KR101268897B1 - 옥수수 이벤트 ｍｉｒ604 - Google Patents

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Abstract

MIR604로 지정된 신규한 유전자전이 옥수수 이벤트가 기재되어 있다. 본 발명은, MIR604 이벤트를 생성시키는, 옥수수 게놈내로 삽입된 재조합 작제물의 DNA 서열 및 당해 삽입 부위 측면의 게놈 서열에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 MIR604의 DNA 서열의 존재를 검출하기 위한 검정법, MIR604의 유전자형을 포함하는 옥수수 식물 및 옥수수 종자, 및 MIR604 유전자형을 포함하는 옥수수 식물을 자가교배하거나 다른 옥수수 변종과 교배함으로써, 옥수수 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

옥수수 이벤트 ＭＩＲ604{Corn Event MIR604}
본 발명은 일반적으로 식물 분자 생물학, 식물 형질전환 및 식물 육종 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 유전자전이 유전자형을 포함하는 곤충 내성 유전자 전이 옥수수 식물 및 시료 내에서 옥수수 식물 DNA의 존재를 검출하는 방법 및 이의 조성물에 관한 것이다.
식물 해충은 전세계 중요한 농작물 손실의 주요 인자이다. 곤충을 포함한 비-포유동물성 해충의 만연으로 인해 미국에서만 연간 약 80억불이 손실되고 있다. 옥수수 뿌리벌레(rootworm) 종은 가장 파괴적인 옥수수 해충으로 간주된다. 중요한 뿌리벌레 해충종으로는 서부 옥수수 뿌리벌레 디아브로티카 버기페라 버기페라 (Diabrotica virgifera virgifera); 북부 옥수수 뿌리벌레 디. 롱기코니스 바베리 (D. longicornis barberi); 남부 옥수수 뿌리벌레 디. 운데심펑타타 호왈디 (D.undecimpunctata howardi), 및 멕시코 옥수수 뿌리벌레 디. 버기페라 제애(D. virgifera zeae)를 포함한다.
옥수수 뿌리벌레는 주로 화학 농약을 집중적으로 적용하여 방제된다. 따라서 옥수수 뿌리벌레의 우수한 방제가 이루어질 수 있으나, 이같은 화학물질은 때로는 이로운 유기체에도 영향을 끼칠 수 있다. 화학 농약의 광범위한 사용으로 부터 초래되는 또 다른 문제점은 내성 곤충 변이주의 출현이다. 이는 다양한 내성 관리 실행에 의해 부분적으로 완화되어 왔으나, 대안적인 해충 방제 전략에 대한 요구가 증가되고 있다. 이러한 대안중 하나는, 유전자전이 식물 내에서 살충성(insecticidal) 단백질을 암호화하는 외래 유전자의 발현을 포함한다. 이러한 접근법은 선택된 해충에 대한 식물 보호에 있어 효과적인 수단을 제공하였으며, 살충성 독소를 발현하는 유전자전이 식물이 시판되어, 농부들의 화학적 살충제 적용을 감소시켰다.
식물내에서 외래 유전자의 발현은, 아마도 염색질 구조 또는 통합 부위에 근접한 전사 조절 요소의 접근성으로 인해, 이들의 염색체 위치에 의해 영향받을 수 있다[참조: Weising et al., 1988, "Foreign Genes in Plants", Ann.Rev.Genet.22:421-477]. 따라서, 수백개의 상이한 이벤트(event)를 생산하고, 상업적 목적을 위해 바람직한 전이유전자 발현 수준과 패턴을 나타내는 단일 이벤트에 대해 이들 이벤트들을 선별하는 것이 보편적이다. 전이유전자 발현의 바람직한 수준 또는 패턴을 갖는 이벤트는, 통상의 육종 방법을 사용하여 유성적 이종교배에 의해 전이유전자를 다른 유전적 배경으로 도입(introgressing)하는데 유용하다. 이러한 교배의 자손은 원 형질전환체의 전이유전자 발현 특성을 유지한다. 이러한 전략은 국부적인 생장 조건에 잘 적응된 다수의 변이주에서 신뢰할 만한 유전자 발현을 보장하는데 사용된다.
유성 교배의 자손이 관심대상인 전이유전자를 갖는지의 여부를 결정하기 위해 특정한 이벤트의 존재를 검출할 수 있는 것이 유리할 것이다. 또한, 특정 이벤트를 검출하는 방법은, 예를 들면 재조합 농작물로 부터 유래되는 식품의 표시 및 사전 품목 허가를 요구하는 규정을 충족하는데 도움이 될 것이다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머, 또는 핵산 프로브를 사용하는 DNA 하이브리드화를 이용한 열 증폭반응 (폴리머라제 연쇄 반응: PCR)을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 널리 공지된 핵산 검출 방법에 의해 전이유전자의 존재를 검출할 수 있다. 일반적으로, 다양한 식물 변종을 형질전환시키는데 사용되어 온 특정 DNA 작제물을 검출하는데 사용되는 시약 및 방법론을 단순화하고 균일화하기 위해, 이들 검출 방법은 일반적으로 빈번히 사용된 유전적 요소들, 예를 들면, 프로모터, 터미네이터 및 마커 유전자에 집중하고 있는데, 그 이유는 많은 DNA 작제물에 있어서 암호화 서열 영역이 상호교환적이기 때문이다. 그 결과, 이러한 방법은 암호화 서열에 대해서만 상이한 작제물들 간을 구분하는데는 유용하지 못할 수 있다. 또한, 이들 방법은, 삽입된 이종성 DNA에 인접한 염색체 DNA('플랭킹 DNA')의 서열이 공지되어 있지 않는 한, 상이한 이벤트들, 특히 동일한 DNA 작제물을 사용하여 생산된 것들 간을 구분하는데 유용하지 않을 수 있다.
본 발명은, 본원중 참조로서 인용된 국제 공개 공보 WO 03/018810 (2003.3.6 공개)에 기재되어 있으며, Cry3A055 살충성 독소를 암호화하는 cry3A055 유전자를 게놈 내에 혼입한, 디아브로티카 종 (Diabrotica spp .) 해충 방제에 유용한 곤충 내성 유전자전이 옥수수 이벤트를 포함한다. 당해 유전자전이 옥수수 이벤트는 또한 그의 게놈내에, 포스포만노스 이소머라제 효소(PMI)를 암호화하는 pmi 유전자를 혼입하였고, 이는 본원 중 참조문헌으로 언급된 미국 특허 제5,767,378호에 기재되어 있으며, 이 유전자는 선별성 마커로서 유용하고 당해 식물이 탄소원으로서 만노스를 이용하도록 한다. 본 발명은 추가로, 당해 유전자전이 옥수수 이벤트를 동정하고 생물학적 시료내에서 당해 유전자전이 옥수수 이벤트로 부터의 핵산을 검출하는데 유용한, 당해 유전자전이 옥수수 이벤트 특유의 신규한 분리된 핵산 서열, 및 생물학적 시료 내에서 이들 핵산 검출에 사용하는데 필요한 시약을 포함하는 키트를 포함한다.
발명의 요약
본 발명은 MIR604 옥수수 이벤트에게 곤충 내성과 탄소원으로서의 만노스 이용능을 각각 부여하는 cry3A055 유전자 및 pmi 유전자를 포함하는 신규한 유전자전이 유전자형을 포함하는, MIR604로 명명되는 유전자전이 옥수수 이벤트 및 이의 자손에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 발명의 유전자형을 포함하는 유전자전이 옥수수 식물, 당해 발명의 유전자형을 포함하는 유전자 전이 옥수수 식물로 부터의 종자, 및 본 발명의 유전자형을 포함하는 옥수수 근교계(inbred)를 그 자체와 또는 상이한 유전자형의 또 다른 옥수수주와 교배함으로써 본 발명의 유전자형을 포함하는 유전자전이 옥수수 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 유전자전이 옥수수 식물은 당해 발명의 신규한 유전자형에 의해 옥수수 식물에게 부여된 특징들 이외에 상응하는 동질유전자(isogenic) 비-유전자전이 옥수수 식물의 본질적으로 모든 형태학적 및 생리학적 특징을 가질 수 있다. 본 발명은 또한, 옥수수 게놈내로 삽입되어 당해 MIR604 이벤트를 초래하게 하는 재조합 발현 카세트의 DNA 서열 및 당해 삽입부위를 플랭킹하는 게놈 서열의 DNA 서열을 기본으로 하여 MIR604 이벤트로 부터 핵산의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. MIR604 이벤트는 Cry3A055의 발현 수준 및 PMI 단백질을 분석하고 또한 옥수수 뿌리벌레에 대한 효능을 시험함으로써, 추가로 특징분석될 수 있다.
하나의 실시양태에 따라, 본 발명은 옥수수 이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈내로 삽입된 이종성 DNA 서열의 적어도 10개의 연속 뉴클레오타이드와 옥수수 이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈내로 삽입된 이종성 DNA 서열의 삽입 지점을 플랭킹하는 옥수수 식물 게놈 DNA의 적어도 10개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 이같은 양태에 따른 분리된 핵산 분자는 옥수수 이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈내로 삽입된 이종성 DNA 서열의 적어도 20개 또는 적어도 50개의 연속 뉴클레오타이드와 옥수수 이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈내로 삽입된 이종성 DNA 서열의 삽입 지점을 플랭킹하는 옥수수 식물 게놈 DNA의 적어도 20개또는 적어도 50개의 연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹중에서 선택되는 이벤트 MIR604의 적어도 하나의 접합(junction) 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자 및 이의 상보체를 제공한다. 접합 서열은 옥수수 게놈내로 삽입된 발현 카세트를 포함하는 이종성 DNA와 당해 삽입 부위를 플랭킹하는 옥수수 게놈으로 부터의 DNA 사이의 접합부에 걸쳐 연장되어 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 이종성 DNA 분자를 서열번호 1, 서열번호 2 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약 11개 내지 약 20개의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 옥수수 이벤트 MIR604 내의 옥수수 식물 게놈 내로 연결시키는 분리된 핵산을 제공한다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 앰플리콘이 제공된다.
본 발명의 여전히 또 다른 실시양태에 따르면, 이벤트 MIR604를 검출하기 위한 플랭킹 서열 프라이머가 제공된다. 이러한 플랭킹 서열 프라이머는, 서열번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 1번 내지 801번으로 부터의 적어도 10 내지 15개의 연속 뉴클레오타이드 또는 이의 상보체를 포함하는 분리된 핵산 서열(본원에서는 임의로 5' 플랭킹 서열로서 지칭됨)을 포함한다. 이러한 국면의 한가지 실시양태에서, 플랭킹 서열 프라이머는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 국면에서, 플랭킹 서열 프라이머는 서열번호 4에 제시된 뉴클레오타이드 507번 내지 1570번으로 부터의 적어도 10 내지 15개의 연속 뉴클레오타이드 또는 이의 상보체를 포함하는 분리된 핵산 서열(본원에서는 임의로 3' 플랭킹 서열로서 지칭됨)을 포함한다. 이러한 국면의 한가지 실시양태에서, 플랭킹 서열 프라이머는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 예를 들면 핵산 증폭에 유용한 프라이머쌍이 제공된다. 이러한 프라이머쌍은 상기 기재된 게놈성 플랭킹 서열중 하나 (서열번호 3 또는 서열번호 4)이거나 이에 상보적인 적어도 10 내지 15개 연속 뉴클레오타이드 길이의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머 및 이벤트 MIR604 게놈내로 삽입되는 이종성 DNA의 적어도 10 내지 15개의 연속 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 제2 프라이머는 바람직하게 서열번호 3에 제시된 식물 게놈성 플랭킹 DNA 서열의 위치 802번 내지 1310번의 뉴클레오타이드 및 서열번호 4에 있어서 뉴클레오타이드 위치 1번 내지 506번에 인접한 삽입 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 생물학적 시료내에서 이벤트 MIR604에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은, (a) DNA를 포함하는 시료를, 옥수수 이벤트 MIR604로 부터의 게놈성 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용하는 경우 옥수수 이벤트 MIR604에 대해 특징적인(diagnostic) 앰플리콘을 생산하는 한쌍의 프라이머와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 당해 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 국면의 한가지 양태에 있어서, 앰플리콘은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열 및 이의 상보체를 포함한다.
또 다른 양태에 따라, 본 발명은 생물학적 시료 내에서 MIR604 이벤트에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) DNA를 포함하는 시료를, 옥수수 이벤트 MIR604로 부터의 게놈성 DNA와 높은 엄중 조건하에서 하이브리드화하지만 대조군 옥수수의 DNA와는 높은 엄중 조건하에 하이브리드화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 당해 시료 및 프로브를 높은 엄중 하이브리드화 조건에 적용시키는 단계; 및 (c) DNA에 대한 당해 프로브의 하이브리드화를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 생물학적 시료내에서 이벤트 MIR604 핵산의 검출을 위한 키트가 제공된다. 키트는, 충분한 길이의, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하며, 이때 당해 DNA 서열은 이벤트 MIR604로 부터의 분리된 DNA에 하이브리드화하고, 또한 시료내에서 핵산 서열의 증폭 또는 당해 핵산서열로의 하이브리드화에 이은 앰플리콘의 검출 또는 표적 서열에 대한 하이브리드화시, 시료내의 이벤트 MIR604로 부터의 핵산 서열의 존재에 대해 특징적(diagnostic)인 프라이머 또는 프로브로서 유용하다. 당해 키트는 추가로 핵산 하이브리드화 또는 증폭 방법을 가능하게 하는데 필요한 다른 물질을 포함한다.
또 다른 국면에 있어, 본 발명은, (a) 옥수수 이벤트 MIR604 조직의 시료로 부터 단백질을 추출하는 단계; (b) MIR604 이벤트에 의해 생산된 살충성 또는 선별성 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함하는 면역학적 방법을 사용하여 추출된 단백질을 검정하는 단계; 및 (c) 당해 항체가 살충성 또는 선별성 마커 단백질로 결합하는 것을 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료 내에서 옥수수 이벤트 MIR604 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 국면에 있어, 본 발명은 이벤트 MIR604 옥수수 식물, 조직 또는 종자로 부터 유도된 생물학적 시료를 제공하며, 이때 당해 시료는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 당해 서열은 핵산 증폭 또는 핵산 하이브리드화 방법을 사용하여 시료중에서 검출가능하다. 이러한 국면의 한가지 실시양태에 있어, 시료는 옥수수 가루, 옥수수 분, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 전분, 및 옥수수 부산물을 함유하도록 전체적 또는 부분적으로 가공된 씨리얼로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
또 다른 양태에 있어, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이벤트 MIR604 옥수수 식물, 조직 또는 종자로 부터 유도된 추출물을 제공한다. 이러한 국면의 한가지 양태에서, 당해 서열은 핵산 증폭 또는 핵산 하이브리드화 방법을 사용하여 추출물 중에서 검출가능하다. 이러한 국면의 또 다른 실시양태에서, 당해 시료는 옥수수 가루, 옥수수 분, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 전분, 및 옥수수 부산물을 함유하도록 전체적 또는 부분적으로 가공된 씨리얼로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 옥수수 식물 및 종자가 제공된다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은, (a) 제1 친주 옥수수 식물을 제2 친주 옥수수 식물(이때 제1 또는 제2 친주 옥수수 식물은 옥수수 이벤트 MIR604의 DNA를 포함한다)과 유성교배시켜 다수의 제1 세대 자손 식물을 생성시키는 단계; (b) 적어도 옥수수 뿌리벌레 감염에 대해 내성인 제1 세대 자손 식물을 선별하는 단계; (c) 당해 제1 세대 자손 식물을 자가교배하여 다수의 제 2 세대 자손 식물을 생성시키는 단계; (d) 당해 제2 세대 자손 식물로 부터 옥수수 뿌리벌레 감염에 대해 적어도 내성인 식물을 선별하는 단계(이때, 제2 세대 자손 식물은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다)를 포함하여, 적어도 옥수수 뿌리벌레 감염에 대해 내성인 옥수수 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 제1 친주 옥수수 식물을 제2 친주 옥수수 식물과 교배하는 단계 및 수득된 제1 세대 옥수수 종자를 수거함을 포함하고, 이때 제1 및 제2 친주 옥수수 식물이 본 발명에 따른 근교계 옥수수 식물인, 옥수수 종자를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은, (a) 본 발명에 따른 제1 근교계 옥수수주의 종자 및 상이한 유전자형을 갖는 제2 근교계 옥수수주의 종자를 이식하는 단계; (b) 이같은 이식으로 부터 생긴 옥수수 식물을 개화시까지 경작하는 단계; (c) 옥수수 근교계주 중 하나의 옥수수 식물의 꽃을 탈웅시키는 단계; (d) 다른 근교계주로 수분시키는 단계; 및 (e) 이로써 생산된 하이브리드 종자를 수거하는 단계를 포함하여, 하이브리드 옥수수 종자를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 국면은 하기 상세한 설명으로 부터 보다 명백해질 것이다.
서열 목록의 서열의 기술
서열번호 1은 5' 게놈-삽입부 접합부이다.
서열번호 2는 3' 삽입부-게놈 접합부이다.
서열번호 3은 5' 게놈 + 삽입부 서열이다.
서열번호 4는 3' 삽입부 + 게놈 서열이다.
서열번호 5는 삽입부에 대한 5' 플랭킹 옥수수 게놈 서열이다.
서열번호 6은 삽입부에 대한 3' 플랭킹 옥수수 게놈 서열이다.
서열번호 7 내지 15는 본 발명에 유용한 5' 플랭킹 서열 프라이머이다.
서열번호 16 내지 20은 본 발명에 유용한 MTL 프로모터 서열 프라이머이다.
서열번호 21 내지 28은 본 발명에 유용한 cry3A055 서열 프라이머이다.
서열번호 29 및 30은 본 발명에 유용한 ZmUbiInt 서열 프라이머이다.
서열번호 31 내지 37은 본 발명에 유용한 pmi 서열 프라이머이다.
서열번호 38은 본 발명에 유용한 NOS 서열 프라이머이다.
서열번호 39 내지 46은 본 발명에 유용한 3' 플랭킹 서열 프라이머이다.
서열번호 47 내지 49는 cry3A055 TAQMAN 프라이머 및 프로브이다.
서열번호 50 내지 52는 pmiTAQMAN 프라이머 및 프로브이다.
서열번호 53 내지 55는 ZmADH TAQMAN 프라이머 및 프로브이다.
서열번호 56은 본 발명에 유용한 MIR604 프로브이다.
서열번호 57은 우측 경계 영역에 대한 서열이다.
서열번호 58은 MTL 프로모터의 서열이다.
서열번호 59는 cry3A055 유전자의 서열이다.
서열번호 60은 NOS 터미네이터의 서열이다.
서열번호 61은 ZmUbInt 프로모터의 서열이다.
서열번호 62는 pmi 유전자의 서열이다.
서열번호 63은 좌측 경계 영역의 서열이다.
정의
하기 정의 및 방법은 본 발명을 보다 잘 설명하고 당업계의 숙련인이 본 발명을 보다 더 잘 수행하기 위한 지침으로 제공된다. 달리 명시하지 않는 한, 본원 중 사용된 용어는 당업계의 숙련인의 통상적인 용도에 따라 이해되는 것으로 의도된다. 분자생물학의 통상적 용어의 정의는 또한 다음을 참조한다 [Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1994].
본원 중 사용된 용어 "증폭된"이란 핵산 분자의 다중 복사체 또는 핵산 분자에 대해 상보적인 다중 복사체를, 주형으로서 하나 이상의 핵산 분자를 사용하여 작제하는 것을 의미한다. 증폭 시스템은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 시스템, 리가제 연쇄 반응 (LCR) 시스템, 핵산 서열 기반의 증폭 (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), Q-베타 레플리카제 시스템, 전사-기반의 증폭 시스템 (TAS), 및 쇄 치환 증폭 (SDA)를 포함한다. 참조: Diagnostic MolecularMicrobiology: Principles and Applications, D. H. Persing et al. , Ed. , American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1993). 증폭 산물은 앰플리콘으로 명명한다.
"암호화 서열"은 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA와 같은 RNA로 전사되는 핵산 서열이다. 바람직하게 RNA는 이후 유기체 내에서 해독되어 단백질을 생성한다.
본원 중 사용된 용어 "검출 키트"는, 높은 엄중 조건하에 표적 DNA 서열에 하이브리드화하는 본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머, 및 핵산 하이브리드화 또는 증폭 반응을 가능하게 하는데 필요한 다른 물질들을 포함하며, 시료내에서 MIR604 식물로 부터의 DNA의 유무를 검출하는데 사용되는 키트를 의미한다.
본원중 사용된 용어 유전자전이 "이벤트(event)"란, 단일 식물 세포를 이종성 DNA, 예를 들면 관심대상의 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키고 재생시켜 생산된 재조합 식물을 언급한다. 용어 "이벤트"란 원 형질전환체 및/또는 이종성 DNA를 포함한 형질전환체의 자손을 언급한다. 용어 "이벤트"란 또한 형질전환체와 다른 옥수수주 사이의 유성 이종교배에 의해 생성되는 자손도 언급한다. 재발성 친주로의 반복된 역교배 후에도, 삽입된 DNA 및 형질전환된 친주로 부터의 플랭킹 DNA는 당해 교배의 자손에서도 동일한 염색체 위치에 존재한다. 정상적으로, 식물 조직의 형질전환은 다수의 이벤트들을 생성하게 되고, 이들 각각은 식물 세포의 게놈 내 상이한 위치 내로 DNA 작제물이 삽입된다. 전이유전자 또는 다른 목적하는 특징의 발현을 근거로 하여, 특정 이벤트가 선별된다. 따라서, 본원중 사용된 "이벤트 MIR604", "MIR604" 또는 "MIR604 이벤트"는 원형 MIR604 형질전환체 및/또는 MIR604 형질전환체의 자손을 의미한다.
본원중 사용된 용어 "발현 카세트"는 적절한 숙주 세포내에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로, 전사 시그날에 작동적으로 연결된 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 이는 또한 전형적으로 뉴클레오타이드 서열의 적절한 해독에 필요한 서열을 포함한다. 발현 카세트는 또한 목적하는 뉴클레오타이드 서열의 직접적인 발현에 필요하지는 않지만 발현 벡터로 부터 당해 카세트의 제거에 있어 편리한 제한 부위로 기인하는 서열을 포함한다. 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있는데, 이는 이의 성분중 적어도 하나가 이의 나머지 성분중 적어도 하나에 대하여 이종성임을 의미한다. 발현 카세트는 또한 천연발생성이나 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득되기도 한다. 일반적으로, 하지만, 발현 카세트는 숙주에 대해 이종성으로, 즉, 발현 카세트의 특정 핵산 서열은 숙주 세포내에서 천연으로 발생하지 않고, 당해 분야에 공지된 형질전환 방법에 의해 숙주 세포내로 또는 숙주 세포의 조상으로 도입되어야 한다. 발현 카세트내 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성성 프로모터의 조절하에 또는 숙주 세포가 몇몇 특정의 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성 프로모터의 조절하에 놓일 수 있다. 식물과 같은 다세포 유기체의 경우, 프로모터는 또한 특정의 조직, 기관, 또는 발생 단계에 특이적일 수 있다. 발현 카세트 또는 이의 단편은 식물내로 형질전환되는 경우 "삽입된 서열" 또는 "삽입 서열"로서 언급될 수 있다.
"유전자"는 게놈 내에 위치하고, 상술한 암호화 핵산 서열 이외에, 암호화 영역의 발현 조절, 즉 전사 및 해독에 기여하는 다른, 주로 조절성인 핵산 서열을 포함한다. 유전자는 또한 다른 5' 및 3' 비해독 서열 및 종결 서열을 포함할 수 있다. 존재할 수 있는 추가의 구성요소는, 예를 들면 인트론이다.
"관심 대상의 유전자"란 식물내로 전달되는 경우, 식물에게 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성, 또는 기타 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 향상된 영양가, 산업 공정에서의 개선된 수행능 및 변경된 번식능과 같은 바람직한 특질을 부여하는 임의의 유전자를 언급한다. "관심 대상의 유전자"란 또한 식물내에서 상업상 유용한 효소 또는 대사물의 생산을 위해 식물에게 전달되는 유전자일 수 있다.
본원 중 사용된 "유전자형"은 친주 옥수수 식물로 부터 유전되는 유전자 물질이나, 그 모든 것이 반드시 후손 옥수수 식물내에서 발현될 필요는 없다. MIR604 유전자형은 식물의 게놈내로 형질전환된 이종성 유전자 물질 뿐만 아니라 삽입된 서열을 플랭킹하는 유전자 물질도 언급한다.
"이종성" 핵산 서열은, 당해 서열이 도입되는 숙주 세포에 천연으로 연결되지 않은 핵산 서열로서, 천연 발생 핵산 서열의 비-천연 발생 다중 복사체도 포함된다.
"동종성" 핵산 서열은, 당해 서열이 도입되는 숙주 세포에 천연적으로 연결된 핵산 서열이다.
"작동적으로 연결된"이란 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열들이 결합되어 하나의 기능이 나머지 것들의 기능에 영향을 주는 것을 언급한다. 예를 들면, 프로모터는 암호화 서열 또는 작용성 RNA의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우 암호화 서열 또는 작용성 RNA(즉, 이들 암호화 서열 또는 작용성 RNA는 프로모터의 전사적 조절하에 놓인다)와 작동적으로 연결된다. 센스 또는 안티센스 배향의 암호화 서열은 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프라이머"는, 프라이머와 표적 DNA 쇄 사이에 하이브리드를 형성하고 이후 DNA 폴리머라제와 같은 폴리머라제에 의해 표적 DNA 쇄를 따라 연장되는, 핵산 하이브리드화에 의해 상보성 표적 DNA 쇄에 어닐링되는 분리된 핵산이다. 프라이머쌍 또는 세트는, 예를 들면 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 통상적인 핵산 증폭 방법에 의해 핵산 분자의 증폭에 사용될 수 있다.
"프로브"는 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소와 같은 검출가능한 라벨 또는 리포터 분자에 부착되는 분리된 핵산이다. 이같은 프로브는 표적 핵산의 쇄, 본 발명의 경우에서는, 옥수수 이벤트 MIR604로 부터의 게놈성 DNA의 쇄에 상보적이다. MIR604의 게놈성 DNA는 옥수수 식물 또는 당해 이벤트로 부터의 DNA를 포함하는 시료로 부터 유래되는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하여 당해 표적 DNA 서열의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 기타 프로브 물질 및 폴리아미드를 포함한다.
프라이머 및 프로브는 일반적으로 길이가 10 내지 15개 뉴클레오타이드 또는 그 이상이고, 프라이머 및 프로브는 또한 적어도 20개 길이의 뉴클레오타이드, 또는 적어도 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이, 또는 적어도 30개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 이러한 프라이머 및 프로브는 높은 엄중 하이브리드화 조건하에 표적 서열과 특이적으로 하이브리드화한다. 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 표적 서열과 완전히 상보적인 서열을 가질 수 있으나, 표적 서열과 상이하고 표적 서열과 하이브리드화하는 능력을 보유하는 프로브를 통상의 방법에 의해 디자인할 수 있다.
"엄중 조건" 또는 "엄중 하이브리드화 조건"은, 프로브가 이의 표적 서열과 다른 서열 보다 더 검출가능하게 큰 정도로 하이브리드화하는 조건을 의미한다. 엄중 조건은 표적-서열-의존성이고, 폴리뉴클레오타이드의 구조에 따라 다양할 것이다. 하이브리드화 및/또는 세척 조건의 엄중성을 조절함으로써, 프로브에 대해 100% 상보성인 표적 서열이 동정될 수 있다 (동종성 프로빙). 다른 방편으로, 보다 낮은 유사성도 검출될 수 있도록 서열내에 미스매칭을 허용하도록 엄중 조건이 조절될 수도 있다 (이종성 프로빙). 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화 한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 지침은 문헌[참고: Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier: New York; and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1995), and also Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5th Ed. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참고한다.
특이성은 일반적으로 하이브리드화 후 세척의 함수로서, 최종 세척 용액의 이온 농도 및 온도인 결정 인자이다. 일반적으로, 높은 엄중 하이브리드화 및 세척 조건은 정의된 이온 농도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮게 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 매치된 프로브에 하이브리드화하는 온도이다(정의된 이온 농도 및 pH 하에서). 일반적으로, 높은 엄중 조건하에서, 프로브는 이의 표적 서열과 하이브리드화 할 것이나 다른 서열과는 그러지 아니한다.
서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개 이상의 상보성 잔기를 갖는 상보성 핵산의 하이브리드화를 위한 높은 엄중 하이브리드화 조건의 예는 42 ℃에서 1mg 헤파린과 함께 50% 포름아미드로 밤새 하이브리드가 수행되는 것이다. 매우 엄중한 세척 조건의 예는 72℃에서 0.15M NaCl, 15분이다. 높은 엄중 세척 조건의 예는 65℃에서 15분간 0.2 X SSC 이다 (참조: Sambrook, 상기참조, SSC 완중액에 대한 기재).
본 발명에서 예시적인 하이브리드화 조건은, 7% SDS, 0.25 M NaP04 pH 7.2 67℃에서 밤새 하이브리드화한 이후, 5% SDS, 0.20 M NaP04 pH7.2, 65℃에서 30분간 각각 2회 세척, 및 1 % SDS, 0.20 M NaP04 pH7.2, 65℃ 에서 30 분간 각각 2회 세척하는 것이다. 예를 들면 100개 이상의 뉴클레오타이드의 이본체를 위한 예시적 중간 엄중성 세척은 1 x SSC, 45℃, 15 분이다. 예를 들면 100개 이상의 뉴클레오타이드의 이본체에 대한 예시적인 낮은 엄중성 세척은 4-6 X SSC, 40℃, 15분이다.
약 10 내지 50개 뉴클레오타이드의 프로브에 있어, 높은 엄중성 조건은 일반적으로 약 1.0 M 이하의 Na 이온의 염 농도, 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도와 관련되고, 온도는 전형적으로 약 30℃ 이상이다. 높은 엄중성 조건은 또한 포름아미드 같은 탈안정성 제제의 부가로 성취될 수 있다. 일반적으로, 특정 하이브리드화 검정에서 비관련 프로브에 대해 관측되는 것보다 시그날 대 노이즈 비 2x (또는 그 이상)는 특이적 하이브리드화의 검출을 나타낸다. 높은 엄중 조건하에 서로에 대해 하이브리드화하지 않는 핵산들은, 이들이 암호화하는 단백질들이 실질적으로 동일하다면 실질적으로 동일한 것들이다. 이는, 예를 들면, 핵산의 복사체가 유전자 코드에 의해 허용되는 최대의 코돈 축퇴성을 사용하여 만들어지는 경우에 발생한다.
다음은 본 발명의 참조 뉴클레오타이드에 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는데 사용될 수 있는 하이브리드화/세척 조건의 예시적 세트이다: 참조 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 0.5 M NaP04,1 mM EDTA, 50℃에서 2 X SSC, 0.1% SDS, 50℃에서 세척, 보다 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 0.5 M NaP04,1 mM EDTA, 50℃에서 1 X SSC, 0.1% SDS, 50℃에서 세척, 보다 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 0.5 M NaP04,1 mM EDTA, 50℃에서 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 50℃에서 세척, 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 0.5 M NaP04,1 mM EDTA, 50℃에서 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 50℃에서 세척, 보다 바람직하게는 7% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA, 50℃에서 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65℃에서 세척하는 조건하에 참조 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화한다. 본 발명의 서열은 모든 상기 조건을 사용하여 검출될 수 있다. 본 발명을 정의하기 위한 목적상 높은 엄중성 조건이 사용된다.
"형질전환"은 이종성 핵산을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하기 위한 방법이다. 특히, "형질전환"은 관심 대상의 유기체의 게놈 내로 DNA 분자를 안정적으로 혼입시킴을 의미한다.
"형질전환된/유전자전이된/재조합체"란, 이종성 핵산 분자가 도입되는 세균 또는 식물과 같은 숙주 유기체를 언급한다. 핵산 분자는 숙주의 게놈 내로 안정적으로 혼입될 수 있거나 핵산 분자는 또한 염색체외 분자로서 존재할 수 있다. 이러한 염색체외 분자는 자가-복제성일 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 식물은 형질전환 공정의 최종 산물 뿐 아니라, 이의 유전자전이된 자손까지 포괄하는 것으로 이해된다. "비-형질전환된", "비-유전자전이된", 또는 "비-재조합" 숙주는 야생형 유기체, 예를 들면, 이종성 핵산 분자를 함유하지 않는 세균 또는 식물을 언급한다. 본원중 사용된 "유전자전이체"란, 널리 공지된 유전자 조작 및 유전자 삽입 기술을 통해, 관심대상의 유전자를 나타내는 핵산의 서열이 식물 게놈내로, 전형적으로는 식물 핵의 염색체 내로, 마이토콘드리아 또는 염색체를 함유하는 기타 소기관내로, 천연 식물 또는 식물 세포에 정상적으로 존재하는 것 보다 많은 복사체 수로 상이한 유전자 좌에서 혼입된 식물, 식물 세포, 또는 구조화되거나 비구조화된 다수의 식물 세포를 언급한다. 유전자전이 식물은, 이러한 핵산 서열이 조작되고 삽입되어 생성되는 것으로, 천연 발생 돌연변이와는 달리, 비-천연 발생 식물 또는 비-천연 발생 유전자형을 갖는 식물을 생성한다. 식물 및 식물 세포의 형질전환을 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며 예를 들면 전기천공, 미세주입, 아그로박테리움-매개된 형질전환 및 탄두 형질전환법을 포함할 수 있다.
37 C.F.R. §1.822에 설명된 DNA 염기 및 아미노산에 대한 명명법이 본원 중에 사용된다.
상세한 설명
본 발명은, 곤충 방제 단백질, Cry3A055, 및 식물이 탄소원으로서 만노스를 이용하도록 허용하는 포스포만노스 이소머라제 효소 (PMI)를 생산하는 유전학적으로 개량된 옥수수주에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 신규한 유전자형을 포함하는 MIR604로 지정된 유전자전이 옥수수 이벤트, 및 생물학적 시료 내에서 당해 이벤트로 부터의 핵산을 검출하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 MIR604 유전자형을 포함하는 옥수수 식물, 당해 옥수수 식물로 부터의 유전자전이된 종자, 및 MIR604 유전자형을 포함하는 옥수수 근교계를 자체적으로 또는 다른 옥수수주와 교배함으로써 MIR604 유전자형을 포함하는 옥수수 식물을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 MIR604 유전자형을 포함하는 옥수수 식물은, 서부 옥수수 뿌리벌레 디아브로티카 버기페라 버기페라 (Diabrotica virgifera virgifera); 멕시코 옥수수 뿌리벌레 디. 버기페라 제애(D. virgifera zeae), 북부 옥수수 뿌리벌레 디.롱기코니스 바베리 (D. longicornis barberi)를 포함한 딱정벌레목 해충을 방제하는데 유용하다. 본 발명의 MIR604 유전자형을 포함하는 옥수수 식물은 또한 탄소원으로서 만노스를 이용할 수 있다.
한가지 실시양태에 있어, 본 발명은, 옥수수 이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈내로 삽입된 이종성 DNA 서열의 적어도 10개 또는 그 이상 (예를 들면 15, 20, 25 또는 50개)의 연속 뉴클레오타이드 및 옥수수 이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈내로 삽입된 이종성 DNA 서열의 삽입 지점을 플랭킹하는 옥수수 식물 게놈 DNA의 적어도 10개 또는 그 이상 (예를 들면 15, 20, 25 또는 50개)의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 또한, 이벤트 MIR604로 부터의 연속 삽입 서열의 10개 이상의 뉴클레오타이드와 삽입 서열에 인접한 MIR604 이벤트로 부터의 플랭킹 DNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 이벤트 MIR604에 대해 특징적(diagnostic)이다. MIR604 이벤트로 부터의 게놈성 DNA의 핵산 증폭은 이러한 특징적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 앰플리콘을 생성한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 이벤트 MIR604의 적어도 하나의 접합 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 바, 여기서 접합 서열은 옥수수 게놈내로 삽입된 이종성 발현 카세트와 당해 삽입 부위를 플랭킹하는 옥수수 게놈으로 부터의 DNA 사이의 접합부에 걸쳐 연장되어 있으며, 당해 이벤트에 대해 특징적이다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 이종성 DNA 분자를, 서열번호 1, 서열번호 2 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약 11개 내지 약 20개의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 옥수수 이벤트 MIR604 내의 옥수수 식물 게놈 내로 연결한 분리된 핵산을 포함한다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 앰플리콘이 포함된다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 이벤트 MIR604를 검출하기 위한 플랭킹 서열 프라이머를 포함한다. 이러한 플랭킹 서열 프라이머는, 서열번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 1번 내지 801번으로 부터의 적어도 10 내지 15개의 연속 뉴클레오타이드 또는 이의 상보체를 포함하는 분리된 핵산 서열(본원에서는 임의로 5' 플랭킹 서열로서 지칭됨)을 포함한다. 이러한 국면의 한가지 실시양태에서, 플랭킹 서열 프라이머는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 서열번호 4에 제시된 뉴클레오타이드 507번 내지 1570번으로 부터의 적어도 10 내지 15개의 연속 뉴클레오타이드 또는 이의 상보체를 포함하는 플랭킹 서열 프라이머(본원에서는 임의로 3' 플랭킹 서열로서 지칭됨)를 포함한다. 이러한 국면의 한가지 실시양태에서, 플랭킹 서열 프라이머는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
또 다른 양태에 있어, 본 발명은 옥수수 이벤트 MIR604에 대해 특징적인 앰플리콘을 생산하기 위해 시료내에 옥수수 이벤트 MIR604 DNA 주형의 존재하에 함께 기능하는 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 프라이머쌍을 포함하는데, 이때 제1 프라이머 서열은 옥수수 이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈 내로 삽입되는 이종성 DNA 서열의 삽입 지점을 플랭킹하는 옥수수 식물 게놈의 서열이거나 이에 상보적이며, 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머 서열은 옥수수 이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈 내로 삽입되는 이종성 DNA 서열이거나 이에 상보적이다.
이러한 양태의 한가지 국면에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 3의 위치 1-801로 부터 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오타이드 또는 이의 상보체를 포함한다. 이러한 실시양태의 추가의 국면에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함한다. 이러한 양태의 한가지 국면에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 4의 위치 507번-1570번으로 부터 적어도 10개의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체 서열을 포함한다. 이러한 양태의 또 다른 국면에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 또는 서열번호 46에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체 서열을 포함한다. 이러한 양태의 또 다른 국면에서, 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62 또는 서열번호 63의 적어도 10개의 연속 뉴클레오타이드 또는 이의 상보체를 포함한다. 이러한 양태의 추가의 국면에 있어서, 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 16 내지 서열번호 38에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체 서열을 포함한다.
이러한 양태의 또 다른 국면에서, 서열번호 15에 기재된 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 28에 기재된 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 시료 내에서 옥수수 이벤트 MIR604 DNA 주형의 존재하에 함께 기능하여 옥수수 이벤트 MIR604에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성한다. 이러한 실시양태의 또 다른 국면에서, 서열번호 45에 기재된 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 27에 기재된 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 시료 내에서 옥수수 이벤트 MIR604 DNA 주형의 존재하에 함께 기능하여 옥수수 이벤트 MIR604에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성한다.
물론, 당업계의 기술 내에서, MIR604 이벤트에 대해 특징적인 서열을 증폭하기 위한 프라이머 쌍에 사용할 수 있는 프라이머 서열로서 사용하기 위해 삽입된 이종 DNA 서열의 어느 한 말단을 플랭킹하는 게놈 서열로 추가의 서열을 수득할 수 있다. 이러한 기술의 목적상, "삽입된 이종 DNA 서열의 어느 한 말단을 플랭킹하는 게놈 서열로"란 용어는, 삽입된 DNA 서열이 천연 게놈 DNA 서열에 인접한 지점인 삽입되는 이종 DNA 서열의 말단으로 부터 이종성 DNA 서열이 삽입되는 특정 염색체의 게놈성 DNA 서열로 점진적으로 이동함을 일컫는다. 바람직하게는, 삽입 서열의 일부에 상응하거나 이에 상보적인 프라이머 서열은 가장 가까운 플랭킹 서열 접합부 쪽으로 DNA 또는 RNA의 초기 서열의 전사 연장을 프라임해야 한다. 결과적으로, 게놈성 플랭킹 서열의 일부에 상응하는 또는 이에 상보적인 프라이머 서열은 가장 가까운 플랭킹 서열 접합부 쪽으로 DNA 또는 RNA의 초기 쇄의 전사성 연장을 프라임해야 한다. 프라이머 서열은 식물의 염색체 또는 게놈성 플랭킹 서열 내로 삽입된 이종성 DNA 서열일 수 있거나, 이에 상보적일 수 있다. 당업계의 숙련인은, 게놈성 DNA 서열과 삽입된 이종성 DNA 서열 사이의 접합부를 함유하는 특정의 플랭킹 서열을 증폭시키는데 사용하기 위해 의도된 프라이머의 중첩 세트의 사용을 통해 수득되는 것이 바람직한 생성물의 특성에 따라, 프라이머 서열이, 삽입된 이종성 DNA 서열 내의 기재된 서열 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4에 기재된 서열이어야 하는지 또는 이에 상보적이어야 하는지에 대한 이점을 쉽게 인지할 것이다.
또 다른 실시양태에 있어, 본 발명은 생물학적 시료내에서 이벤트 MIR604에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함하는데, 이러한 방법은 (a) DNA를 포함하는 시료를, 옥수수 이벤트 MIR604로 부터의 게놈성 DNA와 높은 엄중 조건하에서 하이브리드화하지만 대조군 옥수수의 DNA와는 높은 엄중 조건하에 하이브리드화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 당해 시료 및 프로브를 높은 엄중 하이브리드화 조건에 적용시키는 단계; 및 (c) DNA에 대한 당해 프로브의 하이브리드화를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 양태의 한가지 국면에서, 앰플리콘은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 양태에 있어, 본 발명은, 생물학적 시료내에서 MIR604 이벤트에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함하는데, 이러한 방법은, (a) DNA를 포함하는 시료를, 옥수수 이벤트 MIR604로 부터의 게놈성 DNA와 높은 엄중 조건 하에서는 하이브리드화 하지만 대조군 옥수수의 DNA와는 높은 엄중 조건하에 하이브리드화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 당해 시료 및 프로브를 높은 엄중 하이브리드화 조건에 적용시키는 단계; 및 (c) DNA에 대한 당해 프로브의 하이브리드화를 검출하는 단계를 포함한다. 검출은 당업계에 널리 공지된 임의의 수단으로서, 형광성, 화학발광성, 방사성, 면역성 또는 그 이외의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하이브리드화가 MIR604 옥수수 이벤트에 대해 특징적인 앰플리콘을 생산하기 위한 특정 서열의 증폭을 위한 수단으로서 사용하도록 의도되는 경우, 당업계에 널리 공지된 임의의 수단에 의한 앰플리콘의 생산 및 검출은 표적 서열에 대한 의도된 하이브리드화를 지적하는 것으로서 의도되는 바, 여기서 하나의 프로브 또는 프라이머가 사용되거나, 또는 2개 이상의 프로브 또는 프라이머가 사용되는 서열들이 사용된다. 용어 "생물학적 시료"란, 삽입된 이종성 DNA 서열의 두개 말단중 하나 또는 나머지 하나가, 이종성 DNA 서열이 삽입되는 염색체내 게놈성 DNA 서열(본원에서는 접합 서열로도 칭함)과 접촉하는 지점의 어느 한 쪽에 5개 내지 10개 뉴클레오타이드를 포함한 핵산을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 시료를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 접합 서열은 2개 이하의 뉴클레오타이드를 포함한다: 삽입된 이종성 DNA 서열내 제1 뉴클레오타이드에 인접하고 공유적으로 연결된 플랭킹 게놈 DNA내의 제1 뉴클레오타이드.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 생물학적 시료내에 이벤트 MIR604 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함하는데, 여기서 키트는, 이벤트 MIR604에 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로서 기능하는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 상동성이거나 이에 상보적인 충분한 길이의 연속 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 핵산 분자, 및 핵산이 하이브리드화 하거나 증폭되도록 하는데 필요한 기타 물질을 포함한다. 다양한 검출 방법이 사용될 수 있는데, 여기에는 TAQMAN (Perkin Elmer), 열 증폭, 리가제 연쇄 반응, 서던 하이브리드화, ELISA 방법, 및 색측정 및 형광성 검출 방법을 포함한다. 특히 본 발명은 표적 서열의 존재, 예를 들면, MIR604로 부터의 게놈성 핵산을 함유하는 시료 내에서 MIR604 내의 옥수수 식물의 게놈성 DNA와 삽입 DNA의 접합부 중 하나 이상을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 표적 부위에 결합할 수 있거나 이에 실질적으로 인접한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 표적 부위로 폴리뉴클레오타이드의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 수단으로 구성된다. 검출수단은 형광성, 화학발광성, 색상분석 또는 동위원소 분석일 수 있으며, 적어도 결합을 검출하기 위한 면역학적 방법과 연계될 수 있다. 키트는 또한, 표적 서열에 인접하거나 표적서열의 약 100개 염기쌍, 또는 약 200개 염기쌍, 또는 약 500개 염기쌍 또는 약 1000개 염기쌍 내의 뉴클레오타이드 서열에 함께 결합하여 서로에 대해 연장되어 적어도 표적 부위를 함유하는 앰플리콘을 형성하게 되는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 이용하여, 시료 내에서 표적 부위의 존재, 예를 들면 MIR604 내의 옥수수 식물의 게놈성 DNA와 삽입 DNA의 접합부중 하나 이상을 검출할 수 있도록 구상된다.
또 다른 양태에 있어, 본 발명은, (a) 옥수수 이벤트 MIR604 조직의 시료로 부터 단백질을 추출하는 단계; (b) MIR604 이벤트에 의해 생산된 살충성 또는 선별성 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함하는 면역학적 방법을 사용하여 추출된 단백질을 검정하는 단계; 및 (c) 당해 항체가 살충성 또는 선별성 마커 단백질로 결합하는 것을 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료 내에서 옥수수 이벤트 MIR604 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 유전자전이 이벤트 MIR604의 유전자형을 포함하는 옥수수 식물 또는 이의 일부를 포함하는데, 여기서 유전자형은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체 서열을 포함한다. 이러한 양태의 한가지 국면에서, 옥수수 식물은 CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP948, NP934, NP982,NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, BCTT609, AF031, H8431,894, BUTT201, R327H, 2044BT, 및 2070BT 근교계 옥수수주로 부터 유래된다. 하지만 당업자는, MIR604 유전자형이, 야생형 종을 포함하여 옥수수와 육종될 수 있는 임의의 식물 변이주내로 도입(introgressed)될 수 있으며, 따라서 이러한 실시양태의 바람직한 근교계 주가 제한적이지 않음을 의미한다는 것을 이해할 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 함께 연결되어 연속 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 적어도 제1 및 제2 DNA 서열을 포함하는 옥수수 식물을 포함하는데, 여기서 제1 DNA 서열은 접합 서열 내에 존재하고, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 792-811, 서열번호 4의 뉴클레오타이드 497-516, 서열번호 5, 서열번호 6 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택된 약 11개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 제2 DNA 서열은 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 이의 상보체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 이종성 삽입 DNA 서열내에 존재하며, 제1 및 제2 DNA 서열은 생물학적 시료 내에서 옥수수 이벤트 MIR604 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브로서 유용하다. 이러한 실시양태의 한가지 국면에 있어서, 뉴클레오타이드 프라이머는 옥수수 식물로부터 추출된 주형 DNA로 부터의 표적 DNA 서열을 증폭하기 위한 DNA 증폭 방법에 사용되고, 옥수수 식물은 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하는 DNA 서열에 상응하는 앰플리콘의 생성에 의해 다른 옥수수 식물로 부터 동정될 수 있다.
본 발명의 옥수수 식물은, 식물의 게놈성 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 KpnI로 분해시, 높은 엄중 조건하에 cry3A055-특이적 프로브를 사용하여 단일 cry3A055 하이브리드화 밴드가 생성된다는 점을 특징으로 한다. 본원중 예시된 것은 서열번호 56 또는 서열번호 59에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 cry3A055 프로브이다.
본 발명의 옥수수 식물은 추가로,식물의 게놈성 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 KpnI로 분해시, 높은 엄중 조건하에 pmi-특이적 프로브를 사용하여 단일 pmi 하이브리드화 밴드가 생성된다는 점을 특징으로 한다. 본원중 예시된 것은 서열번호 62에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pmi 프로브이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 MIR604 유전자형이 옥수수 식물에 곤충에 대한 내성 또는 만노스를 사용하는 능력을 부여한 옥수수 식물을 제공한다. 이러한 실시양태의 한가지 국면에서, 옥수수 식물에게 곤충에 대한 내성을 부여하는 유전자형은 cry3A055 유전자를 포함한다. 이러한 양태의 또 다른 국면에서, 옥수수 식물에게 만노스 이용능을 부여하는 유전자형은 pmi 유전자를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 이벤트 MIR604 옥수수 식물, 조직, 또는 종자로 부터 유래된 생물학적 시료를 제공하는데, 당해 시료는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 당해 서열은 핵산 증폭 또는 핵산 하이브리드화 방법을 사용하여 시료중에서 검출될 수 있다. 이러한 실시양태의 한 국면에 있어서, 시료는 옥수수 가루, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 전분, 및 옥수수 산물을 함유하도록 전체적으로 또는 부분적으로 가공된 씨리얼로 부터 선택된다.
또 다른 양태에 있어, 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이벤트 MIR604 옥수수 식물, 조직 또는 종자로 부터 유도된 추출물을 제공한다. 이러한 국면의 한가지 양태에서, 당해 서열은 핵산 증폭 또는 핵산 하이브리드화 방법을 사용하여 추출물 중에서 검출된다. 이러한 국면의 또 다른 실시양태에서, 당해 시료는 옥수수 가루, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 전분, 및 옥수수 부산물을 함유하도록 전체적 또는 부분적으로 가공되는 씨리얼중에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, (a) 제1 친주 옥수수 식물과 제2 친주 옥수수 식물(여기서, 제1 또는 제2 친주 옥수수 식물은 옥수수 이벤트 MIR604 DNA를 함유한다)을 유성 교배시켜 다수의 제1 세대 자손 식물을 생산하는 단계; (b) 적어도 옥수수 뿌리벌레 감염에 내성인 제1 세대 자손 식물을 선별하는 단계; (c) 제1 세대 자손 식물을 자가교배시켜 다수의 제2 세대 자손 식물을 생산하는 단계 및 (d) 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 세대 자손 식물로부터 적어도 옥수수 뿌리벌레 감염에 내성인 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 적어도 옥수수 뿌리벌레 감염에 내성인 옥수수 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 근교계 옥수수주의 종자 및 유전자형이 상이한 제2 근교계 주의 종자를 심는 단계; (b) 당해 식재로부터 수득한 옥수수 식물을 개화할때까지 재배하는 단계; (c) 옥수수 교배주중 하나의 식물의 꽃을 탈웅하는 단계; (d) 2개의 상이한 근교계 주를 서로 유성 교배시키는 단계 및 (e) 이에 의해 생산된 하이브리드 종자를 수확하는 단계를 포함하는, 하이브리드 옥수수 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 당해 양태중 하나의 측면에서, 제1 근교계 옥수수주는 자성 친주를 제공한다. 당해 양태중 또 다른 측면에서, 제1 근교계 옥수수주는 웅성 친주를 제공한다. 본 발명은 또한 구현된 방법에 의해 생산된 하이브리드 종자 및 종자로부터 성장한 하이브리드 식물을 포함한다.
당업자는 본 발명의 유전자전이 유전자형이 상이한 유전자전이 유전자형을 포함하는 또 다른 옥수수주로 육종함에 의해 도입될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 유전자전이 유전자형을 포함하는 옥수수 근교계는 당업계에 공지된 레피도프테란 내성 Bt11 이벤트의 유전자전이 유전자형을 포함하는 옥수수 근교계와 교배함에 따라서 본 발명의 유전자전이 유전자형 및 Bt11 유전자전이 유전자형 둘다를 포함하는 옥수수 종자를 생산할 수 있다. 본 발명의 근교계와 교배될 수 있는 기타 유전자전이 이벤트의 예는 글리포사테 내성 이벤트 GA21 및 NK603, 글리포사테 내성/레피도프테란 곤충 내성 MON802 이벤트, 레피도프테란 내성 DBT418 이벤트, 레피도프테란 내성 이벤트 DAS-06275-8, 웅성 불임 이벤트 MS3, 포스피노트리신 내성 이벤트 B16, 레피도프테란 곤충 내성 이벤트 MON80100, 포스피노트리신 내성 이벤트 T14 및 T25, 레피도프테란 곤충 내성 이벤트 176 및 콜레오프테란 내성 이벤트 MON863을 포함하고 이들 모두는 당업계에 공지되어 있다. 기타 조합물이 본 발명의 유전자전이 유전자형들을 사용하여 생성될 수 있고 이들의 예는 제한하는 것으로 고려되지 말아야함을 추가로 인지할 것이다.
당업자는 또한 본 발명의 유전자전이 유전자형을 포함하는 유전자전이 옥수수 종자가 살충제를 포함하는 다양한 종자 처리 화학물질로 처리되어 Cry3A055 단백질의 살충 활성을 증강시키거나 공동상승작용시킬 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 유전자전이 옥수수 종자는 시판되는 살충제 CruiserR로 처리될 수 있다. 이를 조합하여 활성 스펙트럼을 증가시키고 발현된 단백질 및 화학물질의 효능을 증가시킬 수 있다.
육종
본 발명의 유전자전이 유전자형은 당업계에 공지된 육종 기술을 사용하여 임의의 옥수수 근교계 또는 하이브리드에 도입될 수 있다. 식물 육종의 목적은 다양한 바람직한 성질들을 단일 변종 또는 하이브리드에 조합시키기 위한 것이다. 농작물에 대해, 이들 성질은 곤충 및 질환에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 열 및 가뭄에 대한 내성을 포함하여 작물의 성숙 시기를 감소시키고, 수확율을 크게 높이고 농작물 품질을 보다 우수하게 할 수 있다. 많은 작물의 기계적인 수확으로 발아 및 종자세, 성장률, 성숙도 및 식물 및 이삭의 높이와 같은 식물 특성의 균일화가 중요하다.
농작물은 식물의 수분작용 방법을 이용한 기술을 통해 육종된다. 한 꽃의 꽃가루가 동일한 식물의 동일하거나 다른 꽃으로 전달되는 경우 자가수분된다. 식물은 꽃가루가 상이한 식물의 꽃으로부터 오는 경우 이종 수분된다.
자가수분되고 여러 세대동안 특정 유형에 대해 선택된 식물은 거의 모든 유전자좌에서 동종접합성이되고 균일한 집단의 진정한 육종 자손을 생산한다. 2개의 상이한 동접접합주간의 교배는 많은 유전자좌에 대해 이종접합성일 수 있는, 균일한 집단의 하이브리드 식물을 생산한다. 다수의 유전자좌에서 각각 이종접합성인 2개 식물의 교배는 유전학적으로 상이하고 균일하지 않는 하이브리드 식물 집단을 생산할 것이다.
옥수수는 자가 수분작용 및 이종 수분작용 기술 둘다에 의해 육종될 수 있다. 옥수수는 동일한 식물상에 별도의 자성 및 웅성 꽃을 갖고 있고 이들은 각각 수염 및 이삭에 위치하고 있다. 천연 수분작용은 바람이 수염으로부터 꽃가루를 이삭 정상부로부터 돌출된 수염으로 불어버리는 경우 발생한다.
식물에서 웅성 번식력을 조절하는 확실한 방법은 개선된 식물 육종에 대한 기회를 제공하는 것이다. 이것은 특히, 몇몇 종류의 웅성 불임 시스템에 의존하는 옥수수 하이브리드의 개발을 위해 절실하다. 육종자에게 유용한 웅성 번식력을 조절하는 몇가지 선택사항이 있다: 수동조작 또는 기계적 탈웅(또는 웅수제거), 세포질성 웅성 불임, 유전학적 웅성 불임 및 살정제등.
하이브리드 옥수수 종자는 전형적으로 수동조작 또는 기계적 웅수제거를 포함하는 웅성 불임 시스템에 의해 생산된다. 2개의 옥수수 근교계의 호생 스트립을 농작지에 심고 꽃가루 함유 수염을 근교계(자성)의 하나로부터 제거하였다. 외래 옥수수 꽃가루 근원으로부터 충분히 분리되어 있는 경우, 웅수제거된 근교계의 이삭은 단지 기타 근교계(웅성)로부터 수정될 것이고 따라서 수득한 종자는 하이브리드이고 하이브리드 식물을 형성할 것이다.
노동집약적이지만 때로는 신임할 수 없는 웅수제거 방법은 당업계에서 유전학적 웅성 불임을 제공하는 많은 방법중 하나를 사용하여 회피될 수 있고 이것은 잇점과 결점을 수반한다. 이들 방법은 웅성 조직 특이적 프로모터 또는 번식력에 치명적인 유전자를 동정하고 이러한 유전자에 대한 안티센스가 식물에 삽입된 안티센스 시스템과 연합된, 세포 독성 물질을 암호화하는 유전자를 식물에 전달하는 다양한 방법을 사용한다[문헌참조: Fabinjanski, et al. EPO 89/3010153.8 공개번호 제329,308호 및 WO 90/08828로서 공개된 PCT 출원 PCT/CA90/00037].
옥수수 근교계 주의 발생
그러나 웅성 불임 근교계의 사용은 옥수수 하이브리드의 생산에 한 요소이다. 당업계에 공지되어 있고 옥수수 식물 육종 프로그램에 사용되는 식물 육종 기술은 순환 선별, 역교배, 계통 육종, 제한 길이 다형성 증진된 선별, 유전자 마커 증진된 선별 및 형질전환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 옥수수 식물 육종 프로그램에서 옥수수 하이브리드의 발생은 일반적으로 동종접합성 근교계 주의 발생, 이들 식물주의 교배 및 당해 교배에 대한 평가를 필요로한다. 계통 육종 및 순환 선별 유종 방법은 육종 집단으로부터 근교계 주를 발생시키는데 사용된다. 옥수수 식물 육종 프로그램은 2개 이상의 근교계 주 또는 다양한 기타 배원질의 유전학적 배경을, 목적하는 표현형을 자가교배시키고 선별함에 의해 새로운 근교계 주가 발생되는 육종 풀로 조합하는 것이다. 새로운 근교계는 기타 근교계 주와 교배되고 이들 교배 기원의 하이브리드를 평가하여 이들중 어느것이 상업성이 있는지를 결정한다. 옥수수 식물 육종 프로그램에서 수행되는 바와 같은 식물 육종 및 하이브리드 발생은 고가이고 시간 소모적인 과정이다.
계통 육종은 하나에는 결핍되어 있지만 다른 하나가 이를 보완하는 각각 하나 이상의 목적하는 특성들을 갖는 2개의 유전자형을 교배시키는 것으로 출발한다. 2개의 본래의 친주가 모든 목적하는 특성들을 제공하지 않는다면, 기타 재원이 육종 집단에 포함될 수 있다. 계통 방법에서, 보다 우수한 식물은 자가교배하고 연속되는 세대에서 선별한다. 연속하는 세대에서, 자가수분 또는 선택 결과로서 이종접합성 조건이 동종접합성 주로 전향된다. 전형적으로, 계통 육종 방법에서, 5세대 이상의 자가교배 및 선별이 수행된다: F1→F2; F2→F3; F3 →F4; F4 →F5 등.
순환 선별 육종, 역교배는 예를 들어, 당해 근교계 주를 사용하여 만들어진 근교계 주 및 하이브리드를 개선시키는데 사용될 수 있다. 역교배는 특정 바람직할 수 있는 성질을 하나의 근교계 또는 공급원으로부터 당해 성질이 결여된 근교계 주로 전달하는데 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 먼저 보다 우수한 근교계 주(순환 친주)를 미지의 당해 성질에 대한 적절한 유전자를 갖고 있는 공여체 근교계(비순환 친주)로 교배시킴에 의해 성취될 수 있다. 당해 교배 자손은 이어서 보다 우수한 순환 친주에 역교배시킴에 이어서 비순환 친주로부터 전달된 목적하는 성질에 대한 순환 자손중에서 선별한다. 목적하는 성질에 대한 선별과 함께 5회 이상의 역교배 세대 후, 자손은 전달된 특성을 조절하는 좌에 대해 동종접합성일 것이지만 모든 필수 기타 유전자에 대해서는 보다 우수한 친주와 유사할 것이다. 이어서 최종 역교배 세대를 자가교배시켜 전달된 유전자에 대한 순수한 육종 자손을 산출한다. 전달된 유전자를 함유하는 근교계 주로부터 발생된 하이브리드는 전달된 유전자가 없는 동일한 근교계로부터 발생된 하이브리드와 근본적으로 동일하다.
정예 근교계 주, 즉, 순수한 육종 동종접합성 근교계 주는 또한 기타 근교계 주를 발생시키기 위해, 육종 또는 공급원 집단을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 정예 근교계 주 기원의 당해 근교계 주는 앞서 기재된 계통 육종 및 순환 선별 육종 방법을 사용하여 발생될 수 있다. 한 예로서, 역교배 육종을 사용하여 옥수수 식물 육종 프로그램에서 이들 유래된 식물주를 개발하는 경우, 정예 근교계 주는 친주 또는 출발 물질 또는 공급원 집단으로서 사용될 수 있고 공여체 또는 재현성 친주로서 작용할 수 있다.
옥수수 하이브리드의 발생
단일 교배 옥수수 하이브리드는 각각 서로 다른 하나의 유전자형을 보완하는 유전자형을 갖는 2개의 근교계 주의 교배로부터 수득된다. 제1 세대의 하이브리드 자손은 F1으로 지정된다. 옥수수 식물 육종 프로그램에서 시판되는 하이브리드의 발생에서, F1 하이브리드 식물만이 모색된다. 바람직한 F1 하이브리드는 이들의 근교계 친주 보다 왕성하다. 이러한 하이브리드의 원기 또는 하이브리드 강세는 식물 성장 증가 및 수율의 증가를 포함하는 많은 다원유전자 성질에서 증대될 수 있다.
옥수수 식물 육종 프로그램에서 옥수수 하이브리드의 발생은 3개의 단계를 포함한다: (1) 초기 육종 교배를 위해 다양한 배원질 풀로부터 식물을 선별하는 단계; (2) 수세대동안 육종 교배로부터 선택된 식물을 자가교배시켜 일련의 근교계 주(서로 상이하지만 순수하게 육종되고 고도로 균일하다)를 생산하는 단계 및 (3) 선택된 근교계 주를 상이한 근교계 주와 교배시켜 하이브리드 자손(F1)을 생산하는 단계. 옥수수에서 육종 과정동안에, 당해 식물주의 원기는 감소한다. 2개의 상이한 근교계 주를 교배시켜 하이브리드 자손(F1)을 생산하는 경우 원기는 회복된다. 근교계 주의 동종접합성 및 균일성의 중요한 결과는 한정된 쌍의 근교계 주간의 하이브리드는 항상 동일할 것이라는 것이다. 일단 보다 우수한 하이브리드를 제공하는 근교계 주가 확립된 경우, 당해 하이브리드 종자는 근교계 친주의 균일성이 유지되는 한 무한적으로 재생될 수 있다. F1 하이브리드에 의해 나타나는 대부분의 하이브리드 원기는 다음 세대(F2)에서 상실된다. 결과적으로, 하이브리드 기원의 종자는 묘목을 위해 사용되지 않는다.
하이브리드 종자 생산은 자성 식물에 의해 생산되는 꽃가루를 제거하거나 불활성화시킬 필요가 있다. 꽃가루의 불완전한 제거 또는 불활성화는 자가 수분할 가능성을 제공한다. 이것은 우연하게 자가 수분된 종자가 의도하지 않게 수확되고 하이브리드 종자와 함께 포장될 수 있다.
일단 종자를 심으면, 당해 자가 수분 식물을 동정하고 선별할 수 있다. 이들 자가 수분된 식물은 하이브리드를 생산하는데 사용된 자성 근교계 주와 유전학적으로 동일할 것이다.
당업자에게 이미 명백해진 바와 같이, 이미 기재된 다양한 방법중 일부에 의해 수득되는 본 발명의 근교계는 본 발명의 유전자전이 유전자형을 기타 옥수수 주에 도입하고자 하는 자들에 의해 수득될 수 있다. 기타 방법이 유용하고 상기 예는 단지 설명하기 위한 것이다.
도 1은 pZM26으로 명명된 식물 발현 벡터를 도시한다. 지도는 서던 분석에 사용되는 KpnI 제한 부위를 나타낸다.
도 2는 옥수수 이벤트 MIR604 게놈내로 삽입된 이종성 핵산 서열을 포함하는구성요소들의 구조화를 나타내는 도식 지도로서, 삽입되는 이종성 DNA 서열의 말단을 플랭킹하는 옥수수 게놈 DNA 서열에 연결되는 삽입 핵산 서열간의 상대적 위치를 설명한다. 1 = 5' 플랭킹 식물 게놈 (서열번호 5); 2 = 우측 경계 영역 (서열번호 57); 3 = MTL 프로모터 (서열번호 58); 4= cry3A055 유전자 (서열번호 59); 5= NOS 터미네이터 (서열번호 60); 6 = ZmUbINT 프로모터 (서열번호 61); 7 = pmi 유전자 (서열번호 62); 8 = NOS 터미네이터 (서열번호 60); 9 = 좌측 경계 영역 (서열번호 63); 10 = 3' 플랭킹 식물 게놈 (서열번호 6).
본 발명은 하기의 상세한 실시예를 참조로 추가로 설명될 것이다. 이들 실시예는 단지 설명을 목적으로 제공되고 달리 특정되지 않는 경우 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고 문헌[참조: Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); J. Sambrook, et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 3d Ed ., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); and by T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)]에 기재되어 있다.
실시예 1. 형질전환 및 MIR604 이벤트의 선별
MIR604 이벤트는 근교계 옥수수(Zea mays) 주 A188의 아그로박테리움 매개 형질전환에 의해 생산된다. I형 배형성 캘러스는 근본적으로, 플라스미드 pZM26(도 1) 기원의 DNA 단편을 사용하여 본원에 참조문헌으로서 인용된 문헌[참조: Negrotto et al. (Plant Cell Reports 19: 798-803, 2000)]에 기재된 바와 같이 형질전환시킨다. pZM26은 탠덤 발현 카세트를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제1 발현 카세트는 노팔린 신타제 3' 말단 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열에 작동적으로 연결된 cry3A055 암호화 서열에 작동적으로 연결된 MTL 프로모터 서열(미국 특허 제6,018,099호)로 이루어져 있다. 제2 발현 카세트는 노팔린 신타제 3' 말단 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열에 작동적으로 연결된 pmi 암호화 서열에 작동적으로 연결된 옥수수 유비퀴틴 프로모터(ZmUbiInt)[문헌참조: Christensen et al. 1992 PMB 18: 675]로 이루어져 있다.
미성숙 배아는 8일 내지 12일된 이삭으로부터 절개하고 형질전환을 위해 새로운 매질로 세정하였다. 배아는 형질전환 벡터 pZM26을 함유하는 아그로박테리움 세포의 현탁액과 혼합하고 30초동안 볼텍싱하며 추가로 5분동안 배양하였다. 과량의 아그로박테리움 용액을 흡인함에 이어서 배아를 비선택 배양 배지를 함유하는 플레이트로 이동시켰다. 배아를 암실에서 2 내지 3일동안 22℃에서 잔류하는 아그로박테리움과 함께 배양하였다. 배아를 티가르실린(100mg/ml) 및 질산은(1.6mg/l)이 보충된 배양 배지로 이동시키고 암실에서 10일동안 배양하였다. 배형성 캘러스를 생산하는 배아는 만노스를 함유하는 세포 배양 배지로 이동시켰다.
재생된 모종을 항생제 내성 스펙티노마이신(spec) 유전자 부재에 대해서 뿐만 아니라 pmi 및 cry3A055 유전자가 존재하는지의 여부에 대해 TAQMANR PCR 분석(실시예 2 참조)으로 시험하였다. 양 전이유전자에 대해 양성이고 spec 유전자에 대해 음성인 식물을 추가 성장을 위해 온실로 이동시켰다. 양성 이벤트를 동정하였고 옥수수 뿌리벌레에 대한 곤충 생분석을 사용하여 검색하였다. 살충 이벤트는 TAQMAN 분석에 의한 카피 수로서 특성화된다. MIR604는 단일 카피의 전이유전자를 갖는지의 여부, ELISA에 의해 동정된 바와 같은 우수한 단백질 발현 및 옥수수 뿌리벌레에 대한 살충 활성을 기초로 하는 추가 분석을 위해 선택되었다.
T0 MIR604를 근교계 옥수수 주 CG00526과 역교배하여 T1 집단을 형성시켰다. T1 식물은 자가 수분되어 T2 집단을 형성하고 당해 과정이 반복되어 T3 집단이 형성되었다. T3 식물의 자손 시험을 사용하여 동종접합성(변형된) 패밀리를 동정하였다. MIR604-변형된 CG00526 근교계를 기타 정예 근교계 주와 교배하여 추가 연구에 사용되는 하이브리드를 형성시켰다.
실시예 2. TAQMAN PCR에 의한 MIR604 검출
TAQMAN 분석은 근본적으로 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Ingham et al. (Biotechniques, 31:132-140, 2001)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 단순하게, 게놈 DNA를, 근본적으로 제조업자의 지침에 따라 PuregeneR 게놈 DNA 추출 키트(Gentra Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 유전자전이 및 비유전자전이 옥수수 식물 잎으로부터 추출하였고 단, 모든 단계는 1.2ml의 96웰 플레이트에서 수행하였다. 건조된 DNA 펠렛을 TE 완충액(10Mm 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁시켰다.
TAQMAN PCR 반응은 96웰 플레이트에서 수행하였다. 내인성 옥수수 유전자 대조군을 위해, Zea mays 알콜 데하이드로게나제(adh) 유전자(Genbank accession no. AF044295)에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 당업자는 기타 옥수수 유전자가 내인성 대조군에 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 반응은 다중방식으로 cry3A055 및 adh 또는 pmi 및 adh를 동시에 증폭시켰다. 각각의 시료에 대해, 마스터 혼합물은, 각각 최종 농도가 900nM인 프라이머 및 각각 최종 농도가 100nM인 프로브가 보충되고 최종 용적이 70㎕가 되도록 물이 보충된 35㎕의 2x TAQMAN Universal PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems)와 20㎕의 추출 게놈 DNA를 배합하여 생성시켰다. 당해 혼합물을 96웰 증폭 플레이트에 각각 20㎕씩 3개의 동일 웰에 분배하고 광학적으로 투명한 열 밀봉 필름(Marsh Bio Products)으로 밀봉하였다. PCR을 하기의 증폭 계수를 사용하여 ABI 프리즘 7700 장치에서 수행하였다: 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분에 이어서 95℃에서 15초로 35회 및 60℃에서 1분.
TAQMAN 분석의 결과는 이벤트 MIR40이 cry3A055 유전자의 1개 카피와 pmi 유전자의 1개 카피를 가짐을 입증한다.
사용되는 적합한 프라이머/프로브 서열의 예는 다음과 같다.
Figure 112013016763157-pat00001

실시예 3. 서던 블롯에 의한 MIR604의 검출
서던 분석을 위해 사용되는 게놈 DNA는 근본적으로 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Thomas et al. (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993)]의 방법을 사용하여 MIR604의 역교배 6(BC6) 세대인 10개 식물로부터 모은 잎 조직으로부터 분리하였다. DNA 분리를 위해 사용되는 모든 식물은 각각 TAQMAN PCR(실시예 2에 기재된 바와 같음)을 사용하여 분석하여 cry3A055 유전자 및 pmi 유전자의 존재를 확인하였다. 음성 분리체 대조군을 위해, DNA를, 이벤트 MIR604의 BC4 세대인 5개의 식물로부터 모은 잎 조직으로부터 분리하였다. 이들 음성 분리체 식물은 각각 TAQMAN PCR을 사용하여 분석하였고 당해 분석은 cry3A055 유전자 및 pim 유전자의 존재에 대해 음성이었지만 예상된 바와 같이 분석 내부 대조군인 내인성 옥수수 adh 유전자에 대해서는 양성이었다.
서던 분석은 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 수행하였다. 게놈 DNA(7.5㎍)를 플라스미드 pZM26(도 1) 기원의 MIR604 T-DNA 삽입체내에 단일 인지 부위를 갖는 KpnI 제한 효소로 분해하였다. 이러한 방법으로 MIR604에 도입된, 각각 서던 분석에 사용된 특정 프로브에 상응하는 성분들의 카피수를 결정한다. 이것은 MIR604에 존재하는 성분 카피당 하나의 하이브리드화 밴드가 생성되도록 한다. 아가로스 겔 전기영동 및 NytranR 막으로의 알칼린 이동 후, 성분 특이적 전장 PCR 합성 프로브를 사용하여 하이브리드화를 수행하였다. cry3A055 및 pmi 서던 블롯에 사용된 프로브는 각각 서열번호 58 및 서열번호 61에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 당해 프로브는 RediprimeTM II 시스템(Amersham Biosciences, Cat. No. RPN1633)을 사용한 랜덤 프라이밍을 통해 32P로 표지시켰다.
하기의 높은 엄중 하이브리드화 조건을 사용하였다. 1 내지 2백만 cpm/ml을, 65℃로 미리 가온된 10㎍/ml의 송아지 흉선 DNA(Invitrogen)이 보충된 PerfectHyb(Sigma)에 첨가하였다. 상기된 바와 같은 동일한 용액중에서 밤새 또는 1시간 이상동안 동일한 온도에서 예비 하이브리드화를 수행하였다. 65℃에서 3시간동안 하이브리드화를 수행한 후 65℃에서 20분동안 2 X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척하고 65℃에서 20분동안 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척하였다.
각각 서던 분석에는 3개의 대조군 시료가 포함된다: (1) 성분 특이적 프로브와 교차 하이브리드화할 수 있는 임의의 내인성 Zea mays 서열을 동정하는데 사용되는 음성 (비형질전환된) 분리체 기원의 DNA; (2) Zea mays 게놈내에 하나의 단일 유전자 카피를 검출하는데 있어서 실험의 감도를 입증하기 위한, 프로브 길이를 기준으로 하나의 카피수와 동일한 KpnI-I 분해된 pZM26의 양이 도입된 음성 분리체 기원의 DNA; 및 (3) 실험의 감도를 입증하기 위한 것 뿐만 아니라 하이브리드화에 대한 양성 대조군으로서, 프로브 길이를 기준으로 하나의 카피수와 동일한 KpnI- 분해된 pZM26 플라스미드.
하이브리드화 데이타는 MIR604가 단일 카피의 cry3A055 및 pmi 유전자를 함유하고 pZM26에 존재하는 벡터 골격 서열중 어느 하나를 함유하지 않는다는 TAQMAN PCR 분석을 지지하는 확증을 제공한다. cry3A055 및 pmi 프로브 둘다에 대해 예상된 바와 같이, KpnI 분해는 올바른 크기의 단일 하이브리드화 밴드를 생성시켰고 이것은 각각의 단일 유전자 카피가 MIR604 이벤트에 존재함을 입증한다. 추가로, 골격에 대해, 하이브리드화 프로브의 결핍은 형질전환 과정동안에 MIR604로 도입된 임의의 pZM26 벡터 골격 서열이 부재함을 입증한다.
실시예 4. T-DNA 삽입체 서열 분석
이벤트 MIR604에 존재하는 전체 전이유전자 DNA 삽입체의 뉴클레오타이드 서열은 삽입체의 전체 위상, 기능성 성분들과의 연속성을 입증하고 임의의 각각의 염기쌍 변화를 검출하기 위해 결정하였다. MIR604 삽입체는 2개 각각의 중첩 단편으로서 BC5 세대로부터 기원하는 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 각각의 단편은 MIR604 삽입체를 플랭킹하는 식물 게놈 서열과 상동성인 하나의 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 cry3A055 유전자와 상동성인 하나의 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 5' 단편을 합성하기 위해, 5' 플랭킹 서열과 상동성 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머인 5'S1(서열번호 15)을, cry3A055 유전자내에 삽입된 DNA와 상동성인 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머인 5'AS1(서열번호 28)과 조합하였다. 3' 단편을 합성하기 위해, 3' 플랭킹 서열과 상동성인 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머인 9268AS(서열번호 45)를 cry3A055 유전자내 삽입된 DNA와 상동성인 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머인 5161S(서열번호 27)과 조합하였다.
PCR 증폭은 Expand High Fidelity PCR 시스템(Roche, Cat. No. 1732650) 및 하기의 증폭 계수를 사용하여 수행하였다: 1회 94℃에서 2분, 94℃에서 15초 10회, 55 내지 65℃에서 30초 및 68℃에서 5분, 94℃에서 15초 20회, 55 내지 65℃에서 30초 및 72℃에서 회당 5분 +5초에 이어서 72℃에서 7분 1회.
서열번호 15 및 서열번호 28을 사용한 PCR 증폭으로부터 생성된 앰플리콘은 5' 접합 서열(서열번호 1)을 포함하였다. 서열번호 45 및 서열번호 27을 사용한 PCR 증폭으로부터 생성된 앰플리콘은 3' 접합 서열(서열번호 2)을 포함하였다. 각각의 서열분석된 단편을 각각 pCRR-XL-TOPO 벡터(Invitrogen, Cat. No. K4700-20)으로 클로닝하고 각각의 단편에 대한 3개의 분리된 클론을 동정하고 서열분석하였다. ABI BigDyeR 1.1 또는 Big Dye 3.1 dGTP(GC 풍부 주형용) 화학물질을 사용하는 ABI3730XL 분석기를 사용하여 서열분석하였다. 서열 분석은 워싱턴 대학의 Phred, Phrap 및 Consed 팩키지를 사용하여 수행하였고 10,000 염기당 1개 미만의 오류 비율로 수행하였다[문헌참조: Ewing and Green, 1998). 최종 보존성 서열은 6개 각각의 클론(각 서열분석 단편에 대해 3개)으로부터의 서열 데이타를 종합하여 결정하였고 MIR604 삽입체의 하나의 보존성 서열을 밝혔다. 추가로, MIR604 삽입체와 pZM26 플라스미드간의 임의의 각각의 염기쌍 불일치를 명백히 하기 위해, 염기쌍 불일치가 초기 보존성 서열에서 나타나는 임의의 지역에 특이적인 작은(약 300 내지 500bp) PCR 생성물을 상기 동일한 방법을 사용하여 증폭시켰다. MIR604 삽입체내 모든 추정 염기쌍 불일치에 대해, 직접적인 PCR 생성물 서열분석은 미지의 모든 염기쌍에서 단일의 명백한 피크를 나타내었고 이것은 이들 불일치가 MIR604 삽입체에 존재할 가능성이 있음을 시사한다. 하기의 계수를 사용하여 ClustalW 프로그램을 사용하여 정렬시켰다: 스코어링 매트릭스 블로섬 55, 갭 개방 페날티 15, 갭 신장 페날티 6.66(문헌참조: Thompson et al, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680).
MIR604 T-DNA 삽입체에 대한 보존성 서열 데이타는 pZM26에서 의도되는 바와 같은 삽입체의 전체 위상 및 삽입체내 기능성 성분들과의 연속성이 유지되었음을 입증한다. 서열 분석은 이벤트 MIR604를 생성시키는 형질전환 과정동안에 T-DNA 삽입체의 오른쪽 경계(RB)(서열번호 57) 및 왼쪽 경계(LB)(서열번호 62) 말단에서 약간 절단되었음을 밝혔다. T-DNA 삽입체의 RB 부분은 44bp 절단되었고 T-DNA 삽입체의 LB 말단은 43bp 절단되었다. 이들 결실은 T-DNA 삽입체의 효능에 어떠한 영향을 미치지 않고 이러한 현상은 이전에 아그로박테리움 형질전환에서 관찰되었다[문헌참조: Tinland & Hohn, 1995. Genetic Engineering, 17: 209-229]. 추가로, 3개의 염기쌍 변화가 MIR604 T-DNA 삽입체에서 나타났다. 단백질을 암호화하지 않는 조절 영역인 MTL 프로모터내에서 하나의 불일치가 나타났다. pmi 암호화 서열에서 나머지 2개의 불일치가 나타났고 이로인해 2개의 아미노산이 변화되었다. 61번 위치에서 발린이 알라닌으로 치환되었고(V61A) 210번 위치에서 글루타민이 히스티딘으로 치환되었다(Q210H). 알라닌 및 발린 둘다는 지방족 아미노산이고 보존성 치환을 유발한다. 글루타민의 히스티딘으로의 치환은 염기성 잔기가 산성 잔기로 치환된 것이다.
실시예 5. 플랭킹 DNA 서열의 분석
이벤트 MIR604의 옥수수 식물 게놈으로 삽입된 이종성 DNA를 플랭킹하는 옥수수 게놈 DNA 서열은 근본적으로 본원에 참조문헌으로 인용된 문헌[참조: Kamberov et al (Proceedings of SPIE, Tools for Molecular Analysis and High -Throughput Screening, 4626:1-12, 2002)]에 기재된 바와 같은 OmniPlexTM 기술을 사용하여 수득하였다.
5' 및 3' 플랭킹 서열 및 접합 서열은 표준 PCR 과정을 사용하여 확인하였다. 5' 플랭킹 및 접합 서열은 서열번호 16 또는 서열번호 17에 제시된 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머와 조합된 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 제시된 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 확인하였다. 3' 플랭킹 및 접합 서열은 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 또는 서열번호 36에 제시된 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머와 조합된 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43 또는 서열번호 44에 제시된 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 확인하였다. 당업자는 기타 프라이머 서열이 플랭킹 및 접합 서열을 확인하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
MIR604 삽입체는 서열번호 5의 옥수수 게놈 서열에 의해 우측 경계(5' 플랭킹 서열)상에서 플랭킹되어 있고 서열번호 6의 옥수수 게놈 서열에 의해 좌측 경계(3' 플랭킹 서열)상에서 플랭킹되어 있는 것으로 밝혀졌다. 5' 접합 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다. 3' 접합 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다.
실시예 6. ELISA를 통한 MIR604 단백질의 검출
MIR604 식물에서 Cry3A055(활성 살충 원리) 및 포스포만노스 이소머라제(PMI)(선택성 마커) 단백질의 발현 범위의 특성을 분석하기 위해, 2개의 하이브리드(MIR604-B 및 MIR604-C)에서 및 하나의 근교계(MIR604-A)에서 Cry3A055 단백질 및 PMI의 농도를 4개의 성장 단계(윤생체, 개화기, 종자 성숙기 및 노화기)의 여러 식물 조직 및 전체 식물에서 ELISA로 측정하였다. 하이브리드는 이벤트 MIR604에서 전이유전자에 대한 반접합성인 반면, 근교계는 전이유전자에 대해 동종접합성이다.
전체 식물 및 각각의 부분(꽃가루를 제외한)은 커피 분쇄기, 블렌더, GrindomixTM 분쇄기(Brinkmann Instruments; Westbury, NY, USA), 막자 또는 제분기를 갖는 막자사발 또는 이들 장치의 조합을 사용하는 가공으로 미세 분말로 축소시켰다. 모든 가공은 드라이 아이스 또는 액체 질소의 존재하에 수행하였다. 시료를 잘 혼합하여 균일하게 한다. 전체 식물 조직 시료 또는 대표적인 서브-시료를 분석을 위해 남겨두고 보유 식물 조직 시료의 기록 저장을 위해 충분한 시료 크기로 유지한다. 각 시료의 건조 중량%를 결정하고 가공된 시료를 동결건조때까지 약 -80℃에서 저장하였다.
새로운 조직(꽃가루 및 사일리지(silage)를 제외함) 및 전체 식물 시료를 추출하였다. 분석된 각각의 시료에 대해, 분말화된 새로운 재료 1.0g을 15ml의 폴리프로필렌 튜브중에서 칭량하고 3ml의 추출 완충액[50mM CAPS, 0.1M NaCl, 2mM EDTA, 1mM 디티오트레이톨, 1mM 4-(1-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 HCl, 1mM 류펩틴, pH 10]중에 현탁시키고 AutogizerR 파쇄기(Tomtek; Hamden, CT, USA)를 사용하여 추출하였다. 10,000 x g에서 4℃에서 15분동안 원심분리 한 후, ELISA에 의한 Cry3A055 및 PMI 분석을 위해 상등액을 사용하였다. 문헌[참조: Hill and Straka(1988)에 기재된 바와 같이 요오도아세트아미드로 처리한 후, 추출물중의 총 단백질을 BCATM 단백질 분석 시약(Pierce; Rockford, IL, USA)을 사용하여 정량하였다.
꽃가루 추출물은, 꽃가루 1:30(w/v)을 추출 완충액중에 현탁시켜 제조하였다. 빙상에서 30분 후, 꽃가루 현탁액을 약 15,000psi에서 프렌치 프레스 셀을 통해 3회 통과시켜 분쇄시킴에 이어서 4℃에서 5분동안 14,000 x g에서 원심분리하였다. ELISA에 의한 Cry3A055 및 PMI 분석은 하기된 바와 같은 상등액에 대해 수행하였다. 총 단백질은 상기된 바와 같이 정량하였다.
사일리지 추출물은 사일리지 1:25(w/v)를 2X 추출 완충액중에 현탁시켜 제조하였다. 빙상에서 30분 후 사일리지 현탁액은 브링크만 PolytronR 파쇄기(Brinkmann; Westbury, NY, USA)를 사용하여 추출하였다. 15분동안 4℃에서 10,000 x g에서 원심분리 한 후 상등액은 ELISA에 의한 Cry3A055 및 PMI 분석을 위해 사용하였다. 총 단백질은 상기한 바와 같이 정량하였다.
Cry3A055 정량
상기한 바와 같이 제조된 추출물은 면역 친화성 정제된 래빗 항-Cry3A055 폴리클로날 항체 및 면역 친화성 정제된 염소 항-Btt(바실러스 써링기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 아종, 테네브리오니스(tenebrionis)의 고유 Cry3A) 폴리클로날 항체를 사용하는 ELISA를 사용하여 Cry3A055에 대해 정량적으로 분석하였다. 이중-샌드위치 ELISA의 정량 하한치는 표준 곡선의 선형 부분에 있는 순수한 참조 단백질의 최저 농도, 배경 간섭없이 분석될 수 있는 대조군 추출물의 최대 용적 및 일정 부분 시료의 상응하는 중량을 기준으로 평가하였다.
Cry3A055 단백질의 정량 가능한 수준은 꽃가루를 제외한 분석되는 모든 MIR604 유래 식물 조직에서 검출하였다. 대부분의 경우에, 결과는 5개의 동일한 조직 시료의 평균치로서 나타낸다. 사일리지를 위해, 하나의 시료를 분석하였고 따라서, 어떠한 평균치가 계산될 수 없었다. 대조군 시료 수준은 모든 단계 및 조직에 대해 정량 제한치 미만이었다.
모든 성장 단계를 거쳐, 잎, 뿌리 및 전체 식물에서 측정된 평균 Cry3A055 수준의 범위는 각각 약 3-23㎍/g 생중량(4-94㎍/g 건조중량), 약 2 - 14 ㎍/g 생중량(7-62㎍/g 건조중량) 및 약 0.9 - 11㎍/g 생중량(3-28㎍/g 건조중량)이다. 종자 성숙기 및 노화기에서 열매에서 측정된 평균 Cry3A055 수준의 범위는 약 0.6 - 1.4㎍/g 생중량(0.8 - 2.0㎍/g 건조중량)이다. 개화기에서 수염 조직에서 측정된 평균 Cry3A055 수준은 정량 하한치(LOQ)(<1.0㎍/g 건조중량) 미만인 0.1㎍/g 생중량 미만 이었다. 종자 성숙기에서 수염 조직에서 측정된 평균 Cry3A055의 범위는 약 0.6 - 1.9 ㎍/g 생중량(1 -3 ㎍/g 건조중량)이었다. 근교계 MIR604-A 또는 하이브리드 MIR604-B 및 MIR604-C 기원의 꽃가루에서는 어떠한 Cry3A055가 검출되지 않았다[검출 한계치(LOD) = 0.07㎍/g 생중량, 0.15㎍/g 건조중량].
Cry3A055 수준은 일반적으로 각각의 시점에서 각각의 조직 유형에 대해 하이브리드간에 유사하였다. 근교계 주에 대해, Cry3A055 발현은 일반적으로 윤생체 및 개화기에서 잎, 뿌리 및 전체 식물의 하이브리드 및 종자 성숙기의 뿌리에서 높았다. 사일리지 조직에서 측정된 Cry3A055 수준은 15, 29 및 75일에서 평균적으로 2.5 ㎍/g 생중량(7.3㎍/g 건조중량)이었다. 대조적으로, 사일리지를 사일로(silo) 저장하기 전(사일리지 전 0일)에 잘라진 식물 재료에서 측정된 Cry3A055의 수준은 약 8㎍/g 생중량(20㎍/g 건조중량)이었다.
PMI 정량
상기된 바와 같이 제조된 추출물은 PMI에 특이적인 단백질 A 정제된 폴리클로날 래빗 및 면역친화성 정제된 폴리클로날 염소 항체를 사용한 ELISA(Tjissen, 1985)로 PMI에 대해 정량적으로 분석하였다. 이중 샌드위치 ELISA의 정량 하한치는 표준 곡선의 선형 부분에 있는 순수한 참조 단백질의 최저 농도, 배경 간섭없이 분석될 수 있는 대조군 추출물의 최대 용적 및 일정 부분의 시료의 상응하는 중량을 기초로 평가하였다.
PMI 단백질은 수준은 낮았지만 분석된 대부분의 MIR604 유래 식물 조직에서 검출되었다. 대부분의 경우에, 결과는 5개의 동일한 조직 시료의 평균치로서 나타내었다. 사일리지에 대해, 하나의 동일 시료를 분석하였다. 따라서, 어떠한 평균치가 계산될 수 없었다. 대조군 시료 수준은 모든 단계 및 조직에 대해서 정량 한계치 미만이었다.
모든 식물 단계를 거쳐, 잎, 뿌리 및 전체 식물에서 측정된 평균 PMI 수준 범위는 각각 검출불가능한 것(ND)에서 약 0.4㎍/g 생중량(ND-2.1㎍/g 건조중량), LOQ 미만(<0.03㎍/g 생중량) 내지 약 0.2㎍/g 생중량 미만(<0.1 -1.0㎍/g 건조중량) 및 LOQ 미만(<0.02 ㎍/g 생중량) 내지 약 0.3㎍/g 생중량 미만(<0.04-2㎍/g 건조중량)이다. 종자 성숙기 및 노화기에서 열매에서 측정된 평균 PMI 수준의 범위는 LOQ 미만(<0.06㎍/g 초기중량) 내지 약 0.4㎍/g 생중량 미만(<0.07 - 0.5 ㎍/g 건조중량)이다. 개화기 및 종자 성숙기에서 수염 조직에서 측정된 평균 PMI 수준의 범위는 LOQ 미만(<0.1㎍/g 생중량) 내지 약 0.8㎍/g 생중량 미만(<0.2 -6.8㎍/g 건조중량)이다. 꽃가루에서 PMI 범위는 약 1.9-2.6 ㎍/g 생중량(3.9 - 5.2 ㎍/g 건조중량)이다.
PMI 수준은 각각의 시점에서 각각의 조직 유형에 대해 근교계 및 하이브리드 유전자형간에 유사하였다. PMI는 모든 3회 시료 채취 시점(15일, 29일 및 75일)에서 사일리지에서 검출가능하지 않은 반면에 사일리지 저장전(사일리지 전 0일)에 잘라진 식물 재료에서 측정된 수준은 약 0.3㎍/g 생중량(0.7㎍/g 건조중량)이었다.
에어커 및 헥타르당 평가된 총 Cry3A055 단백질 수준
근교계 주(MIR604-A) 및 2개의 하이브리드(MIR604-B 및 MIR604-C)에 대해, 식물은 종자 성숙기에서 최고의 바이오매쓰에 도달하였다. 또한 식물은 종자 성숙기에서 에어커 당(헥타르 당) 최고의 평균 Cry3A055 수준에 도달하였고 MIR604-A, MIR604-B 및 MIR604-C 각각에 대해서 에어커당 약 78, 141 및 240g(헥타르당 193, 348 및 592g/헥타르)을 함유하는 것으로 평가되었다. 성장기 및 교차 유전자형에 대해서, MIR604-유래 식물에서 Cry3A055의 평가치의 범위는 노화기에서 약 8g Cry3A055/에어커(21g Cry3A055/헥타르) 내지 종자 성숙기에서 약 240g Cry3A055/에어커(592g Cry3A055/헥타르)의 평균 수준이고 이것은 식재 밀도가 에어커당 26,500개의 식물(헥타르당 65,500 식물)인 경우이다.
실시예 7. MIR604의 농작지 효능
서부 및 북부 옥수수 뿌리벌레
MIR604 식물은 미국의 12개 지역에서 서부 및 북부 옥수수 뿌리벌레에 대항하는 효능에 대해 시험하였다. MIR604는 살충성 종자 처리 CruiserR의 첨가 및 첨가 부재하에 시험하였다. 대조군 그룹은 2개의 상이한 비율의 CruiserR로 처리된 종자 및 비처리된 종자로 이루어져 있다. 당해 처리는 무작위 완전 블록에서 디자인된 중심에서 30" 격리된 2개의 17.5-20 걸음 간격의 4개의 동일부류로 이루어져 있다. 처리당 10개의 식물을 무작위로 선택하였고 0 내지 3 스케일(여기서, 0은 어떠한 공급 손상이 없는 것이고(주어질 수 있는 가장 낮은 등급); 1 = 줄기의 약 2인치 이내(7번째 마디상에 토양 라인)에서 접어들어가는 하나의 마디(뿌리 원형) 또는 전체 마디의 등가물; 2= 접혀들어간 2개의 완전한 마디; 3= 접어들어간 3개 이상의 마디(주어질 수 있는 최고 등급)이다)를 사용하여 효능에 대해 평가되었다. 완전히 접혀들어간 마디에서의 손상은 마디 결손 %, 즉, 1.50은 1 1/2 마디, 0.25 = 한 마디에서 1/4이 접혀들어감.
표 1에 나타낸 결과는 MIR604의 2개의 동일 주의 뿌리 3-11 및 3-12의 뿌리는 CruiserR 처리 기원의 뿌리 또는 비처리된 대조군 뿌리 보다 상당히 덜한 영양공급 손상을 나타냄을 입증한다. MIR604-3-11 및 MIR604-3-12는 각각 1.6 및 0.9의 손상 등급을 갖는 0.25 및 1.25 mgA/종자 CruiserR 처리군 및 손상 등급이 2.14인 대조군 주와 비교하여 0.44 및 0.42의 뿌리 손상 등급을 나타낸다. 종자가 Cruiser로 처리된 MIR604 식물에서 보다 낮은 뿌리 손상 등급을 나타내는 경향이 있고 이것은 CrusierR이 Cry3A055를 증대시키거나 CrusierR과 Cry3A055 사이에 공동상승작용이 일어남을 시사하는 것이다. 이것은 특히, 각각 뿌리 손상 등급이 0.33 및 0.29인 1.0 및 1.25mgA/MIR604에서 명백하다.
Figure 112013016763157-pat00002
MIR604 효능은 밭고랑에 적용되는 시판되는 낟알 표준 살충제와 비교하였다. 실험 디자인은 상기한 바와 같이 기재되어 있다. 표 2의 결과는 MIR604의 효능이 옥수수 뿌리벌레 영양공급 손상에 대해 식물을 보호하는데 있어서 시판되는 표준물에 필적할만한 것임을 입증한다.
Figure 112013016763157-pat00003
멕시코 옥수수 뿌리벌레
MIR604 식물은 텍사스의 2개 지역에서 멕시코 옥수수 뿌리벌레에 대한 내성에 대해 평가되었다. 실험 디자인은 근본적으로 상기된 바와 동일하다.
표 3에 나타낸 결과는 MIR604 동일부류 둘다가 비처리된 것 보다 덜한 영양공급 손상을 나타내었음을 입증한다. Cruiser가 MIR604 종자에 첨가되는 경우 멕시코 옥수수 뿌리벌레를 제어하는 양성 반응을 나타냈다. 속도 반응이 명백하게 입증되었다. 표 4의 결과는 MIR604의 효능이 멕시코 옥수수 뿌리벌레 영양공급 손상에 대해 식물을 보호하는데 있어서 시판되는 표준물에 필적할 수 있음을 입증한다.
Figure 112013016763157-pat00004
Figure 112013016763157-pat00005
본원 명세서에 언급된 모든 공개문헌 및 특허출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 지적한다. 모든 공개문헌 및 특허출원은 각각의 개별적인 공개문헌 또는 특허출원이 구체적으로 및 별개로 본원에 참조로서 지적되는 바와 같이 동일한 정도로 본원에 참조로서 인용된다.
이전에 기재된 발명은 일부 상세하게 본 발명의 명쾌한 이해를 목적으로 설명 및 예시를 통해 기재되었지만 특정 변화 및 변형이 본 발명의 범위이내에서 수행될 수 있음은 명백하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. (a) 옥수수 이벤트 MIR604 기원의 DNA 주형의 존재하에 핵산 증폭 반응에서 함께 작용하여 옥수수 이벤트에 특징적인 앰플리콘을 생성시키는 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 앰플리콘을 생성시키는 단계; 및
    (c) 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 앰플리콘이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 생물학적 시료에서 옥수수 이벤트 MIR604 DNA의 존재를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 앰플리콘이 서열번호 1을 포함하고, 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 서열이 서열번호 7 내지 서열번호 15 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머 서열이 서열번호 16 내지 서열번호 38 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 앰플리콘이 서열번호 2를 포함하고, 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 서열이 서열번호 39 내지 서열번호 46 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머 서열이 서열번호 16 내지 서열번호 38 및 이의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.

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