JP2002512523A

JP2002512523A - ＢＲＡＳＳＩＣＡＮＡＰＵＳにおけるＯＧＵＲＡＲｆ遺伝子の遺伝子型決定のための分子マーカーの使用

Info

Publication number: JP2002512523A
Application number: JP50117099A
Authority: JP
Inventors: ケイ．タルシーラム，ロマス; エム．リデル，クリスティーン
Original assignee: パイオニアハイ−ブレッドインターナショナル，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-06-10
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 2002-04-23
Also published as: AU8004898A; WO1998056948A1; CA2206673A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Brassica植物、およびBrassica植物を育種する方法に関する。より詳細には、本発明は、それらの生育段階の初期段階でのBrassica植物においてOgura Rf遺伝子の遺伝子型を決定するための分子マーカーの使用に関する。この方法は、ホモ接合性、ヘテロ接合性、と非回復または不稔性遺伝子型との間の区別を可能にするための、PCR反応におけるRAPDマーカーに由来するプライマーの組合せを使用することを含む。このような区別を可能にするプライマーの組み合わせもまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 BRASSICA NAPUSにおけるOGURA Rf遺伝子の遺伝子型決定のための分子マーカーの使用発明の分野本発明は、BrassicaおよびBrassica育種に関する。より詳細には、本発明は、 Ogura回復(Rf)遺伝子を有するBrassica系統、および遺伝子マーカー分析を使用するこれらの系統を同定するための方法に関する。発明の背景 Brassica植物、および特に、このような植物に由来する脂肪種子は、ますます重要な作物である。植物油の供給源として、これらは、今や、商業的重要性において、大豆およびヤシのわずかに後ろに順位付けされており、そしてこれらは、ヒマワリに匹敵している。油は、サラダ油および調理油の両方として使用される。この分野における顕著な改良が、単一の交雑ハイブリッド(cross hybrid)を使用してBrassicaにおいて実証されている（Hutchesonら、1981、SernykおよびSte fansson、1983；GrantおよびBeversdorf、1985）。商業的なハイブリッド産物については、確実であり、そして効率的な受粉制御システムが必要とされる。Bras sicaにおいては、多数の受粉制御システムが利用可能である：核性雄性不稔、自家不和合性、および細胞質性雄性不稔（CMS）。Brassicaにおいて、例えば、Ogu ra CMSおよびPolima CMSを含む、種々の型のCMSが存在する。植物におけるCMSは、正常な朽および機能的な花粉産生の不全によって特徴付けられる。これは、雌性遺伝形質である。CMSについての遺伝的な決定因子は、核ゲノムではなくミトコンドリアゲノム中に存在する。1.4Kbの転写物を生じる2 .5KbのNCO1フラグメントは、Ogura CMSに関係している（Bonhommeら、1991）。この転写物は、２つのオープンリーディングフレーム（ORF 158およびORF 138）を含む。続く研究は、Ogura CMS植物における花粉の発育停止において、ORF 158 の役割を排除し、従ってORF 138の重要な役割を再確認したようである。 F₁ハイブリッド種子産生について有用であるためには、CMSシステムは、強力な稔性の回復および不稔性維持対立遺伝子を必要とする。市販のハイブリッド産物についての使用に関して、Brassicaにおける他のCMSシステムからOguraシステムを区別することは、実行可能な回復またはRf遺伝子の利用可能性である（本出願において「OGU Rf」）。 Ogura CMSおよび良好な稔性回復遺伝子の供給源の両方が、ラディッシュRapha nus sativusで同定された（Ogura、1968；Heyn、1976）。Ogura CMSは、ラディッシュからB．napusに属間交雑、胚レスキュー、および戻し交配によって移入された（Bannerotら、1974）。B．napusとのプロトプラスト融合が、雄性不稔B．n apusサイブリッドを産生するために必要とされた（Pelletierら、1983）。回復遺伝子はまた、ラディッシュからB．napusに属間交雑によって移入され（Heyn、 1976）、そして単一の回復遺伝子を有する完全に回復されたOgura CMS植物が同定された（Pelletierら、1987）。残念なことに、回復された植物における減少した雌性稔性は、このような移入を達成し、そして回復遺伝子を保有し、そしてラディッシュから移入された（introgressed）ラディッシュの染色体セグメントもまた、Ogura回復遺伝子以外の遺伝情報を有するラディッシュDNAを含むことがまた仮定される（Pellan-DelourmeおよびRenard、1988）。しかし、回復対立遺伝子座の周辺のラディッシュの遺伝情報の保持が、最近、種子の産生を改良するために減少されている（Delourmeら、1991）にもかかわらず、DelourmeおよびEb er、1992による連鎖研究によってアイソザイム遺伝子座(マーカー)PGI II(回復遺伝子に連鎖され、そしてまた、おそらくラディッシュ染色体セグメント上に位置する)が同定された。生物化学的アッセイは、PGI IIの発現を決定するために必要とされる。PGI IIは、タンパク質として発現され、そしてゲル上でタンパク質を泳動することによって分析される。ゲル上のパターンを分析することによって、個々のサンプルのPGI II遺伝子型を決定することが可能である。遺伝子マーカー分析は、回復遺伝子の存在を検出するために有用であることが証明された。PGI IIまたは遺伝子マーカーのようなマーカーを用いなければ、育種者は、植物が回復遺伝子を有するか否かを決定するために開花まで待つ必要がある。回復遺伝子が存在する場合、花は正常（稔性）であり、そして回復遺伝子が存在しない場合、それらは減数した（異常な／非機能的な）葯を有し、そして花粉を欠損する。植物の発育の初期段階での分離集団におけるマーカー分析によって遺伝子の存在を同定することに、顕著な利点が存在する。１つの利点は、開花前に植物の遺伝子型を決定することによって、育種者が、開花まで植物を生長させることおよび所望されない遺伝子型を排除することに関連する資源（時間および空間）を節約することである。冬napusにおいて、マーカー分析により遺伝子の存在を同定する能力は、育種者が春化処理の前にこの遺伝子が存在する植物を同定することを可能にする。このことは、育種者が春化処理の前に、この遺伝子を有さない任意の植物を排除することを可能にし、これによって春化処理室中の貴重な空間を節約するので、特に有用である。冬B．napusは、開花を開始するために８〜12週間の春化期間を必要とする。マーカーは、遺伝子の存在を決定するためだけではなく、その遺伝子型（ホモ接合型対ヘテロ接合型）を決定するためにもまた使用され得る。理想的には、実際の遺伝子の配列が入手可能である場合、PCR分析によってその存在を明確に決定するための分子技術を使用し得る。遺伝子配列を得ることが困難である場合、遺伝子に連鎖される遺伝子座(マーカー)を同定することは、困難ではあるが、遺伝子配列を同定することと比較して困難が少ない。目的の遺伝子に対するマーカー遺伝子座の「マッピング距離」（「連鎖」と呼ばれる）によって、マーカーが存在すると同定されている場合に、遺伝子が存在することを結論付けることの確信のレベルが決定される。「マッピング距離」が短ければ短いほど、確信のレベルはより大きい。 DelourmeおよびEber（1992）によって同定されたアイソザイム遺伝子座は、回復遺伝子の存在を同定するために使用され得、そしてこのアイソザイム分析は、 OGU Rf遺伝子を含有する植物の遺伝子型を決定するためにしばしば使用される。しかし、このマーカーの遺伝子型を使用することは、特定の制限を有する。分析は、遺伝子産物、タンパク質をアッセイすることを含む。これは、理想的な温度条件下で葉組織サンプルまたは葉組織から調製された抽出物が扱われない場合に、容易に分解される。さらに、この遺伝子産物は、発達段階に応じて調節され得る。すなわち、特定の組織、または特定の発達段階では発現されない。他のPGI遺伝子座（例えば、PGI IIアイソザイム遺伝子座）は、B．napusに存在し、そして特定の植物中に存在する対立遺伝子の組み合わせに依存して、春napusにおいて見出されるように、ゲル上で泳動されるPGI-IIタンパク質産物のバンドパターンは、複雑になる。従って、回復遺伝子の遺伝子型を有する酵素の表現形を関連付けることは可能でないかもしれない。アイソザイム分析は、冬napus集団において広範に使用されているが、ゲル上で観察されるバンドパターンの複雑さに起因して、春napus集団においては信頼できる結果は得られていない。現在、アイソザイム分析以外に、BrassicaのOGU Rf遺伝子の遺伝子型を決定するための分子／生化学的マーカーを使用する技術または方法は存在しない。1997 年１月30日に公開されたFormanらのPCT国際特許出願WO 97/02737は、Brassicaの改良された回復系統の産生方法を請求し、ここで、稔性についての子孫の試験には、Raphanus sativus材料の遺伝子フィンガープリントを得るための、AFLP、RF LP、および／またはRAPD分子マーカー、マイクロサテライト、プライマー、ならびに他のプローブの使用が含まれる。１つの実施態様において、この分子マーカーは、OPC2の領域と類似の領域にマッピングする。開示される分子マーカーは回復遺伝子の存在を示すが、これらは、本発明の分子マーカーが示すように、回復遺伝子の非存在も、回復遺伝子の遺伝子型決定も示さない。 Delourmeら（1994）の研究においては、６つのランダムに増幅された多型DNA( Randomly Amplified Polymorphic DNA)(RAPD)マーカーが、集団分離分析(bulkse gregant analysis)に使用された。しかし、本発明の配列決定されて特徴づけられて増幅された領域(Sequenced Characterized Amplified Region)(SCAR)マーカーとは異なり、(i)RAPDマーカーは、増幅反応を駆動する恣意的なヌクレオチド配列の単一のプライマーのみを使用するゲノムDNAの増幅によって生成され、そして(ii)アブラナのOgura CMSシステムを含む植物中の回復遺伝子（Rf）の存在のみが決定され得た。Delourmeら(1994)の研究は、種々の特定の遺伝子型を決定するための方法を当業者には教示しなかった。 Delourmeら(1994)の研究は、回復遺伝子座に連鎖することが見出され、次いで、これらのマーカーが、この遺伝子が関与する育種プログラムを容易にするために使用され得ることが仮定される、ランダムに増幅された多型DNA(Randomly Ampli fied Polymorphic DNA)(RAPD)フラグメントに由来するSCARマーカーの可能性について言及している。Delourmeら（1994）は、当業者に、(i)Ogura CMSについて Brassica植物の遺伝子型の決定するためのマーカーを使用する方法、(ii)RAPDマーカーに関連する「rf」に由来するSCARマーカーを開発するための方法、（iii ）植物の品種の特定の遺伝子型を決定する（むしろ、植物品種が稔性回復遺伝子座を有するか、または稔性維持遺伝子座を有するかを単に決定する）ための単回の多重増幅反応におけるSCARマーカーの組合せの開発および使用の方法、あるいは(iv)マーカーがOPY5由来である場合に、回復遺伝子座の非存在に連鎖したSCAR マーカーを開発および使用する方法を教示しなかった。RPADマーカーに関連する「rf」に由来するSCARマーカーを用いない場合、当業者は、Rf遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である植物との間を明確に区別することは不可能である。 BrassicaにおけるOGU Rf回復遺伝子の遺伝子型を決定するための現在の技術および方法の欠点は以下のとおりである： i)特に、春Brassica napusにおいて、OGU Rf遺伝子型を決定するためのアイソザイム分析は効果的でない。なぜなら、この分析は、分解され得るか、または発生的に調節され得るタンパク質をアッセイすることを含むからである。特定の植物に存在する対立遺伝子の組合せに依存して、タンパク質産物のバンドパターンは、解釈するには複雑すぎるかもしれない（春Brassica napusの場合と同様である）。 ii)RAPDマーカーは信頼できない。なぜなら、反応が、低いアニーリング温度で行われるからである。反応条件または成分におけるわずかなバリエーション（例えば、DNAの質、またはプライマーもしくはDNAの濃度）が、しばしば増幅されるRAPD産物の全体的または部分的な失敗を生じる。 iii）RFLPマーカーは、育種プログラムにおいては扱いにくい。なぜなら、処理量に関して大量のDNAが必要であり、大量のサンプルが必要とされ、そして遅い所要時間は、RFLP分析に関連するからである。 iv）回復遺伝子(Rf)に連鎖したSCARマーカーを利用することによって、当業者は回復遺伝子を有さない品種から回復遺伝子を有する品種を区別することが可能である。マーカーは、回復遺伝子を有する個体において現れるが、回復遺伝子を有さない個体には存在しない。しかし、このシステムは：・ホモ接合型「RfRf」回復型とヘテロ接合型「Rfrf」回復型との間では差異は認められない。マーカーは、これらの遺伝子型の両方において現れる。なぜなら、これらの両方が回復遺伝子を含むからである：および・偽陰性を示し得る。マーカーが現れない個体は、「rfrf」と評価され、このことはそれが回復遺伝子を有さないことを示す。実際、PCR反応は、単なる失敗であり得る（多くの反応の任意の１回について）−このことは、PCRに基づくシステムにおいて実際に共通の現象である。本発明の１つの目的は、Ogura回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を同定するための、単純で、効率的、かつ信頼できる方法を提供することである。本発明の別の目的は、冬および春Brassica napus集団の両方を含む分離集団、ならびに他のBrassica種における遺伝子の遺伝子型状態を決定するために組み合わせて使用され得るマーカーを同定することである。本発明の別の目的は、回復遺伝子「Rf」について、および「回復遺伝子の非存在」「rf」についてマーカーを増幅するための標準的なPCRプライマーの組合せを使用することによって、ホモ接合性回復型とヘテロ接合性回復型との間を区別することである。別の目的は、成熟するまで植物を生育させずに(すなわち、植物が開花する前に)、OGU回復遺伝子について遺伝子型を決定するためにBrassica生殖質の多数のサンプルを迅速にスクリーニングする方法を提供することである。さらなる目的は、切断点を同定することによって低グルコシノラート組換えOg ura Rf系統を特徴づけること、それゆえ、これらの組換え系統に存在するRaphan us DNAの量を決定することである。発明の要旨本発明は、Brassicaの育種プログラムにおいてOgura（Rf）回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するための方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：(1)少なくとも１つのプライマーを使用してOgura(rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質を増幅する工程：および(2)少なくとも２つの核酸マーカーを使用して遺伝子型を決定する工程。ここで、１つのマーカーはOGU Rf 遺伝子の存在(Rf)を示し、そして他方のマーカーは、OGU Rf遺伝子の非存在(rf) を示し、そして遺伝子型を検出するためにドットブロットアッセイを使用する。 Brassica生殖質は、冬または春Brassica napus、Brassica rapa、またはBrassic a junceaであり得る。マーカーは、SCARマーカー、RAPDマーカー、またはAFLPマーカーであり得る。 OGU Rf遺伝子の非存在（rf）を示すSCARマーカーは、Y5、Y5配列に部分的に相同性を有するマーカー、またはこのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る。OGU Rf遺伝子の存在（Rf）を示すSCARマーカーは、C2、N20、F10、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る。OGU Rf遺伝子の非存在(rf)を示すRAPDマーカーは、OP Y5、0PG8、OPG2、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る。OGU Rf遺伝子の存在（Rf）を示すRAPDマーカーは、OPC2、OPN20、O PH3、OPF10、OPH15、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る。OGU Rf遺伝子の存在(Rf)を示すAFLPマーカーは、E36XM48AIII 、E35XM62AV、E33XM47AI、E38XM60AI、E32XM50、E32XM59A、E32XM59B、E33XM58 、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る。本発明に関連する方法における増幅工程は、少なくとも１つのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、およびPCRのためのプライマー（これは、以下の表２に記載されるプライマーであり得るか、またはこれらのプライマーに部分的に相同性を有するプライマーであり得る）を含み得る。この増幅工程を包含する方法はまた、単一の反応において全てのプライマーを使用する、多重ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）を包含し得る。増幅工程はまた、多重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてプライマーのセットC2およびY5を組み合わせて使用することを含み得、そして遺伝子型を決定する工程は以下を包含し得る： (A)(1)２つの同一のメンブレン上でPCR反応物をドットする工程、(2)プローブを用いてメンブレンをプローブする工程、ここで、１つのメンブレンは、Rfの存在を示すマーカー(これは、677塩基対のマーカーであり得る)にハイブリダイズするプローブを用いてプローブされ、そして第２のメンブレンは、rfの非存在を示すマーカー（約774塩基対のマーカーであり得る）にハイブリダイズするプローブを用いてプローブされ、そして(3)Ogura回復についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するために２つのメンブレンを比較する工程；あるいは (B)(1)電気泳動ゲル上でPCR産物を泳動する工程、ここで反応産物は、(a)１つのバンド(約677bp)(これは、RfRfの遺伝子型を示す)(b)２つのバンド(約677bpおよび約774bp)(これは、Rfrf位の遺伝子型を示す)、または(c)１つのバンド(約774b p)(これは、rfrfの遺伝子型を示す)であり得、そして(2)Ogura回復についてBras sica生殖質の遺伝子型を決定するためにゲルを読み取る工程。本発明はまた、Ogura(RfRf)回復遺伝子の存在に関連するホモ接合性遺伝子座（上記の遺伝子座は、マーカ−C2、N20、F10、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、もしくはこれらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカーの少なくとも１つにマッピングされる）、またはOgura(rfrf)回復遺伝子の非存在に関連するホモ接合性遺伝子座（上記の遺伝子座は、マーカーY5、この配列に部分的な相同性を有するマーカー、もしくはこのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカーの１つにマッピングされる）を含む。Ogura(Rfrf)回復遺伝子の存在に関連するヘテロ接合性遺伝子座、および上記のマーカーの１つにマップされるものもまた、本発明の一部である。本発明はまた、Ogura(RfRf)回復遺伝子の存在に関連するホモ接合性遺伝子座（上記の遺伝子座は、マーカーOPC2、OPN20、OPH3、OPF10、0PH15、E36XM48AIII 、E35XM62AV、E33XM47AI、E38XM60AI、E32XM50、E32XM59A、E32XM59B、E33XM58 、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するRAPDもしくはAFLPバンドの配列から選択される任意の他のマーカーの少なくとも１つにマッピングされる）、あるいはOgura(rfrf)回復遺伝子の非存在に関連するホモ接合性遺伝子座（上記の遺伝子座は、マーカーOPY5、OPG8、 OPG2、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するRAPDもしくはAFLPバンドの配列から選択される任意の他のマーカーの１つにマッピングされる）を含む。Ogura(Rfrf)回復遺伝子の存在に関連するヘテロ接合性遺伝子座、および上記のマーカーの１つにマップされるものもまた、本発明の一部である。 Ogura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するためのマーカーの組み合わせは、本発明の一部である。上記の組合せには、Ogura(Rf)回復遺伝子の存在を示す少なくとも１つのマーカー、およびOgura(rf)回復遺伝子の非存在を示す少なくとも１つのマーカーが含まれる。マーカーの組み合わせはまた、核酸マーカーの第1のセット（これは、C2、N20、F10、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するRAPD バンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る）および核酸マーカーの第２のセット（これは、Y5、Y5配列に部分的に相同性を有するマーカー、またはこのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る）を含み得る。マーカーの組み合わせはさらに、核酸マーカーの第 1のセット（これは、OPC2、OPN20、OPH3、OPF10、0PH15、E36XM48AIII、E35XM62 AV、E33XM47AI、E38XM60AI、E32XM50、E32XM59A、E32XM59B、E33XM58、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するRAPDまたはAFLPバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る）および核酸マーカーの第２のセット（これは、OPY5、OPG8、OPG2、これらの配列の１つに部分的に相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するRAPDまたはAFLPバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る）を含み得る。本発明はまた、SCARマーカーに関する：(1)Brassica生殖質の遺伝子型におけるOgura(Rf)回復遺伝子の存在を決定するためのマーカーであって、これは、核酸マーカーC2、N20、F10、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る；あるいは(2)Brassica生殖質の遺伝子型におけるOgura (rf)回復遺伝子の非存在を決定するためのマーカーであって、これは、核酸マーカーY5、この配列に部分的に相同性を有するマーカー、またはこのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る。 Brassica生殖質におけるOgura（Rf）回復遺伝子の存在を決定するためのRAPD マーカー(これは、核酸マーカ−OPN20、OPH3、OPF10、OPH15、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカーであり得る）もまた、本発明の一部である。本発明はまた、Brassica生殖質におけるOgura(Rf)回復遺伝子の存在を決定するためのAFLPマーカーに関する。これは、核酸マーカーE36XM48AIII、E35XM62AV 、E33XM47AI、E38XM60AI、E32XM50、E32XM59A、E32XM59B、またはE33XM58、これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、またはこれらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカーを含み得る。本発明はまた、Ogura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)における使用のためのプライマーの組み合わせを含む。このプライマーは、以下の表２に記載されるプライマー、これらのプライマーに少なくとも部分的に相同性を有するプライマー、これらのプライマーが由来する配列にアニ−リングするプライマー、またはRAPDフラグメントまたはこれらのプライマーが由来する増幅されたRAPDフラグメントの任意の部分に由来するプライマーであり得る。上記のプライマーを含むプライマーキットもまた、本発明の一部である。さらに、本発明は、Ogura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するためのシステムを含む。このシステムは以下の工程を包含する： (a)以下の表２に記載されるプライマー、これらのプライマーに少なくとも部分的に相同性を有するプライマー、これらのプライマーが由来する配列にアニ− リングするプライマー、あるいはRAPDフラグメントまたはプライマーが由来する増幅されたRAPDフラグメントの任意の部分に由来するプライマーを使用して、単回の多重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において遺伝子型を増幅する工程；および (b)核酸マーカーの組み合わせを使用して遺伝子型を決定する工程であって、ここで、これらのマーカーは、OGU Rf遺伝子の存在(Rf)を示すC2マーカー、またはC2マーカーに少なくとも部分的な相同性を有するマーカー、およびOGU Rf遺伝子の非存在(rf)を示すY5マーカー、またはY5マーカーに少なくとも部分的な相同性を有するマーカーであり得る。図面の簡単な説明本発明の実施態様が以下の図面に説明される。図１は、元のF2集団94CWN2133の使用による、Ogura回復（Rf）遺伝子に連鎖したRAPDマーカーを例示のために説明する。図２は、集団94CWN2133の第２の部分の集団の使用による、Ogura回復(Rf)遺伝子に連鎖したRAPDおよびAFLPマーカーを例示のために説明する。図３は、Ogura回復遺伝子の存在に関連するRAPDおよびAFLPマーカーのマップを例示のために説明し、これによっていくつかの組換えBrassica napus系統における切断点を示す。本発明のこれらのおよび他の目的および利点は、以下の説明および添付の請求の範囲から当業者に明らかである。発明の詳細な説明本発明は、育種者に、２つのSCARマーカー（１つは回復遺伝子「Rf」に連鎖し、そしてもう一方は「rf」（すなわち、回復遺伝子の非存在）に連鎖している）の組み合わせを使用することによってホモ接合性とヘテロ接合性Ogura回復型との区別を可能にする。１つの実施態様において、各DNAサンプルについて２つのPCR反応が使用される。１つは、「Rf」マーカーについてのプライマーを用い、そしてもう一方は「rf 」マーカーについてのプライマーを用いる。これらの２つの反応の結果を比較することによって、個々の植物の遺伝子型（「RfRf」、「Rfrf」、または「rfrf」のいずれか）を決定することが可能である。ホモ接合性回復型「RfRf」は、「Rf 」に連鎖したマーカーのみを含む。ヘテロ接合性植物は、「Rf」および「rf」の両方に連鎖したマーカーを含む。ホモ接合性非回復型は、「rf」に連鎖したマーカーのみを含む。別の実施態様において、各DNAサンプルについて単回のPCR反応が、単回のPCR 反応において両方のプライマーのセットを多重使用することによって、使用される。多重PCR反応においてともに使用される場合、２つのプライマーのセットは、分離OGU Rf集団の個々の植物におけるOGU Rf遺伝子の遺伝子型決定を可能にする。これらの２つの標準的なPCRプライマーのセットは、RAPD PCR（実施例１）およびAFLP分析（実施例７）を使用する分離OGU Rf集団の集団分離分析を介して誘導された。OGU Rf遺伝子（Rf）に連鎖したRAPDおよびAFLPマーカー（バンド）が発見された。他のRAPDおよびAFLPマーカーは、OGU Rfの非存在(rf)においてのみ存在することが見出された。目的のマーカー（バンド）はクローニングされ、そして配列決定され、そして標準(SCAR)PCRプライマーがこれらの配列決定されたフラグメントから設計された。１つの標準的なPCRプライマー対（OperonプライマーOPC2を使用して生成されたRAPDバンドに由来する）は、OGU Rf遺伝子(Rf)に連鎖しているバンドを生じる。第２のプライマー対（OperonプライマーOPY5を使用して生成されたRAPDバンドに由来する）は、回復遺伝子の非存在下でのみ存在するバンド（すなわち、rfに連鎖する）を生じる。プライマー対の２つのセット（C2およびY5と命名され、Rf に連鎖したOPC2およびrfに連鎖したOPY5を使用するRAPDマーカーに由来する）が、表２に以下で記載されている。標準的なPCR反応で使用される場合、プライマー対C2は、677bp（塩基対）のバンドを生じ、このことは、OGU Rf遺伝子（Rf）の存在を示す。プライマー対Y5は、774bpのバンドを生じ、このことは、OGU Rf遺伝子の非存在(rf)を示す。多重P CR反応においてともに使用される場合、プライマー対の２つのセットは、RfRf（ホモ接合性回復）、Rfrf（ヘテロ接合性回復）、およびrfrf（非回復／不稔性）遺伝子型の間を区別することを可能にする。プライマーセットC2およびY5を組み合わせて使用する多重PCRにおいて観察されるバンドは以下のとおりである：・ RfRf−１本のバンド(677bp)が見られる・ Rfrｆ−２本のバンド(677bpおよび774bp)が見られる・ rfrf−１本のバンド(774bp)が見られる同じ２つのプライマーのセットに基づくドットブロットアッセイ検出システムがまた開発され、以下のように作動させる：・プライマーセットC2およびY5を組み合わせて使用する多重PCRを設定する；・メンブレン上にPCR反応物をドットすることによって２つの同一のメンブレンを作製する；・放射性プローブまたは非放射性プローブを用いてメンブレンをプローブする。一方のメンブレンをRfに連鎖した677bpフラグメントでプローブし、第２のメンブレンをrfに関連した774bpフラグメントでプローブする；そして・ OGU Rf遺伝子型を決定するために２つのメンブレンを比較する。 OGU集団の遺伝子型に対して現在利用されているシステムは、RAPDバンドから開発された２つのSCARマーカーの組み合わせである。一方のマーカーC2は、回復遺伝子「Rf」に連鎖しており（RAPDプライマーOPC2を使用して開発された）、そして他方のマーカーY5は、回復遺伝子の非存在「rf」に対して連鎖している（RA PDプライマーOPY5を使用して開発された）。これらの２つのマーカーの組合せによって、個々の植物におけるOGU Rf遺伝子型（「RfRf」、「Rfrf」、または「rf rf」のいずれか）の決定が可能である。２つのSCARマーカーのそれぞれについて、２つの標準的なPCRプライマーのセットが存在する。一方は正方向プライマーであり、そして他方は逆方向プライマーであり、これらは、目的のバンドのみを増幅するように開発された（表２）。プライマーの一方のセット(C2)は、回復遺伝子「Rf」に関連するバンドを増幅するが、一方、プライマーの第２のセット(Y5)は、回復遺伝子の非存在「rf」に関連するバンドを増幅する。プライマーのこれらの２つのセットは、それらが両方同じPCR反応で利用され得るように開発された。同じPCR反応で２つのプライマーのセットを使用することによって、偽陰性の問題が排除される。すなわち、失敗したPCR反応が明らかである。なぜなら、検出可能な結果は、電気泳動によるか、または放射活性もしくは非放射活性プローブのいずれかでのプローブすることによっては得られないからである。 PCR反応の多重形式を使用することによって（この場合、１つの反応で２つのプライマー対）、少なくとも１つの産物が形成されるはずである。両方の産物の非存在は、PCR反応の失敗を意味する。「Rf」に関連するバンドが増幅された唯一のバンドである場合、個々の植物は、回復遺伝子についてホモ接合性（RfRf）であり、両方の「Rf」および「rf」に関連するバンドが増幅される場合、個体は回復遺伝子についてヘテロ接合性（Rfrf）である。「rf」に関連するバンドが増幅された唯一のバンドである場合、個体はホモ接合性非回復型（rfrf）である。増幅されるバンドがない場合、PCR反応はそのサンプルについて失敗であり、そして反応が繰り返され得る。この手順は、偽陰性を排除する。 PCR増幅の結果の可視化するために利用され得る２つの主な方法が存在する。１つの方法は、アガロースゲル上で反応産物を泳動させること、そしてバンドを検出するためにエチジウムブロミドで染色することである。しかし、この方法は、少数のサンプルについて適切であるので、数百のサンプルの大規模な分析の助けにはならない。ゲルの流し込み、充填、泳動、および染色／検出は、非常に時間を消費し、労働集約的であり、そして経費がかかる。本発明は、多数のサンプルの迅速な分析を可能にするドットブロットシステムを提供する。高処理量DNA抽出システムと組み合わせて、ドットブロットシステムは、400サンプル以上の同時の試験が可能である。自動化によって、試験されるサンプルの数を著しく増大させ得る。ドットブロットアッセイは、二連のブロット上にPCR産物を「ドット」する工程、およびそれぞれのクローニングされたRAPDバンドでプローブする工程を包含する（以下により詳細に説明する）。以下の実施例は、本発明の特定の例示を示す。しかし、本発明が実施例に示される特定の詳細に限定されないことは理解されるべきである。実施例１―回復遺伝子に連鎖したRAPDマーカーを同定するため、および植物の遺伝子型が最も正確に反映されるこれらのマーカーを決定するための集団94CWN2 133のスクリーニング F2集団94CWN2l33の種子から、369個の植物を温室で生育させた。アイソザイム分析を、葉組織を使用して各植物について行った。さらに植物を、花の表現型（稔性または不稔性のいずれか）についてスコアした。これらの369個の植物のうち、175個を、OGU回復遺伝子（Rf）についてのマーカーを開発するための連鎖分析に利用するために選択した。他の植物は、決定的ではないアイソザイムスコアに起因して、あるいは植物が開花したかまたは開花するのが遅すぎたために、研究から除外した。これらの175個の植物から、集団DNAの２つのセットを形成した。 500個のRAPDプライマーの集団分離分析（材料および方法、RAPD分析を参照のこと）から、５個［OPC2、OPH3、OPN20、OPH15、およびOPF10］は、稔性の集団、および親NW3002(RfRf)、および不稔性の集団の非存在下で存在する増幅産物であることを表し、一方、４個のプライマー［OPG8、OPF6、OPY5、および0PG2］は、不稔性の集団、および親サンプル、Bristol(rfrf)に存在する増幅産物であることを表したが、稔性の集団においては存在しなかった（表１）。集団94CWN2133に由来する個々のF2植物（集団を形成するために使用したものを含む）を、集団分離分析によって同定されている９個のRAPDマーカーを使用してスクリーニングした。稔性の集団に関連する５つのマーカーは、175個の個体においてほぼ完全に同時分離された。すなわち、任意の個体において、全ての５つのバンドが存在したか、または存在しなかったかのいずれかであった。同じことが、回復遺伝子の非存在に関連する４つのプライマーについて観察された。このことは、これらのマーカー間の組換えを示し、そして回復遺伝子が比較的まれであることを示す。 Mapmaker 3.0（Whitehead Institute for Biomedical Research）を使用することにより行った連鎖分析は、OPC2、OPN20、OPH3（Rf遺伝子に関連するマーカー）、ならびにOPY5、OPG8、OPG2、およびOPF6マーカー（Rf遺伝子の非存在に関連するマーカー）が、Rf遺伝子から1.4cMの同じ遺伝子座にマップされたことを示した。PGI II遺伝子座は、RAPDマーカーから回復遺伝子の反対側に、1.5cMにマップされた。２つの他のマーカー（OPH15およびOPF10）はまた、Rf遺伝子に連鎖して、しかし遠位（0.6cMおよび1.7cM）でそれぞれ他のRAPDマーカーに連鎖した（図１）。回復遺伝子の非存在に連鎖したRAPDマーカーをさらに、10個の通常のアブラナ品種（すなわち、正常な細胞質および欠失したOGU Rf遺伝子）のセットについて試験した。これらの５つの品種は、冬B．napusであり、そして５つは春B．napus であった。10個の品種の全てが回復遺伝子を含まなかったので、回復遺伝子の非存在に関連する４つのマーカーがこれらの品種の全てに存在しないのが当然であると予想した。マーカーのうちの２つ（OPG2およびOPY5）は、全ての10個の品種に存在することが見出されたが、一方、他の２つのマーカー（OPF6およびOPG8）は一貫しなかった。OPY5およびOPG2は回復遺伝子の非存在を決定するためにより正確であると結論された。実施例２―SCARマーカーへのRAPDマーカーバンドの転換、および遺伝子型を決定するためのSCARマーカーの使用 RAPDマーカーはいくらか信頼できず、そして日常的な遺伝子型の決定を含むシステムには容易には適用できない。この理由のために、いくつかのSCARマーカーおよびこれらのマーカーのためのプライマーを、RAPDマーカーから開発した。組み合わせでのSCARプライマーの選択的な使用を、植物の遺伝子型（RfRf、Rfrf、またはrfrf）を決定するために、ゲル電気泳動またはドットブロット分析による PCR産物の検出を通して使用した。２つのSCARマーカー（C2およびY5）が、組み合わせにおいて互いに十分に作用することを見出した。最初に、SCARマーカーを利用するために、DNAを試験するサンプルから抽出した。当業者に公知のような任意のDNA抽出システムを使用し得た。DNA抽出後、PC R反応を、同じ反応において２つのセットのプライマー対を使用して設定した。１つのセットのプライマー対（セットC2）は、回復遺伝子（「Rf」）に関連する 677bpのバンドを増幅した；第２のセットプライマー対（セットY5）は、回復遺伝子の非存在（「rf」）に関連する774bpのバンドを増幅した。表２は、関係するプライマー対のヌクレオチド配列を示す。DNA増幅および結果の可視化のために使用したPCR反応混合物およびPCR反応技術は、材料および方法の節で以下に記載する。実施例３―1.4％アガロースゲル上でのゲル電気泳動によるPCR結果の可視化 PCR産物を、0.4μg/mlのエチジウムブロミドを含有する1.4％アガロースゲル（1×TAE（0.04M Tris酢酸；0.001M EDTA、pH8.0）または0.5×TBE（0.045M Tri sホウ酸；0.001M EDTA）のいずれか）にのせた。ゲルを対応する緩衝液中で80V で４時間泳動し、次いで、UV線下で観察した。ゲルを記録するために写真を撮り、そしてサンプルの遺伝子型をこれらの写真から決定した。ホモ接合性回復個体については、約677bpの１本のバンドが見られた。ヘテロ接合性個体については、２本のバンド（一方は約677bpであり、そして第２のバンドは約774bp）が見られた。回復遺伝子の任意のコピーを含まない個体については、約774bpの１本のバンドが見られた。実施例４―高処理量ドットブロット検出システムの開発高処理量ドットブロット検出システムを開発した。ドットブロット分析については、材料および方法の節で以下に記載する手順に従った。実施例５―ドットブロット検出システムを使用するOGU Rf遺伝子型の決定同一のメンブレンのセットによって形成されたオートラジオグラムを比較することによって、サンプルのOGU Rf遺伝子型を正確に決定することが可能であった。例えば、メンブレン上の所定のサンプルについて、C2でプローブした場合にそれはドットを示したが、Y5でプローブした場合に対となるメンブレン上の二連のサンプルがドットを示さなかった場合、サンプルは回復遺伝子についてホモ接合性(RfRf)であった。一方のメンブレンがC2およびその対となるメンブレンでプローブした場合にドットを示し、Y5でプローブした場合もまたドットを示した場合、サンプルは回復遺伝子についてヘテロ接合性(Rfrf)であった。一方のメンブレンがY5でプローブした場合にドットを示したが、その対となるメンブレンがC2でプローブした場合にドットを示さなかった場合、サンプルはホモ接合性の非回復 (rfrf)であった。両方のメンブレンがドットを示さなかった場合、PCR反応は失敗であった。実施例６―RAPDマーカーから開発したSCARマーカーの試験 Rf遺伝子の連鎖に関してSCARマーカーの有効性を試験するために、集団94CWN2 133から生育させた137個のF2植物の第２のサンプルを、SCARプライマーのセット C2およびY5でスクリーニングした。結果を、表３にまとめた。これらのマーカーを、春および冬napus品種改良プログラムによる多数の分離集団を使用してさらに試験した。以下の表は、PGI IIおよび／または開花スコアとのマーカースコアの一致（従って、Rf遺伝子の存在）を例示する。例示の目的で、１集団あたり10個の植物についてのデータを表に示す。表に示されるもの以外に、多くのさらなる個体およびさらなる集団から構成される集団をまた試験した。試験交配を、SCARマーカーの正確さを決定するために、いくつかの集団からの個体について行った。ほとんど全ての場合、予想される分離比が観察された。実施例７―AFLPマーカーの同定 OGU Rf回復遺伝子に対して、および回復遺伝子の非存在に対しての両方に連鎖したAFLPマーカーを同定するための実験は、集団94CWN2133の第２のセクションに由来する集団のDNAサンプルを使用した。４つの集団を使用した。２つはホモ接合性回復植物の10個の個体それぞれから構成し、一方、他の２つの集団は、10 個の不稔性の個体のそれぞれから構成した。回復遺伝子に連鎖したAFLPマーカーを同定するための集団94CWN2133のスクリーニングを、当業者に公知の技術を使用して行う。増幅のAFLP法を、Vosら（1995）の材料および方法の節に記載されている技術に従って行った。 AFLPおよびRAPDの両方のマーカーを、集団94CWN2133の第２のセクションに由来する全151個の個体についてスクリーニングした（「AFLPマーカー」の節の「植物材料」を参照のこと）。マーカーを、3.0のLOD限界値および80 Haldane cM の距離限界値でMapmaker（バージョン3.0）を使用してマッピングした。これらのパラメーターを使用して、全てのマーカーが１つの連鎖群に連鎖していることが見出された。マーカーの順番を、複数点分析を使用して割り当て、そして最初のマップを、「影響（ripple）」コマンドを使用することによって決定した最良の対数見込みスコアを使用して構築した。しかし、多くの場合、別のマーカーの順番は、最良の順番とは統計的に異なっていた（図２を参照のこと）。今日までに、回復遺伝子に連鎖した17個の推定のAFLPマーカーが、回復遺伝子の非存在に連鎖した18個の可能性のあるマーカーとともに同定されている。開発されている（クローニングされ、配列決定され、そしてマッピングされている）８個のAFLPマーカーは、E36XM48AIII、E35XM62AV、E33XM47AI、E38XM60AI、E32X M50、E32XM59A、E32XM59B、およびE33XM58である。SCARマーカー、およびこれらのマーカーのためのプライマーが、当業者に公知の技術を使用してこれらのAFLP マーカーから開発される。図１対図２における、RAPDマーカーの相対マップ位置における明らかな矛盾は、以下のように合理的に説明され得る：(i)異なるマッピング集団および異なる大きさの集団の使用、(ii)図２と比較して、図１は、より少ないマーカーおよびより少ない組換え体に基づく、(iii)図２におけるマーカーのマップ位置は、連鎖分析と切断点分析の組み合わせに基づく、すなわち、Ogura Rf連鎖群上の連続したマーカーを伴うマーカーの存在または非存在に基づく（表５）。これらの差異を仮定すると、本発明者らは、図２に示されるマーカーのマップ位置に、より大きな確信をもつ。図１のわずかにいくつかのRAPDマーカー（例えば、OPF6および OPG8）は、集団94CWN2133の第２のセクションについてはスクリーニングされず、従って、図２にはマッピングされなかった。実施例８組換え体低グルコシノラートOGU-Rfの冬および春Brassica napus系統における切断点の決定 OGU-Rf回復遺伝子を、PGI IIアイソザイムマーカーとともに、Raphanus sativ usからアブラナに移入した。冬napus系統においては、PGI IIが失われる交差事象が存在しない限り、PGI IIマーカーをOGU遺伝子型の決定のために使用し得る。OGUシステムの使用に伴う最大の難問の１つは、回復遺伝子の存在が、種子中の所望されない高レベルのグルコシノラートと連鎖して見出されることである。 Pioneerでの春および冬napus育種プログラムでは、回復遺伝子に固定され、そして受容可能な(低い)レベルのグルコシノラートを含むいくつかのOGU-Rf系統が開発された（1997年12月19日に出願されたCharne，David G.らのPCT国際特許出願第PCT/CA95/01005号）。 Rf遺伝子座上のマーカー位置に対するさらなる知見を得るために、および組換え体の低グルコシノラート系統における切断点を決定し、それによってRaphanus フラグメントの最も小さい部分を有する組換え体を同定するために、いくつかの組換え体低グルコシノラートB．napus回復系統を、回復遺伝子に連鎖したRAPDおよびAFLPマーカーを使用してスクリーニングした。これらの系統は、冬napus系統のNW1717MおよびNW1712、ならびに春napus系統NS3058 MO、NS3060 MO、97SN74 09、97SN7416、97SN7422、97SN7423、および97SN7425であった。使用したコントロール材料には、NW3002およびBristolを含んだ。さらに、NW1717Mとの交配によって誘導した２つの回復系統を含んだ：97CWR150069および97CWR120046。系統NW 1717MおよびNS3060MOを回復系統に固定し、一方、残りの系統を回復遺伝子について分離した。これらの分離系統において、ホモ接合性回復植物のみを試験した。それぞれの組換え体中に存在しなかったマーカーは、組換えによって欠失され、そして組換え系統における染色体の「切断点」を示した。 Ogu Rf遺伝子の存在に関連する以下のマーカーを使用した：RAPDマーカーOPH3 、OPN20、OPH15、OPF10、OPC2、およびAFLPマーカーE36/M48、E35/M62、E33/M47 、E38/M60、E32/M50、E32/M59A、E32/M59B、E33M58（これらは全て、Ogura回復遺伝子の存在（Rf）を示す）。目的の系統からDNAを抽出し、PCR増幅し、そして可視化した。RAPDマーカーについては、可視化を、アガロースゲル上での電気泳動によって行った。AFLPについては、可視化にはアクリルアミドゲルの使用を含んだ。結果を、以下の表５および６にまとめる（1997年12月19日に出願されたCharne ，David G.らのPCT国際特許出願第PCT/CA95/01005号）。目的の系統の稔性を、花の形態の可視的な検査によって確認した。グルコシノラート分析をTMSまたはH PLCによって行い、そして目的の系統が低グルコシノラート含量を有することを確認した。全てのマーカーが、NS3058MO系統およびNW1712系統中に存在することが見出された。従って、これらの系統は、任意のOGU-Rfに連鎖したマーカーが欠失した組換え体からの結果として生じたものではなかった。いくつかのマーカーが、NS3060 MO系統およびNW1717M系統には存在しないことを見出し、そして２つのマーカーが、97SN7409系統、97SN7416系統、97SN7422系統、97SN7423系統、および97SN7425系統のそれぞれには存在しないことを見出した。従って、これらの系統は、回復遺伝子付近のRaphanus染色体セグメントとともに生じた切断点での組換えの結果として生じ、その結果、OGU-Rfに連鎖したマーカーが欠失された。このことはおそらく、Raphanus染色体セグメントのより小さい部分が、NS3058 MOおよびNW1712系統の関連する組換えの間に移入されるよりも、これらの組換えの間に移入されたことを示す。さらに、NW1717M中に保持されているマーカーの数は、NS3060 MO、97SN7409、97SN7416、97SN7422、97SN7 423、および97SN7425よりも少なく、このことはおそらく、NW1717M中のRaphanus 染色体セグメントが、NS3060 MO、97SN7409、97SN7416、97SN7422、97SN7423、および97SN7425中のセグメントよりも小さいことを示す。材料および方法 RAPD マーカー植物材料：使用した植物材料は、冬B．napus F2 OGU回復集団94CWN2133、ならびにその親NW3022およびBistol（これは、Pioneer Hi-Bredの冬アブラナ育種グループから入手した）であった。植物を４枚の葉の段階まで生育させ、４℃で12 週間春化処理をし、次いで温室中で生育させた。この集団に由来する植物を、Pg i-2アイソザイムマーカー（DelourmeおよびEber、1992）を使用して回復遺伝子の存在についてスクリーニングした。アイソザイム分析を、PioneerのJohnson， Iowaの電気泳動研究室で行った。アイソザイムパターンに基づいて、この集団に由来する植物を遺伝子型（ホモ接合性回復（RfRf）、ヘテロ接合性回復（Rfrf）、または非回復（rfrf）のいずれか）に従って分類した。個々の植物をまた、花の表現型（すなわち、花粉／葯が正常であるか、または非機能的である）に基づいて雄性稔性または不稔性としてスコアした。 DNA抽出：DNAを、改変したCTBA抽出プロトコール（DoyleおよびDoyle、199 0)を使用して、凍結乾燥した粉末状の葉組織から抽出した。各サンプルについて、0.3gの挽いた葉組織を、10mlのCTAB緩衝液（0.1MTris、0.7M NaCl、10mM EDTA 、27mM CTAB、１％ β-メルカプトエタノール）を含有するチューブ中に入れた。チューブを、60℃で１時間インキュベートした。クロロホルム：イソアミルアルコール24：１（５ml）を添加し、そして混合した懸濁物を、6,000rpmで５分間、Beckman J2-HS遠心分離機で遠心分離した。上清を回収し、そして２回目のクロロホルム／イソアミルアルコール抽出を行った。次いで、上清を新しいチューブに移し、そして８mlのイソプロパノールを添加してDNAを沈殿させた。5000rpm で５分間の遠心分離後、上清を流しだし、そして４mlの76％ EtOH、0.2M NaOAc を添加した。この溶液を20分間放置し、その後、流し出した。76％ EtOH、10mM のNH₄Oacでペレットを洗浄し、次いで９mlのTE緩衝液（pH8.0）中に再懸濁した。必要であれば、一旦、DNAを再懸濁し、さらに２回クロロホルム／イソアミル抽出を行った。最後のクロロホルム／イソアミル抽出後、7.0mlの20％ PEG、2.5 M NaClを上清に添加し、２つの溶液を混合し、そしてチューブを氷上に１時間置いた。１時間後、チューブを、8,000rpmで10分間、４℃にて遠心分離した。上清を廃棄し、そしてペレットを70％の冷却エタノールで、50μg/mlのRNAseを含有する0.5mlのTEに再懸濁する前に洗浄した。DNA濃度を、TKO 100蛍光光度計(Hoef er）を使用してベンゼンジアミド（Hoescht色素33258）の存在下での蛍光によって決定した。 RAPD分析：Bulk Segregant Analysis（BSA）法（Michelmoreら、1991）を、Og ura Rf遺伝子に連鎖した推定のマーカーの同定のために使用した。２μgのDNAのアリコートをそれぞれ、ホモ接合性稔性個体およびホモ接合性不稔性個体から回収した。これらのアリコートを、４つの異なるDNAのプール（ホモ接合性稔性個体（RfRf）の２つのプールおよびホモ接合性不稔性（rfrf）固体の２つのプール）と組み合わせた。各集団中の個体の数は、17または18のいずれかであった。親系統NW3002（ホモ接合性回復）およびBristol（ホモ接合性非回復）に由来するDNAを用いて、DNAの「集団」を25ng/μlに希釈した。RAPDマーカーを、プールしたDNAの「集団」の間、ならびに２つの親の間の多型性を検出するそれらの能力について試験した。全50のオリゴヌクレオチドから構成されるOperon Techn ologiesのプライマーキットＡからＹを、プライマーとして使用した。希釈したD NAの１μlを、最終反応用量15μl中で鋳型として使用した。PCR反応溶液は、1× PCR Buffer II（Perkin Elmer）、2.5mMのMgCl₂、200μMの各dATP、dCTP、dGTP 、およびdTTP、0.4μMのOperonプライマー、0.375ユニットのTaqポリメラーゼ（ Perkin Elmer）を含んだ。DNA増幅を、以下のようにプログラムされたPerkin El mer Geneamp PCR System 9600サーモサイクラーで行った：２分間94℃を１サイクル：５秒間94℃、30秒間36℃、および１分間72℃を35サイクル：５分間72℃を１サイクル：４度に保つ。増幅産物を、1.4％のアガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分離し、そしてエチジウムブロマイド染色によって可視化した。次いで、多型性を検出するプライマーを、どのプライマーが回復遺伝子の存在または非存在に連鎖した多型性バンドを生じる化を決定するために、集団94CWN2133 から全ての個体について試験した。この分析のためのゲルは、1.4％アガロースまたは２％アガロースのいずれかであった（１％ Metaphoreおよび１％ NuSieve ３：１：FMC BioProducts）。 SCARプライマーへの転換：回復遺伝子の存在または回復遺伝子の非存在のいずれかへの連鎖を示すバンドを、TA Cloning Kit（Invitrogen）を使用してクローニングし、そして配列決定した。クローニングしたバンドの配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、目的のフラグメントがより再現性のある反応条件化を使用して、PCRによって増幅し得るように、設計した。この方法で生じたPCR産物またはマーカーバンドは、配列決定されて特徴づけられた増幅された領域(Sequence Characterized Amplification Regimen)またはSCARと呼ばれている。プライマーを、それらが多重PCR反応で互いに使用され得るように、類似のアニ-リング温度を有するように設計した。これらのSCARプライマーを、それらがRAPDプライマーによって特徴付けられるような植物の遺伝子型を正確に反映するかどうかを決定するために、94CWN2133分離集団に由来する個体に対して試験した。 SCARSマーカープライマーを試験するためのPCR反応混合物（20.0μl）は、25n gのゲノムDNA、1×PCR Buffer II（Perkin Elmer）、1.5mMのMgCl₂、250μMの各 dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、22.5pmolの各正方向プライマーおよび逆方向プライマー、0.5UのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含んだ。DNA増幅を、以下のようにプログラムされたPerkin Elmer Geneamp PCRSystem 9600サーモサイクラーで行った：２分間94℃を１サイクル；１分間94℃、１分間60℃、および１分間72℃を35サイクル；５分間72℃を１サイクル；４℃に保つ。増幅産物を、1.4 ％アガロースゲル上で可視化した。開発した全９個のSCARマーカーから、回復遺伝子に連鎖した１つ（マーカーＣ 2）、および回復遺伝子の非存在に連鎖した第２のマーカー（マーカーY5）が、多重PCR反応においてともに試験した場合に良好な再現性を生じ、そして明確なバンドを生じた。SCARマーカーH3およびH15（回復遺伝子に連鎖）およびG8（回復遺伝子の非存在に連鎖）は、再現性が得られず、多重PCR反応で使用した場合に明確なバンドを生じなかった。これらの２つのプライマーのセットを多重使用することについて最良の結果を生じることが見出されたPCR反応混合物（20.0μl ）は以下のとおりであった：10〜25ngのゲノムDNA、１×PCR Buffer II（Perkin Elmer）、1.5mMのMgCl₂、250μMの各dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、19.5pmol のC2プライマー（正方向および逆方向とを等量で混合）、25.5pmolのY5プライマー（正方向と逆方向とを等量で混合）、0.5UのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer ）。DNA増幅を、以下のようにプログラムされたPerkin Elmer Geneamp PCR Syst em 9600サーモサイクラーで行った：２分間94℃を１サイクル；１分間94℃、１分間60℃、および１分間72℃を35サイクル；５分間72℃を１サイクル；４℃に保つ。PCR後、結果を、1.4％アガロースゲル上でのゲル電気泳動によって可視化するか、または結果を、ドットブロットアッセイ（先に記載した）によって可視化した。ドットブロットシステムの開発：２つのSCARプライマーのセット（C2およびY5 ）を使用する多重PCR反応の結果を可視化するためのドットブロット検出システムを開発した。この同じシステムを、多重PCRに役立つプライマーの任意の他の組み合わせを使用して利用し得る。ドットブロット分析のために、多重PCR反応による５μlのPCR産物を、２つのH ybond^TM N+ナイロンメンブレン上にそれぞれドットした。次いでメンブレンを回収し、そして0.6MのNaCl、0.4MのNaOHで満たしたブロッティングパッド上にDNA を２分間配置させ、次いで、0.5MのTris（pH7.5）、1.5MのNaClで満たしたブロッティングパッドに10分間移した。サンプルを、30分から１時間、80℃で焼き付けることによってメンブレンに結合させた。２つの同一のメンブレンのうち一方を、「Rf」関連プローブ（C2）でプローブし、そして他方を「rf」関連ブローブ（Y5）でプローブした。プレハイブリダイゼーションを、Hybaid^TMオーブンで65℃にて２時間から一晩行った。プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション溶液は、１％の SDS、10％のデキストラン硫酸ナトリウム塩500K、５×SSPE（0.9MのNaCl、50mM のNa₂HPO₄・7H₂O、５mMのEDTA、pH7.7）、10×Denhardts（0.2％のBSA画分V、0. 2％のficoll 400K、0.2％のポリビニルピロリドン360K）から構成された。ハイブリダイゼーションのために使用したDNAプローブは、同じプライマーセット（C 2およびY5）を使用して本来のRAPDマーカーバンドのクローニングから得たプラスミドクローンから増幅したフラグメントであった。増幅したプローブをゲル精製し、そしてGENECLEANキット(BIO 101,Inc.)を使用して単離した。プレハイブリダイゼーションの間に、プローブを、AmershamマルチプライムDNA標識システのプロトコールを使用して精製した。プレハイブリダイゼーション後、標識したプローブをプレハイブリダイゼーション溶液に添加し、そしてメンブレンを１時間から一晩ハイブリダイズさせた。２つの同一のメンブレンのセットから、一方のメンブレンをC2プローブ（Rf関連）でプローブし、一方、その対となるプローブを、回復遺伝子の非存在に関連するY5プローブを用いてプローブした。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを、2×SSC、0.1％のSDSで20分間、60℃にて１回洗浄し、続いて0.1×SSC、0.1％のSDSで30分間、60℃にて２回洗浄した。ドットブロットを、４時間から一晩まで時間を変化させて、Amersham Hyperfilm^TM-M Pに暴露した。サンプルのOGU Rf遺伝子型を、同一のメンブレンのセットによって形成したオートラジオグラフィーを比較することによって決定した。例えば、メンブレン上の所定のサンプルについて、それがC2によってプローブした場合にはドットが示されるが、対になるメンブレン上の二連のサンプルをY5でプローブした場合にドットを示さなければ、このサンプルはホモ接合性回復(RfRf)である。一方のメンブレンがC2でプローブした場合にドットを示し、そして対になるメンブレンをY5 でプローブした場合にもドットを示すならば、このサンプルは、回復遺伝子についてヘテロ接合性(Rfrf)である。一方のメンブレンは、Y5でプローブした場合にドットを示すが、対となるメンブレンはC2でプローブした場合にドットを示さないならば、サンプルはホモ接合性の非回復(rfrf)である。いずれのメンブレンもドットを示さない場合、PCR反応は失敗であった。AFLP マーカー植物材料：AFLP分析に使用した植物材料は、RAPD分析について使用した冬B.na pus OGU回復集団94CWN2133に由来する、冬B．napus集団であった。AFLP分析に使用した集団を、集団94CWN2133に由来するホモ接合性回復植物と同じ集団に由来する不稔性植物植物とを交配させることによって誘導した。次いで、得られたヘテロ接合性子孫を自家受粉させて、回復遺伝子について分離集団を得た。この集団を、集団94CWN2133のセクション２と呼ぶ。94CWN2133のセクション２に由来する植物を春化処理し、Pgi-2アイソザイムマーカーでスクリーニングし、そして元の94CWN2133集団について使用した同じプロトコールに従って花の表現型についてスコアした。集団94CWN2133の第２のセクションは、151個の個体から構成された。これらの個体のいくつかを、開花の欠失またはPGI IIスコアによって排除し、最終的な集団を137個体にした。 DNA抽出：DNAを、元の94CWN2133集団について使用したものと同じプロトコールである、改変したCTAB抽出プロトコール（DoyleおよびDoyle、1990）に従って抽出した。集団94CWN2133のセクション２について、0.1gの凍結乾燥させた粉末状葉組織を抽出のために使用した。最後のクロロホルム／イソアミルアルコール抽出後、DNAを、20％のPEG、2.5MのNaClのかわりに、1/10容量の3MのNaOAcおよび2/3容量のプロパノールで沈殿させた。チューブを反転させて混合し、次いで、70％のエタノールで洗浄する前に10分間４℃にて8,000rpmで遠心分離し、そしてTEに再懸濁した。 AFLP分析：RAPD分析と同様に、Bulk Segregant Analysis法（Michelmoreら、 1991）を、Ogura Rf遺伝子に連鎖した推定のAFLPマーカーの同定のために使用した。50ng/μlの濃度を有する集団DNAサンプルを形成するために、５μgのDNAのアリコートをそれぞれ、ホモ接合性稔性個体およびホモ接合性不稔性個体から回収した。それぞれ５μgのアリコートを、２つのホモ接合性稔性（RfRf）プールおよび２つのホモ接合性不稔性（rfrf）のプールを形成するように組み合わせた。各プール／集団中の個体の数は10であった。 DNAの集団、ならびに親サンプルであるNW3002およびBristolを、AFLPプロトコール（Vosら、1995）を使用してスクリーニングした。DNAをEcoRIおよびMesI酵素を使用して消化し、そして最初の増幅工程を、単一の選択的ヌクレオチドを有するAFLPプライマーを使用して行った。最初の増幅工程について、50μlのPCR反応を、75μgの両方のAFLPプライマー、５μlのDNA鋳型（消化／連鎖混合物の1： 10希釈物）、１UのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、1×PCR Buffer（Perkin Elmer）、および1.25mMの全４種のdNTPを含んで設定した。PCR後、最初の増幅工程の反応混合物を20倍に希釈し、その後、第２回目の増幅反応のための鋳型として使用した。第２回目の増幅のためのEcoRIプライマーの標識のための反応を、１×One-Phor-All緩衝液PLUS（Pharmacia Biotech）中で行った。第２回目の増幅後、等量のホルムアミド色素（98％ホルムアミド、10mMのEDTA 、pH8.0、およびブロモフェノールブルー、および追跡用色素としてのキシレンシアノール）を添加し、次いで得られた混合物を、３分間90℃で加熱し、そして氷上で冷却した。各サンプル（使用した櫛に依存して３〜５μl）を、4.5％の変性ポリアクリルアミドゲル上にロードした。ゲルを、4.5％のアクリルアミド／B is Solutlon 19：１（Bio-Rad Laboratories）、7.5Mの尿素、50mMのTris、50mM のホウ酸、１mMのEDTAを含有する溶液を使用して、調製した。120mlのゲル溶液の容量を、20分の減圧源に連結したデシケーター中で脱気した。この溶液に100 μlAcid Electrophoresis Cell（Bio-Rad Laboratories）を使用して鋳造した。そこの緩衝液トレーには、1.25Mの酢酸ナトリウムを含んだ。100mMのTris、100mM のホウ酸、２mMのEDTA,および100mMのTris、100mMのホウ酸、２mMのEDTAを、泳動緩衝液として使用した。電気泳動を、120W、45℃で約２時間行った。電気泳動後、ゲルを１時間、二相温度スラブゲル乾燥機（Bio-Rad Laboratories）中で80 ℃で乾燥させ、そして４〜７日間フィルム（Hyperfilm^TM−MP、Amersham）に曝した。多型性のバンドを、Ogu回復遺伝子についての推定のマーカーとして同定した。次いで、これらの推定のマーカーを、集団94CWN2133のセクション２に由来する個体に対してスクリーニングして、マーカーが回復遺伝子に対してどのように密接に連鎖しているかを決定した。 SCARマーカーへのAFLPマーカーの転換：回復遺伝子への連鎖を示すAFLPバンドをクローニングし、そして配列決定した。配列情報に基づいて、SCARプライマーを、目的のバンドを増幅するために設計した。これらのSCARプライマーを、それらが個体の遺伝子型を正確に反映するかどうかを決定するために、集団94CWN213 3のセクション２について試験したSCARプライマーの試験に使用したプロトコールは、RAPDバンドから開発したSCARプライマーを試験するために使用したものと同じである。これらのプライマーを、プライマーが多重PCR反応においてともに使用され得るように、RAPDバンドから開発したものと類似のアニーリング温度で消化する。全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、詳細に、そして個々にその全体が本明細書中で参考として援用されているかのように同じ程度で、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。本発明は、詳細に、そして好ましい実施態様を特に参照して記載されているが、本発明の特定の実施態様の改変が請求の範囲に規定されているような本発明の精神および範囲から逸脱することなく可能であることが、当業者に明らかである。全てのこのような改変が、本発明の範囲内に含まれることが意図される。

Claims

【特許請求の範囲】１．Brassica育種プログラムにおいてOgura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するための方法であって、以下の工程：・少なくとも１つのプライマーを使用してOgura(rf)回復遺伝子についてBrassic a生殖質を増幅する工程、および・少なくとも２つの核酸マーカーを使用して遺伝子型を決定する工程であって、ここで、一方のマーカーはOGU Rf遺伝子の存在(Rf)を示し、そして他方のマーカーはOGU Rf遺伝子の非存在(rf)を示す工程、を包含する、方法。２．前記マーカーが、SCARマーカー、RAPDマーカー、およびAFLPマーカーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。３．前記OGU Rf遺伝子の非存在(rf)を示すマーカーが、以下：・配列番号１に示されるY5、・その配列に部分的に相同性を有するマーカー、および・そのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択されるSCARマーカーである、請求項１に記載の方法。４．前記OGU Rf遺伝子の存在(Rf)を示すマーカーが、以下：・配列番号２に示されるC2、・配列番号３に示されるN20、・配列番号４に示されるF10、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択されるSCARマーカーである、請求項１に記載の方法。５．前記マーカーがSCARマーカーであり、そして前記OGU Rf遺伝子の存在(Rf)を示すマーカーが配列番号２に示される配列を有するC2、または該C2に部分的な相同性を有するマーカーであり、そして前記OGU Rf遺伝子の非存在(rf)を示すマーカーが配列番号１に示される配列を有するY5、または該Y5に部分的な相同性を有するマーカーである、請求項１に記載の方法。６．前記OGU Rf遺伝子の非存在(rf)を示すマーカーが、以下：・配列番号５に示されるOPY5、・配列番号６に示されるOPG8、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択されるRAPDマーカーである、請求項１に記載の方法。７．前記OGU Rf遺伝子の存在(Rf)を示すマーカーが、以下：・配列番号７に示されるOPC2、・配列番号８に示されるOPN20、・配列番号９に示されるOPH3、・配列番号10に示されるOPF10、・配列番号11に示されるOPH15、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択されるRAPDマーカーである、請求項１に記載の方法。８．前記OGU Rf遺伝子の存在(Rf)を示すマーカーが、以下：・配列番号12に示されるE36XM48AIII、・配列番号13に示されるE35XM62AV、・配列番号14に示されるE33XM47AI、・配列番号15に示されるE38XM60AI、・配列番号16に示されるE32XM50、・配列番号17に示されるE32XM59A、・配列番号18に示されるE32XM59B、・配列番号19に示されるE33XM58、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択されるAFLPマーカーである、請求項１に記載の方法。９．前記増幅工程が、少なくとも１つのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を包含し、そしてPCRのためのプライマーが、プライマーの以下の群から、またはプライマーの以下の群に部分的な相同性を有するプライマーから選択される、請求項１に記載の方法：１０．前記方法が、単回の反応において全ての前記プライマーを使用する多重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を包含する、請求項９に記載の方法。１１．前記遺伝子型を決定する工程が、遺伝子型の検出のためのドットブロットアッセイの使用を包含する、請求項１に記載の方法。１２．前記増幅工程が、多重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてプライマーのセットC2およびY5を組み合わせて使用することを含み、そして前記遺伝子型を決定する工程が、以下：・２つの同一のメンブレン上にPCR反応物をドットする工程、・プローブを用いて該メンブレンをプローブする工程であって、ここで、一方のメンブレンを、Rfの存在を示すマーカーにハイブリダイズするプローブを用いてプローブし、そして第２のメンブレンを、rfの非存在を示すマーカーにハイブリダイズするプローブを用いてプローブする工程、および・Ogura回復について前記Brassica生殖質の遺伝子型を決定するために、該２つのメンブレンを比較する工程、を包含する、請求項１に記載の方法。１３．前記Rfの存在を示すマーカーが約677塩基対であり、そして前記rfの非存在を示すマーカーが約774塩基対である、請求項１２に記載の方法。１４．前記増幅工程が、多重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてプライマーのセットC2およびY5を組み合わせて使用することを包含し、そして前記遺伝子型を決定する工程が、以下：・電気泳動ゲル上でPCR産物を泳動する工程であって、ここで、該反応産物が以下：・RfRfの遺伝子型を示す１本のバンド（約677bp）、・Rfrfの遺伝子型を示す２本のバンド（約677bpおよび約774bp）、および・rfrfの遺伝子型を示す１本のバンド（約774bp）、からなる群由来である工程、ならびに・前記Ogura回復について前記Brassica生殖質の遺伝子型を決定するために該ゲルを読み取る工程、を包含する、請求項１に記載の方法。１５．前記Brassica生殖質が、冬および春Brassica napus、Brassica rapa、およびBrassica junceaからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。１６．Ogura(RfRf)回復遺伝子の存在に関連するホモ接合性遺伝子座であって、該遺伝子座が、以下のマーカー：・配列番号２に示されるC2、・配列番号３に示されるN20、・配列番号４に示されるF10、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、の少なくとも１つにマッピングされる、ホモ接合性遺伝子座。１７．Ogura(RfRf)回復遺伝子の存在に関連するホモ接合性遺伝子座であって、該遺伝子座が、以下のマーカー：・配列番号７に示されるOPC2、・配列番号８に示されるOPN20、・配列番号９に示されるOPH3、・配列番号10に示されるOPH10、・配列番号11に示されるOPH15、・配列番号12に示されるE36XM48AIII、・配列番号13に示されるE35XM62AV、・配列番号14に示されるE33XM47AI、・配列番号15に示されるE38XM60AI、・配列番号16に示されるE32XM50、・配列番号17に示されるE32XM59A、・配列番号18に示されるE32XM59B、・配列番号19に示されるE33XM58、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、の少なくとも１つのマッピングされる、ホモ接合性遺伝子座。１８．Ogura(rfrf)回復遺伝子の非存在に関連するホモ接合性遺伝子座であって、該遺伝子座が、以下のマーカー：・配列番号１に示されるY5、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、の１つにマッピングされる、ホモ接合性遺伝子座。１９．Ogura(rfrf)回復遺伝子の非存在に関連するホモ接合性遺伝子座であって、該遺伝子座が、以下のマーカー：・配列番号５に示されるOPY5、・配列番号６に示されるOPG8、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、の１つにマッピングされる、ホモ接合性遺伝子座。２０．Ogura(Rfrf)回復遺伝子の存在に関連するヘテロ接合性遺伝子座であって、請求項１６または請求項１７に記載のマーカーの１つ、および請求項１８または１９に記載のマーカーの１つにマッピングされる、ヘテロ接合性遺伝子座。２１．Ogura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するためのマーカーの組み合わせであって、ここで、少なくとも１つのマーカーがOgura( Rf)回復遺伝子の存在を示し、そして少なくとも１つのマーカーがOgura(rf)回復遺伝子の非存在を示す、組み合わせ。２２．Ogura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するためのマーカーの組み合わせであって、以下：・配列番号２に示されるC2、・配列番号３に示されるN20、・配列番号４に示されるF10、・それらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択される核酸マーカーの第１のセット、ならびに、以下：・配列番号１に示されるY5、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択される核酸マーカーの第２のセットを含む、マーカーの組み合せ。２３．Ogura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するためのマーカーの組み合わせであって、以下：・配列番号７に示されるOPC2、・配列番号８に示されるOPN20、・配列番号９に示されるOPH3、・配列番号10に示されるOPH10、・配列番号11に示されるOPH15、・配列番号12に示されるE36XM48AIII、・配列番号13に示されるE35XM62AV、・配列番号14に示されるE33XM47AI、・配列番号15に示されるE38XM60AI、・配列番号16に示されるE32XM50、・配列番号17に示されるE32XM59A、・配列番号18に示されるE32XM59B、・配列番号19に示されるE33XM58、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択される核酸マーカーの第１のセット、ならびに以下：・配列番号５に示されるOPY5、・配列番号６に示されるOPG8、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択される核酸マーカーの第２のセットを含む、マーカーの組み合わせ。２４．Brassica生殖質の遺伝子型におけるOgura(Rf)回復遺伝子の存在を決定するためのSCARマーカーであって、以下：・配列番号２に示されるC2、・配列番号３に示されるN20、・配列番号４に示されるF10、・それらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択される核酸マーカーを含む、マーカー。２５．Brassica生殖質の遺伝子型におけるOgura(Rf)回復遺伝子の非存在を決定するためのSCARマーカーであって、以下：・配列番号１に示されるY5、・それらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するRAPDバンドの配列から選択される任意の他のマーカーからなる群から選択される核酸マーカーを含む、マーカー。２６．Brassica生殖質の遺伝子型におけるOgura(Rf)回復遺伝子の存在を決定するためのRAPDマーカーであって、以下：・配列番号８に示されるOPN20、・配列番号９に示されるOPH3、・配列番号10に示されるOPF10、・配列番号11に示されるOPH15、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群から選択される核酸マーカーを含む、マーカー。２７．Brassica生殖質の遺伝子型におけるOgura(Rf)回復遺伝子の存在を決定するためのAFLPマーカーであって、以下：・配列番号12に示されるE36XM48AIII、・配列番号13に示されるE35XM62AV、・配列番号14に示されるE33XM47AI、・配列番号15に示されるE38XM60AI、・配列番号16に示されるE32XM50、・配列番号17に示されるE32XM59A、・配列番号18に示されるE32XM59B、・配列番号19に示されるE33XM58、・これらの配列の１つに部分的な相同性を有するマーカー、および・これらのマーカーが由来するバンドの配列から選択される任意の他のマーカー、からなる群より選択される核酸マーカーを含む、マーカー。２８．Ogura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)における使用のためのプライマーの組み合わせであって、該プライマーが、プライマーの以下の群から、プライマーの以下の群に少なくとも部分的に相同性を有するプライマーから、これらのプライマーが由来する配列にアニーリングするプライマーから、またはRAPDフラグメントもしくは以下のプライマーが由来する増幅されたRAPDフラグメントの任意の部分に由来するプライマーから選択されるプライマーを含む、組み合わせ：２９．請求項２８に記載のプライマーを含む、プライマーキット。３０．Ogura(Rf)回復遺伝子についてBrassica生殖質の遺伝子型を決定するためのシステムであって、以下：・プライマーの以下の群から、プライマーの以下の群に少なくとも部分的に相同性を有するプライマーから、これらのプライマーに相補的なプライマーから、これらのプライマーが由来する配列にアニーリングするプライマーから、またはRAPDフラグメントもしくは以下のプライマーが由来する増幅されたRAPDプラグメントの任意の部分に由来するプライマーから選択されるプライマーを使用して、単回の多重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において遺伝子型を増幅する工程：・核酸マーカーの組み合わせを使用して遺伝子型を決定する工程であって、ここで、該マーカーは、以下：OGU Rf遺伝子の存在(Rf)を示すC2マーカー、または C2マーカーと少なくとも部分的に相同性を有するマーカー、およびOGU Rf遺伝子の非存在(rf)を示すY5マーカー、またはY5マーカーと少なくとも部分的に相同性を有するマーカー、からなる群より選択される工程、を包含する、システム。