WO2014027502A1 - イネrt型細胞質雄性不稔性原因遺伝子およびその利用 - Google Patents

イネrt型細胞質雄性不稔性原因遺伝子およびその利用 Download PDF

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WO2014027502A1
WO2014027502A1 PCT/JP2013/066528 JP2013066528W WO2014027502A1 WO 2014027502 A1 WO2014027502 A1 WO 2014027502A1 JP 2013066528 W JP2013066528 W JP 2013066528W WO 2014027502 A1 WO2014027502 A1 WO 2014027502A1
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rice
seq
cytoplasmic male
male sterility
gene
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PCT/JP2013/066528
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欽哉 鳥山
智彦 風間
恵二 本村
圭介 五十嵐
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国立大学法人東北大学
国立大学法人琉球大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
    • A01H1/023—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/13—Plant traits
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a rice RT-type cytoplasmic male sterility causative gene and a method for discriminating an RT-type cytoplasmic male sterility rice line using the gene.
  • the first-generation hybrid breeding method is also called a hybrid variety breeding method, and it is used in various plants because it can grow varieties that have excellent traits of parents and show hybrid strength.
  • a three-line method using cytoplasmic male sterility (CMS) is used to breed hybrid rice (a hybrid variety).
  • CMS cytoplasmic male sterility
  • Cytoplasmic male sterility is a phenomenon in which pollen formation is inhibited by the action of an abnormal mitochondrial gene. Genes that cause male sterility are present in the male sterile cytoplasmic mitochondria, while the nuclear-encoded fertility-recovery gene is thought to avoid the inhibition by modifying the chimeric gene product .
  • the three-line method consists of a “sterile line” that is a line carrying male sterile cytoplasm, a “fertility restoration line” that is a line carrying fertility recovery gene (Rf), and a nuclear gene that is A breeding method that uses a “maintenance line” that is the same line and does not have a sterile cytoplasm.
  • hybrid seeds can be obtained by (i) crossing the pollen of the recovery line to the sterile line, and (ii) crossing the pollen of the maintenance line to the sterile line. Can maintain and proliferate cocoon lines.
  • Non-patent Document 1 WA-type cytoplasmic male sterility
  • orf126 has been reported as a candidate gene for causing cytoplasmic male sterility in WA-type cytoplasmic male sterility rice (Non-patent Document 2).
  • it has not been experimentally proven whether it is directly involved in cytoplasmic male sterility.
  • RT98 type cytoplasmic male sterility line is made by Motomura et al. Of the University of the Ryukyus, using the wild rice Oryza rufipogon K98 line (National Institute of Genetics, line number W1109) as a single parent and Taichung No. 65 as 8 times. In a line grown by continuous backcrossing, pollen is apparently normal but has no fertilization function.
  • a fertility recovery line RT98C that has the same cytoplasm as RT98A but recovers fertility because it has a fertility recovery gene derived from K98 has been bred (Non-patent Document 3).
  • the RT102 type cytoplasmic male sterile line (RT102A) is similarly used as the parent of the Oryza rufipogon K102 line (National Institute of Genetics line number W1125) and Taichung No. 65 is subjected to 8 consecutive backcrossings. The pollen was found to be a mixture of starch and non-accumulated pollen, but none of them had fertilizing ability.
  • Non-Patent Document 4 a fertility recovery line RT102C that has the same cytoplasm as RT102A but recovers fertility because it has a fertility recovery gene derived from K102 has been bred.
  • Non-Patent Document 4 no mitochondrial gene responsible for RT98 cytoplasmic male sterility and RT102 cytoplasmic male sterility has been reported. In order to use for breeding hybrid varieties, it is desired to identify and clone these mitochondrial genes that cause RT cytoplasmic male sterility.
  • an object of the present invention is to identify a rice RT cytoplasmic male sterility gene responsible for the use of rice RT cytoplasmic male sterility by the three-line method, and to use this as a DNA marker for RT male sterility.
  • An object of the present invention is to provide a means for discriminating a rice sterile line having a cytoplasm.
  • the present inventors determined the entire nucleotide sequence of the mitochondrial genome extracted from the RT-type cytoplasmic male sterile rice line, and obtained the normal cytoplasm of “Nipponbare”, which has already been reported.
  • RT-type cytoplasmic male sterile rice line In comparison with the mitochondrial genome, an open reading frame (ORF) unique to the RT-type cytoplasmic male sterile rice line was identified. Among them, a chimera structure with a previously reported mitochondrial gene and / or a translation product were identified. RT-type cytoplasmic male sterility candidate genes were selected using the presence of a transmembrane region as an index. Furthermore, using primers designed based on the nucleotide sequence of this candidate gene, amplification was performed by PCR using genomic DNA extracted from normal sterile rice lines and male male sterile rice lines (RT type, WA type) as a template.
  • RT type normal sterile rice lines
  • WA type male male sterile rice lines
  • the present invention includes the following inventions.
  • a rice RT-type cytoplasmic male sterility causative gene comprising a DNA shown in any of the following (a) to (c): (A) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 (B) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 and that is involved in rice RT cytoplasmic male sterility (C) DNA consisting of a base sequence having 80% or more homology to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and involved in rice RT-type cytoplasmic male sterility [2] A rice RT-type cytoplasmic male sterility causative gene encoding a protein shown in any of (d) to (f) below: (D) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 (e) an amino acid sequence comprising one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in S
  • [4] The presence of the gene described in [1] or [2] is detected by detecting the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a DNA region containing a partial sequence of the base sequence.
  • [5] The method according to [3] or [4], wherein the detection is performed by a PCR method or a hybridization method.
  • [6] A rice line having an RT-type male sterile cytoplasm discriminated by the method according to any one of [3] to [5] is used as a pollinating line, and pollen fertility is restored with respect to the cytoplasmic male sterile.
  • a method for producing rice hybrid seed comprising mating a rice line carrying or introducing a fertility recovery gene as a pollinating line.
  • RT-type cytoplasmic male sterility comprising an oligonucleotide having a length of at least 15 bases for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial sequence of the base sequence
  • a primer set for amplification of genes responsible for sex [8]
  • the primer set according to [7] which is a primer set of the following (A) or (B).
  • A RT98 type cytoplasmic male sterility gene causing primer set (B) sequence comprising an oligonucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 RT102 type cytoplasmic male sterile gene amplification primer set [9] consisting of an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in No. 7 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 8 A probe comprising an oligonucleotide having a length of at least 15 bases for detecting the gene according to [1], which hybridizes to the base sequence of No.
  • a kit for discriminating rice lines having an RT-type male sterile cytoplasm comprising the primer set according to [7] or [8] and / or the probe according to [9].
  • mitochondrial genes responsible for rice RT RT98 and RT102
  • cytoplasmic male sterility were identified.
  • the present invention is useful for the establishment of a male sterile line that is the basis for breeding rice hybrid varieties by the three-line method utilizing RT-type cytoplasmic male sterile and production of highly pure male sterile line seeds.
  • FIG. 1 (A) shows the structure of RT98 cytoplasmic male sterility causative gene (orf113_RT98), and the positions of the probe and the PCR primer.
  • FIG. 1B shows a transmembrane region of a protein predicted from ORF113_RT98 by TMHMM analysis.
  • FIG. 2 (A) shows the chimeric structure of RT102 type cytoplasmic male sterility gene (orf352_RT102), and the position of the probe and PCR primer.
  • FIG. 2B shows a transmembrane region of a protein predicted from ORF352_RT102 by TMHMM analysis.
  • FIG. 3 shows the results of Northern blot analysis of the expression of orf selected as a candidate gene for RT98 cytoplasmic male sterility in RT98 cytoplasmic male sterility line (RT98A) and RT98 cytoplasmic male sterility recovery line (RT98C).
  • A RT98A (without fertility recovery gene), C: RT98C (with fertility recovery gene), T: Taichung No. 65).
  • FIG. 4 shows an agarose gel electrophoresis photograph of a PCR amplification product with RT98 type cytoplasmic male sterility detection primer set for genomic DNA of each rice line (RT98A: RT98 type cytoplasmic male sterility line, T65: Taichung No.
  • FIG. 5 shows RT102 type cytoplasmic male sterility lines (RT102A) and RT102 type of genes with known function (atp1, atp6, cox3, orfB) in the Nipponbare mitochondrial genome sequence and previously reported orf (orf165, orf284, orf288).
  • RT102C Northern blot analysis of expression in a cytoplasmic male sterility recovery line
  • FIG. 6 shows the results of Northern blot analysis of expression in RT102 type cytoplasmic male sterility line (RT102A) and RT102 type cytoplasmic male sterility recovery line (RT102C) of the probe set in the specific region of orf352_RT102.
  • FIG. 7 shows agarose gel electrophoresis photographs of PCR amplification products using a primer set for detecting RT102 cytoplasmic male sterility against the genomic DNA of each rice line (Nippobare: Nipponbare, T65: Taichung65, BTA: BT type cytoplasmic male sterility).
  • RT98C male sterile recovery line with RT98 male sterile cytoplasm
  • RT102C male sterile recovery line with RT102 male sterile cytoplasm
  • WAA WA type cytoplasmic male sterile line
  • Rice RT-type cytoplasmic male sterility causative gene identified in the present invention is a gene involved in rice RT98-type cytoplasmic male sterility and rice RT-type cytoplasmic male sterility. Includes genes involved in sex.
  • the gene of the present invention is modified in the transcription of the open reading frame (orf) unique to male sterile cytoplasmic mitochondria, and the transcriptional or translational pattern is not the same as that of the fertility restoration gene. It is a gene containing an open reading region (orf) specified by changing compared to the presence.
  • RT98 CMS gene A gene involved in rice RT98 cytoplasmic male sterility (hereinafter also referred to as “RT98 CMS gene”) has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 unique to the cytoplasm of rice showing RT98 cytoplasmic male sterility.
  • SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 unique to the cytoplasm of rice showing RT98 cytoplasmic male sterility.
  • the 202st to 543rd nucleotide sequences the portion encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are included as an open reading frame (orf113), and from ⁇ 151 to +11
  • the nucleotide sequence completely matched with nad9 and had a chimera structure with nad9 (FIG. 1).
  • RT102 CMS gene a gene involved in rice RT102 cytoplasmic male sterility
  • SEQ ID NO: 3 unique to the rice cytoplasm showing rice RT102 cytoplasmic male sterility.
  • 301st to 1359th nucleotide sequences the part encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 as an open reading frame (orf352) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, And has a chimera structure (FIG. 2).
  • RT98 type CMS gene or the RT102 type CMS gene of the present invention has a function involved in rice RT type cytoplasmic male sterility
  • one or several amino acids are deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4. It may be a gene encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence.
  • the number of amino acids that may be deleted, substituted, or added refers to the number that can be deleted, substituted, or added by a known mutant protein production method such as site-directed mutagenesis. Is one to several.
  • 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 may be deleted, and 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, preferably 1 to 5 amino acids may be added, or 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 may be substituted with other amino acids.
  • the “mutation” here means a mutation artificially introduced mainly by a known mutant protein production method, but may be a similar naturally occurring mutation.
  • the gene of the present invention encodes a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 and involved in rice RT cytoplasmic male sterility.
  • the 80% or higher homology is preferably 85% or higher, more preferably 90% or higher, and most preferably 95% or higher.
  • Sequence identity can be determined by FASTA search or BLAST search.
  • the RT98 type CMS gene or RT102 type CMS gene according to the present invention hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and the rice RT It may be a gene containing DNA encoding a protein involved in type cytoplasmic male sterility.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • a nucleic acid having high homology that is, a nucleotide sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3
  • Examples include conditions in which complementary strands of DNA hybridize and complementary strands of nucleic acids having lower homology do not hybridize.
  • the sodium salt concentration is 15 to 750 mM, preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM
  • the temperature is 25 to 70 ° C., preferably 50 to 70 ° C., more preferably 55 to 65 ° C.
  • formamide The condition is that the concentration is 0 to 50%, preferably 20 to 50%, more preferably 35 to 45%.
  • the washing conditions for the filter after hybridization are usually sodium salt concentration of 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, and temperature of 50 to 70 ° C., preferably The temperature is 55 to 70 ° C, more preferably 60 to 65 ° C.
  • the RT98 CMS gene homologous gene of the present invention has the base sequence shown in SEQ ID NO: 46, and among the base sequences shown in SEQ ID NO: 46, the 101st to 544th base sequences (SEQ ID NO: 48 base sequence; a portion encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47) as an open reading frame (orf147).
  • SEQ ID NO: 48 base sequence; a portion encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47
  • a person skilled in the art will refer to Molecular Cloning (see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive, 198). Such homologous genes can be easily obtained.
  • the homology of the above sequences can be determined by FASTA search or BLAST search.
  • RT98 type CMS gene or RT102 type CMS gene of the present invention is RT98A or RT98C strain having RT98 type cytoplasmic male sterile mitochondria, or RT102 type using primers designed based on the information of the respective base sequences. It can be obtained as a nucleic acid fragment by performing PCR amplification using a nucleic acid derived from a genomic DNA library or the like prepared from any cell or tissue of the RT102A or RT102C strain carrying cytoplasmic male sterile mitochondria as a template.
  • RT98 type CMS gene or RT102 type CMS gene is obtained by performing hybridization using nucleic acid derived from the above library or the like as a template and using a DNA fragment which is a part of the RT98 type CMS gene or RT102 type CMS gene as a probe, It can be obtained as a nucleic acid fragment.
  • the RT98 type CMS gene or the RT102 type CMS gene may be synthesized as a nucleic acid fragment by various nucleic acid sequence synthesis methods known in the art such as chemical synthesis methods. 2.
  • RT-type cytoplasmic male-sterile rice line is discriminated from the RT98 type CMS gene (SEQ ID NO: 1) or RT102 type CMS gene (SEQ ID NO: 3) in the test rice.
  • the above gene is carried out by detecting a DNA region containing the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial sequence of the base sequence, which is the respective base sequence.
  • RT98 type CMS gene and RT102 type CMS gene (hereinafter collectively referred to as “RT type CMS gene”) can be detected by either PCR method or hybridization method.
  • the extracted genomic DNA is preferably used as a template, and PCR is preferably performed using a primer that can amplify the DNA region.
  • Rice lines having RT-type male sterile cytoplasm can be discriminated by separating the amplified genomic DNA amplified by the PCR method by electrophoresis and then visually detecting the amplified genomic DNA.
  • the genomic DNA of the test rice used in the discrimination method of the present invention is, for example, the latest agricultural experiment basics, edited by the Department of Agriculture, Tohoku University, 1990 Tokyo Soft Co., Ltd. Protocols, Isao Shimamoto, supervised by Takuji Sasaki, 1995 Tokyo / Shujun Co., Ltd., etc.
  • any part of the rice to be examined eg, seeds, leaves, stems, etc.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • mitochondrial genomic DNA can be prepared by the following method. First, protoplasts derived from cultured cells of test rice are subjected to cell membrane disruption in a buffer solution, and the mitochondrial fraction is collected by centrifuging the disrupted product and treated with DNase to remove mixed genomic DNA. Next, the purified mitochondrial fraction is treated with proteinase to digest the mitochondrial membrane, and then extracted with phenol and chloroform.
  • the primer used is not particularly limited as long as it is an oligonucleotide that amplifies the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial sequence of the base sequence .
  • Primer design methods are well known in the art, and primers that can be used in the present invention satisfy conditions that allow specific annealing, such as length and base composition (melting temperature) at which specific annealing is possible.
  • the length having a function as a primer is preferably at least 15 bases, more preferably 20 to 30 bases.
  • Tm means a temperature at which 50% of an arbitrary nucleic acid strand forms a hybrid with its complementary strand.
  • the annealing temperature must be Need to optimize. On the other hand, if this temperature is lowered too much, a non-specific reaction occurs, so it is desirable that the temperature be as high as possible.
  • known primer design software can be used.
  • an example of a primer for amplifying a gene causing RT98 cytoplasmic male sterility is not limited, but is present 176 bases upstream from the translation initiation codon of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Examples include a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 existing 77 bases downstream from the translation stop codon of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Examples of primers for amplifying a gene responsible for RT102 cytoplasmic male sterility include, but are not limited to, SEQ ID NO: 228 bases upstream of the translation start codon of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 present 241 bases downstream from the translation stop codon of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • each oligonucleotide of the primer has substantially the same function as the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 5 to 8
  • one to several nucleotides in the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 8 may be an oligonucleotide having a base sequence deleted, added or substituted.
  • Each oligonucleotide of the above primer is synthesized by a method known in the art as an oligonucleotide synthesis method, for example, a phosphotriethyl method, a phosphodiester method, etc., using a commercially available DNA automatic synthesizer that is usually used. Is possible. Further, the oligonucleotide may be an oligonucleotide to which a labeling substance is attached in order to facilitate detection of a PCR amplification product using these as primers.
  • DNA amplification by the PCR method is not particularly limited except that the above primers are used, and may be performed according to a conventional method. Specifically, a cycle including denaturation of template DNA, annealing of the primer to the template, and primer extension reaction using a thermostable enzyme (Taq polymerase) is repeated 20 to 40 times, preferably 25 to 30 times.
  • a DNA region containing the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or a partial sequence of the base sequence a DNA region containing the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or a partial sequence of the base sequence.
  • the composition of the PCR reaction solution and the PCR reaction conditions are determined by those skilled in the art based on preliminary experiments and the like so that a PCR amplification product can be obtained with high sensitivity in PCR using the designed primer set. If there is, it can be selected and set appropriately. Methods for selecting appropriate PCR reaction conditions based on the Tm of the primer are well known in the art, eg, first a denaturation reaction at 96 ° C. for 2 minutes, then 96 ° C. for 30 seconds, 64 ° C.
  • the composition, reaction temperature, and time of the PCR reaction solution can be appropriately set according to the length of the oligonucleotide sequence that serves as a primer, the base composition, and the like.
  • Such a series of PCR operations can be performed using a commercially available PCR kit or PCR apparatus according to the operating instructions.
  • a thermal cycler TP600 manufactured by Takara
  • GeneAmp PCR System 9700 manufactured by Applied Biosystems
  • the like can be used as the PCR apparatus.
  • the PCR amplification product is detected using a method such as conventional electrophoresis such as agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis.
  • a method such as conventional electrophoresis such as agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis.
  • staining is performed with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplification product is detected as a single band.
  • the amplification product can be detected by performing PCR using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like.
  • the probe used is a poly (oligo) nucleotide consisting of a partial sequence of the base sequence of the RT-type CMS gene, or the base sequence of the RT-type CMS gene.
  • a poly (oligo) nucleotide fragment consisting of a continuous partial sequence of a complementary sequence to is used.
  • the length of the probe is not particularly limited, but a specific hybrid can be formed between the target genes as long as it is, for example, 15 bases or more, preferably 20 bases or more.
  • the nucleotide fragment can be synthesized in vitro, for example, by cleaving a polynucleotide having each nucleotide sequence with an appropriate restriction enzyme, or by a well-known chemical synthesis technique. Further, since it is well known to those skilled in the art that an oligonucleotide that can be used as a primer for specifically amplifying the RT-type CMS gene can also be used as a probe for specifically detecting the gene, An oligonucleotide that can be used as a probe may be designed based on this knowledge. When the nucleotide fragment is used as a probe, it is labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance is not particularly limited, and for example, a fluorescent substance, a radioisotope, an enzyme, avidin, or biotin can be used.
  • fluorescent substances include fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRIC), cyanine dyes (for example, Cy3 and Cy5 of Cy Dye TM series), acetylaminofluorene (AFF), and the like.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • TAC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • cyanine dyes for example, Cy3 and Cy5 of Cy Dye TM series
  • AFF acetylaminofluorene
  • examples include peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase and the like, and examples of the radioisotope include 125 I and 3 H.
  • the poly (oligo) nucleotide fragment used as the probe is hybridized with the RT-type CMS gene under stringent conditions.
  • the stringent condition is a condition that enables selective and detectable specific binding between the gene and the poly (oligo) nucleotide fragment.
  • Stringent conditions are defined by salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. Stringency is increased by decreasing the salt concentration, increasing the organic solvent concentration, or increasing the hybridization temperature.
  • stringent salt concentrations are typically about 750 mM or less of NaCl and about 75 mM or less of trisodium citrate, more preferably about 500 mM or less of NaCl and about 50 mM or less of trisodium citrate, most preferably about 250 mM or less of NaCl and citric acid. Trisodium is about 25 mM or less.
  • the stringent organic solvent concentration is about 35% or more, preferably about 50% or more of formamide.
  • the stringent temperature condition is about 30 ° C. or higher, preferably about 37 ° C. or higher, more preferably about 42 ° C. or higher.
  • the probe may be used by being immobilized on an immobilization carrier such as a microarray.
  • the microarray formation method is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art may be used. For example, a method of directly synthesizing a probe on the surface of a solid support (on-chip method), or a probe prepared in advance There are methods for binding to the surface of a solid support.
  • a protective matrix that is selectively removed by light irradiation is used, and a predetermined micromatrix is formed by combining photolithography technology and solid phase synthesis technology used for semiconductor manufacturing.
  • a method for selective synthesis of oligonucleotides in a region is common.
  • a polycation compound, an amino group, an aldehyde group, an epoxy group, etc. can be used with a spotter device.
  • a method of spotting on the surface of a solid phase carrier surface-treated with a silane coupling agent or the like, and synthesizing a probe nucleic acid into which a reactive group has been introduced and preliminarily forming a reactive group on the surface of the solid phase carrier surface For example, a method of spotting the probe nucleic acid and covalently binding and fixing the probe nucleic acid to the surface of the solid phase carrier can be used.
  • Reagents and instruments for detecting the RT-type CMS gene used in the method of the present invention can be combined in advance to form a kit.
  • the kit may contain at least the primer set and / or poly (oligo) nucleotide used as a probe.
  • the kit contains, as necessary, reagents for extracting genomic DNA, PCR reagents such as PCR buffers and DNA polymerase, detection reagents such as staining agents and gels for electrophoresis, hybridization buffers, A washing buffer, a microplate, a nylon membrane, a labeling substance, a positive or negative standard sample, and the like may be included. Instructions describing how to use the kit can also be included.
  • the reagent in the kit may be a solution or a lyophilized product.
  • Mitochondria were purified from RT98C seed callus carrying RT98 cytoplasmic male sterile mitochondria, and mitochondrial genomic DNA was extracted. The entire base sequence of mitochondrial genomic DNA was determined by a next-generation sequencer (GS-FLX system, 8 kb paired end analysis method), and a 525,913 bp master circle was revealed. The orf was searched using the genome viewer Artemis that displays the result of translating the determined base sequence in six reading frames. In order to search for a candidate gene responsible for RT98 cytoplasmic male sterility, a new orf not found in Nipponbare (accession no. DQ167400) was investigated.
  • the orf whose transcriptional modification differs depending on the presence or absence of the fertility restoration gene is identified.
  • Expression in the fertility recovery line RT98C carrying the fertility recovery gene was compared by Northern blot analysis. Probes used for Northern blot analysis of each orf were prepared using the primers shown in Table 2 below. Northern blot analysis showed that orf113 showed a band pattern difference in expression in cytoplasmic male sterile line RT98A and fertile recovery line RT98C, and that the transcript was modified in the presence of the fertile recovery gene. In contrast, other orf showed no difference in expression in RT98A and RT98C (FIG. 3).
  • orf113 is directly involved in cytoplasmic male sterility, that is, the gene responsible for RT98 cytoplasmic male sterility. orf113 has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and was not present in the previously reported rice mitochondrial genome.
  • Detection of orf113 in genomic DNA of each rice line PCR was carried out using the following specific primers designed from the upstream and downstream base sequences of the orf113 base sequence and using the genomic DNA of multiple rice lines as a template. As a result, orf113 was amplified only by RT98 cytoplasmic male sterility (FIG. 4).
  • Mitochondria were purified from callus derived from RT102C seeds carrying RT102 type cytoplasmic male sterility mitochondria, and mitochondrial genomic DNA was extracted. The entire base sequence of mitochondrial genomic DNA was determined by a next-generation sequencer (GS-FLX system, 8 kb paired end analysis method), and a master circle of 502,250 bp was revealed. An orf search was performed using the genome viewer Artemis, which displays the results of translation of the determined base sequence in six reading frames. In order to search for a candidate gene responsible for cytoplasmic male sterility, a new orf not found in Nipponbare (accession no. DQ167400) was investigated.
  • orf352 is directly involved in cytoplasmic male sterility, that is, the gene responsible for RT102 type cytoplasmic male sterility. orf352 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Orf352 was amplified only in the RT102 cytoplasmic male sterile line (FIG. 7).
  • the present invention can be used in the field of breeding hybrid varieties by the three-line method using rice RT-type cytoplasmic male sterility. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

　本発明は、三系法でイネRT型細胞質雄性不稔性を利用するために、イネRT型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子を同定し、これをDNAマーカーとしてRT型雄性不稔細胞質を保有するイネ不稔系統を判別する手段を提供することを課題とする。　本発明は、配列番号１または３に示す塩基配列からなるDNAを含むイネRT型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子、ならびに被検イネにおける該遺伝子の存在を検出することによってRT型雄性不稔細胞質を保有するイネ不稔系統を判別方法を提供する。

Description

イネＲＴ型細胞質雄性不稔性原因遺伝子およびその利用
　本発明は、イネＲＴ型細胞質雄性不稔性原因遺伝子および当該遺伝子を用いてＲＴ型細胞質雄性不稔イネ系統を判別する方法に関する。
　一代雑種育種法はハイブリッド品種育種法とも呼ばれ、両親の優れた形質を合わせ持ち、かつ、雑種強勢を示す品種が育成できるため、種々の植物において利用されている。イネにおいてはハイブリッドライス（一代雑種品種）を育種するために、細胞質雄性不稔性（ＣＭＳ：Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｍａｌｅ　Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）を利用した三系法が利用されている。細胞質雄性不稔は、異常なミトコンドリア遺伝子の働きにより、花粉形成が阻害される現象である。雄性不稔細胞質のミトコンドリアには雄性不稔の原因となる遺伝子が存在し、一方、核コードの稔性回復遺伝子はキメラ遺伝子産物の修飾を行なって上記阻害を回避していると考えられている。三系法は、雄性不稔細胞質を保有する系統である「不稔系統」、稔性回復遺伝子（Ｒｆ）を保有する系統である「稔性回復系統」、および、核遺伝子は不稔系統と同一であって不稔細胞質を保有しない系統である「維持系統」を利用する育種方法をいう。これらの３系統を用いて、（ｉ）不稔系統に回復系統の花粉を交配させることによりハイブリッド種子を獲得することができ、（ｉｉ）不稔系統に維持系統の花粉を交配することにより不稔系統を維持・増殖することができる。
　三系法で細胞質雄性不稔性を利用するにあたっては、雄性不稔細胞質を確実に保有するイネ不稔系統かどうかの検定が必要である。従来、植物体中での雄性不稔細胞質の遺伝子型を判定するためには、まず、自家受粉および正逆の検定交雑を行い、種子形成率が０％である個体の出現頻度を調査する必要があった。しかしながら、この方法は年単位の膨大な時間と多大な労力を要し、また、種子稔性は温度や日照時間などの環境条件により影響を受けやすく正確な検定ができない。よって、迅速かつ簡便に効率よくイネ雄性不稔細胞質を検定する方法が望まれていた。
　従来より三系法を用いたイネのハイブリッド品種に育成にはインド型イネＣｈｉｎｓｕｒａｈ　Ｂｏｒｏ　ＩＩ品種のＢＴ型細胞質雄性不稔性や海南島野生イネ品種のＷＡ型細胞質雄性不稔性が用いられきたが、主流はＷＡ型細胞質雄性不稔性である（非特許文献１）。世界のイネ全栽培面積からみれば、１割が単一のＷＡ型雄性不稔細胞質に依存していることになる。これまでＷＡ型細胞質雄性不稔性イネにおいて細胞質雄性不稔性の原因連伝子の候補としてｏｒｆ１２６が報告されている（非特許文献２）。しかし、細胞質雄性不稔性に直接関与するかは実験的に証明されていない。よって、ＷＡ型細胞質雄性不稔性は、細胞質の原因遺伝子、稔性回復系統のもつ稔性回復遺伝子の正体も明らかにされておらず、分子基盤が解明されないまま使われている。
　また、上記以外にも細胞質雄性不稔性を提供するイネ系統について幾つか報告がある。たとえば、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔系統（ＲＴ９８Ａ）は琉球大学の本村らにより、野生イネＯｒｙｚａ　ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ　Ｋ９８系統（国立遺伝学研究所　系統番号Ｗ１１０９）を１回母本にし、台中６５号を８回の連続戻し交配を行って育成された系統で、花粉は見かけ上正常であるが、受精機能を持たない。また、その育成過程において、ＲＴ９８Ａと同じ細胞質をもつが、Ｋ９８に由来する稔性回復遺伝子をもつために稔性が回復する稔性回復系統ＲＴ９８Ｃが育成されている（非特許文献３）。また、ＲＴ１０２型細胞質雄性不稔系統（ＲＴ１０２Ａ）は、同様にＯｒｙｚａ　ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのＫ１０２系統（国立遺伝学研究所　系統番号Ｗ１１２５）を１回母本にし、台中６５号を８回の連続戻し交配を行って育成された系統で、花粉はデンプンの蓄積するものと蓄積しないものが混在して見られたが、いずれも受精能力がない。また、その育成過程において、ＲＴ１０２Ａと同じ細胞質をもつが、Ｋ１０２に由来する稔性回復遺伝子をもつために稔性が回復する稔性回復系統ＲＴ１０２Ｃが育成されている（非特許文献４）。しかしながら、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性およびＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性の原因となるミトコンドリア遺伝子は報告されていない。ハイブリッド品種育成に利用するために、これらのＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因となるミトコンドリア遺伝子を同定し、クローニングすることが望まれている。
Ｌｉ　Ｓ，Ｙａｎｇ　Ｄ，Ｚｈｕ　Ｙ（２００７）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｍａｌｅ　ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｈｙｂｒｉｄ　ｒｉｃｅ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４９：７９１−８０４ Ｂｅｎｔｏｌｉｌａ　Ｓ，Ｓｔｅｆａｎｏｖ　Ｓ．（２０１２）Ａ　ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｍａｌｅ−ｆｅｒｔｉｌｅ　ａｎｄ　ｍａｌｅ−ｓｔｅｒｉｌｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５８：９９６−１０１７． 本村恵二・石嶺行男・村山盛一・比嘉照夫・呉屋　昭・友寄哲夫（２００１）イネ台中６５号の核置換系統ＲＴ９８Ｃにおける雄性不稔および稔性回復の遺伝．熱帯農業　４５：２０２−２０８ Ｍｏｔｏｍｕｒａ　Ｋ，Ｍｏｒｏｍｉｚａｔｏ　Ｚ，Ａｄａｎｉｙａ　Ｓ（２００３）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｍａｌｅ　ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｌｉｎｅ，ＲＴ１０２Ｃ，ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｏｒｙｚａ　ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ．Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　４７：７０−７６
　従って、本発明の課題は、三系法でイネＲＴ型細胞質雄性不稔性を利用するために、イネＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子を同定し、これをＤＮＡマーカーとしてＲＴ型雄性不稔細胞質を保有するイネ不稔系統を判別する手段を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、ＲＴ型細胞質雄性不稔イネ系統から抽出したミトコンドリアゲノムの全塩基配列を決定し、それを既に報告されている正常型細胞質である「日本晴」のミトコンドリアゲノムと比較調査して該ＲＴ型細胞質雄性不稔イネ系統に固有のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するともに、その中から、既報のミトコンドリア遺伝子とキメラ構造をなすこと及び／又は翻訳産物が膜貫通領域を持つことを指標としてＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子の候補遺伝子を選抜した。さらに、この候補遺伝子の塩基配列をもとに設計したプライマーを用いて、正常可稔イネ系統および細胞雄性不稔イネ系統（ＲＴ型、ＷＡ型）より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅した結果、ＲＴ型細胞質雄性不稔イネ系統のミトコンドリアＤＮＡでのみ増幅断片が検出されることを確認し、ＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子を同定することに成功した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
　即ち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］　以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかに示すＤＮＡを含むイネＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子。
　（ａ）配列番号１または３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１または３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するＤＮＡ
　（ｃ）配列番号１または３に示す塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するＤＮＡ
［２］　以下の（ｄ）~（ｆ）のいずれかに示すタンパク質をコードするイネＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子。
　（ｄ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｅ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するタンパク質
　（ｆ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するタンパク質
［３］　被検イネにおける［１］または［２］に記載の遺伝子の存在を検出することを特徴とする、ＲＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統の判別方法。
［４］　［１］または［２］に記載の遺伝子の存在の検出が、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列を含むＤＮＡ領域を検出することにより行われる、［３］に記載の方法。
［５］　検出が、ＰＣＲ法またはハイブリダイゼーション法により行われる、［３］または［４］に記載の方法。
［６］　［３］~［５］のいずれかに記載の方法により判別されたＲＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統を受粉系統とし、該細胞質雄性不稔に対して花粉稔性を回復する稔性回復遺伝子を保有または導入したイネ系統を授粉系統として交配することを特徴とするイネハイブリッド種子の生産方法。
［７］　配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列を増幅するための、少なくとも１５塩基以上の長さのオリゴヌクレオチドから構成される、ＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子増幅用プライマーセット。
［８］　以下の（Ａ）または（Ｂ）のプライマーセットである、［７］に記載のプライマーセット。
（Ａ）配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子増幅用プライマーセット
（Ｂ）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、ＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子増幅用プライマーセット
［９］　配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列にハイブリダイズし、［１］に記載の遺伝子を検出するための少なくとも１５塩基以上の長さのオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
［１０］　［７］または［８］に記載のプライマーセット、および／または、［９］に記載のプローブを含む、ＲＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統の判別用キット。
　本発明によれば、イネＲＴ型（ＲＴ９８型およびＲＴ１０２型）細胞質雄性不稔性の原因となるミトコンドリア遺伝子が同定された。このイネＲＴ型細胞質雄性不稔性原因遺伝子をＤＮＡマーカーとすることによりＲＴ型雄性不稔細胞質を保有するイネ系統を迅速かつ効率的に判別できる。よって、本発明は、ＲＴ型細胞質雄性不稔性を利用する三系法によるイネハイブリッド品種育成の基盤となる雄性不稔系統の確立と高純度の雄性不稔系統種子の生産に有用である。
　本願は、２０１２年８月１７日に出願された日本国特許出願２０１２−１８０８２４の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１（Ａ）は、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子（ｏｒｆ１１３＿ＲＴ９８）の構造、ならびにプローブとＰＣＲプライマーの位置を示す。図１（Ｂ）は、ＴＭＨＭＭ解析によるＯＲＦ１１３＿ＲＴ９８から予測されるタンパク質の膜貫通領域を示す。
　図２（Ａ）は、ＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子（ｏｒｆ３５２＿ＲＴ１０２）のキメラ構造、ならびにプローブとＰＣＲプライマーの位置を示す。図２（Ｂ）は、ＴＭＨＭＭ解析によるＯＲＦ３５２＿ＲＴ１０２から予測されるタンパク質の膜貫通領域を示す。
　図３は、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子の候補として選抜したｏｒｆのＲＴ９８型細胞質雄性不稔系統（ＲＴ９８Ａ）およびＲＴ９８型細胞質雄性不稔回復系統（ＲＴ９８Ｃ）における発現のノーザンブロット解析結果を示す（Ａ：ＲＴ９８Ａ（稔性回復遺伝子なし）、Ｃ：ＲＴ９８Ｃ（稔性回復遺伝子あり）、Ｔ：台中６５号）。
　図４は、各イネ系統のゲノムＤＮＡに対するＲＴ９８型細胞質雄性不稔検出用プライマーセットによるＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真を示す（ＲＴ９８Ａ：ＲＴ９８型細胞質雄性不稔系統、Ｔ６５：台中６５号、ＢＴＡ：ＢＴ型細胞質雄性不稔系統、ＣＷＡ：ＣＷ型細胞質雄性不稔系統、ＬＤＡ：Ｌｅａｄ　Ｒｉｃｅ細胞質雄性不稔系統、ＷＡＡ：ＷＡ型細胞質雄性不稔系統）。
　図５は、日本晴ミトコンドリアゲノム配列における機能既知の遺伝子（ａｔｐ１、ａｔｐ６、ｃｏｘ３、ｏｒｆＢ）および既報の機能未知のｏｒｆ（ｏｒｆ１６５、ｏｒｆ２８４、ｏｒｆ２８８）のＲＴ１０２型細胞質雄性不稔系統（ＲＴ１０２Ａ）およびＲＴ１０２型細胞質雄性不稔回復系統（ＲＴ１０２Ｃ）における発現のノーザンブロット解析結果を示す（１：ＲＴ１０２Ｃ、２：ＲＴ１０２Ａ）。
　図６は、ｏｒｆ３５２＿ＲＴ１０２の特異的領域に設定したプローブのＲＴ１０２型細胞質雄性不稔系統（ＲＴ１０２Ａ）およびＲＴ１０２型細胞質雄性不稔回復系統（ＲＴ１０２Ｃ）における発現のノーザンブロット解析結果を示す。
　図７は、各イネ系統のゲノムＤＮＡに対するＲＴ１０２型細胞質雄性不稔検出用プライマーセットによるＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真を示す（Ｎｉｐｐｏｂａｒｅ：日本晴、Ｔ６５：Ｔａｉｃｈｕｎｇ６５、ＢＴＡ：ＢＴ型細胞質雄性不稔系統、ＲＴ９８Ｃ：ＲＴ９８型雄性不稔細胞質を有する雄性不稔回復系統、ＲＴ１０２Ｃ：ＲＴ１０２型雄性不稔細胞質を有する雄性不稔回復系統、ＷＡＡ：ＷＡ型細胞質雄性不稔系統）。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．イネＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子
　本発明において同定されたイネＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子は、イネＲＴ９８型細胞質雄性不稔性に関与する遺伝子およびイネＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性に関与する遺伝子を包含する。本発明の上記遺伝子は、稔性回復遺伝子の存在下で、雄性不稔細胞質ミトコンドリアに固有のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）の転写産物が修飾を受け、転写または翻訳パターンが、稔性回復遺伝子の非存在下と比べて変化することにより特定されたオープンリーディング領域（ｏｒｆ）を含む遺伝子である。
　イネＲＴ９８型細胞質雄性不稔性に関与する遺伝子（以下、「ＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子」ともいう）は、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性を示すイネの細胞質に固有な配列番号１に示す塩基配列を有し、配列番号１に示す塩基配列のうち、第２０２番目から第５４３番目の塩基配列（配列番号２のアミノ酸配列をコードする部分）をオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ１１３）として含み、−１５１から＋１１までの塩基配列がｎａｄ９と完全に一致し、ｎａｄ９とキメラ構造になっていた（図１）。また、イネＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性に関与する遺伝子（以下、「ＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子」ともいう）は、イネＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性を示すイネの細胞質に固有な配列番号３に示す塩基配列を有し、配列番号３に示す塩基配列のうち、第３０１番目から第１３５９番目の塩基配列（配列番号４のアミノ酸配列をコードする部分）をオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ３５２）として含み、既報のｏｒｆとはキメラ構造になっている（図２）。
　本発明のＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子またはＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子は、イネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与する機能を有する限り、配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　ここで、欠失、置換若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により欠失、置換、若しくは付加できる程度の数をいい、好ましくは、１個から数個である。例えば、配列番号２または４に示すアミノ酸配列の１~１０個、好ましくは１~５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２または４に示すアミノ酸配列に１~１０個、好ましくは１~５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２または４に示すアミノ酸配列の１~１０個、好ましくは１~５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、ここにいう「変異」は、主には公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
　また、本発明の上記遺伝子には、配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。上記８０％以上の相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性をいう。配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
　本発明に係るＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子またはＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子は、配列番号１または３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子であってもよい。
　ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１または３に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５~７５０ｍＭ、好ましくは５０~７５０ｍＭ、より好ましくは３００~７５０ｍＭ、温度が２５~７０℃、好ましくは５０~７０℃、より好ましくは５５~６５℃、ホルムアミド濃度が０~５０％、好ましくは２０~５０％、より好ましくは３５~４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５~６００ｍＭ、好ましくは５０~６００ｍＭ、より好ましくは３００~６００ｍＭ、温度が５０~７０℃、好ましくは５５~７０℃、より好ましくは６０~６５℃である。例えば、本発明の上記ＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子の相同遺伝子としては、配列番号４６に示す塩基配列を有し、配列番号４６に示す塩基配列のうち、第１０１番目から第５４４番目の塩基配列（配列番号４８の塩基配列；配列番号４７に記載のアミノ酸配列をコードする部分）をオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ１４７）とする遺伝子が挙げられる。
　当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１０　Ｓｋｙｌｉｎｅ　Ｄｒｉｖｅ　Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９））等を参照することにより、こうしたホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、上記の配列の相同性は、同様に、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
　本発明のＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子またはＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子は、それぞれの塩基配列の情報に基づいて設計したプライマーを用いて、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性のミトコンドリアを保有するＲＴ９８ＡまたはＲＴ９８Ｃ系統、またはＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性のミトコンドリアを保有するＲＴ１０２ＡまたはＲＴ１０２Ｃ系統の任意の細胞若しくは組織から調製したゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。またＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子またはＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子は、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、当該ＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子またはＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいはＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子またはＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
２．ＲＴ型細胞質雄性不稔イネ系統の判別方法
　本発明のＲＴ型細胞質雄性不稔イネ系統の判別は、被検イネにおける前記ＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子（配列番号１）またはＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子（配列番号３）の存在を検出することにより行なう。上記遺伝子は、具体的には、それぞれの塩基配列である配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列を含むＤＮＡ領域を検出することにより行われる。
　ＲＴ９８型ＣＭＳ遺伝子およびＲＴ１０２型ＣＭＳ遺伝子（以下、これらを総称して「ＲＴ型ＣＭＳ遺伝子」ともいう）の検出は、ＰＣＲ法またはハイブリダイゼーション法のいずれによっても行なうことができるが、被検イネより抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記ＤＮＡ領域を増幅できるプライマーを用いたＰＣＲ法により行なうことが好ましい。ＰＣＲ法により増幅された増幅ゲノムＤＮＡを電気泳動にて分離後、増幅ゲノムＤＮＡの視覚的な検出を行うことにより、ＲＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統を判別することができる。
　本発明の判別方法で用いられる被検イネのゲノムＤＮＡは、たとえば、最新農学実験の基礎、東北大学農学部農学科編、１９９０　東京・（株）ソフトサイエンス社発行および植物細胞工学別冊　植物のＰＣＲ実験プロトコール、島本功、佐々木卓治監修、１９９５　東京・（株）秀潤社発行等に記載される通常の植物のゲノムＤＮＡ抽出方法によって調製することができる。具体的には、被検イネの任意の一部（例えば、種子、葉、茎等）を材料とし、必要に応じて液体窒素中で磨砕し、該磨砕物に臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液を添加してインキュベート後、クロロホルム−イソアミルアルコールを加えてよく混和し、遠心分離により水層を分離・回収し、これにイソプロピルアルコールを加えて混和する。次に、遠心分離により沈殿を回収後、たとえばＥＤＴＡ等含有の緩衝液を加えて溶解し、ＲＮａｓｅ処理する。処理後、フェノール、フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール、クロロホルム−イソアミルアルコールの順序で溶媒を置換する。置換処理後、エタノールを加えてよく混和し、遠心分離によりゲノムＤＮＡを得る。また、イネのゲノムＤＮＡとしてミトコンドリアゲノムＤＮＡを利用する場合には、たとえば、次の方法でミトコンドリアＤＮＡを調製することができる。まず、被検イネの培養細胞由来のプロトプラストを緩衝液中で細胞膜破壊を行ない、該破壊物を遠心分離によりミトコンドリア画分を回収し、これにＤＮａｓｅを処理することにより混在ゲノムＤＮＡを除去する。次に、精製ミトコンドリア画分をプロテイナーゼ処理してミトコンドリア膜を消化した後、フェノールとクロロホルムで抽出を行い、得られたミトコンドリアＤＮＡとＲＮＡの混和物にＲＮａｓｅを処理し、処理後、再びフェノールとクロロホルムで抽出を行うことによりミトコンドリアＤＮＡを得る。
　ＲＴ型ＣＭＳ遺伝子の検出をＰＣＲ法で行う場合、用いるプライマーは、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列を増幅するようなオリゴヌクレオチドであれば特に限定されない。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。例えば、プライマーとしての機能を有する長さとしては、少なくとも１５塩基以上が好ましく、より好ましくは２０~３０塩基である。また設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。
　具体的には、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子を増幅する場合のプライマーの例としては、限定するものでないが、配列番号１に示す塩基配列の翻訳開始コドンより１７６塩基上流に存在する配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー、および配列番号１に示す塩基配列の翻訳停止コドンより７７塩基下流に存在する配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　また、ＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子を増幅する場合のプライマーの例としてとしては、限定するものでないが、配列番号３に示す塩基配列の翻訳開始コドンより２２８塩基上流に存在する配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー、および配列番号３に示す塩基配列の翻訳停止コドンより２４１塩基下流に存在する配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　上記プライマーの各オリゴヌクレオチドは、配列番号５~８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと実質的に同一の機能を有する限り、配列番号５~８に示す塩基配列において１~数個（例えば、５個、好ましくは３個、より好ましくは１個）の塩基が欠失、付加、置換した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。
　上記プライマーの各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられる市販のＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することが可能である。
　また、上記オリゴヌクレオチドは、これらをプライマーとするＰＣＲ増幅産物の検出を容易にするために、標識物質をつけたオリゴヌクレオチドであってもよい。標識物質としては、当該技術分野においてよく知られる蛍光物質（ＦＩＴＣ、ＲＯＣ等）、放射性同位体、化学発光物質（例えば、ＤＮＰ）、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）等を用いることができる。
　ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅は上記のプライマーを用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行えばよい。具体的には、鋳型ＤＮＡの変性、プライマーへの鋳型へのアニーリング、および耐熱性酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを２０から４０回、好ましくは２５~３０回繰り返すことにより、目的とする遺伝子の特定の領域（配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列を含むＤＮＡ領域）を増幅させる。ＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲ反応条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、設計されたプライマーセットを用いたＰＣＲにおいて高感度でＰＣＲ増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択および設定することができる。プライマーのＴｍに基づいて適当なＰＣＲ反応条件を選択する方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、最初に９６℃で２分間の変性反応、次に９６℃で３０秒間、６４℃で１分間、７２℃で１．５分間を１サイクルとして３０サイクル、最後に７２℃で７分間の伸長反応により実施することができる。ＰＣＲ反応液の組成、反応温度や時間は、プライマーとなるオリゴヌクレオチド配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。このようなＰＣＲの一連の操作は、市販のＰＣＲキットやＰＣＲ装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。ＰＣＲ装置は、例えば、サーマルサイクラーＴＰ６００（Ｔａｋａｒａ社製）、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などが使用できる。
　ＰＣＲ増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動などの慣用の電気泳動等の方法を用いて行う。例えば、アガロースゲル電気泳動では、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を単一のバンドとして検出する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて当該ＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。
　また、ＲＴ型ＣＭＳ遺伝子の検出をハイブリダイゼーション法で行う場合、用いるプローブとしては、ＲＴ型ＣＭＳ遺伝子の塩基配列の連続する部分配列からなるポリ（オリゴ）ヌクレオチド、あるいは、ＲＴ型ＣＭＳ遺伝子の塩基配列に対する相補配列の連続する部分配列からなるポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片が用いられる。プローブの長さは特に限定されないが、例えば１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上であれば目的とする遺伝子の間で特異的なハイブリッドを形成できる。上記ヌクレオチド断片は、例えば、各塩基配列を有するポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するか、あるいは、周知の化学合成技術により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。また、前記のＲＴ型ＣＭＳ遺伝子を特異的に増幅させるプライマーとして利用可能なオリゴヌクレオチドは、当該遺伝子を特異的に検出するためのプローブとしても使用可能であることは当業者にとって周知であるため、この知見を元にブローブとして利用可能なオリゴヌクレオチドを設計すればよい。
　上記ヌクレオチド断片をプローブとして使用する場合、標識物質により標識化する。標識物質は、特に限定はされないが、例えば、蛍光物質、放射性同位体、酵素、アビジン若しくはビオチンなどを用いることができる。蛍光物質としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＣ）、シアニン色素（例えば、Ｃｙ　ＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、アセチルアミノフルオレン（ＡＦＦ）などが挙げられ、酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられ、放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈなどが挙げられる。
　上記のプローブとして用いるポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片は、前記ＲＴ型ＣＭＳ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることを特徴とする。ここで、ストリンジェントな条件とは、前記遺伝子とポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片との選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件によって定義される。ストリンジェンシーは、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによって増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、ＮａＣｌ約７５０ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約７５ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約５０ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下及びクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、好ましくは約３７℃以上、より好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。
　また、プローブはマイクロアレイなどの固定化担体に固定化して用いてもよい。マイクロアレイの形成方法は特に限定されず、当業者が利用可能ないかなる方法を用いてもよく、例えば、固相担体表面で直接プローブを合成する方法（オン・チップ法）、又は予め調製したプローブを固相担体表面に結合する方法などがある。固相担体表面で直接プローブを合成する場合には、光照射で選択的に除去される保護基を用い、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術を組み合わせて所定の微少なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行う方法が一般的である。一方、予めプローブを調製して固相担体表面に結合する方法では、プローブ核酸の種類や固相担体の種類に応じて、スポッタ装置によりポリ陽イオン化合物やアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤などで表面処理した固相担体の表面に点着する方法、反応活性基を導入したプローブ核酸を合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該プローブ核酸を点着して該プローブ核酸を固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法などが利用できる。
　本発明の方法に用いる上記ＲＴ型ＣＭＳ遺伝子を検出するための試薬や器具を予め組み合わせてキット化することもできる。例えば、キットには、前記のプライマーセット、および／またはプローブとして用いるポリ（オリゴ）ヌクレオチドを少なくとも含んでいればよい。また、該キットには、必要に応じて、ゲノムＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液やＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、ハイブリダイゼーション用緩衝液、洗浄バッファー、マイクロプレート、ナイロンメンブレン、標識物質、陽性や陰性の標準試料などを含んでもよい。キットの使用方法を記載した指示書等を含めることもできる。なお、キット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でもよい。
　以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子の同定
　ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性のミトコンドリアを保有するＲＴ９８Ｃの種子由来カルスからミトコンドリアを精製し、ミトコンドリアゲノムＤＮＡを抽出した。ミトコンドリアゲノムＤＮＡの全塩基配列を次世代型シークエンサー（ＧＳ−ＦＬＸシステム、８ｋｂペアエンド解析法）により決定し、５２５，９１３ｂｐのマスターサークルを明らかにした。
　決定した塩基配列を６通りの読み枠で翻訳した結果を表示するゲノムビューアＡｒｔｅｍｉｓを用いてｏｒｆの検索を行った。ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子の候補を探索するため、日本晴（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＤＱ１６７４００）に見られない新規ｏｒｆを調査した。まず、アミノ酸を７０個以上コードするｏｒｆについて調査したところ、ＲＴ９８型に特異的なｏｒｆを２７個見出した（表１）。次に、既知の遺伝子とキメラ構造をなすこと、または、膜貫通領域を持つこと（ＴＭＨＭＭ解析）について調査し、いずれかの条件を満たすｏｒｆ３４０（配列番号９）、ｏｒｆ２７６（配列番号１０）、ｏｒｆ２１０（配列番号１１）、ｏｒｆ１７４（配列番号１２）、ｏｒｆ１１３（配列番号１３）、ｏｒｆ８３ａ（配列番号１４）をＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子の候補として選抜した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
選抜したｏｒｆ３４０、ｏｒｆ２７６、ｏｒｆ２１０、ｏｒｆ１７４、ｏｒｆ１１３、ｏｒｆ８３ａについて、稔性回復遺伝子の有無によって、転写産物の修飾が異なるｏｒｆを同定するため、稔性回復遺伝子を保持しない細胞質雄性不稔系統ＲＴ９８Ａにおける発現と稔性回復遺伝子を保持する稔性回復系統ＲＴ９８Ｃにおける発現をノーザンブロット解析により比較した。
　各ｏｒｆのノーザンブロット解析に用いるプローブは下記表２に示すプライマーを用いて作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　ノーザンブロット解析では、ｏｒｆ１１３は細胞質雄性不稔系統ＲＴ９８Ａと稔性回復系統ＲＴ９８Ｃにおける発現にバンドパターンに差が見られ、稔性回復遺伝子の存在下で転写産物が修飾されることを示したのに対し、他のｏｒｆはＲＴ９８ＡとＲＴ９８Ｃにおける発現に差が見られなかった（図３）。これらの結果より、ｏｒｆ１１３は直接細胞質雄性不稔性に関与していること、すなわち、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子であることが明らかとなった。ｏｒｆ１１３は、配列番号１に示す塩基配列を有し、既報のイネミトコンドリアゲノムには存在しなかった。
各イネ系統のゲノムＤＮＡにおけるｏｒｆ１１３の検出
　ｏｒｆ１１３の塩基配列の上流側および下流側の塩基配列より設計した下記の特異的プライマーを用い、複数のイネ系統のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。その結果、ｏｒｆ１１３はＲＴ９８型細胞質雄性不稔性のみで増幅が見られた（図４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
ＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子の同定
　ＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性のミトコンドリアを保有するＲＴ１０２Ｃの種子由来カルスからミトコンドリアを精製し、ミトコンドリアゲノムＤＮＡを抽出した。ミトコンドリアゲノムＤＮＡの全塩基配列を次世代型シークエンサー（ＧＳ−ＦＬＸシステム、８ｋｂペアエンド解析法）により決定し、５０２，２５０ｂｐのマスターサークルを明らかにした。
　決定した塩基配列を６通りの読み枠で翻訳した結果を表示するゲノムビューアＡｒｔｅｍｉｓを用いて、ｏｒｆの検索を行った。細胞質雄性不稔性の原因遺伝子の候補を探索するため、日本晴（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＤＱ１６７４００）に見られない新規ｏｒｆを調査した。まず、アミノ酸を７０個以上コードするｏｒｆについて調査したところ、ＲＴ１０２型に特異的なｏｒｆを２７個見出した（表３）。次に、既知の遺伝子とキメラ構造をなすこと、または、膜貫通領域を持つこと（ＴＭＨＭＭ解析）について調査し、いずれかの条件を満たすｏｒｆ３５２（配列番号２７）、ｏｒｆ１３３（配列番号２８）、ｏｒｆ１１７（配列番号２９）、ｏｒｆ１１０（配列番号３０）、ｏｒｆ９８（配列番号３１）を細胞質雄性不稔性の原因遺伝子の候補として選抜した。なお、ｏｒｆ１１４は上記条件を満たすが、インディカ品種９３−１１のミトコンドリアゲノム（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＤＱ１６７３９９）と１００％一致したため候補から除外した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　既報の日本晴ミトコンドリアゲノム配列における機能既知の遺伝子（ａｔｐ１、ａｔｐ６、ｃｏｘ３、ｏｒｆＢ）および既報の機能未知のｏｒｆ（ｏｒｆ１６５、ｏｒｆ２８４、ｏｒｆ２８８）について、稔性回復遺伝子の有無によって、転写産物の修飾が異なるｏｒｆを同定するため、稔性回復遺伝子を保持しない細胞質雄性不稔系統ＲＴ１０２Ａにおける発現と稔性回復遺伝子を保持する稔性回復系統ＲＴ１０２Ｃにおける発現をノーザンブロット解析により比較した。
　各遺伝子のノーザンブロット解析に用いるプローブは下記表４に示すプライマーを用いて作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　その結果、ｏｒｆ２８８をプローブとしたときのみ、転写産物の大きさに差が見られた（図５）。ｏｒｆ２８８そのものの遺伝子はＲＴ１０２のゲノム上に存在せず、前記候補遺伝子のうち、ｏｒｆ３５２は既知の配列ｏｒｆ２８８の一部を含むキメラ構造になっていたため（図２）、ｏｒｆ３５２についてＲＴ１０２ＡとＲＴ１０２Ｃにおける発現をノーザンブロット解析により比較した。
　ｏｒｆ３５２のノーザンブロット解析に用いる特異的なプローブを図２に示す領域に設計し、プローブは配列番号４４と配列番号４５に示すプライマーを用いて作製した。
　その結果、ｏｒｆ３５２のバンドパターンに差が見られた（図６）。これらの結果より、ｏｒｆ３５２は直接細胞質雄性不稔性に関与していること、すなわち、ＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子であることが明らかとなった。ｏｒｆ３５２は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。
各イネ系統のゲノムＤＮＡにおけるｏｒｆ３５２の検出
　ｏｒｆ３５２の塩基配列の上流側および下流側の塩基配列より設計した下記の特異的プライマーを用い、複数のイネ系統のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行ったところ、ｏｒｆ３５２はＲＴ１０２型細胞質雄性不稔系統のみで増幅が見られた（図７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　本発明は、イネＲＴ型細胞質雄性不稔性を用いた三系法によるハイブリッド品種の育成分野において利用できる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 　以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかに示すＤＮＡを含むイネＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子。
    　（ａ）配列番号１または３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
    　（ｂ）配列番号１または３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するＤＮＡ
    　（ｃ）配列番号１または３に示す塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するＤＮＡ
  2. 　以下の（ｄ）~（ｆ）のいずれかに示すタンパク質をコードするイネＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子。
    　（ｄ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    　（ｅ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するタンパク質
    　（ｆ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイネＲＴ型細胞質雄性不稔性に関与するタンパク質
  3. 　被検イネにおける請求項１または２に記載の遺伝子の存在を検出することを特徴とする、ＲＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統の判別方法。
  4. 　請求項１または２に記載の遺伝子の存在の検出が、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列を含むＤＮＡ領域を検出することにより行われる、請求項３に記載の方法。
  5. 　検出が、ＰＣＲ法またはハイブリダイゼーション法により行われる、請求項３または４に記載の方法。
  6. 　請求項３~５のいずれかに記載の方法により判別されたＲＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統を受粉系統とし、該細胞質雄性不稔に対して花粉稔性を回復する稔性回復遺伝子を保有または導入したイネ系統を授粉系統として交配することを特徴とするイネハイブリッド種子の生産方法。
  7. 　配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列を増幅するための、少なくとも１５塩基以上の長さのオリゴヌクレオチドから構成される、ＲＴ型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子増幅用プライマーセット。
  8. 　以下の（Ａ）または（Ｂ）のプライマーセットである、請求項７に記載のプライマーセット。
    （Ａ）配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、ＲＴ９８型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子増幅用プライマーセット
    （Ｂ）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとから構成される、ＲＴ１０２型細胞質雄性不稔性の原因遺伝子増幅用プライマーセット
  9. 　配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の部分配列にハイブリダイズし、請求項１に記載の遺伝子を検出するための少なくとも１５塩基以上の長さのオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
  10. 　請求項７または８に記載のプライマーセット、および／または、請求項９に記載のプローブを含む、ＲＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統の判別用キット。
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