KR100435152B1 - Ｐｃｒ－ｒｆｌｐ를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별방법 - Google Patents

Ｐｃｒ－ｒｆｌｐ를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양파의 세포질 웅성불임인자를 교배를 통하지 않고 실험실 수준에서 판별할 수 있도록 양파 psbA 유전자를 PCR로 증폭시킨 다음 그 DNA 단편내에 존재하는 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP 분석으로 양파의 세포질 웅성불임인자를 판별하는, PCR-RFLP를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별 방법에 관한 것으로서, 높은 정확도와 신뢰도를 나타내며, 일반적으로 일대잡종 품종을 육성하기 위한 세포질 웅성불임인자 판별에 소요되는 4년 내지 8년의 기간을 일주일 이내로 단축시킬 수 있을 뿐 아니라 웅성불임친과의 검정교배 및 후대 임성확인 과정을 생략할 수 있어 육종효율을 높일 수 있는 장점이 있다.

Description

ＰＣＲ－ＲＦＬＰ를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별 방법{Identification method for cytoplasmic male sterility factor using PCR-RFLP in onion}
본 발명은 PCR-RFLP를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별 방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 양파의 psbA 유전자를 증폭시켜 제한효소로 처리한 다음 유전자의 절단 여부로 양파의 세포질 웅성불임인자를 판별하는, PCR-RFLP를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별 방법에 관한 것이다.
우리나라에서 시판되고 있는 주요 채소품종의 대부분은 일대잡종이다.
이러한 일대잡종 종자를 생산하기 위해서는 인공교배, 웅성불임성 및 자가불화합성 등을 이용하고 있다.
웅성불임성(雄性不 稔性, male sterility)이란 자연계에서 일어나는 일종의 돌연변이로 웅성기관, 즉 수술의 결함으로 인하여 수정능력이 있는 화분을 생산하지 못하는 현상이다.
웅성불임성을 이용한 일대잡종 생산은 양파를 비속한 고추, 무, 파 등을 들 수 있는데, 웅성불임성을 이용할 경우 순도가 매우 높은 일대잡종 종자를 채종할 수 있는 장점이 있다.
그러나, 양파는 그 생육 특성상 파종 후 2년이 지나야 가임과 불임의 판단이 가능하므로 세포질의 인자형 즉 불임인 S 인자와 가임인 N 인자를 구분하기 위해서는 웅성불임개체(Smsms)와 검정교배시킨 다음 일일이 꽃의 임성과 가임을 관찰한 후 후대검정을 하는 등 4년 내지 8년의 장기간이 소요될 뿐 만 아니라 판별 노력과 비용이 많이 소요되는 문제점이 있었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 최근에는 분자유전학적 마커를 이용한 세포질 인자형 구분 방법들이 개발되었으며, 세포질에 존재하는 엽록체와 미토콘드리아의 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 밴드의 차이를 조사함으로서 정상개체(N)와 불임개체(S)를 구분할 수 있다고 보고되었다.
그러나 상기와 같은 RFLP 방법은 교배를 통한 방법보다는 빠르고 효과적이기는 하나 많은 양의 DNA 추출이 필요하고 숙련된 기술을 요하는 문제점이 있었다.
본 발명은 종래의 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 양파의 웅성불임을 조절하는 세포질의 웅성불임인자를 교배를 통하지 않고 실험실 수준에서 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 F1 품종육성을 위해 꼭 필요한 웅성불임친 및 유지친 육성기간을 단축시킬 수 있는 신속하고 정확한 양파세포질 웅성불임인자의 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기와 같은 목적들은 양파 psbA 유전자를 PCR로 증폭시킨 다음 그 DNA 단편내에 존재하는 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP 분석으로 양파의 세포질 웅성불임인자를 판별하는 방법을 제공함으로써 달성되는데, 상기 방법은 실험실내에서 간단히 수행할 수 있을 뿐 아니라 높은 정확도와 신뢰도를 나타내는 장점이 있다.
도 1a는 실시예 2의 35종 양파의 psbA 유전자 증폭산물의 전기영동 사진,
도 1b는 실시예 3의 35종 양파의 psbA 유전자증폭산물을 HinfI 제한효소로 처리한 후의 전기영동 사진,
도 1c는 실시예 3의 35종 양파의 psbA 유전자증폭산물을 HaeIII 제한효소로 처리한 후의 전기영동 사진,
도 1d는 실시예 3의 35종 양파의 psbA 유전자증폭산물을 RsaI 제한효소로 처리한 후의 전기영동 사진,
도 1e는 실시예 3의 35종 양파의 psbA 유전자증폭산물을 MspI 제한효소로 처리한 후의 전기영동 사진,
도 2는 실시예 4의 W202, W205, W404, 사뽀로끼, 대관령 1호의 psbA 유전자의 PCR-RPLP 결과에 따라 웅성불임 및 가임을 판단한 사진이다.
본 발명은 양파 psbA 유전자를 PCR로 증폭시킨 다음 그 DNA 단편내에 존재하는 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP 분석으로 양파의 세포질 웅성불임인자를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 psbA 유전자 PCR 증폭산물을 제한효소 MspI로 처리한 후 psbA 유전자가 절단되면 세포질 웅성불임인자가 가임인 N 인자(N-type)이고 절단되지 않으면 불임인 S 인자(S-type)로 판별하는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 양파의 세포질 웅성불임인자를 판별하기 위하여 다양한 엽록체 유전자들을 PCR(Polymerase chain reaction) 증폭시킨 다음 그 산물들을 여러 가지 제한효소를 이용하여 절단하는 PCR-RFLP를 수행한 결과 양파의 세포질 웅성불임인자를 판별할 수 있는 새로운 방법을 개발하였다.
즉, 포토시스템 II(Photosystem II)의 D1 단백질을 생산하는 유전자인 psbA 유전자를 MspI 제한효소로 처리한 다음 그 절단 여부에 따라 웅성 불임과 가임 인자를 구분할 수 있었으며, 웅성 불임 인자와 가임 인자 개체의 psbA 유전자를 염기서열 분석한 결과 각각의 468번째 염기서열이 불임성은 T로 가임성은 C로 치환된 단일누클레오티드 폴리모리즘(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)인 것으로 밝혀졌다.
상기와 같은 양파 psbA 유전자의 468번째 염기서열의 단일누클레오티드 폴리모리즘(A/T가 C/G로 변함)으로 인하여 세포질 가임 인자(N-type)를 가지는 개체는 CCGG 염기서열이 있어 MspI 제한효소로 절단할 수 있으나 불임 인자(S-type)를 가지는 개체는 CTGG 염기서열을 가지므로 MspI 제한효소가 절단할 수 없는 것이다.
이하, 본 발명 PCR-RFLP를 이용한 양파세포질 웅성불임인자의 판별 방법을 실시예를 들어 상세하게 설명하면 다음과 같다.
실시예 1
DNA 추출
1. 하기 표 1의 양파 종자 35종을 각각 406공 트레이에 파종 후 30일이 지난 어린 잎을 채취하여 액체 질소를 사용하여 곱게 파쇄하고 50㎖ 튜브로 옮긴 후 시료 1g당 6㎖의 완충제(buffer){2% CTAB, 1.4M 염화나트륨(NaCl), 0.2% 2-머캡토 에탄올(2-mercapto ethanol), 20mM EDTA, pH 8.0의 100mM Tris-Cl}를 첨가하여 60℃에서 10∼20분 동안 반응시켰다.
2. 상기 반응액과 동량의 클로로폼/이소아밀알코올(chloroform /isoamylalcohol) 혼합용액(24:1)을 섞어 10분간 반응시킨 다음 3,000rpm으로 원심분리한 후 상징액을 새 튜브로 옮겼다.
3. 상기 용액 전체량의 2/3에 해당하는 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)을 넣어 조심스럽게 섞은 후 2,000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전된 DNA 펠릿(pellet)을 70% 에탄올로 세척하고 공기중에서 말렸다.
4. 잘 말린 DNA 펠릿(pellet)에 적정량의 TE 완충제(buffer)를 첨가하여 녹인 후 1.5㎖ 튜브로 옮기고 최종량이 10㎍/㎖가 되게 RNase를 첨가하여 37℃에서 두시간 동안 반응시켜 RNA를 제거하였으며, 동량의 클로로폼/이소아밀알코올(chloroform/isoamylalcohol) 혼합용액(24:1)을 첨가하여10분간 반응시킨 후 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상징액을 채취하였다.
5. 새 튜브로 옮긴 상징액에 2.5배의 100% 에탄올을 첨가하여 침전시킨 후 70% 에탄올로 세척하고 건조시킨 다음 200∼500㎕의 TE 완충제(buffer)에 녹여 냉동보관하였다.
DNA 정량은 DNA 플루오로미터(Fluorometer) TKO 100(Hoefer사)을 이용하였으며, 20ng을 PCR 분석에 이용하였다.
실시예 1에서 사용된 양파 품종 및 세포질 웅성불임인자
No 품종 세포질웅성불임인자 No 품종 세포질웅성불임인자
1 T406 S 19 천심 S
2 Redwing S 20 Daytona(osborn) S
3 고랭지여름양파 S 21 Frontier S
4 가무이 S 22 울프 S
5 히구마 S 23 삿뽀로끼 S
6 Copro S 24 원륜(이상명) S
7 Orograncle S 25 대관령 1호 N
8 Corona S 26 76065 N
9 Tamara S 27 76067a S, N
10 Daytona(bejo) S 28 76080 N
11 Sundance S 29 76114 N
12 Hustier S 30 W202B N
13 Aldato N 31 링메스타a S, N
14 Headliner S 32 미야모토a S, N
15 DH97-75 S 33 기다미a S, N
16 DH-97-78 N 34 기따모미찌a S, N
17 DH98-KF931 S 35 85-6(레오) S
18 DH98-WP3 N
a : S와 N 인자의 혼재
실시예 2
PCR 반응
1. 상기 실시예 1에서 추출된 각각의 게놈 DNA(genomic DNA) 20ng, 하기 표 2에 나타낸 프라이머(primer) 100nM, dNTP 200μM, 탁 폴리머라제(Taq polymerase)(Bioneer, Co.) 1.0U, 10X 완충제 2uL{500mM 염화칼륨, 100mM 트리스-염산(Tris-HCl) pH 8.3, 15mM 염화마그네슘, 0.01% 젤라틴(gelatin)}을 첨가한 후 총 반응액 20uL로 하여 PCR을 수행하였다.
2. PCR 조건은 94℃에서 프리-디네츄레이션(pre-denaturation) 5분 후 94℃에서 디네츄레이션(denaturation)을 30초간 실시한 다음 하기 표 2의 각 프라이머의 종류에 따라 어닐링(annealing) 온도를 52℃에서 60℃까지 다르게 하여 30초간 수행하였고 72℃에서 익스텐션(extension)을 1분으로 하여 45회 반응시킨 다음 포스트-익스텐션(post-extension)을 72℃에서 5분간 수행하였다.
PCR 머신(machine)은 PE-9700을 이용하였고 PCR 반응 후 1.4% 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동하여 EtBr 염색 후 이미지 애널라이저 II(Image Analyzer II)(Bioneer, Co.)를 이용하여 촬영하였다.
실시예 2에서 사용된 유전자 및 프라이머의 특징
유전자 프라이머 염기서열 증폭산물 크기(bp)
rpoB trpoB1 5'-ctaaggggttgttgtgtaac-3' 1,286
trpoB2 5'-aatatgcaacgtcaagcagt-3'
psbA tpsbA1 5'-tacgttcgtgcataacttcc-3' 939
tpsbA2 5'-ctagcactgaaaaccgtctt-3'
16S t16s1 5'-acgggtgagtaacgcgtaag-3' 1,375
t16s2 5'-cttccagtacggctaccttg-3'
psaA tpsaA1 5'-aagaatgcccatgttgtggc-3' 2,218
tpsaA2 5'-ttcgttcgccggaaccagaa-3'
trnK ttrnK1 5'-aacccggaactagtcggatg-3' 2,519
ttrnK2 5'-tcaatggtagagtactcggc-3'
실시예 3
PCR-RFLP
1. 상기 실시예 2에서 얻어진 rpoB, psbA, 16S, psaA, trnK 등 5가지 엽록체 유전자의 PCR 증폭산물들을 각각 5ul씩 취하여 제한효소 HinfI, HaeIII, RsaI, MspI로 처리하였다.
2. 상기 PCR 증폭산물들의 절단여부를 알아보기 위하여 1.5% 아가로스젤에 전기영동 후 EtBr로 염색하여 세포질웅성불임인자와 가임인자를 구분할 수 있는 조합을 선발하였다.
상기 실시예 3의 결과 rpoB, 16S, psaA, trnK 등의 엽록체 유전자의 PCR 증폭산물들은 제한효소 HinfI, HaeIII, RsaI, MspI과의 반응에서 세포질 웅성불임인자가 N 인자 또는 S 인자일 경우에 따른 특이성을 나타내지 않았으나, psbA 유전자는 도 1a∼1e에 도시된 바와 같이 MspI 제한효소와의 반응에서 세포질 웅성불임인자가 N 인자일 경우에는 절단되고 S 인자일 경우에는 절단되지 않는 특이성을 나타내어 세포질 웅성불임과 가임을 판별할 수 있었다.
본 발명자들은 상기 실시예 3으로부터 포토시스템 II(Photosystem II)의 D1 단백질을 생산하는 유전자인 psbA 유전자를 MspI 제한효소로 절단하였을 때 양파 세포질 웅성 불임과 가임 인자를 구분할 수 있음을 밝혀내고 이를 하기 실시예 4에서 다양한 양파 종자에 적용하여 재확인하였다.
실시예 4
위스콘신대학에서 육성한 근동질 유전 계통(near isogenic lines; NILs)인 웅성불임친(A 계통)과 유지친(B 계통) W202, W205, W404 3조합과 방임수분 품종이며 고랭지양파 품종인 사뽀로끼, 고랭지농업시험장에서 육성한 고랭지양파 품종인 대관령 1호를 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA를 추출하고 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 PCR-RPLP를 실시하였다.
도 2는 상기 W202, W205, W404, 사뽀로끼, 대관령 1호의 psbA 유전자의 PCR-RPLP 결과에 따른 웅성불임 및 가임을 판단한 사진으로서, "A"는 상기 W202, W205, W404, 사뽀로끼, 대관령 1호의 psbA 유전자 증폭산물의 전기영동 사진이며, "B"는 상기 psbA 유전자 증폭산물들을 MspI 제한효소로 절단하여 웅성불임과 가임을 판단한 사진이다. 또한, "M"은 DNA 크기를 알기 위한 마커이며, "S"와 "N"은 각각 세포질 웅성불임인자인 S 인자(S type)와 N 인자(N type)를 나타낸 것이다.
상기 실시예 4의 결과 도 2에 나타난 바와 같이 세포질 웅성불임인자가 N 인자일 경우에는 절단되고 S 인자일 경우에는 절단되지 않는 특이성을 나타내어 본발명의 실효성을 재확인할 수 있었다.
실시예 5
DNA 염기서열결정
양파의 엽록체내의 psbA 유전자 염기서열을 결정하기 위하여 클로닝 운반체로서 프로메가사(Promega Co.)의 pGEM-T 이지 벡터(pGEM-T EASY vector)를 이용하였고 자동 DNA 시퀀서(automatic DNA Sequencer)인 ABI377(Applied Biosystem Co.)을 이용하여 ABI 빅다이 터미네이터(ABI Bigdye terminator) 방법을 사용하였다.
자동 DNA 시퀀서(Automatic DNA sequencer)를 이용하여 분석된 염기서열들은 유닉스 워크스테이션(UNIX workstation) 하에서 프래드 & 프랩 & 콘시드(Phred & Phrap & Consed) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
상기 염기서열 모두를 양방향으로 시퀀싱(sequencing) 하고 각 시퀀스(sequence)들을 어셈블리(assembly)하여 완전한 염기서열을 해독한 결과 서열목록의 서열번호 1 및 2에 나타난 바와 같이 468번째 염기서열이 불임성은 T로 가임성은 C로 치환된 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)로 밝혀졌다.
즉 양파의 경우 세포질 가임인자를 가진 개체는 psbA 유전자에 CCGG 염기서열이 있어 MspI 제한효소로 절단할 수 있으나 불임인자를 가진 개체는 CTGG 염기서열로 MspI 제한효소가 절단할 수 없기 때문에 PCR-RFLP를 이용하여 양파세포질 웅성불임인자를 판별할 수 있다.
본 발명의 PCR-RFLP를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별 방법은 실험실내에서 간단히 수행할 수 있는 간단용이한 방법으로서 높은 정확도와 신뢰도를 나타내며, 일반적으로 일대잡종 품종을 육성하기 위한 세포질 웅성불임인자 판별에 소요되는 4년 내지 8년의 기간을 일주일 이내로 단축시킬 수 있을 뿐 아니라 웅성불임친과의 검정교배 및 후대 임성확인 과정을 생략할 수 있어 육종효율을 높일 수 있는 장점이 있다.
또한 상기와 같은 판별 기간 단축으로 국내 품종 뿐 아니라 전량 일본으로부터 수입되고 있는 극조생 양파와 고랭지 양파에 대한 품종 육성을 활성화 시킬 수 있으므로 양파 육종에 소요되는 시간적·공간적 비용을 획기적으로 절감시킬 수 있는 효과가 있다.

Claims (2)

  1. 양파 psbA 유전자를 PCR로 증폭시킨 다음 그 DNA 단편내에 존재하는 제한효소 MspI의 인식부위인 양파 psbA 유전자의 468번째 염기서열을 이용한 RFLP 분석으로 양파의 세포질 웅성불임인자를 판별하는, PCR-RFLP를 이용한 양파세포질 웅성불임인자 판별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 psbA 유전자 PCR 증폭산물을 제한효소 MspI로 처리한 후 psbA 유전자가 절단되면 세포질 웅성불임인자가 가임인 N 인자(N-type)이고 절단되지 않으면 불임인 S 인자(S-type)로 판별하는 것을 특징으로 하는, 양파의 세포질 웅성불임인자 판별 방법.
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