記。該單倍型與增加可培養性以及可轉形性有關。
在一另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可 培養性以及可轉形性之植物之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體1上，包含且兩側為idp8516以及magi87535之區間(Bin 1.07)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
在另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可培養性以及可轉形性之植物之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體4上，包含且兩側為npi386a以及gpm174b之區間(Bin 4.04)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
在另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可培養性以及可轉形性之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體4上，包含且兩側為agrr37b以及nfa104之區間 (Bin 4.05)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
在另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可培養性以及可轉形性之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體4上，包含且兩側為umc156a以及pco061578之區間(Bin 4.06)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
在另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可培養性以及可轉形性之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體4上，包含且兩側為php20608a以及idp6638之區間(Bin 4.10)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。 在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
在另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可培養性以及可轉形性之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體5上，包含且兩側為bnl4.36以及umc1482之區間(Bin 5.04)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
在另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可培養性以及可轉形性之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體5上，包含且兩側為umc126a以及idp8312之區間(Bin 5.06)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
在另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可培養性以及可轉形性之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該 對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體8上，包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a之區間(Bin 8.02)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
在另外的具體例中，提供一種選擇具有增加可培養性以及可轉形性之方法。在一態樣方面，獲得一第一玉米植物，其具有至少一種標記基因座之對偶基因，其中該對偶基因與增加可培養性以及可轉形性有關。該標記基因座可在染色體9上，包含且兩側為wx1以及bnlg1209之區間(Bin 9.03)內找到。可使該第一玉米植物與第二玉米植物雜交，然後評估從該雜交產生之子代是否具有該第一玉米植物之對偶基因。具有來自該第一玉米植物之對偶基因之子代植物，被選擇為具有增加可培養性以及可轉形性。在此亦關注利用此方法選擇之玉米植物。
圖式以及序列表之簡單說明
從下列詳細的說明以及所附之圖式以及序列表，可更完整地了解本發明，其等形成此申請案之一部分。序列表含有針對核苷酸序列字符之單字母碼以及針對胺基酸之三字母碼，此遵照Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)以及Biochemical Journal 219(No.2)：345-373(1984) 中所述之IUPAC-IUBMB標準，其等之全部，在此併入本案以為參考。核苷酸以及胺基酸序列數據中所使用之符號以及格式，遵守37 C.F.R.§1.822.中所述之規則。
圖1為轉形實驗中使用之pDAB1405之圖譜。
序列辨識編號：1含有DAS-PZ-7146 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：2含有DAS-PZ-12685 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：3含有Mo17-100177 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：4含有DAS-PZ-5617 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：5含有DAS-PZ-2343 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：6含有Mo17-100291 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：7含有DAS-PZ-19188 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：8含有DAS-PZ-2043 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：9含有DAS-PZ-20570 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：10含有Mo17-14519 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：11含有DAS-PZ-12236 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：12含有DAS-PZ-366 SNP以及兩側序列。
序列辨識編號：13是用於擴增PZA01216.1之正向PCR引子。
序列辨識編號：14是用於擴增PZA01216.1之正向PCR引子。
序列辨識編號：15是用於擴增PZA01216.1之反向PCR引子。
序列辨識編號：16是用於擴增序列辨識編號：1之正向PCR引子。
序列辨識編號：17是用於擴增序列辨識編號：1之正向PCR引子。
序列辨識編號：18是用於擴增序列辨識編號：1之反向PCR引子。
序列辨識編號：19是用於擴增序列辨識編號：2之正向PCR引子。
序列辨識編號：20是用於擴增序列辨識編號：2之正向PCR引子。
序列辨識編號：21是用於擴增序列辨識編號：2之反向PCR引子。
序列辨識編號：22是用於擴增magi17761之正向PCR引子。
序列辨識編號：23是用於擴增magi17761之正向PCR引子。
序列辨識編號：24是用於擴增magi17761之反向PCR引子。
序列辨識編號：25是用於擴增序列辨識編號：3之正向PCR引子。
序列辨識編號：26是用於擴增序列辨識編號：3之正向PCR引子。
序列辨識編號：27是用於擴增序列辨識編號：3之反向PCR引子。
序列辨識編號：28是用於擴增序列辨識編號：4之正向PCR引子。
序列辨識編號：29是用於擴增序列辨識編號：4之正向PCR引子。
序列辨識編號：30是用於擴增序列辨識編號：4之反向PCR引子。
序列辨識編號：31是用於擴增序列辨識編號：5之正向PCR引子。
序列辨識編號：32是用於擴增序列辨識編號：5之正向PCR引子。
序列辨識編號：33是用於擴增序列辨識編號：5之反向PCR引子。
序列辨識編號：34是用於擴增PZA03203-2之正向PCR引子。
序列辨識編號：35是用於擴增PZA03203-2之正向PCR引子。
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序列辨識編號：37是用於擴增序列辨識編號：6之正向PCR引子。
序列辨識編號：38是用於擴增序列辨識編號：6之正向PCR引子。
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序列辨識編號：40是用於擴增PZA03409之正向PCR引子。
序列辨識編號：41是用於擴增PZA03409之正向PCR引子。
序列辨識編號：42是用於擴增PZA03409之反向PCR引子。
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序列辨識編號：44是用於擴增序列辨識編號：7之正向PCR引子。
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序列辨識編號：49是用於擴增序列辨識編號：9之正向PCR引子。
序列辨識編號：50是用於擴增序列辨識編號：9之正向PCR引子。
序列辨識編號：51是用於擴增序列辨識編號：9之反向PCR引子。
序列辨識編號：52是用於擴增PZA02965之正向PCR引子。
序列辨識編號：53是用於擴增PZA02965之正向PCR引子。
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序列辨識編號：56是用於擴增序列辨識編號：10之正向PCR引子。
序列辨識編號：57是用於擴增序列辨識編號：10之反向PCR引子。
序列辨識編號：58是用於擴增序列辨識編號：11之正向PCR引子。
序列辨識編號：59是用於擴增序列辨識編號：11之正向PCR引子。
序列辨識編號：60是用於擴增序列辨識編號：11之反向PCR引子。
序列辨識編號：61是用於擴增magi52178之正向PCR引子。
序列辨識編號：62是用於擴增magi52178之正向PCR引子。
序列辨識編號：63是用於擴增magi52178之反向PCR引子。
序列辨識編號：64是用於擴增序列辨識編號：12之正向PCR引子。
序列辨識編號：65是用於擴增序列辨識編號：12之正向PCR引子。
序列辨識編號：66是用於擴增序列辨識編號：12之反向PCR引子。
較佳實施例之詳細說明
本發明提供一種辨識以及選擇具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。下列定義提供輔助理解本發明。
術語"對偶基因"指的是發生在特定基因座之二或多個不同核苷酸序列中之一者。
"擴增子"是擴增的核酸，如，以任何可用的擴增 方法(如，PCR、LCR、轉錄等等)，擴增樣版核酸所產生之核酸。
在核酸擴增方面之術語"擴增"，是任何一種從而產生選定核酸(或其轉錄形式)之額外複本的過程。典型的擴增方法包括各種聚合酶為基礎的複製方法，包括聚合酶鏈反應(PCR)、諸如連接酶鏈反應(LCR)之連接酶介導的方法以及RNA聚合酶為基礎的擴增(如，利用轉錄)方法。
術語"組裝"適用於BAC以及其等集合形成連續延伸的DNA之傾向。不管BAC是經過定序，還是透過其之BAC指紋與其它BAC之指紋之比對，BAC根據序列比對"組裝"成片段重疊群。使用可在網路上公開獲得之玉米基因組瀏覽器，可找到該等組裝。
當一個對偶基因與一個性狀"連鎖"時，以及當該對偶基因之存在，是該所欲的性狀或性狀形式將會在包含該對偶基因之植物中發生之指示物時，該對偶基因與該性狀"有關"。
"BAC"或細菌人工染色體，是一種從天然發生的大腸桿菌F因子衍生而來之選殖載體。BAC可接受大型的DNA序列插入。在玉米方面，許多BAC或細菌人工染色體(各含有大型的玉米基因組DNA插入)已經組裝成片段重疊群(重疊連續的遺傳片段，或"連續的DNA")。
"回交"指的是一種雜交子代重覆地回交至親本中之一者之過程。在回交之計劃中，"供體"親本指的是具有欲進行滲入之基因或基因座之親本植物。"受體"親本(使 用一或多次)或"輪迴"親本(使用二或多次)，指的要被該基因或該基因座滲入之親本植物。例如，見Ragot,M.et al.(1995)Marker-assisted backcrossing：a practical example,in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques,Vol.72,pp.45-56以及Openshaw et al.,(1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding,Analysis of Molecular Marker Data,pp.41-43。初始雜交得到F1世代：術語"BC1"之後指的是第二次使用輪迴親本，"BC2"指的是第三次使用輪迴親本，以此類推。
“箱(Bin)”意指染色體片段。將染色體之二個固定核心標記之間，劃分成100個大約為20分摩之片段，稱作箱(Gardiner et al.1993 Genetics 134：917-930)。該等片段以染色體數後面接著兩位數小數(如，1.00、1.01、1.02等等)命名。箱是包括從最左邊或最上面的核心標記，至下一個核心標記之所有的基因座之區間。於箱中安置基因座，仰賴精準的定位數據，標記之確定性增加，則數量或總量亦會增加。每當安置是統計上不確定時，'箱1'指的是範圍的開端，而'箱2'意指該範圍之終端。
分摩("cM")是重組率之測量單位。1分摩等於在單代染色體交換中，某遺傳位點上的標記具有1%的機會與另一個遺傳位點上的標記分離。
"染色體區間"指的是位在植物單一染色體上，連續的線性基因組DNA跨度。位在單一染色體區間上之遺傳因子或基因，是物理上連鎖的。染色體區間之大小，沒有 特別限制。在某方面中，位在單一染色體區間內之遺傳因子，在遺傳上是連鎖的，典型地遺傳重組距離，例如，小於或等於20cM或，選擇性地小於或等於10cM。即，單一染色體區間內之二個遺傳因子，經歷重組之頻率小於或等於20%或10%。術語"染色體區間"指的是本發明中所述之標記中任一個所界定之任一以及所有的區間。在此提供與增加可培養性以及可轉形性有關之染色體區間。
術語"互補"意指互補於指定的核苷酸序列之核苷酸序列，即，依照鹼基配對規則產生關聯之序列。
術語"連續的DNA"意指重疊連續的遺傳片段。
術語"核心箱標記(CBM)"意指界定染色體箱之邊界的固定核心標記。
術語"雜交的(crossed)"或"雜交(cross)"，意指透過授粉，配子融合而產生後代(如，細胞、種子或植株)。該術語包含有性雜交(一個植株對另一植株之授粉)與自交(自體授粉，如，花粉與胚珠來自相同植株之情況)。術語"雜交(crossing)"意指透過授粉融合配子產生後代之動作。
"有利對偶基因"是一種在特別基因座上，可提供或促成所欲的表現型，如，增加可培養性以及可轉形性，之對偶基因，或選擇性地，是一種可從育種計劃或栽種("反選擇")移除，使能夠辨識具有減低可培養性以及可轉形性之植物之對偶基因。帶有標記之有利對偶基因，是一種標記對偶基因，其可分離有利表現型，或選擇性地分離不利植物表現型，因此提供辨識植物之好處。
"片段"目的是指一部分的核苷酸序列。片段可用作為使用在此所揭示之方法之雜交探針或PCR引子。
"遺傳圖譜"是說明特定物種內，一或多個染色體上之基因座間之遺傳連鎖關係，通常以圖解或表格形式描述。對於每一個遺傳圖譜，基因座間之距離，是用其等間之重組頻率測量，而基因座間之重組，可使用各種分子遺傳標記(亦稱作分子標記)檢測。遺傳圖譜是作圖群體、所使用之標記類型以及不同群體間各標記之多態可能性之產物。在一遺傳圖譜中，基因座間之順序以及遺傳距離可能與另一遺傳圖譜中的不同。然而，可使用通用的共同標記框架，使一圖譜中之資訊，與另一個產生關連。熟悉此技藝之人士可使用共同標記框架，辨識標記以及其它所關注之基因座，在每一個別的遺傳圖譜上之位置。
術語"遺傳標記"應指任何以核酸為基礎之類型的標記，包括，但不限於，限制性片段長度多態性(RFLP)、簡單序列重覆(SSR)隨機擴增多態DNA(RAPD)、切割擴增多態序列(CAPS)(Rafalski and Tingey,1993,Trends in Genetics 9：275-280)、擴增片段長度多態性(AFLP)(Vos et al,1995,Nucleic Acids Res.23：4407-4414)、單核苷酸多態性(SNP)(Brookes,1999,Gene 234：177-186)、序列特徵化擴增區域(SCAR)(Pecan and Michelmore,1993,Theor.Appl.Genet,85：985-993)、序列標籤位點(STS)(Onozaki et al.2004,Euphytica 138：255-262)、單鏈構象多態性(SSCP)(Orita et al.,1989,Proc Natl Aced Sci USA 86：2766-2770)、 簡單序列重覆區間(ISR)(Blair et al.1999,Theor.Appl.Genet.98：780-792)、反轉錄轉位子間擴增多態性(IRAP)、反轉錄轉位子-微衛星擴增多態性(REMAP)(Kalendar et al.,1999,Theor.Appl.Genet 98：704-711)、RNA裂解產物(諸如Lynx標籤)等等。
"遺傳重組頻率"是二個遺傳基因座間交換事件(重組)之頻率。重組頻率之觀察，可藉由追蹤減數分裂後，標記和/或性狀之分離狀況。
"基因組"意指染色體或染色體組所攜帶之全部的DNA或整組的基因。
術語"基因型"是個體(或個體群)之一或多個遺傳基因座上之遺傳組成，對比於可觀察到之性狀(表現型)。基因型是由個體中從其親本遺傳而來之一或多個已知的基因座之對偶基因所界定的。術語基因型可用於意指個體之單一基因座上、數個基因座上之遺傳組成，或更一般地，該術語基因型可用於意指，個體之基因組中所有基因的遺傳組成。
"種原"指的是個體(如，植株)、一群個體(如，植物品系、品種或科)或從品系、品種、物種或培養衍生而來之選殖株之遺傳物質。種原可為有機體或細胞之一部分，或從有機體或細胞分離出來的。一般而言，種原提供具特定分子組成之遺傳物質，其可提供有機體或細胞培養物之一些或全部的遺傳特質之物理基礎。在此使用之種原，包括可從其等長成新植株之細胞、種子或組織，或植物部分， 如葉子、莖、花粉或可培養成整株植物之細胞。
"單倍型"是個體之數個遺傳基因座上之基因型，即，對偶基因之組合。典型地，單倍型所描述之遺傳基因座，是物理上以及遺傳上連鎖的，即，在相同的染色體片段上。術語"單倍型"可意指特定基因座上，諸如單一標記基因座上之序列、多態性，或給定基因組中沿著染色體片段之數個基因座上之序列多態性。前者亦稱作"標記單倍型"或"標記對偶基因"，而後者可稱作"遠距離單倍型"。
"雜種優勢群"包含一組基因型，其當與從不同雜種優勢群而來之基因型雜交時，表現非常好(Hallauer at al.(1998)Corn breeding,p.463-564.In G.F.Sprague and J.W.Dudley(ed)Corn and corn improvement)。自交系被分類為雜種優勢群，且根據許多標準，諸如譜系、分子標記為基礎的關聯以及在雜交組合中之表現，在雜種優勢群內進一步次分成家系(Smith at al.(1990)Theor.Appl.Gen.80：833-840)。在美國，二個使用最廣的雜種優勢群是"愛荷華堅桿綜合種(Stiff Stalk Synthetic)"(BSSS)以及"Lancaster"或"Lancaster Sure Crop"(有時稱作NSS或非堅桿)。
術語"異型接合的"意指在同源染色體上對應的基因座處，座落不同的對偶基因之遺傳條件。
術語"同型接合的"意指在同源染色體上對應的基因座處，座落相同的對偶基因之遺傳條件。
"雜交(hybridization)"或"核酸雜交"指的是互補RNA以及DNA鏈之配對，以及互補DNA單鏈之配對。
術語"雜交(hybridize)"意指在核酸鏈之互補區域之間，形成鹼基對。
"IBM遺傳圖譜"指的是任一種下列之圖譜：IBM、IBM2、IBM2 neighbors、IBM2 FPC0507、IBM2 2004 neighbors、IBM2 2005 neighbors、IBM2 2005 neighbors frame或IBM2 2008 neighbors。IBM遺傳圖譜是以B73 X Mo17群體為基礎，其中從初始雜交而得之子代，在建構用於作圖之重組自交系之前，隨機交配數代。更新的版本反映了遺傳以及BAC作圖的選殖株之加入，以及由於併入從其它遺傳圖譜獲得之資訊，而提高圖譜之精細度。
術語"indel"指的是插入或刪除，其中可將一品系相對於第二品系稱為具有插入，或可將第二品系相對於該第一品系稱為具有刪除。
術語"基因滲入"指的是將遺傳基因座上所欲的對偶基因，從一遺傳背景傳送至另一個。例如，透過二個相同物種之親本(該等親本中之至少一個之基因組中，具有所欲的對偶基因)間的有性雜交造成之基因滲入，可將特定基因座上之所欲的對偶基因傳送至至少一個子代。選擇性地，例如，對偶基因之傳送，可藉由二個，如，在融合原生質體中之供體基因組(該等供體原生質體中之至少一個之基因組中，具有所欲的對偶基因)間之重組進行。該所欲的對偶基因可為，如，經選定的標記對偶基因、QTL、轉基因等等。在任何情況下，包含該所欲對偶基因之後代，可重複回交至具有所欲遺傳背景之品系，然後選擇該所欲 的對偶基因，以便產生變成固定在選定的遺傳背景中之對偶基因。例如，可將在此所述之染色體1基因座，利用基因滲入至具有綠色植物突然折斷(green snap)問題之輪迴親本。帶有該滲入的基因或基因座之輪迴親本品系，於是具有增加可培養性以及可轉形性。
在此使用之術語"連鎖"，是用於描述一個標記基因座與另一個標記基因座或一些其它基因座(例如，可培養性以及可轉形性基因座)有關之程度。分子標記以及表現型間之連鎖關係，以"機率"或"調整的機率"表示。連鎖可表述為想要的限制或範圍，例如，在一些具體例中，當任二個標記之分離小於50、40、30、25、20或15個圖譜單位(cM)時，其中一個標記是(遺傳上以及物理上)連鎖至另一個標記。在某些方面，界定一個連鎖的範圍框框是有利的，例如，介於10與20cM之間、介於10與30cM之間或介於10與40cM之間。一標記與第二基因座之連鎖越緊密，該標記對該第二基因座之指示效果越好。因此，像是標記基因座以及第二基因座之"緊密連鎖的基因座"，展現出基因座內重組頻率為10%或更低，較佳地約9%或更低，又更佳地約8%或更低，又更佳地約7%或便低，又更佳地約6%或更低，又更佳地約5%或更低，又更佳地約4%或更低，又更佳地約3%或更低以及又更佳地約2%或更低。在極佳的具體例中，該有關的基因座展現重組頻率為約1%或更低，如約0.75%或更低，更佳地約0.5%或更低，或又更佳地約0.25%或更低。二個位在相同染色體上，且其等間之重組頻率在此一低於10 (如，約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%或更低)之距離下之基因座，亦被稱作彼此"接近"。因為1cM是顯示1%重組頻率的二個標記之間的距離，所以當任一標記與任一其它標記(在遺傳上以及物理上)緊密連鎖時，即彼此接近之距離，如等於或小於10cM。在相同染色體上，二個緊密連鎖之標記，彼此位置之距離可為9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更小。
術語"連鎖不平衡"指的是遺傳基因座或性狀(或二者)之非隨機分離。不論那一種情況，連鎖不平衡意味著有關的基因座沿著一段染色體上在物理上足夠接近，如此其等一起分離之頻率大於隨機(即，非隨機)頻率(在共同分離性狀之情況下，構成該性狀之基因座彼此夠接近)。顯示連鎖不平衡之標記，被視為是連鎖的。連鎖的基因座共分離之機率超過50%，如從約51%至約100%之機率。換句話說，二個共分離之標記，具有重組頻率小於50%(按照定義，在相同染色體上分離距離小於50cM)。在此所使用之連鎖，可在二個標記之間，或選擇性地在標記與表現型之間。標記基因座可與性狀"有關"(連鎖)，如，減低綠色植物突然折斷。分子標記對表現型性狀之連鎖的程度之測量單位為，如，該分子標記與該表現型共分離之統計機率。
連鎖不平衡最常使用量度r2作評估，其是使用Hill,W.G.and Robertson,A,Theor Appl.Genet 38：226-231(1988)中所述之方程式計算。當r2=1時，二個標記基因座之間存在完全的連鎖不平衡，意指該等標記沒有經重組而分 離，且具有相同的對偶基因頻率。當r2之值大於1/3時，指示夠強的連鎖不平衡可用於作圖(Ardlie at al.,Nature Reviews Genetics 3：299-309(2002))。因此，當成對標記基因座間之r2值大於或等於0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0時，對偶基因是連鎖不平衡的。
在此使用之"連鎖平衡"描述一種狀況，在此二個標記獨立地分離，即，在子代中隨機分類。顯示連鎖平衡之標記，被視為非連鎖的(不管其等是否落在相同的染色體上)。
"機率對數(LOD)值"或"LOD計分"(Risch,Science 255：803-804(1992))是用於區間作圖法，用以描述二標記基因座間之連鎖程度，二個標記間之LOD計分為3，表示連鎖可能為無連鎖的1000倍，而LOD計分為2，表示連鎖可能為無連鎖的100倍。LOD計分大於或等於2，可用於檢測連鎖。
"基因座"是基因或標記位在染色體上之位置。
"玉米"指的是Zea mays L.ssp.mays植物，亦稱作"玉米(corn)"。
術語"玉米植物"包括：整個玉米植株、玉米植物細胞、玉米植物原生質體、從其中可再生出玉米植株之玉米植物細胞或玉米組織培養物、玉米植物癒傷組織，以及完整的在玉米植物中或玉米植物之部分之玉米植物細胞，諸如玉米種子、玉米穗軸、玉米花、玉米子葉、玉米葉、玉米莖、玉米芽、玉米根、玉米根尖等等。
"標記"是作為參考點之核苷酸序列或其編碼產物(如，蛋白)。對於用在檢測重組之標記，其等需要檢測進行監測之群體內的差異或多態性。至於分子標記，此意指因多核苷酸序列差異產生之DNA位準的差異(如，SSR、RFLP、FLP、SNP)。基因組變異可以是任何起源的，例如，插入、刪除、複製、重複元件、點突變、重組事件，或轉位元之存在以及序列。分子標記可從基因組或表達的核酸(如，EST)衍生而來，且亦可意指用作為能夠經由使用PCR為基礎之方法，擴增序列片段之探針或引子之核酸。許多業界已知之玉米標記是公開的，或可從各種來源獲得的，諸如玉米GDB網路資源以及由Arizona大學管理的Arizona基因組研究所網路資料。
對應於群體之成員間之遺傳多態性之標記，可用業界已建立良好之方法檢測。此等包括，如DNA定序、PCR為基礎的序列專一性擴增方法、限制片段長度多態性(RFLP)之檢測、同功酶標記之檢測、利用對偶基因專一性雜交(ASH)之多核苷酸多態性之檢測、植物基因組之擴增的可變序列之檢測、自我持續序列複製之檢測、簡單重覆序列(SSR)之檢測、單核苷酸多態性(SNP)之檢測或擴增的片段長度多態性(AFLP)之檢測。亦已知有建立良好之方法可用於表達序列標籤(EST)以及從EST序列以及隨機擴增的多態性DNA(RAPD)衍生而來之SSR標記之檢測。
"標記對偶基因"，或者"標記基因座之對偶基因"，指的是可在一群體(其之標記基因座上具多態性)中之標記 基因座處找到之數個多態性核苷酸序列中之一個。
"標記輔助選擇法(MAS)”是一種可根據標記基因型選擇表現型之方法。
"標記輔助反選擇法"是一種標記基因型可用於辨識不想要選擇的植物，容許其等從育種計劃或栽種中移除之方法。
"標記單倍型"指的是在標記基因座處之對偶基因的組合，如PZA01216對偶基因1。
"標記基因座"是在一物種之基因組中可找到特定標記之特定染色體位置。標記基因座可用於追蹤第二連鎖基因座之存在，如編碼或促成表現型性狀之表達之連鎖基因座。例如，標記基因座可用於監控基因座處，遺傳上或物理上連鎖至該標記基因座的對偶基因，諸如QTL或單一基因，的分離。
"標記探針"是可用於辨識標記基因座之存在的核酸序列或分子，如核酸探針，其可透過核酸之雜交作用，互補於標記基因座序列，含有30或更多個在該標記基因中之連續的核苷酸之標記探針(該標記基因座序列之"全部或部分")，可用於核酸之雜交。選擇性地，在一些態樣中，標記探針指的是任何一種能夠區分出現在標記基因座處之特定對偶基因(即，基因型)之類型的探針。
術語"分子標記"，如以上之定義，可用於意指遺傳標記，或其編碼的產物(如，蛋白)，用作為辨識連鎖的基因座之參考點。標記可衍生自基因組核苷酸序列或來自表 達的核苷酸序列(如，來自剪接的RNA、cDNA等等)，或來自編碼的多肽。該術語亦指與該標記序列互補或在其兩側之核酸序列，諸如用作能夠擴增該標記序列之探針或引子對之核酸。
"分子標記探針"是可用於辨識標記基因座之存在的核酸序列或分子，如互補於標記基因座序列之核酸探針。選擇性地，在一些態樣中，標記探針意指任何一種能夠區分出現在標記基因座處之特定對偶基因(即，基因型)之類型的探針。當核酸在溶液中，如，依照Watson-Crick鹼基配對規則專一性雜交時，其等為"互補"。在此所述之標記中之一些，當坐落在插入刪除區域，諸如在此所述之不共線區域時，亦稱作雜交標記。此是因為插入區域，在定義上，是沒有插入之植物的多態性。因此，標記僅需指出有或無該插入刪除區域。任何適合的標記檢測技術，均可用於辨識此一雜交標記，如在此所提供之範例中，使用SNP技術。
"核苷酸序列"、"多核苷酸"、"核酸序列"以及"核酸片段"可交換使用，且意指單或雙鏈，任擇地含有合成、非天然或修改過的核苷酸鹼基之RNA或DNA之聚合物。"核苷酸"是建構DNA或RNA聚合物之單體單元，由嘌呤或嘧啶鹼基、五碳糖以及磷酸基團構成。核苷酸(通常以其等之5'-單磷酸鹽之形式出現)以其等之單一字母名稱稱呼，如下："A"是腺苷酸或去氧腺苷酸(分別針對RNA或DNA)、"C"是胞嘧啶核苷酸或去氧胞嘧啶核苷酸。"G"是鳥苷酸或去氧 鳥苷酸。"U"是脲苷酸、"T"是去氧胸苷酸，"R"是嘌呤(A或G)、"Y"是嘧啶(C或T)、"K"是G或T、"H"是A或C或T、"I"是肌苷以及"N"是任一核苷酸。
術語"表現型"或"表現型性狀"或"性狀"指的是有機體之一或多種性狀。表現型可用目視，或用任何其它業界已知之評估工具觀察，如，顯微鏡、生化分析法或電機分析法。在一些情況下，表現型可由單一基因或遺傳基因座直接控制，即，"單一基因性狀"。在其它情況下，表現型可為數個基因之結果。
基因組之"物理圖譜"是顯示染色體DNA上，可辨識的地標(包括基因、標記等等)之線性順序。然而，與遺傳圖譜相反，地標之間之距離是絕對的(例如，測量鹼基對或分離以及重疊的連續遺傳片段)且不是以遺傳重組為基礎。
"植物"可為整個植株、其任何部分或從植物衍生而來之細胞或組織培養物。因此，術語"植物"可意指下列中之任一種：整個植株、植物組成或器官(如，葉、幹、根等等)、植物組織、種子、植物細胞和/或其等之子代。植物細胞是植物之細胞、從植物取得之細胞或透過培養從植物取得之細胞衍生而來之細胞。
“植物組織培養”指的是，在無菌條件下，於已知組成之營養培養基中維持或生長植物細胞、組織或器官之收集技術。植物組織培養是基於許多植物細胞能夠再生成整個植株之事實。在植物組織培養方面，不同的技術可提 供某些優於傳統的繁殖方法之優點。
"多態性"是DNA之變異，其太過常見，以致不是僅因為新的突變。多態性在群體中，必須具有至少1%的頻率。多態性可為單核苷酸多態性或SNP，或插入/刪除多態性，在此亦稱作"indel"。
"機率值"或"p值"是一表現型與有或無特定標記對偶基因之特定組合是隨機的之統計學可能性。因此，機率計分愈低，表現型以及特定標記共分離之可能性愈高。在一些態樣中，機率計分之評斷為"顯著的"或"不顯著的"。在一些具體例中，隨機分類之機率計分為0.05(p=0.05，5%機率)，被視為共分離的顯著性指示。然而，可接受的機率可為任一小於50%(p=0.5)之禨率。例如，顯著性機率可小於0.25、小於0.20、小於0.15、小於0.1、小於0.05、小於0.01或小於0.001。
術語"子代"指的是雜交產生之後代。
"子代植物"是二個植株間雜交產生的。
"參考序列"是一確定的序列，用作為序列比對之基準。將許多品系之基因座上的基因型分類，可獲得參考序列，在序列比對程式(如，定序裝置)中比對核苷酸序列，然後獲得比對之一致的序列。
"再生"是從植物細胞(如，植物原生質體、癒傷組織或外植體)長成植株之過程。
"硬桿(Stiff Stalk)"雜種優勢群，代表北美以及加拿大玉米生長區域中之主要的雜種優勢群。其亦可被稱為 愛荷華堅桿綜合種，BSSS)雜種優勢群。
術語"轉形"意指將DNA序列或建構體(如，載體或表達盒)引入細胞或原生質體之過程，其中外源DNA是併入染色體中，或能夠自己複製。
短語"在嚴苛條件下"意指一種條件，於其下，探針或多核苷酸可雜交至特定的核酸序列，典型地呈核酸之複合混合物之形式，但基本上不會雜交至其它序列。嚴苛條件是序列依賴性的，會因不同的環境而不同。
序列愈長，專一性雜交需在愈高的溫度下。一般而言，在確定的離子強度pH下，針對特定序列之嚴苛條件之選定，為約低於熱熔化點(Tm)5-10℃。Tm是(在確定離子強度，pH以及核酸濃度下)50%互補於標的之探針，雜交至該標記序列平衡時之溫度(當存在的標記序列過量時，Tm是平衡時，50%的探針被占據)，嚴苛條件可為該等其中鹽濃度低於約1.0M鈉離子，典型地約0.01至1.0M鈉濃度(或其它鹽類)，pH 7.0至8.3，以及對於短探針(如，10至50個核苷酸)，溫度至少約30℃，而對於長探針(如，大於50個核苷酸)，至少約60℃之條件。添加去安定劑，諸如甲醯胺，亦可達到嚴苛條件。在選擇性或專一性雜交方面，正訊號是至少2倍的背景，較佳地10倍的背景雜交。例示性嚴苛雜交條件通常為：50%甲醯胺、5xSSC以及1% SDS，在42℃下培育，或5xSSC、1% SOS，在65℃下培育，在65℃下用0.2xSSC以及0.1% SDS清洗。在PCR方面，對於低嚴苛擴增，溫度典型的約36℃，然而回黏溫度，視引子長度而定，可在約 32℃與48℃間變動。有關決定雜交參數之額外的指導規則，在許多參考文獻中均有提供。
序列比對以及一致性百分比之計算，可使用各種設計用於檢測同源序列之比較方法測定，包括，但不限於，LASERGENE.RTM.生物資訊學電腦套件之MEGALIGN.RTM.程式(DNASTAR.RTM.Inc.,Madison,Wis.)。除非另有說明，否則在此提供之序列多重比對，是使用Clustal V比對方法(Higgins and Sharp,CABIOS.5：151-153(1989))，預設參數(空位罰分=10，空位長度罰分=10)來進行，使用Clustal V，針對蛋白序列的雙序列比對以及一致性百分比之計算的預設參數，是KTUPLE=1，空位罰分=3、WINDOW=5以及DIAGONALS SAVED=5。至於核酸，此等參數是KTUPLE=2，空位罰分=5，WINDOW=4以及DIAGONALS SAVED=4。使用Clustal V程式進行序列比對後，觀察相同程式上之"序列距離"表，能夠獲得"一致性百分比"以及"離散"值；除非另有說明，否則在此提供以及請求之一致性百分比以及離散，是用此方法計算。
"載體"是一能夠在宿主細胞中複製和/或另一DNA片段可操作地連接於其上，以便使附上之片段一起複製之DNA分子。質體是載體之例子。
在詳細描述本發明之前，應先了解，本發明並不限於特定的具體例。亦應了解，在此使用之術語，目的是用於描述特定具體例，不是用於限制。在此以及所附之申請專利範圍所使用之單數以及單數形式，例如"一"以及"該"， 包括複數名詞，除非在內文中有另外清楚的指示。因此，例如，有關"植物"、"該植物"或"一植物"，亦包括複數個植物。視內容而定，術語"植物"之使用，亦包括該植物之遺傳上相似的或一致的子代。使用之術語"核酸"，任擇地包括該核酸分子之許多複本。
遺傳圖譜
長時間以來已知，可將與特定表現型(諸如增加可培養性與可轉形性)有關之特定遺傳基因座，作圖在有機體之基因組中。植物育種者可方便地使用分子標記，經由檢定與所欲的表現型共分離顯示出統計上顯著性機率(表現為連鎖不平衡)之標記對偶基因，來辨識所欲的個體。藉由辨識出與所關注之性狀共分離之分子標記或分子標記叢，育種者能夠藉由選擇適當的分子標記對偶基因，快速地選擇所欲的表現型(一種稱作標記輔助選擇或MAS之方法)。
在業界已熟知各種可用於檢測會與所關注之性狀(諸如增加可培養性以及可轉形性)共分離之分子標記或分子標記叢之方法。此等方法之基本的觀念是檢測其中供選擇的基因型(或對偶基因)具有顯著不同的平均表現型之標記。因此，可以比較標記基因座之間，供選擇的基因型(或對偶基因)間之差異大小，或該差異之顯著性的程度。性狀基因推論為落在最靠近具有最大有關的基因型差異之標記。
二種用於檢測所關注的性狀基因座之方法是：1)群體為基礎的相關分析法以及2)傳統連鎖分析法。在群體 為基礎的相關分析法方面，從具多個首建者(如，優良育種品系)之既存群體中獲取品系。群體為基礎的相關分析法，仰賴連鎖不平衡(LD)的衰減，以及在非結構化的群體中，僅有控制所關注的性狀之基因與緊密連鎖至該等基因之標記之間的相關性，會在如此一代又一代的隨機配對後仍保留下來之概念。事實上，大部分既存的群體具有群體次結構。因此，使用結構化相關的方法，可藉由使用從隨機分佈在基因組中之標記獲得之數據，將個體分配於群體中，幫助控制群體結構，從而使因個體群體內群體結構(亦稱亞群)之不平衡最小化。比較亞群中，各品系之標記基因座之各個基因型(對偶基因)之表現型的值。顯著的標記-性狀相關性表示，標記基因座與一或多個涉及該性狀之表達之遺傳基因座間之劑量接近。
傳統連鎖分析法基於相同的原理；然而連鎖不平衡是由從少量的首建者製造群體而產生。選定首建者，以使建構的群體內之多態性的位準最大化，以及評估多態性位點與指定表現型共分離之程度。已有許多的統計方法可用來辨識顯著的標記-性狀的相關性。此等方法之一種是區間作圖方法(Lander and Botstein,Genetics 121：185-199(1989)，其中測試沿著遺傳圖譜之許多位置中之每一個(約莫1cM區間)，控制所關注的性狀之基因位在該位置之可能性。使用基因型/表現型之數據，計算每一個測試位置之LOD計分(可能比之對數)。當LOD計分超過閾值時，有顯著的證明，控制所關注的性狀之基因的位置，在該遺傳圖譜 上之該位置處(其將落在二個特定標記基因座之間)。
如上所述，此技藝中公知之方法，可用於檢測與所關注的性狀(諸如增加可培養性以及可轉形性)共分離之分子標記或分子標記叢。然而，某些實驗方法，諸如培養、轉形以及再生的動作，可在遺傳分離之植物群體上，使用選擇壓力，如此僅含有該所關注的性狀之遺傳區域之植株，能夠存活以及變成BC1植物。因此，假如遺傳基因座對該所關注的性狀很重要，則可選擇由親本中之一者所攜帶之對偶基因。因此，當在使用選擇壓力後掃描基因組時，對所關注的性狀很重要之對偶基因出現之頻率大於50%。顯示顯著偏差大於50%之標記，代表選擇為正面影響之基因座，且可使用卡方檢定(p<0.05)識別。其中描述了此等用於分子標記檢測之方法。
與增加可培養性以及可轉形性有關之標記。
在此辨識與增加可培養性以及可轉形性有關之標記。該方法涉及檢測至少一個與提高玉米植物之種原有關之標記對偶基因之存在。該標記基因座可選自任一個表1中所提供之標記基因座，包括PZA01216.1、DAS-PZ-7146、DAS-PZ-12685、magi17761、Mo17-100177、DAS-PZ-5617、DAS-PZ-2343、PZA03203-2、Mo17-100291、PZA03409、DAS-PZ-19188、DAS-PZ-2043、DAS-PZ-20570、PZA02965、Mo17-14519、DAS-PZ-12236、magi52178以及DAS-PZ-366，以及任何其它連鎖至此等標記之標記(可從玉米GDB來源 中，決定連鎖的標記)。
位在單一染色體上之基因組DNA之連續線性跨距上之遺傳因子或基因，是物理上連鎖的。標記asg62以及magi87535，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在asg62(或根據Clustal V之比對方法，與asg62具有95%一致性之核苷酸序列)與magi87535(或根據Clustal V之比對方法，與magi87535具有95%一致性之核苷酸序列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
此外，npi386a以及gpm174b，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在npi386a(或根據Clustal V之比對方法，與npi386a具有95%一致性之核苷酸序列)與gpm174b(或根據Clustal V之比對方法，與gpm174b具有95%一致性之核苷酸序列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
此外，agrr37b以及nfa104，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在agrr37b(或根據Clustal V之比對方法，與agrr37b具有95%一致性之核苷酸序列)與nfa104(或根據Clustal V之比對方法，與nfa104具有95%一致性之核苷酸序 列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
此外，umc156a以及pco061578，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在umc156a(或根據Clustal V之比對方法，與umc156a具有95%一致性之核苷酸序列)與pco061578(或根據Clustal V之比對方法，與pco061578具有95%一致性之核苷酸序列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
此外，php20608a以及idp6638，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在php20608a(或根據Clustal V之比對方法，與php20608a具有95%一致性之核苷酸序列)與idp6638(或根據Clustal V之比對方法，與idp6638具有95%一致性之核苷酸序列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
此外，bnl4.36以及umc1482，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在bnl4.36(或根據Clustal V之比對方法，與bnl4.36具有95%一致性之核苷酸序列)與umc1482(或根據Clustal V之比對方法，與umc1482具有95%一致性之核苷 酸序列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
此外，umc126a以及idp8312，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在umc126a(或根據Clustal V之比對方法，與umc126a具有95%一致性之核苷酸序列)與idp8312(或根據Clustal V之比對方法，與idp8312具有95%一致性之核苷酸序列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
此外，bnl9.11a以及gpm609a，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在bnl9.11a(或根據Clustal V之比對方法，與bnl9.11a具有95%一致性之核苷酸序列)與gpm609a(或根據Clustal V之比對方法，與gpm609a具有95%一致性之核苷酸序列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
此外，wx1以及bnlg1209，二者均與可培養性以及可轉形性高度地有關，劃出可培養性以及可轉形性之QTL。任何組裝成在wx1(或根據Clustal V之比對方法，與wx1具有95%一致性之核苷酸序列)與bnlg1209(或根據Clustal V之比對方法，與bnlg1209具有95%一致性之核苷酸 序列)之間且包括其等之連續的DNA之多核苷酸，均可容納與可培養性以及可轉形性有關之標記基因座。公開可得之標記的序列，可使用玉米GDB來源找到。
一般連鎖之測量，是測量性狀共分離之頻率。此可以共分離百分比(重組頻率)或分摩(cM)表示。cM是遺傳重組頻率之測量單位。1cM等於有1%的機會，在一個遺傳基因座上之性狀會因單代雜交，而與在另一基因座上之性狀分開(意此性狀同時分離的機率為99%)。因為染色體距離大略與性狀間之雜交事件的頻率成比例，因此物理距離與重組頻率大略有關。
標記基因座本身就是性狀，且可用標準連鎖分析法，在分離期間追蹤該標記基因座進行評估。因此，1cM等於1%的機會，標記基因座會因單代雜交而與另一個基因座分開。
其它連鎖至列在表2中之標記的標記，可用於預測玉米植物中之可培養性以及可轉形性。此等包括任一個與下列之距離在50cM內之標記：PZA01216.1、DAS-PZ-7146、DAS-PZ-12685、magi17761、Mo17-100177、DAS-PZ-5617、DAS-PZ-2343、PZA03203-2、Mo17-100291、PZA03409、DAS-PZ-19188、DAS-PZ-2043、DAS-PZ-20570、PZA02965、Mo17-14519、DAS-PZ-12236、magi52178以及DAS-PZ-366，與可培養性以及可轉形性有關之標記。一標記與控制所關注的性狀之基因愈越近，該標記作為該所欲性狀之指示物之效率以及優點愈多。緊密連鎖的基因座展現出基因座間 交換頻率為約10%或更小，較佳地約9%或更小，又更佳地約8%或更小，又更佳地約7%或更小，又更佳地約6%或更小，又更佳地約5%或更小，又更佳地約4%或更小，又更佳地約3%或更小，又更佳地約2%或更小。在極佳的具體例中，有關的基因座(如，標記基因座以及標的基因座)展現出重組頻率為約1%或更小，如，約0.75%或更小，更佳地約0.5%或更小，或又更佳地約0.25%或更小。因此，該基因座分開約10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更小。換句話說，二個落在相同染色體上之基因座，且二個基因座之間發生之重組距離頻率小於10%(如，約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%、0.5%、0.25%或更小)，稱作彼此"接近"。
雖然特定的標記對偶基因可能顯示出與增加可培養性以及可轉形性共分離，但很重要需注意的是，該標記基因座不必然負責可培養性以及可轉形性表現型之表達。例如，標記多核苷酸序列不需為給予增加可培養性以及可轉形性之基因的一部分(例如，為基因開放讀取框之一部分)。特定標記對偶基因以及增加可培養性以及可轉形性之間之有關性，是由於該標記對偶基因與祖先玉米品系中之對偶基因(起源於該祖先玉米品系之對偶基因)最初的"偶合"連鎖相。事實上，經過重覆的重組，該標記與遺傳基因座之間之交換，可改變此方向。由於這樣的原因，有利的標記對偶基因，可能隨著用於製造分離群體之抗性親本內所存 在之連鎖相而改變。此不會改變標記可用於監控表現型之分離的事情。此僅改變，哪一個標記對偶基因在給定的分離群體中被視為有利的。
術語"染色體區間"意指由本發明中所述之標記中任一項所界定之任一以及全部的區間。在此提供與可培養性以及可轉形性有關之染色體區間。一個位在染色體1上之區間，包含且兩側為asg62以及magi87535。染色體區間asg62以及magi87535之子區間，是PZA01216.1以及magi17761。另一位在染色體4上之區間，包含且兩側為npi386a以及gpm174b，以及包括Mo17-100177。另一位在染色體4上之區間，包含且兩則為agrr37b以及nfa104。agrr37b以及nfa104之子區間是DAS-PZ-5617以及DAS-PZ-19188。另一位在染色體4上之區間，包含且兩側為umc156a以及pco061578，以及包括DAS-PZ-2043。另一位在染色體4上之區間，包含且兩側為php20608a以及idp6638，以及包括DAS-PZ-20570。另一位在染色體5上之區間，包含且兩側為bnl4.36以及umc1482，以及包括PZA02965。另一位在染色體5上之區間，包含且兩側為umc126a以及idp8312。染色體區間umc126a以及idp8312之子區間，為Mo17-14519以及DAS-PZ-12236。另一位在染色體8上之區間，包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a，以及包括magi52178。另一位在染色體9上之區間，包含且兩側為wx1以及bnlg1209，以及包括DAS-PZ-366。
各種業界公知之方法，均可用於辨識染色體區間。 此等染色體區間之邊界，是劃成包含將會連鎖至控制所關注的性狀之基因之標記。換句話說，染色體區間是劃成，任何落在區間內之標記(包括界定該區間邊界之終端標記)均可作為可培養性以及可轉形性之標記。以上所述之區間，包含一與可培養性以及可轉形性共分離之標記叢。標記之類聚發生在染色體上之相對小型的結構區中，表示控制所關注的性狀之基因出現在該等染色體之區域中。該區間被劃成，包含與可培養性以及可轉形性共分離之標記。該區間包含定位在該區間內之標記，以及界定該終端之標記。例如，asg62以及magi87535界定出一染色體區間，其包含與硬桿亞群中之可培養性以及可轉形性共分離之標記叢。第二例子包括子區間，PZA01216.1以及magi17761，其等界定一染色體區間，其包含與硬桿亞群中之可培養性以及可轉形性共分離之標記叢。由界定區間之終點之終端標記所描述之區間，包括該終端標記以及任何落在該染色體結構區內之標記，不論該等標記目前是已知還是未知的。
染色體區間亦可由連鎖至(顯示連鎖不平衡與)所關注的標記之標記界定，且是一種相關研究中測量連鎖不平衡(LD)之常見的方式。假如落在asg62以及magi87535之區間、PZA01216.1以及magi17761之子區間或asg62以及magi87535之任一其它子區間內之任一染色體1標記基因座，與在具有與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因之區間內已經過辨識之標記間之LD之r2值大於1/3(Ardlie et al.Nature Reviews Genetics 3：299-309(2002))，則該等基因 座是連鎖的。此同樣地可應用於在此所述之任一區間內之任一標記。
本發明之標記亦可為在標記基因座處之對偶基因的結合，也叫作單倍型。熟悉此技藝之人士應可預料，在此所辨識之染色體1、4、5、8以及9標記中以及附近之標記基因座處，可能會有額外的多態性位點，其中一或多個多態性位點，與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因連鎖不平衡(LD)。二個在不同多態性位點處之特定的對偶基因，假如在該等位點中之一者處存在該對偶基因，有預知在相同染色體上之另一個位點處存在該對偶基因之傾向，被稱作連鎖不平衡(LD)(Stevens,Mol.Diag.4：309-17(1999))。
標記輔助選擇
分子標記可用於各式各樣的植物育種應用(如，見Staub et al.(1996)Hortscience 729-741；Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter 1：3-8)。所關注之主要領域之一，是使用標記輔助選擇(MAS)，增加回交以及滲入基因之效率。顯示出與會影響所欲表現型性狀之基因座連鎖之分子標記，可成為在植物群體中選擇性狀之有用的工具。此在表現型很難分析之情況下尤是如此，如，許多疾病抗性性狀，或發生在植物成長之後期階段的狀況，如種核特徵。因為DNA標記分析是較低勞力密集的，且需要比田地或溫室表現型的分型小的實體空間、可分析更大的群體、增加找到與從供體品系移至受體品系之標記片段之重 組體的機會。連鎖愈近，標記愈有用，因為標記與引起性狀之基因之間之重組較不會發生，其會導致偽陽性。具有兩側之標記，因為需要雙重重組事件，可減少偽陽性選擇之發生。理想的狀況是基因本身具有標記，如此標記與基因之間不會發生重組。此一標記稱作`完美標記`。
當基因利用MAS滲入時，不僅是基因被引入，且兩側的基因亦會被引入(Gepts.(2002).Crop Sci；42：1780-1790)。此稱作"連鎖累贅"。在供體植物與受體植物之間高度不有關之情況下，此等兩側區域攜帶了可能編碼農藝學上不欲的性狀之額外的基因。此"連鎖累贅"亦可能導致產率減少，或其它負面的農藝特徵，即使在多次的回交至優良玉米品系之周期後亦如此。此有時亦稱作"產率累贅"。利用額外的回交，可減小兩側區域之大小，然而此不總是能成功，因為育種者無法控制該區域之大小或重組斷點(Young et al,(1998)Genetics 120：579-585)。在典型的育種方面，通常僅是靠運氣，選擇到促成減小供體節段之大小的重組(Tanksley et al.(1989).Biotechnology 7：257-264)。即使20次此類型之回交後，可預期會找到相當大片的供體染色體節段仍連鎖至欲選擇的基因。然而，用標記，選擇該等具有在所關注的基因附近經歷重組之極少數個體，是有可能的。在150個回交的植株中，有95%的機率，至少一個植株將在基因之單一減數分裂圖譜距離1cM內經歷交換。標記容許明確的辨識該等個體。在一額外回交的300個植株中，可能有95%的機率，在該基因之另一側單一減數分裂 圖譜距離1cM內有交換，於是在該標靶基因單一減數分裂圖譜距離2cM附近產生一節段。使用標記，此可在二代之內完成，然而在無標記之情況下，其需要平均100代(見Tanksley et al.，如前)。當基因之正確的位置為已知時，基因附近二側的標記可用於選擇不同群體大小中之重組。例如，在較小的群體大小中，預期重組可能離該基因較遠，所以可能需要較遠二側的標記來檢測該重組。
含有漸增公開玉米標記之密度之玉米基因組之整合的連鎖圖譜之可用性，促進了玉米遺傳作圖以及MAS。見，如，IBM2 Neighbors maps，其可在玉米GDB網站之線上獲得。
實施MAS之主要組成是：(i)定義其中標記-性狀有關性待確定之群體，其可為分離群體，或隨機或結構化的群體：(ii)監控多態性標記相對於該性狀之分離或有關性，以及使用統計方法，決定連鎖或有關：(iii)根據該統計結果，界定一組所欲的標記，以及(iv)使用和/或外推此資訊至目前的育種種原組，使能夠進行標記為基礎的選擇決策。在此揭示內容中所述之標記，以及其它諸如SSR以及FLP之標記類型，可用於標記輔助選擇操作。
SSR可定義為長度6bp或更少之相對短的串聯重複DNA(Tautz(1989)Nucleic Acid Research 17：6463-6471；Wang et al.(1994)Theoretical and Applied Genetics,88：1-6)。多態性會因重複單元數目之變化而提高，大概是因DNA複製期間之滑移所引起(Levinson and Gutman(1987)Mol Biol Evol 4：203-221)。針對保守非重複性兩側區域設計PCR引子，可檢測重複長度之變化(Weber and May(1989)Am J Hum Genet.44：388-396)，SSR非常適合用於作圖以及MAS，因為其等為多對偶基因的、共顯性的、可複製的以及可受高通量自動化檢驗的(Rafalski et al.(1996)Generating and using DNA markers in plants.In Non-mammalian genomic analysis：a practical guide.Academic press,pp 75-135)。
可產生各種類型之SSR標記，且透過擴增的產物之凝膠電泳，可獲得來自抗性品系之SSR譜。標記基因型之分數，是依照經擴增的片段之大小評分。玉米之SSR的服務，由位在Saint-Jean-sur-Richelieu,Quebec,Canada之DNA Landmarks，透過簽定合約向大眾公開。
亦可產生各種類型之FLP標記。最常見的是使用擴增引子來產生片段長度多態性。此等FLP標記很多方面相似於SSR標記，不同的是引子擴增之區域典型地不是高度重復的區域。又，擴增的區域或擴增物，常因插入或刪除，在種原中具有足夠的變異，如此擴增引子產生之片段，可在多態性個體中被區別，以及已知此等插入刪除在玉米中頻繁發生(Bhattramakki et al.(2002).Plant Mol Biol 48,539-547；Rafalski(2002b)，上述)。
SNP標記可檢測單一鹼基對核苷酸取代。在所有的分子標記類型中，SNP是最充富的，因此具有潛力提供最高的遺傳圖譜辨識力(Bhattramakki et al.2002 Plant Molecular Biology 48：539-547)。以稱作`超高通量`之形式， SNP甚至可在比SSR更高之通量位準下分析，因為其等不需大量的DNA以及分析法之自動化是直接的。SNP亦保證為相對低成本的系統。此三個因子一起使得SNP在MAS中之應用上極具吸引力。許多的方法可用於SNP基因型之分型，包括，但不限於，雜交、引子延伸法、寡核苷酸連接法、核酸酶斷裂法、微測序以及編碼微球。在下列文獻中，有此等方法之綜述：Gut(2001)Hum Mutat 17 pp,475-492：Shi(2001)Clin Chem 47,pp.164-172；Kwok(2000)Pharmacogenomics 1,pp.95-100：Bhattramakki and Rafalski (2001)Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants.In：R,J Henry,Ed,Plant Genotyping：The DNA Fingerprinting of Plants,CABI Publishing,Vallingford。有許多各種不同的商用技術，使用此等以及其它方法，來檢驗SNP，包括MasscodeTM(Qiagen)、Invader®(Third Wave Technologies)、SnapShot®(Applied Biosystems)、Taqman®(Applied Biosystems)以及BeadarraysTM(Illumina)。
在序列內，或跨連鎖序列之多個SNP一起，可用於描述任何特定基因型之單倍型(Ching et al.(2002),BMC Genet.3：19 pp Gupta et al.2001,Rafalski(2002b),Plant Science 162：329-333)。單倍型可提供比單一SNP還多的資訊，且可能對任一種特定基因更具描述性。例如，針對特定品系或具有增加可培養性以及可轉形性之品種，單一SNP可能為對偶基因‘T’，但該對偶基因‘T’亦可能出現在欲被用作 為輪迴親本之玉米育種群體中。在此情況下，單倍體，如連鎖的SNP標記處對偶基因之組合，可能可提供更多的資訊。一旦獨特的單倍體被指定至供體染色體區域，則單倍體可在群體或其任一子群體中，用於測定是否個體具有特定基因。見，例如，WO2003054229。使用熟悉此技藝之人士已知之自動化高通量標記檢測平台，使得此方法能高度的有效可行。
表2中列出之序列，可很方便地用於獲得此揭示內容所列出之QTL區間內之額外的多態性SNP(以及其它標記)。可使所述圖譜區域內之標記，雜交至BAC或其它基因組庫，或以電子之方式與基因組序列比對，以便在所述之標記相同接近的位置中，找到新的序列。
除了以上所述之SSR、FLP以及SNP外，亦可廣泛地使用其它類型的分子標記，包括，但不限於，從表達序列標籤(EST)發展而來之標記、從EST序列衍生而來之SSR標記、隨機擴增多態性DNA(RAPD)以及其它核酸為基礎的標記。
同功酶譜以及連鎖的形態特性，在一些情況下，亦可間接地作為標記。雖然其等不是直接檢測DNA差異，但其等常受到特定遺傳差異之影響。然而，檢測DNA差異之標記之數量以及多態性，遠高於同功酶或形態標記(Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter 1：3-8)。
序列比對或片段重疊群亦可用於尋找在此所列出之專一性標記上游或下游之序列。此等接近在此所述之 標記之新的序列，之後用於發現以及建立功能相等的標記。例如，比對不同的物理和/或遺傳圖譜，以便定位出此揭示內容內沒有述及之相等的標記。此等圖譜可以在玉米物種中，或其至橫跨其它在基因或物理性上已經與玉米比對之物種，諸如米、小麥、大麥或高梁。
一般而言，MAS使用已經過辨識具有與可培養性以及可轉形性共分離之顯著可能性之多態性標記。推測此等標記可定位在提供植物可培養性以及可轉形性表現型之基因附近，且被視為所欲性狀或標記之指示物。就標記中所欲的對偶基因之存在測試植株，以及預期在一或多個基因座處含有所欲基因型之植株，會轉移該所欲的基因型(以及所欲的表現型)至其等之子代。在此呈現藉由辨識於在此所述之標記基因座，包括PZA01216.1、DAS-PZ-7146、DAS-PZ-12685、magi17761、Mo17-100177、DAS-PZ-5617、DAS-PZ-2343、PZA03203-2、Mo17-100291、PZA03409、DAS-PZ-19188、DAS-PZ-2043、DAS-PZ-20570、PZA02965、Mo17-14519、DAS-PZ-12236、magi52178以及DAS-PZ-366中任一個處之特定對偶基因之植物，來辨識具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物之方法。
在此所呈現之區間，可應用於MAS，用以選擇顯示出增加可培養性以及可轉形性之植物。任何一個定位在染色體1內由asg62以及magi87535所界定且包括asg62以及magi87535之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含在染色體1中由asg62以及magi87535所界定且包括asg62以及 magi87535之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任何一個定位在染色體4中由npi386a以及gpm174b所界定且包括npi386a以及gpm174b之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含在染色體4中由npi386a以及gpm174b所界定且包括npi386a以及gpm174b之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任何一個定位在染色體4中由agrr37b以及nfa104所界定且包括agrr37b以及nfa104之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含在染色體4中由agrr37b以及nfa104所界定且包括agrr37b以及nfa104之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任何一個定位在染色體4中由umc156a以及pco061578所界定且包括umc156a以及pco061578之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含在染色體4中由umc156a以及pco061578所界定且包括umc156a以及pco061578之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任何一個定位在染色體4中由php20608a以及idp6638所界定且包括php20608a以及idp6638之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含在染色體4中由php20608a 以及idp6638所界定且包括php20608a以及idp6638之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任何一個定位在染色體5中由bnl4.36以及umc1482所界定且包括bnl4.36以及umc1482之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含在染色體5中由bnl4.36以及umc1482所界定且包括bnl4.36以及umc1482之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任何一個定位在染色體5中由umc126a以及idp8312所界定且包括umc126a以及idp8312之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含在染色體5中由umc126a以及idp8312所界定且包括umc126a以及idp8312之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任何一個定位在染色體8中由bnl9.11a以及gpm609a所界定且包括bnl9.11a以及gpm609a之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含染色體8中由umc126a以及gpm609a所界定且包括umc126a以及gpm609a之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任何一個定位在染色體9中由wx1以及bnlg1209所界定且包括wx1以及bnlg1209之區間內之標記，可用於此目的。此外，包含在染色體9中由wx1以及bnlg1209所界定 且包括wx1以及bnlg1209之區間內之一或多個標記基因座處之對偶基因之單倍型，可用於將增加可培養性以及可轉形性引入玉米品系或品種中。
任一個與增加可培養性以及可轉形性有關之對偶基因連鎖不平衡之對偶基因或單倍型，均可用於MAS，來選擇具有增加可培養性以及可轉形性之植物。
範例
下列範例提供用以例示說明，並不是用於限制所附之申請專利範圍。可以理解，在此所述之範例以及具體例僅供例示說明之目的，且熟悉此技藝之人士應能辨識各種在不逸離本發明之思想或所附申請專利範圍之情況下修改的試劑或參數。
範例1：植物材料
使高可轉形性品系A188，與Dow AgroSciences(DAS)優良自交系D046358以及SLB24之間進行初始雜交。之後，使從此等群體而來之F1植物，回交至該優良品系，然後收集未成熟的BC1(回交1)胚，進行培養，以及使其再生成BC1植株。採集從該再生的植株而來之葉組織，使用Biocel 1800機器人平台(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)以及Qiagen MagAttract操作程序(Qiagen,Valencia,CA)提取DNA提取。
範例2：胚之收集
將來自D046358以及SLB24群體之穗，浸在次氯酸鈉(5%)與二滴Tween 20之20%溶液中，歷時20-30分鐘， 接著於無菌水中清洗三次，進行表面消毒。從各穗上，以無菌方式切下未成熟的合子胚(1.0-2.0mm)，然後隨機分配於微離心管中，進行農桿菌侵染。將胚集中在盒中，在此可從相同的品系中得到數個穗。
範例3：再生能力之篩選
針對來自不同品系以及雜交系之胚，進行其等在培養中再生之能力的篩選。將少量採自各穗用於轉形之胚(5-30)，置於二種無選擇劑之培養基中(ZM00002234或ZM00001341，表1.5或1.4)。使培養物在28℃黑暗中培育14天。將增生的胚次培養於同類型的培養基中，以及在28℃黑暗中再培育14天。將胚性癒傷組織轉移至再生培養基(ZM00002388，表1.8)中，以及在16/8小時(h)亮/暗，光強度80-100微莫米/秒/平方米(μmol m-2 s-1)，28℃下，培育10-14天。將帶有初生芽之癒傷組織轉移至第二類型之培養基(ZM00002242，表1.10)中，以及在16/8小時(h)亮/暗，光強度80-100微莫米/秒/平方米(μmol m-2 s-1)，28℃下，培育10-14天。再生頻率評估為，在至少一個芽處再生之胚的數目，除以所放置之胚的數目。
範例4：轉形
範例4.1：農桿菌菌株以及建構體
所有的轉形實驗，均使用帶有超級二元載體pDAB1405之農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404。pDAB1405建構體含有在ZmUbi1啟動子控制下之GFP基因v.2與其內含子，以及在OsActin1啟動子控制下 之PAT基因v.3以及其內含子。二個基因以及啟動子之兩側為RB7 MARs序列(圖1)。
圖1，轉形實驗中使用之pDAB1405之圖譜。
範例4.2：農桿菌培養之啟動
從DAS研究培養物保存中心取得在宿主農桿菌LAB4404中之超級二元載體pDAB1405之甘油原液。在使用含有100mg/L觀黴素、250mg/L鏈黴素以及10mg/L四環黴素之AB基本培養基之培養皿上劃線(AT00002172，表1.13)，且令其在20℃下生長3-4天。之後挑單一個選殖株，劃在含有相同抗生素之YEP培養皿上(AT0002170，表1.14)，且令其在28℃下培育1-2天。
範例4.3：農桿菌共培養
實驗當天，從YEP培養皿上取出農桿菌菌落，懸浮於裝在50ml試管中之7-10ml的感染培養基中 (ZM00002231，表1.1)，使用分光光度計，將細胞密度調整至OD550=1.2-1.4。將農桿菌培養物置於100每分鐘轉速(rpm)之旋轉式振盪器上，同時進行胚的解剖。從消毒後之玉米核仁中分離出大小介於1.5-2.0mm間之未成熟的合子胚，然後置於1ml的感染培養基中(2.0ml之Eppendorf管中約30-130個胚)，接著用相同的培養基清洗一次。將農桿菌懸浮液(1.0ml)加至各管中；倒轉該等管20次，之後靜置於室溫下5分鐘。之後將該等胚移至共培養基上(ZM00002232或ZM00001358，表1.2或1.3)。之後使用顯微鏡，使胚之盾片面朝上。在20℃下共培養3天後，觀察綠螢光蛋白(GFP)轉基因之瞬時表達，用以確認農桿菌感染。
範例4.4：轉基因事件之癒傷組織的選擇以及再生
在共培養期間後，將胚移至含有抗生素頭孢噻肟(cefotaxime)之靜息培養基(ZM00002234或ZM00001341，表1.5或1.4)，然後在28℃黑暗中，培育7天。之後將胚移至含有3mg/L雙丙氨磷(Bialaphos)作為用於選擇導入的pat基因之選擇劑之選擇1培養基(ZM00002240或ZM00002180，表1.6或1.7)，以及在28℃黑暗中，培育14天。在立體顯微鏡下，將表達GFP之增生胚性癒傷組織切成更小的切片(2-3mm)，並移至含有3mg/L雙丙氨磷之選擇培養基上，以及在28℃黑暗中，再培育10-14天。用黑色麥克筆將從一個胚上切下之所有的切片圈起來，視為一個事件。此選擇步驟容許癒傷組織進一步增生，以及提高安定的GFP表達之均一度。癒傷組織選擇時期持續大約4至6周。將表達GFP 之增生、胚性癒傷組織，移至含有3mg/L雙丙氨磷之再生1培養基(ZM00002254，表1.9)，在28℃黑暗中，培養7-10天。此期間對胚性癒傷組織之成熟很重要。
將帶有初生芽之胚性癒傷組織移至無雙丙氨磷之再生2培養基(ZM00002242或ZM00002255，表1.10或1.11)。在16/8h亮/暗，光強度80-100μmol m-2 s-1，28℃下，培育10-14天。將帶有初級根之小芽移至在Magenta盒中之芽伸長以及長根之培養基(ZM00002238，表1.12)，以及在16/8h亮/暗，28℃下，培育7-10天。確認假定的小植物之GFP表達，之後列為轉基因事件。
範例5：BC 1 植株之基因分型
針對SLB24群體，從獨立的培養物中再生出173個BC1植株，而針對D046358群體，再生出117個BC1植株。使用KBioscience競爭型對偶基因專一性PCR系統，或KASParTM(KBiosciences,Hertfordshire,UK)，分別使用256個(針對SLB24群體)以及235個(針對D046358群體)多態性標記，對從再生植株而來之葉組織之DNA進行基因分型。KASParTM系統由二個部分構成(1)SNP專一性分析(三種未標籤之引子之組合)，以及(2)通用反應混合物，其含有所有其它所需的組份，包括通用螢光報告系統以及專一性建立的Taq聚合酶。該三種引子、對偶基因專一性1(A1)、對偶基因專一性2(A2)以及共同(C1)或反向，是使用Kraken之工作流程管理器之分析設計演算法(KBiosciences,Hertfordshire,UK)設計。
製作3個引子之分析混合物，包含A1以及A2各12μM，以及C1 30μM。將通用1536反應混合物稀釋成1x。使用自動移液器，將體積2.0μl之從MagAttract萃取的DNA以1：20稀釋之DNA，分配至PCR盤中，然後在65℃下乾燥2個小時。接著，將1.3μl之1x KASP 1536反應混合物加至PCR盤中。使用融合熱封機(KBioscience,Hertfordshire,UK)，將盤封起來。熱循環在Hydrocycler水浴熱循環器(Kbioscience,Hertfordshire,UK)中，以下列條件完成：在94℃下之起始變性以及熱啟動酵素活化進行15分鐘，接著10個94℃下變性20秒以及從65遞減至57℃ 60秒(每個循環 下降0.8℃)之循環。之後接著29個94℃下變性20秒以及57℃回黏60秒之循環。
KASParTM使用螢光素FAM以及VIC用於區分基因型。被動參考染料ROX亦用於使能夠正規化因井與井液體體積中之差異引起之訊號的變異。在Kraken方面，將FAM以及VIC數據分別在x與y軸上作圖。之後根據樣本群集決定基因型。
範例6：統計分析
培養、轉形以及再生之動作，均會在遺傳分離的胚群體上施與選擇壓力，如此僅含有對組織培養、轉形以及再生具重要性之遺傳區域之胚，能夠存活且變成BC1植株。因此，假若遺傳基因座對培養、轉形或再生而言是重要的，則由親本之一者攜帶之對偶基因將會被選擇出。因此，當在培養以及植物再生後掃描基因組時，對可培養性以及可轉形性具重要性的對偶基因，出現之頻率大於50%。顯示出顯著偏差之標記大於50%，代表對選擇顯示出正作用之基因座，然後使用卡方檢定法(p<0.05)辨識。
卡方分析之結果示出9個與增加可培養性以及可轉形性有關之遺傳區域(表2)。此等遺傳區域落在染色體1、4、5、8以及9中，且代表之前未被報告為與可培養性以及可轉形性有關之新的區域。使用在玉米GDB網站上之IBM2 2008 Neighbors圖譜，決定箱之邊界。
範例7：標記框以及於標記輔助選擇之用途
可用一組共同標記，建立用於辨識染色體區間中之標記之框架。表3示出相對於一另一個在B73參考基因組，第2版，上一致的位置之標記。DAS專有標記之實際位置，是使用DAS proprietary GBrowser測定。公開取得之實際位置，是使用玉米GDB網站上之B73參考基因組，第2版，測定。
與所關注之性狀有關之緊密連鎖的標記，其在基因座上具有與受歡迎之對偶基因連鎖不平衡之對偶基因，可有效地用於選擇具有增加可培養性以及可轉形性之子代植株。因此，在此所述之標記，諸如該等列在表3中者，以及其它遺傳上或實際上定位至相同的染色體區間之標記，可用於選擇具有增加可培養性以及可轉形性之玉米植物。典型地，此等標記組將可用於(如，2或更多、3或更多、4或更多、5或更多)與所關注之性狀有關之區域中。任擇地， 可使用實際基因和/或基因座內之標記。用於擴增以及檢測與增加可培養性以及可轉形性有關的基因組區域之例示性引子，示於表4中。
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<212> DNA
<213> 玉米
<400> 6
<210> 7
<211> 201
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 7
<210> 8
<211> 201
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 8
<210> 9
<211> 201
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 9
<210> 10
<211> 121
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 10
<210> 11
<211> 201
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 11
<210> 12
<211> 201
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 12
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PZA01216.1正向A1
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<213> 人工序列
<220>
<223> PZA01216.1正向A2
<400> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PZA01216.1反向
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-7146反向
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<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-12685正向A1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-12685正向A2
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<220>
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<212> DNA
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<223> magi17761正向A2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> magi17761反向
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mo17-100177正向A1
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<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-5617反向
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-2343反向
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<220>
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<220>
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<223> DAS-PZ-19188反向
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<212> DNA
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<220>
<223> DAS-PZ-2043反向
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DAS-PZ-20570正向A1
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<220>
<223> DAS-PZ-20570反向
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PZA02965正向A1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PZA02965反向
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<213> 人工序列
<220>
<223> Mo17-14519正向A1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mo17-14519正向A2
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mo17-14519反向
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-12236正向A2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-12236反向
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> magi52178正向A1
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> magi52178正向A2
<400> 62
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> magi52178反向
<400> 63
<210> 64
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-366正向A1
<400> 64
<210> 65
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-366正向A2
<400> 65
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DAS-PZ-366反向
<400> 66

Claims (12)

  1. 一種辨識會展現增加可培養性和/或可轉形性之玉米植物之方法，其包含：a)檢測該玉米植物之種原中的至少九種標記基因座，其中至少一種基因座是位在各染色體區間(i)-(ix)內：(i)包含且兩側為asg62以及magi87535；(ii)包含且兩側為npi386a以及gpm174b；(iii)包含且兩側為agrr37b以及nfa104；(iv)包含且兩側為umc156a以及pco061578；(v)包含且兩側為php20608a以及idp6638；(vi)包含且兩側為bnl4.36以及umc1482；(vii)包含且兩側為umc126a以及idp8312；(viii)包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a；以及(ix)包含且兩側為wx1以及bnlg1209；以及b)至少一種與增加可培養性和/或可轉形性有關之對偶基因。
  2. 如請求項1之方法，其中至少一種標記基因座是選自於由下列所構成之各個群組(i)-(ix)：(i)PZA01216.1、DAS-PZ-7146、DAS-PZ-12685以及magi17761；(ii)Mo17-100177；(iii)DAS-PZ-5617、DAS-PZ-2343、PZA03203-2、Mo17-100291、PZA03409以及DAS-PZ-19188； (iv)DAS-PZ-2043；(v)DAS-PZ-20570；(vi)PZA02965；(vii)Mo17-14519以及DAS-PZ-12236；(viii)magi52178；以及(ix)DAS-PZ-366。
  3. 如請求項1之方法，其中該玉米植物屬於硬桿(Stiff Stalk)雜種優勢群。
  4. 一種利用如請求項1之方法辨識之玉米植物。
  5. 一種辨識會展現增加可培養性和/或可轉形性之玉米植物之方法，該方法包含檢測該玉米植物之種原中包含在一或多種標記基因座處之對偶基因之單倍型，其中：a)一或多種標記基因座是位在各染色體區間(i)-(ix)內：(i)包含且兩側為asg62以及magi87535；(ii)包含且兩側為npi386a以及gpm174b；(iii)包含且兩側為agrr37b以及nfa104；(iv)包含且兩側為umc156a以及pco061578；(v)包含且兩側為php20608a以及idp6638；(vi)包含且兩側為bnl4.36以及umc1482；(vii)包含且兩側為umc126a以及idp8312；(viii)包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a；以及(ix)包含且兩側為wx1以及bnlg1209；以及b)該單倍型與增加可培養性和/或可轉形性有關。
  6. 如請求項5之方法，其中該一或多種標記基因座是位在各染色體區間(i)-(ix)內：(i)包含且兩側為asg62以及magi87535；(ii)包含且兩側為npi386a以及gpm174b；(iii)包含且兩側為agrr37b以及nfa104；(iv)包含且兩側為umc156a以及pco061578；(v)包含且兩側為php20608a以及idp6638；(vi)包含且兩側為bnl4.36以及umc1482；(vii)包含且兩側為umc126a以及idp8312；(viii)包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a；以及(ix)包含且兩側為wx1以及bnlg1209。
  7. 如請求項5之方法，其中該玉米植物屬於硬桿(Stiff Stalk)雜種優勢群。
  8. 一種利用如請求項5之方法辨識之玉米植物，其中該玉米植物之種原內包含一與增加可培養性和/或可轉形性有關之單倍型，其中該單倍型包含位在各染色體區間(i)-(ix)內之一或多種標記基因座處之對偶基因：(i)包含且兩側為asg62以及magi87535；(ii)包含且兩側為npi386a以及gpm174b；(iii)包含且兩側為agrr37b以及nfa104；(iv)包含且兩側為umc156a以及pco061578；(v)包含且兩側為php20608a以及idp6638；(vi)包含且兩側為bnl4.36以及umc1482；(vii)包含且兩側為umc126a以及idp8312； (viii)包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a；以及(ix)包含且兩側為wx1以及bnlg1209。
  9. 一種標記輔助選擇之方法，其包含：a)獲得一第一玉米植物，其具有至少九種標記基因座，其中至少一種基因座是位在各染色體區間(i)-(ix)內：(i)包含且兩側為asg62以及magi87535；(ii)包含且兩側為npi386a以及gpm174b；(iii)包含且兩側為agrr37b以及nfa104；(iv)包含且兩側為umc156a以及pco061578；(v)包含且兩側為php20608a以及idp6638；(vi)包含且兩側為bnl4.36以及umc1482；(vii)包含且兩側為umc126a以及idp8312；(viii)包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a；以及(ix)包含且兩側為wx1以及bnlg1209；以及該標記基因座之對偶基因與增加可培養性和/或可轉形性有關；b)使該第一玉米植物與一第二玉米植物雜交；c)就該至少一種對偶基因，評估該子代；以及d)選擇具有該至少一種對偶基因之子代植物。
  10. 如請求項9之方法，其中該至少一種標記基因座是擇自於由下列所構成之各個群組(i)-(ix)：(i)PZA01216.1、DAS-PZ-7146、DAS-PZ-12685以及magi17761； (ii)Mo17-100177；(iii)DAS-PZ-5617、DAS-PZ-2343、PZA03203-2、Mo17-100291、PZA03409以及DAS-PZ-19188；(iv)DAS-PZ-2043；(v)DAS-PZ-20570；(vi)PZA02965；(vii)Mo17-14519以及DAS-PZ-12236；(viii)magi52178；以及(ix)DAS-PZ-366。
  11. 如請求項9之方法，其中該玉米植物屬於硬桿(Stiff Stalk)雜種優勢群。
  12. 一種利用如請求項9之方法選擇之玉米子代植物，其中該植物具有一標記基因座之至少一種對偶基因，其中至少一種標記基因座是位在各染色體區間(i)-(ix)內；(i)包含且兩側為asg62以及magi87535；(ii)包含且兩側為npi386a以及gpm174b；(iv)包含且兩側為agrr37b以及nfa104；(iv)包含且兩側為umc156a以及pco061578；(v)包含且兩側為php20608a以及idp6638；(vi)包含且兩側為bnl4.36以及umc1482；(vii)包含且兩側為umc126a以及idp8312；(viii)包含且兩側為bnl9.11a以及gpm609a；以及(ix)包含且兩側為wx1以及bnlg1209。
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