JPH07222588A - イネ細胞質雄性不稔回復系統の遺伝子診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 イネの細胞質雄性不稔形質の有無を検定す
る簡便な方法を提供する。 【構成】 イネ細胞質雄性不稔回復遺伝子または
非細胞質雄性不稔回復遺伝子に係わる塩基配列の有無を
特定のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、特定の
配列が増幅されたか否かにより検定する。 【効果】 雄性不稔回復系統および非雄性不稔回復系
統のそれぞれを容易に検定可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、イネにおいて雄性不稔
回復遺伝子が存在するか否かを検定する方法に関し、ハ
イブリッド種子を生産するためのイネの検定および改良
に利用される。

【０００２】

【従来の技術】細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）は、高等植物
に広く見られる現象で、細胞質と核ゲノムの不適合によ
って正常な花粉の発達が妨げられ、植物が不稔となる現
象である。細胞質雄性不稔を示す植物は、正常な花粉形
成能力を欠如してはいるが雌ずいは正常に発達してお
り、正常な花粉を交配することによって後代を得ること
ができる。また、この現象は細胞質に起因するため、す
べての後代が同じ性質を有することになる。この様な細
胞質雄性不稔の特性は、ハイブリッド種子を生産するた
めには極めて有用であり、ハイブリッド種子の商業生産
に広く利用されている。植物では一般に、雑種（ハイブ
リッド、Ｆ１（”エフワン”）＝雑種第１代）にすると
多くの形質に関して両親のいずれよりも強壮となり、収
量および品質が向上することが古くから知られている。
この現象を雑種強勢と呼び、イネに応用したものがハイ
ブリッドライスである。

【０００３】しかしながら、自家受精作物であるイネに
は、１つの穎花（＝籾殻に包まれた花）に雌しべと雄し
べの両方が存在する。したがって、雑種種子を得るため
には、自家受精を避けるために採種予定イネの穎花の開
花直前に穎花内の雄しべをすべて取り除き（除雄）、父
親（花粉親）となる他のイネの穎花における雄しべの花
粉を採種予定イネの穎花の雌しべに受精させる必要があ
る。イネにおける従来の他家受精を行なう方法には、開
花前に１つ１つの穎花の雄しべを除雄し、その後、雑交
を避けるために袋をかぶせ、開花時期に花粉親の花粉と
受粉させ、また袋をかぶせるといった方法であった。し
かしながら、このような手交配を利用した方法は、商業
的規模での大量の雑種種子生産には全く利用できないも
のである。

【０００４】そこで、イネのような自家受精作物でも雑
種種子を大量に得るために、雄性不稔を利用した採種体
系の導入が図られた。現在、ハイブリッドライスの生産
に関しては、細胞質雄性不稔系統を主軸とし、それを維
持するための系統、およびＦ１雑種生産のための稔性回
復系統（それぞれＡ−ｌｉｎｅ、Ｂ−ｌｉｎｅ、および
Ｒ−ｌｉｎｅと呼ぶ）の３つの系統を用いた「三系法」
が確立されている。ハイブリッドライス作成において
は、その親系統である細胞質雄性不稔系統（Ａライン）
と細胞質雄性不稔回復系統（Ｒライン）の両者について
純化を行なう必要がある。純化されたか否かの検定は従
来法であれば文字どおり種子稔性で調べることになる
が、莫大な労力と時間を要する。また、この操作は気候
や栽培条件に支配され低温日照不足など別の要因で雄性
不稔の現象が現われるなどの問題点がある。さらに、的
確な判断を下すためには検定母数を増やすなどの必要性
があるため、作業現場でのこの作業の効率化と簡略化が
求められていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題はイネの
細胞質雄性不稔形質の有無を検定する簡便な方法を提供
することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記本発明の目的は、イ
ネ細胞質雄性不稔回復遺伝子または非細胞質雄性不稔回
復遺伝子に係わる塩基配列の有無を特異的に検出するこ
とにより、イネ細胞質雄性不稔形質の有無を遺伝子診断
する方法により達成される。以下、本発明につき、本発
明を見いだした経緯と共に具体的に説明する。

【０００７】１９９０年に報告されたランダム増幅多型
ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析法は遺伝的に非常に近い２種の
生物の間の変異を調べるのに効果的である。これは、お
よそ１０ｂｐほどの単一のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖増
幅反応）プライマーを用いて、アニーリング温度を下げ
た条件でＰＣＲを行なう。一回のＰＣＲで平均４個程度
のＤＮＡ断片が増幅されるが、この増幅のパターンが種
によって特異的であるので、この違いを検出することに
よって多型を調べることが可能である。この目的のため
に約８００種以上の合成プライマーが市販されており、
これらをＰＣＲのプライマーとして用いることによって
少なくとも３２００の目印をゲノム上につけることがで
きる。

【０００８】本発明者はハイブリッドライスのＲライン
に存在する雄性不稔回復遺伝子を検出するために、この
ＲＡＰＤ解析法によるＲライン特異的な増幅パターンを
調べた。その結果、多数のプライマーの中のただ１種の
プライマーを用いてＰＣＲを行なった場合に、Ｒライン
に特異的な増幅断片が得られることが明らかとなった。
また、この系統と対立する稔性回復遺伝子を有しない系
統（非稔性回復系統）に特異的な断片を増幅することの
できるプライマーを同様の方法で見いだした。増幅され
たこれらの断片そのものが、雄性不稔回復遺伝子（Ｒ遺
伝子）あるいは非雄性不稔回復遺伝子そのものであると
結論することはできないが、調べた品種すべてにおい
て、これらの断片の存在または不存在と雄性不稔回復因
子の存在または不存在が完全に対応するため、これらの
断片を検出することがすなわち雄性不稔回復遺伝子の存
在または不存在の検出につながると考えられる。

【０００９】しかしながら、ＲＡＰＤ法による検出法で
は、１０ｍｅｒ程度の非常に短いプライマーを用いて低
いアニーリング温度でのＰＣＲ反応を行なう。そのた
め、ＰＣＲによって多数の不必要な断片の増幅が見られ
るので、増幅された多数の断片の中から稔性回復遺伝子
に対応する特定の断片の増幅があるかどうかの判定によ
って、遺伝子の有無を判定することになる。そのため、
この方法を用いての稔性回復遺伝子の検定を日常業務と
して行なうためには、かなりの熟練性を要し、しかも再
現性にもやや問題があることが指摘されている。そこ
で、これらの問題点を解決するため、反応条件およびプ
ライマーの根本的改良を行った。以下、これについて詳
述する。

【００１０】（１）ＲＡＰＤ法による雄性不稔回復系統
および非雄性不稔回復系統にそれぞれ特異的な断片の検
出 細胞質雄性不稔は交配を重ねることによってインディカ
型の細胞質とジャポニカ型の核ゲノムを有するイネに生
じることがわかっている。ジャポニカ型イネである台中
６５号とインディカ型イネであるＣｈｉｎｓｕｒａｈ
Ｂｏｒｏ ＩＩの交配により得られた雄性不稔イネＴ６
５−Ａ系統と、これにインディカ型イネの核ゲノムに含
まれる稔性回復遺伝子Ｒｆ遺伝子を導入し、台中６５号
による戻し交配を７回重ねることによって得られたＴ６
５−Ａの稔性回復遺伝子を除く形質がほぼ等価な準同質
遺伝子系統Ｔ６５−Ｒ系統がある。

【００１１】これらの２つの系統のイネからＲｏｇｅｒ
ｓとＢｅｎｄｉｃｈの方法（Ｒｏｇｅｒｓ，ＳＯ． ａ
ｎｄ Ｂｅｎｄｉｃｈ，ＡＪ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ． ５：６９−７６）に従い、ゲノムＤＮ
Ａを抽出した。得られたＤＮＡを反応材料として、オペ
ロン社（米国カリフォルニア州アラメダ）によって販売
されているおよそ８００種のＲＡＰＤプライマーのそれ
ぞれをＰＣＲのプライマーとしてオペロン社の基本的実
験法に従って反応を行なった。Ｔ６５−ＡとＴ６５−Ｒ
の二つの系統のゲノムＤＮＡは稔性回復遺伝子の周辺の
領域の遺伝子を除いて等価であると考えられる。そのた
め、両者の間で増幅される断片が異なる場合は、その増
幅された断片と稔性回復遺伝子との間で強い関連がある
ことが示唆される。ＲＡＰＤプライマーを用いたＰＣＲ
の反応組成及び反応条件は以下のとおりである。１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣ
ｌ， ２ｍＭ ＭｇＣｌ₂， ０．００１％ ｇｅｌａ
ｔｉｎ， それぞれ１００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ， ５ピコモルの１０−ｂａｓ
ｅからなるプライマーＤＮＡ， ２５ ｎｇのイネゲノ
ムＤＮＡ， １ユニットのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ（宝酒造あるいは東洋紡より購入）を含み、
合計２５μｌになるように水で調節した。反応サイクル
は、９４℃１分、４０℃１分、７２℃２分、の繰り返し
を４５回行なった後、７２℃１０分、その後４℃で維持
した。ＰＣＲ反応はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔ
ｕｓＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０型
を使用した。反応後、７０μｌのクロロホルムを加えて
ＤＮＡを含む水層を抽出した。得られたＤＮＡ溶液のう
ち２０μｌを用いてアガロースゲル電気泳動を行ない、
増幅された断片の解析を実施した。アガロースゲル電気
泳動はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている方法
に従って０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含
む２．２５％アガロースで、ＴＡＥバッファー（ｐＨ
７．６）中で１００Ｖで約３時間電気泳動を行った。

【００１２】大多数のプライマーを用いて増幅された断
片は二つの系統の間で全く差が認められなかった。しか
し、Ｌ−０６プライマー（５’−ＧＡＧＧＧＡＡＧＡ
Ｇ）を用いたときにはＴ６５−Ｒ系統特異的な１．１ｋ
ｂの大きさを有する断片が（図１）、ＡＪ−０８プライ
マー（５’−ＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣ）を用いたときには
Ｔ６５−Ａ系統特異的に増幅される０．６ｋｂの大きさ
を有する断片が（図２）、いくつかの共通に増幅される
断片の中に交じってそれぞれが特異的に増幅されること
がわかった。

【００１３】（２）雄性不稔回復系統に特異的な断片の
単離と構造解析 前項において記載したＴ６５−ＲにおいてＬ−０６プラ
イマーを用いて増幅される１．１ｋｂの特異的断片はア
ガロースゲル電気泳動を行なって単離し、末端をポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてリン酸化したあと、プラス
ミドｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングし
た。得られたプラスミドｐＬ０６Ｒについて制限酵素切
断地図を作成した。さらにダイデオキシ法によって塩基
配列を決定した。これによって得られた塩基配列を配列
番号１に示す。この配列を、ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡデ
ータベースを用いて相同性を有する配列を検索したが、
該当する配列は存在しなかった。このことはこれまでに
報告のない新規な塩基配列であることを示す。

【００１４】（３）稔性回復系統特異的断片増幅用プラ
イマーの作成と稔性回復系統の検定法の改良 Ｌ−０６プライマーを用いる検定法では非特異的に増幅
される断片が多数存在する。それゆえＬ−０６プライマ
ーの改良により不要な断片の増幅を抑えることを試み
た。特異的断片の塩基配列をもとにＬ−０６プライマー
配列を改良することを試みた。そこ結果、１１塩基から
なるＬ０６ＡＡ（５’−ＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧ（配列
番号３））およびＬ０６ＡＢ（５’−ＧＡＧＧＧＡＡＧ
ＡＧＣ（配列番号４））のプライマーの組合せでＰＣＲ
を行なった場合に、最も効率よく稔性回復系統に特異的
な断片が増幅された。このＰＣＲの場合、反応条件は９
４℃１分、４５℃ １分、７２℃ ２分のサイクルを４
５回繰り返した後、７２℃で１０分間保持した。このＰ
ＣＲによる検定では、稔性回復遺伝子系統に特異的な断
片の他にいくつかの非特異的な断片の増幅が見られた
が、目的とする１．１ｋｂの特異的断片が最も強く増幅
された。さらに、さまざまなインディカ種のイネ（稔性
回復遺伝子を有する）から調製したゲノムＤＮＡを用い
て同様のＰＣＲを行なったところ、この１．１ｋｂ断片
に対応するバンドが増幅されることが確認された。一
方、ジャポニカ品種（稔性回復遺伝子を有しない）ゲノ
ムＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった場合には全く断片の
増幅が見られなかった。さらに、このプライマーを用い
たＰＣＲを行なった場合には、前述のＬ−０６プライマ
ー（１０ｍｅｒ）を用いた方法と比較して、非特異的増
幅バンドの数がきわめて少ないため、稔性回復系統の判
断が非常に容易になった。

【００１５】さらに、稔性回復系統に特異的に増幅され
る１．１ｋｂ断片の塩基配列をもとに、２０ｍｅｒから
なるプライマー７種類を合成した。これらのプライマー
を様々に組み合わせてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの反応
組成は変えずに、反応サイクルを、９４℃１分、５５℃
２分、７２℃３分、合計３０サイクルに変更した。その
結果、１０組の組合せのうちＬ０６ＲＡおよびＬ０６Ｒ
Ｒの２種のプライマー（塩基配列：５’−ＴＴＧＡＣＧ
ＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＴＡＣ（配列番号５）および
５’−ＡＧＡＣＧＴＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＣＧＡ（配
列番号６））を組み合わせて反応を行なった場合に稔性
回復系統に特異的な０．６ｋｂバンドのみが増幅された
（図３）。さらに、さまざまなインディカ種のイネ（稔
性回復遺伝子を有する）から調製したゲノムＤＮＡを用
いて同様のＰＣＲを行なったところ、この０．６ｋｂ断
片に対応するバンドが増幅されることが確認された。一
方、ジャポニカ（稔性回復遺伝子を有しない）ゲノムＤ
ＮＡを用いてＰＣＲを行なった場合には全く断片の増幅
が見られなかった。さらに、このプライマーを用いたＰ
ＣＲを行なった場合には、前述のＬ−０６プライマー
（１０ｍｅｒ）を用いた方法と比較して、非特異的増幅
バンドが全く生じないため、判断が非常に容易になっ
た。

【００１６】このＰＣＲによって増幅された断片は前項
で述べたのと同様に単離を行ない、プラスミド ｐＵＣ
１９にクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号
９）。得られた塩基配列はｐＬ０６Ｒに含まれる１．１
ｋｂの断片の一部に対応していた。この断片は前述の
１．１ｋｂ断片の一部であり、この０．６ｋｂ断片を検
出することで稔性回復遺伝子を持つかどうかの検定が可
能である。さらにこのＬ０６ＲＡおよびＬ０６ＲＲの２
つのプライマーを組み合わせたＰＣＲによる検定を行な
った場合には、イネ品種に稔性回復遺伝子があるかどう
かの検定をきわめて簡便に行なうことができた。

【００１７】（４）非雄性不稔回復系統に特異的な断片
の単離と構造解析 第（１）項において記載したＴ６５−ＡにおいてＡＪ−
０８プライマーを用いて増幅される０．６ｋｂの特異的
断片をアガロースゲル電気泳動を行なって単離し、末端
をポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、
プラスミドｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニン
グした。得られたプラスミドｐＡＪ０８Ａについて制限
酵素切断地図を作成した。さらにダイデオキシ法によっ
て塩基配列を決定した。これによって得られた塩基配列
を配列番号２に示す。この配列を、ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ
ＮＡデータベースを用いて相同性を有する配列を検索し
たが、該当する配列は存在しなかった。このことはこれ
までに報告のない新規な塩基配列であることを示す。

【００１８】（５）非稔性回復系統特異的断片増幅用プ
ライマーの合成と非稔性回復系統検定法の改良 非稔性回復系統で特異的に増幅される断片の塩基配列を
もとに、稔性回復系統の検定で実施したのと同様にプラ
イマーの改良を試みた。ＡＪ−０８プライマーを用いる
検定法では非特異的に増幅される断片が多数存在する。
それゆえＡＪ−０８プライマーの改良により不要な断片
の増幅を抑えることを試みた。

【００１９】特異的断片の塩基配列をもとにＡＪ−０８
のプライマー配列を改良することを試みた。そこ結果、
１１塩基からなるＡＪ０８ＡＡ（５’−ＧＴＧＣＴＣＣ
ＣＴＣＣ（配列番号７））およびＡＪ０８ＡＢ（５’−
ＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴ（配列番号８））のプライマー
の組合せでＰＣＲを行なった場合に、最も効率よく非稔
性回復系統に特異的な断片が増幅された。このＰＣＲの
場合、反応条件は９４℃ １分、４５℃ １分、７２℃
２分のサイクルを４５回繰り返した後、７２℃で１０
分間保持した。このＰＣＲによる検定では、非稔性回復
遺伝子系統に特異的な断片の他にいくつかの非特異的な
断片の増幅が見られたが、目的とする０．６ｋｂの特異
的断片が最も強く増幅された（図４）。さらに、さまざ
まなジャポニカ種のイネ（稔性回復遺伝子を有しない）
から調製したゲノムＤＮＡを用いて同様のＰＣＲを行な
ったところ、この０．６ｋｂ断片に対応するバンドが増
幅されることが確認された。一方、インディカ品種（稔
性回復遺伝子を有する）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを
行なった場合には全く断片の増幅が見られなかった。さ
らに、このプライマーを用いたＰＣＲを行なった場合に
は、前述のＬ−０６プライマー（１０ｍｅｒ）を用いた
方法と比較して、非特異的増幅バンドの数がきわめて少
ないため、非稔性回復系統の判断が非常に容易になっ
た。

【００２０】このＰＣＲによって増幅された断片は前項
で述べたのと同様に単離を行ない、プラスミド ｐＵＣ
１９にクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号
１０）。得られた塩基配列はｐＡＪ０８Ａに含まれる
０．６ｋｂの断片に対応していた。すなわち、これらの
プライマーによって増幅された断片は前述の非稔性遺伝
子系統に特異的な０．６ｋｂ断片と同一のものであり、
この０．６ｋｂ断片を検出することで稔性回復遺伝子を
持たないどうかの検定が可能である。さらにこのＡＪ−
０８ＡＡおよびＡＪ−０８ＡＢの２つのプライマーを組
み合わせたＰＣＲによる検定を行なった場合には、イネ
品種に稔性回復遺伝子がないかどうかの検定をきわめて
簡便に行なうことができた。また、ハイブリッドライス
の母親として用いることができる雄性不稔系統（稔性回
復遺伝子を持たない）のイネよりゲノムＤＮＡを抽出
し、これらのプライマーを用いたＰＣＲを行なったとこ
ろ、すべての雄性不稔系統において、再現性よく特異的
にこの０．６ｋｂの断片が増幅されることを確認した。

【００２１】（６）稔性回復系統検定法の簡便化 多数のイネの品種の検定を行なう場合、イネゲノムＤＮ
Ａの抽出操作がかなり煩わしいものとなる。そこで、Ｄ
ＮＡの抽出法の簡便化を検討した。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら
の方法（Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：１３
４９， １９９１）を参考にした。まず、５ｍｍ四方ぐ
らいの大きさのイネの葉を、エッペンドルフチューブの
蓋に挟んで打ち抜き、これに４００μｌの２００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−２５０ｍＭ ＮａＣｌ−２５ｍＭ
ＥＤＴＡ−０．５％ ＳＤＳを加え、プラスチックの棒
を用いてイネの葉を押しつぶした。この結果、イネの葉
が潰れ、葉から汁がでてくる。これを１５，０００ ｒ
ｐｍで１分間遠心分離して上清にきた可溶性画分を単離
した。

【００２２】これをＰＣＲ用のサンプルとし、このうち
１μｌをＰＣＲに用いた。ＰＣＲ反応では微量の試料を
扱うため、まとめて量り取れるように検定法を改良し
た。反応溶液の組成は一般のＰＣＲとほぼ同じである
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０
ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ ｇ
ｅｌａｔｉｎ、１００μＭ ｄＮＴＰ （ｄＡＴＰ，ｄ
ＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ）、５
ｐＭ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ、２５ ｎｇ ｔｅｍｐ
ｌａｔｅ ＤＮＡ、１ ｕｎｉｔ Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）。反応溶液はこれら
のうちプライマー、テンプレートＤＮＡおよび酵素を除
くものを予めまとめて反応混合液として調製し、凍結保
存した。反応混合液２５００μｌが１００サンプル分に
相当する。反応条件は稔性回復系統特異的断片を検出す
る場合には、Ｌ０６ＲＡ（５’−ＴＴＧＡＣＧＣＣＴＴ
ＣＧＴＣＣＴＣＴＡＣ（配列番号５））およびＬ０６Ｒ
Ｒ（５’−ＡＧＡＣＧＴＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＣＧＡ
（配列番号６））の２つのプライマーを用い、９４℃１
分、５５℃ １分、７２℃ ２分のサイクルを３０回繰
り返した後、７２℃１０分で保持した。非稔性回復系統
特異的断片を検出する場合には、ＡＪ０８ＡＡ（５’−
ＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＣ（配列番号７））およびＡＪ０
８ＡＢ（５’−ＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴ（配列番号
８））の２つのプライマーを用い、９４℃ １分、４５
℃ １分、７２℃ ２分のサイクルを４５回繰り返した
後、７２℃で１０分保持した。得られた反応生成物のう
ちそれぞれ１５μｌを用いて１．５％のアガロースゲル
電気泳動により増幅された断片を検定した。

【００２３】その結果、これらのプライマーによって効
率よく、しかも稔性回復系統および非稔性回復系統に特
異的に断片の増幅が見られた。すなわち、改良した検定
法によって、再現性よく特異的に稔性回復系統あるいは
非稔性回復系統を調べることが可能であることが明らか
となった。

【００２４】

【実施例】以下に、本発明の方法により稔性回復系統と
非稔性回復系統の検定を行った実施例を示す。 実施例１ さまざまなジャポニカ種のイネ品種（稔性回復遺伝子を
有しない）、インディカ種のイネ品種（稔性回復遺伝子
を有する）、ハイブリッドライスの母親系統である雄性
不稔イネ系統（稔性回復遺伝子を有しない）、同父親系
統である稔性回復系統から調製したゲノムＤＮＡを用い
て、Ｌ−０６ＲＡとＬ−０６ＲＲの組合せで、あるいは
ＡＪ−０８ＡＡとＡＪ−０８ＡＢの組合せで、稔性回復
系統および非稔性回復系統の検定のＰＣＲを行なったと
ころ、稔性回復遺伝子が存在すること、あるいは存在し
ないことに、それぞれ一対一対応した（表１）［表
１］。

【００２５】

【表１】 表１．イネ品種（系統）におけるPCRによる稔性回復系統あるいは非稔性回 復 系統の検定と稔性回復遺伝子の存在との関連性の調査 ───────────────────────────── 品種（系統）名 Rf遺伝子 特異的断片増幅の有無 の有無 L-06-XY AJ-08-XY ───────────────────────────── T65-A なし − ＋ T65-R あり ＋ − IR24 あり ＋ − IR36 あり ＋ − IR8 あり ＋ − IR9761 あり ＋ − Chinsurah Boro II あり ＋ − 密陽23号 あり ＋ − 南京11号 あり ＋ − ササニシキ なし − ＋ コシヒカリ なし − ＋ キヌヒカリ なし − ＋ つがるおとめ なし − ＋ ミヤマニシキ なし − ＋ コガネモチ なし − ＋ ───────────────────────────── これらの結果から、イネ品種に稔性回復遺伝子の有無を
２種類のＰＣＲを組み合わせることによって、これらの
系統の検定をきわめて簡便に行なうことができることが
明らかとなった。

【００２６】実施例２ Ｆ２分析による特異的断片と稔性回復遺伝子との遺伝的
関連性の検定 前述のＰＣＲプライマーによって断片が特異的に増幅さ
れることと、稔性回復遺伝子の有無の間での遺伝的連鎖
をＦ２分析によって調べた。稔性回復遺伝子を有しない
ジャポニカ優性不稔品種（Ｔ６５−Ａ）を母本とし、こ
れに稔性回復遺伝子を有するインディカ品種（ＭＴＣ４
２Ｒ）の花粉を交配した。その結果得られた種子を栽培
し、２４８粒のＦ２種子を得た。これらのＦ２種子を播
種し、温室内で栽培した。Ｆ２植物からＤＮＡを抽出
し、稔性回復系統および非稔性回復系統の検定を行なっ
たところ、およそ３：１の割合で、稔性回復遺伝子を有
する系統と有しない系統に分離した。両者ともに増幅が
見られる系統あるいは両者ともに増幅のない系統は現わ
れず、２つの遺伝子領域は一致する、あるいは非常に近
接していることが示唆された。また、Ｆ２世代における
分離の割合から、これらの特異的断片の有無が優性に遺
伝することを明らかになった。これらの系統をのイネが
稔性を持っているかどうかを、種子稔性検定によって調
べた。その結果、稔性回復系統に特異的な増幅が見られ
た系統ではすべて種子稔性が見られた。このことは、こ
れらの系統に稔性回復遺伝子が遺伝していることを示
す。一方、非稔性回復系統に特異的な増幅が見られた系
統からは種子が得られなかった。すなわち、これらの系
統には稔性回復遺伝子が存在しないことを意味する。言
い換えれば、稔性回復遺伝子の存在の有無と、これらの
特異的な増幅が完全に連鎖していることになる。すなわ
ち、今回開発したＰＣＲによる稔性回復系統および非稔
性回復系統検定法によって、稔性回復遺伝子の有無を簡
便にかつ確実に検定することが可能であることが明らか
になった。

【００２７】

【発明の効果】本発明では、雄性不稔回復系統および非
雄性不稔回復系統にそれぞれ特異的な断片の塩基配列を
決定し、これらを特異的に増幅するＰＣＲプライマーを
作成し、これによる特異的断片の検出方法を開発し、発
明の完成に到ったものである。したがって、本発明のプ
ライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより雄性不稔回
復系統および非雄性不稔回復系統のそれぞれを非常に容
易に検定することが可能となった。さらに、この方法に
よる検定はハイブリッドライスの親系統の品質検査と品
質保証に使用することが可能である。

【００２８】

【配列表】

【００２９】配列番号 ：１ 配列の長さ：1137 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：オリザ サティバ（Oryza sativa） 組織の種類：緑葉 配列 GAGGGAAGAG GAGGAAGAAG AAGAGGAAGA AGCTGGTGAC GGTGAAGCTG AGCGACGAGC 60 TGATGGGATA CCTGCGGACC AAGGAGGTGA TGCCCTACCT CGCGCGCGAG ACGCCTCGCC 120 CGCTCCCGAT CGATCCCAGC ATCGCGCACA CATGTTCATT GGCCAAGAAC TCAGGCAGGA 180 AATCGCCGCC CAAGTTCACG AGAACAGAGA ATTTGACGCC TTCGTCCTCT ACCAGTACCG 240 CACCAAGGGC TACGCCGAGA TCCAGCAGGA GGTCACCGAC GACGACGACG ACGACGGCTA 300 GAATCTGTAT GGTATGTTTG GGCAGGGATC GATAATGGTT TGGGGTTGGT GGTATGGAGG 360 AGTAATGCTT ATCTAAATAT TTACTAGGGT GGCTCTGCTG CTCATTATTT AGGATATAAT 420 TACCATGGAC AATGGTGTTA TTATGGCCAT ATCTTTGCTA CTCTCTCCGT TCCATAATAT 480 AAGATACAAC TATTTTTTAG GGGGACCACC TATACATTTG CCGATAAATT TTCTTCTGAA 540 AATTTGACAG ATGTAATTAT AGTACAATCG TAGTGTAATT ACACTGTAAC TTATATATAA 600 CTAGTAATAT GCCCGTGCTA AACGCTACGG GGTAATTATG TTTGTCTTTA ATAACATTTA 660 AAATTTCATG TTAGCAATTT TTTTTCTGTT AGCATAAGGT CGTCAATATA AACTCAAATA 720 ACAGTATGAT ATGATATAGA TATCTTAATA ATAGTTTCAC CATGTTAAAC AAGATAACAA 780 TTGTCGATCA TCTTGTTACG TCTTCTTTCA AGATATACAT GGAACAACTA CTAAAATTTG 840 CCAATGGCAA CAGTAAATAT TTAGTGAGAC ACAAGTGTTA ATATATAGTC ATGTTATCAG 900 TCCAGTGCAA ATTGACGCAT CTAGAACACG ATGGTATGGA GAAGATAATC TCACAATATT 960 ACACCTGAGT AGTGATGACG TGCTGTACAA AAACAAGAGG AAGTTGGTGA GTAACATTCC 1020 GATTAACAAT TTACTACCTT CTAAAATATA TTTTCGAATT AATTTTGATC ATGCGAACCT 1080 ACCTTTGCTC ACCAGTCAAG AACGTCTTTA TACACGTATT TCTGGTGCTC TTCCCTC 1137

【００３０】配列番号 ：２ 配列の長さ：623 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：オリザ サティバ（Oryza sativa） 組織の種類：緑葉 配列： GTGCTCCCTC CAATGTAATG CTTATGTGCT AGTATATATA TTACTAGTTT TCTATTTAGT 60 CGGTGATGCA GTCGTGCATC ATGCAAACTC ATCTCCAACC ATCTATTATG TATTTCCTTT 120 TGTTCCACTT TTTATAAGAG CCATCAGTTT ATTTTGACTT TTGAGCTAGC TTCTCCAGAA 180 AAATCCAATA ATCTTTTTTC CCTGATCTAA ATATGGGGCC CCTGCATTTT TTCTGATATA 240 AACAACATCC TAGTTACTGA AACTGTCGGT GCGTAGTGGA TGTGCTTTCT TCATGTACAC 300 TTAGCTTAAT CAGGCCACTA ATTAATTGAC TGAACACCTT TGACTACTAT ACAACACAGT 360 CTCTCTCTCA CACACACACT GTACTTGCTT CATCCACAAA CAAGAGATAT ATTCTATAGG 420 TGTGCACAGT CGTATATAGA ATCATATAAA AATCATACGT GTAGAGATTT GTCTCTCGAG 480 GAATCATTTA AAATGACAGT AGCACAATGC AAATTAGTAG GTCTAAACAG TACAAGAATT 540 TTGGTTAATG CCAGCTGTTG GGAGATGTAT ATATAACCTA ATCAAATTTG GGCTAATCAT 600 TTACTTATTG TGAGAGGGAG CAC 623

【００３１】配列番号 ：３ 配列の長さ：11 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GAGGGAAGAGG

【００３２】配列番号 ：４ 配列の長さ：11 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GAGGGAAGAGC

【００３３】配列番号 ：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 TTGACGCCTTCGTCCTCTAC

【００３４】配列番号 ：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 AGACGTAACAAGATGATCGA

【００３５】配列番号 ：７ 配列の長さ：11 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GTGCTCCCTCC

【００３６】配列番号 ：８ 配列の長さ：11 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GTGCTCCCTCT

【００３７】配列番号 ：９ 配列の長さ：591 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：オリザ サティバ（Oryza sativa） 組織の種類：緑葉 配列 TTGACGCCTT CGTCCTCTAC CAGTACCGCA CCAAGGGCTA CGCCGAGATC CAGCAGGAGG 60 TCACCGACGA CGACGACGAC GACGGCTAGA ATCTGTATGG TATGTTTGGG CAGGGATCGA 120 TAATGGTTTG GGGTTGGTGG TATGGAGGAG TAATGCTTAT CTAAATATTT ACTAGGGTGG 180 CTCTGCTGCT CATTATTTAG GATATAATTA CCATGGACAA TGGTGTTATT ATGGCCATAT 240 CTTTGCTACT CTCTCCGTTC CATAATATAA GATACAACTA TTTTTTAGGG GGACCACCTA 300 TACATTTGCC GATAAATTTT CTTCTGAAAA TTTGACAGAT GTAATTATAG TACAATCGTA 360 GTGTAATTAC ACTGTAACTT ATATATAACT AGTAATATGC CCGTGCTAAA CGCTACGGGG 420 TAATTATGTT TGTCTTTAAT AACATTTAAA ATTTCATGTT AGCAATTTTT TTTCTGTTAG 480 CATAAGGTCG TCAATATAAA CTCAAATAAC AGTATGATAT GATATAGATA TCTTAATAAT 540 AGTTTCACCA TGTTAAACAA GATAACAATT GTCGATCATC TTGTTACGTC T 591

【００３８】配列番号 ：１０ 配列の長さ：623 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：オリザ サティバ（Oryza sativa） 組織の種類：緑葉 配列： GTGCTCCCTC CAATGTAATG CTTATGTGCT AGTATATATA TTACTAGTTT TCTATTTAGT 60 CGGTGATGCA GTCGTGCATC ATGCAAACTC ATCTCCAACC ATCTATTATG TATTTCCTTT 120 TGTTCCACTT TTTATAAGAG CCATCAGTTT ATTTTGACTT TTGAGCTAGC TTCTCCAGAA 180 AAATCCAATA ATCTTTTTTC CCTGATCTAA ATATGGGGCC CCTGCATTTT TTCTGATATA 240 AACAACATCC TAGTTACTGA AACTGTCGGT GCGTAGTGGA TGTGCTTTCT TCATGTACAC 300 TTAGCTTAAT CAGGCCACTA ATTAATTGAC TGAACACCTT TGACTACTAT ACAACACAGT 360 CTCTCTCTCA CACACACACT GTACTTGCTT CATCCACAAA CAAGAGATAT ATTCTATAGG 420 TGTGCACAGT CGTATATAGA ATCATATAAA AATCATACGT GTAGAGATTT GTCTCTCGAG 480 GAATCATTTA AAATGACAGT AGCACAATGC AAATTAGTAG GTCTAAACAG TACAAGAATT 540 TTGGTTAATG CCAGCTGTTG GGAGATGTAT ATATAACCTA ATCAAATTTG GGCTAATCAT 600 TTACTTATTG TGAGAGGGAG CAC 623

【図面の簡単な説明】

【図１】イネゲノムＤＮＡをＬ−０６プライマーを用い
てＰＣＲを行なった結果を表す電気泳動写真である。図
において、Ｒは稔性回復系統のイネから抽出したＤＮＡ
の結果を、Ａは非稔性回復系統のイネから抽出したＤＮ
Ａの結果を示す。

【図２】イネゲノムＤＮＡをＡＪ−０８プライマーを用
いてＰＣＲを行なった結果を表す電気泳動写真である。
図において、Ｒは稔性回復系統のイネから抽出したＤＮ
Ａの結果を、Ａは非稔性回復系統のイネから抽出したＤ
ＮＡの結果を示す。

【図３】イネゲノムＤＮＡをＬ０６ＲＡプライマーおよ
びＬ０６ＲＲプライマーを用いてＰＣＲを行なった結果
を表す電気泳動写真である。図において、Ｒは稔性回復
系統のイネから抽出したＤＮＡの結果を、Ａは非稔性回
復系統のイネから抽出したＤＮＡの結果を示す。

【図４】イネゲノムＤＮＡをＡＪ０８ＡＡプライマーお
よびＡＪ０８ＡＢプライマーを用いてＰＣＲを行なった
結果を表す電気泳動写真である。図において、Ｒは稔性
回復系統のイネから抽出したＤＮＡの結果を、Ａは非稔
性回復系統のイネから抽出したＤＮＡの結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 越野 葉子 東京都練馬区東大泉７−14−６ (72)発明者 中村 淳 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イネ細胞質雄性不稔回復遺伝子または非
   細胞質雄性不稔回復遺伝子に係わる塩基配列の有無を特
   異的に検出することにより、イネ細胞質雄性不稔形質の
   有無を遺伝子診断する方法。
2. 【請求項２】 配列番号３と４の塩基配列のプライマー
   を用いてＰＣＲによりイネゲノムＤＮＡの遺伝子断片の
   増幅を行い、イネ細胞質雄性不稔回復遺伝子に係わる約
   １．１Ｋｂの塩基配列の増幅がなされたか否かにより、
   イネ細胞性雄性不稔形質を遺伝子診断する方法。
3. 【請求項３】 イネ細胞質雄性不稔回復遺伝子に係わる
   約１．１Ｋｂの塩基配列が配列番号１の塩基配列である
   請求項２の方法。
4. 【請求項４】 配列番号５と６の塩基配列のプライマー
   を用いてＰＣＲによりイネゲノムＤＮＡの遺伝子断片の
   増幅を行い、イネ細胞質雄性不稔遺伝子に係わる約０．
   ６Ｋｂの塩基配列の増幅がなされたか否かにより、イネ
   細胞質雄性不稔形質を遺伝子診断する方法。
5. 【請求項５】 イネ細胞質雄性不稔回復遺伝子に係わる
   約０．６Ｋｂの塩基配列が配列番号９の塩基配列である
   請求項５の方法。
6. 【請求項６】 配列番号７と８の塩基配列のプライマー
   を用いてＰＣＲによりイネゲノムＤＮＡの遺伝子断片の
   増幅を行い、イネ非細胞質雄性不稔回復遺伝子に係わる
   約０．６Ｋｂの塩基配列の増幅がなされたか否かによ
   り、イネ非細胞質雄性不稔形質を遺伝子診断する方法。
7. 【請求項７】 イネ非細胞性雄性不稔回復遺伝子に係わ
   る約０．６Ｋｂの塩基配列が配列番号２の塩基配列であ
   る請求項６の方法。
8. 【請求項８】 配列番号１に示す、イネの細胞質雄性不
   稔回復系統における細胞質雄性不稔回復遺伝子に係わる
   細胞質雄性不稔回復系統特異的塩基配列。
9. 【請求項９】 配列番号９に示す、イネの細胞質雄性不
   稔回復系統における細胞質雄性不稔回復遺伝子に係わる
   細胞質雄性不稔回復系統特異的塩基配列。
10. 【請求項１０】 配列番号２に示す、イネの非細胞質雄
    性不稔回復系統における非細胞質雄性不稔回復遺伝子に
    係わる非細胞質雄性不稔回復系統特異的塩基配列。
11. 【請求項１１】 イネゲノムＤＮＡがイネの葉より得ら
    れる汁を遠心分離して上清にきた可溶画分に含まれるも
    のである請求項２〜７の何れか１項の方法。