ES2596317T3 - Evento de maíz MIR604 - Google Patents

Abstract

Un método para identificar una planta de maíz que comprende el inserto heterólogo MIR604 que comprende un gen cry3A055 de la SEC ID NO: 59 flanqueado por las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 3, y la SEC ID NO: 2 y la SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, entre otras plantas de maíz que no comprenden dicho inserto heterólogo, que comprende los pasos de: (a) amplificar una secuencia de ADN diana procedente de la planta de maíz que se va a identificar utilizando cebadores nucleotídicos que comprenden una primera secuencia de ADN que comprende al menos aproximadamente 11 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en los nucleótidos 792-811 de la SEC ID NO: 3; los nucleótidos 497-516 de la SEC ID NO:4; la SEC ID NO: 5; la SEC ID NO: 6; y sus complementos y una segunda secuencia de ADN, que está comprendida en la secuencia de ADN del inserto heterólogo seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 57, la SEC ID NO: 58, la SEC ID NO: 59, la SEC ID NO: 60, la SEC ID NO: 61, la SEC ID NO: 62, la SEC ID NO: 63 y sus complementos; y (b) identificar la planta de maíz que comprende el inserto heterólogo MIR604 entre otras plantas de maíz.

Description

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DESCRIPCION

Evento de maíz MIR604

La presente invención se refiere generalmente al campo de biología molecular de plantas, transformación de plantas, y reproducción de plantas. Más específicamente, la invención se refiere a plantas de maíz transgénlcas resistentes a insectos que comprenden un nuevo genotipo transgénico y a métodos para detectar la presencia del ADN de la planta de maíz en una muestra y a sus composiciones.

Las plagas de plantas son un factor importante en la pérdida de los cultivos agrícolas importantes del mundo. Alrededor de $8.000 millones de dólares se pierden cada año en los Estados Unidos solo debido a infestaciones de plagas no mamíferas que incluyen insectos. Las especies de gusanos de raíz de maíz se consideran las plagas de maíz más destructivas. Especies de plagas de gusanos de raíz importantes incluyen Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de raíz de maíz del oeste; D. longicornis barberi, el gusano de raíz de maíz del norte, D. undecimpunctata howardi, el gusano de raíz de maíz del sur, y D. virgifera zeae, el gusano de raíz de maíz mejicano.

El gusano de raíz de maíz se controla principalmente por aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos. Así se puede lograr un buen control del gusano de raíz de maíz, pero estas sustancias químicas algunas veces también pueden afectar organismos beneficiosos. Otro problema que resulta del amplio uso de plaguicidas químicos es la aparición de variedades resistentes de insectos. Esto se ha mejorado parcialmente mediante varias prácticas de manejo de la resistencia, pero existe una necesidad en aumento de estrategias de control de plagas alternativas. Una de tales alternativas incluye la expresión de genes externos que codifican proteínas insecticidas en plantas transgénicas. Este enfoque ha proporcionado un medio eficiente de protección contra plagas de insectos seleccionadas, y se han comercializado plantas transgénicas que expresan toxinas insecticidas, permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de insecticidas químicos.

La expresión de genes externos en plantas puede ser influenciada por sus posiciones cromosómicas, posiblemente debido a la estructura de cromatina o a la contigüidad de elementos de regulación transcripcional cercanos al sitio de integración (véase, por ejemplo, Weising et al., 1988, “Foreign Genes in Plants”, Ann. Rev. Genet. 22:421-477). Por lo tanto, es habitual producir cientos de eventos diferentes e identificar aquellos eventos en busca de un único evento que tenga niveles y patrones de expresión transgénica deseados para fines comerciales. Un evento que tiene niveles o patrones deseados de expresión transgénica es útil para la introgresión del transgén en otros antecedentes genéticos por cruzamiento sexual usando métodos de reproducción convencionales. La progenie de tales cruzamientos mantienen las características de expresión transgénica del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar la expresión génica fiable en un número de variedades que están bien adaptadas a condiciones de crecimiento local.

El documento WO 03/018810 describe secuencias de ácido nucleico de codifican toxinas Cry3A modificadas que presentan una mayor toxicidad para el gusano de raíz de maíz.

El documento WO 2004/011601 describe composiciones y métodos para detectar la presencia del ADN del evento de maíz MON863 insertado en el genoma de maíz procedente de la transformación del constructo recombinante que contiene un gen Cry3Bb y de secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción. Se describen además plantas del evento de maíz MON863, su progenie y semillas que contienen el ADN del evento de maíz MON863.

El documento WO 02/28185 describe un método para proteger el maíz contra el daño que se origina cuando una o más plagas se alimentan de él, incluyendo dicho método el tratamiento de semillas de maíz que tienen un evento transgénico que tiene como diana al menos una de las plagas y es capaz de expresar ciertas proteínas Cry3Bb modificadas, con entre aproximadamente 100 gm y aproximadamente 400 gm de tlametoxam por 100 kg de semillas.

Sería ventajoso poder detectar la presencia de un evento particular con el propósito de determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un método para la detección de un evento particular podría ser práctico para cumplir con normativas que requieren la aprobación de pre-mercado y el etiquetado de alimentos derivados de plantas de maíz recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier método de detección de ácido nucleico bien conocido que incluye pero no se limita a amplificación térmica (reacción en cadena de la polimerasa (POR)) usando cebadores polinucleotídicos o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Típicamente, por cuestión de simplicidad y uniformidad de reactivos y metodologías para uso en la detección de un constructo de ADN particular que se ha usado para transformar diversas variedades de plantas, estos métodos de detección generalmente se centran en elementos genéticos usados frecuentemente, por ejemplo promotores, terminadores, y genes marcadores, porque para muchos constructos de ADN, la región de secuencia codificante es intercambiable. Como resultado, tales métodos pueden no ser útiles para discriminar entre constructos que difieren solamente con referencia a la secuencia codificante. Además, tales métodos pueden no ser útiles para discriminar entre eventos diferentes, particularmente aquellos producidos usando el mismo constructo de ADN a menos que la secuencia de ADN cromosómico adyacente al ADN heterólogo Insertado (“ADN flanqueante”) sea conocida.

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La presente invención incluye un evento de maíz transgénico resistente a insectos que ha incorporado en su genoma un gen c/y3A055, descrito en la Publicación Internacional n°WO 03/01.8810, publicada el 6 de marzo de 2003, que codifica una toxina insecticida Cry3A055, útil para controlar de plagas de insectos Diabrotica spp. El evento de maíz transgénico también ha incorporado en su genoma un gen pmi, que codifica una enzima de fosfomanosa isomerasa (PMI), descrita en la Patente US n° 5.767.378, útil como un marcador seleccionable, que permite a la planta utilizar mañosa como una fuente de carbono. La presente invención incluye además secuencias de ácido nucleico aisladas novedosas las cuales son únicas para el evento de maíz transgénico, útiles para identificar el evento de maíz transgénico y para detectar ácidos nucleicos del evento de maíz transgénico en una muestra biológica, además de kits que comprenden los reactivos necesarios para uso en la detección de estos ácidos nucleicos en una muestra biológica.

La presente invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz que comprende el inserto heterólogo MIR604 que comprende un gen cry3A055 de la SEC ID NO: 59 flanqueado por las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 3, y la SEC ID NO: 2 y la SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, entre otras plantas de maíz que no comprenden dicho inserto heterólogo, que comprende los pasos de:

(a) amplificar una secuencia de ADN diana procedente de la planta de maíz que se va a identificar utilizando cebadores nucleotídicos que comprenden una primera secuencia de ADN que comprende al menos aproximadamente 11 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en los nucleótidos 792-811 de la SEC ID NO: 3; los nucleótidos 497-516 de la SEC ID NO:4; la SEC ID NO: 5; la SEC ID NO: 6; y sus complementos y una segunda secuencia de ADN, que está comprendida en la secuencia de ADN del inserto heterólogo seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 57, la SEC ID NO: 58, la SEC ID NO: 59, la SEC ID NO: 60, la SEC ID NO: 61, la SEC ID NO: 62, la SEC ID NO: 63 y sus complementos; y

(b) identificar la planta de maíz que comprende el inserto heterólogo MIR604 entre otras plantas de maíz.

La invención se refiere además al uso de una planta de maíz identificada con el método descrito anteriormente que comprende el inserto heterólogo MIR604 para controlar plagas de insectos.

En particular, la plaga de insectos coleópteros se selecciona del grupo que consiste en Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de la raíz de maíz occidental, Diabrotica virgifera zeae, el gusano de la raíz de maíz mejicano, y

Diabrotica longicornis barberi, el gusano de la raíz de maíz del norte.

En otra realización, la invención se refiere al uso descrito anteriormente, donde la semilla de dicha planta de maíz es tratada con agentes químicos para el tratamiento de las semillas, en particular para aumentar u obtener un efecto sinérgico con la actividad insecticida de la proteína Cry3A055 y/o para incrementar el espectro de actividad y la eficacia de la proteína expresada y del agente químico.

En una realización, dicho agente químico es un insecticida, particularmente, dicho insecticida es Cruiser®.

Cualquier referencia a la invención o a aspectos o realizaciones de la invención mencionados en la presente, que exceda el alcance de la invención tal como está representado por las reivindicaciones no forma parte de la invención, sino que representa información general únicamente útil para la comprensión de la invención.

La presente invención se refiere a un evento de maíz transgénico, designado MIR604, que comprende un nuevo genotipo transgénico que comprende un gen cry3A055 y un gen pmi el cual confiere resistencia a insectos y la capacidad para utilizar mañosa como una fuente de carbono, respectivamente, al evento de maíz MIR604 y progenie del mismo. La invención también proporciona plantas de maíz transgénicas que comprenden el genotipo de la invención, semillas de plantas de maíz transgénicas que comprenden el genotipo de la invención, y métodos para producir una planta de maíz transgénica que comprende el genotipo de la invención por cruzamiento de un maíz endogámico que comprende el genotipo de la invención con su propia u otra línea de maíz de un genotipo diferente. Las plantas de maíz transgénicas de la invención esencialmente pueden tener todas las características morfológicas y fisiológicas de la planta de maíz no transgénica isogénica correspondiente, además de aquellas conferidas en la planta de maíz por el genotipo novedoso de la invención. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para detectar la presencia de ácidos nucleicos del evento MIR604 en base a la secuencia de ADN de los casetes de expresión recombinante insertados en el genoma de maíz que dan como resultado el evento MIR604 y de secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción. El evento MIR604 se puede caracterizar además analizando los niveles de expresión de las proteínas Cry3A055 y PMI además de ensayando la eficacia frente al gusano de raíz de maíz.

Según un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN heteróloga insertada en el genoma de la planta de maíz de evento de maíz MIR604 y al menos 10 nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz de evento de maíz MIR604. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con este aspecto puede comprender al menos 20 o al menos 50 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604, y al menos 20 o al menos 50 nucleótidos

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contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga Insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica, que comprende al menos una secuencia de unión del evento MIR604 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, y sus complementos. Una secuencia de unión abarca la unión entre el ADN heterólogo que comprende los casetes de expresión insertados en el genoma de maíz y el ADN del genoma de maíz que flanquea el sitio de inserción, y es un diagnóstico para el evento MIR604.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que liga una molécula de ADN heteróloga al genoma de la planta de maíz en el evento de maíz MIR604 que comprende una secuencia de alrededor de 11 a alrededor de 20 nucleótidos contiguos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, y sus complementos.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y sus complementos.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un amplicón que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención.

Según todavía otro aspecto de la invención, se proporcionan cebadores de secuencias flanqueantes para detectar el evento MIR604. Tales cebadores de secuencias flanqueantes comprenden una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1-801 como se expone en SEC ID NO: 3 (designada arbitrariamente en la presente como la secuencia de flanqueo 5’), o sus complementos. En una realización de este aspecto, los cebadores de secuencias flanqueantes se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID NO:7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, y sus complementos.

En otro aspecto de la invención, los cebadores de secuencias flanqueantes comprenden una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 507-1570 como se expone en SEC ID NO: 4 (designada arbitrariamente aquí como la secuencia flanqueante 3’), o sus complementos. En una realización de este aspecto, los cebadores de secuencias flanqueantes se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, y sus complementos.

Según otro aspecto de la invención, se proporcionan, por ejemplo, pares de cebadores que son útiles para amplificación de ácido nucleico. Tales pares de cebadores comprenden un primer cebador que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 10-15 nucleótidos contiguos de longitud que es o es complementaria a una de las secuencias de flanqueo genómlcas descritas anteriormente (SEC ID NO: 3, o SEC ID NO: 4), y un segundo cebador que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 10-15 nucleótidos contiguos de ADN heterólogo insertado en el genoma del evento MIR604. El segundo cebador preferiblemente comprende una secuencia nucleotídica la cual es o es complementaria a la secuencia de inserto adyacente a la secuencia de ADN flanqueante genómica de la planta como se expone en SEC ID NO: 3 desde la posición nucleotídica 802 hasta 1310 y en SEC ID NO: 4 desde la posición nucleotídica 1 hasta 506.

Según otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para detectar la presencia de ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica. Tales métodos comprenden: (a) poner en contacto de la muestra que comprende ADN con un par de cebadores que, cuando se usan en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de maíz MIR604, produce un amplicón que es de diagnóstico para el evento de maíz MIR604; (b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esa manera el amplicón; y (c) detectar el amplicón. En una realización de este aspecto, el amplicón comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, y sus complementos.

Según otro aspecto, la invención proporciona métodos para detectar la presencia de un ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica. Tales métodos comprenden: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN genómico del evento de maíz MIR604 y que no se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN de una planta de maíz de control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación muy restrictivas; y (c) detectar la hibridación de la sonda al ADN.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un kit para la detección de ácidos nucleicos del evento MIR604 en una muestra biológica. El kit incluye al menos una secuencia de ADN que comprende una longitud suficiente de polinucleótidos que es o es complementaria a SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, o SEC ID NO: 4, en el que las secuencias de ADN son útiles como cebadores o sondas que se hibridan a ADN aislado del evento MIR604, y que, con la amplificación de o hibridación a una secuencia de ácido nucleico en una muestra seguido de la detección del amplicón o hibridación a la secuencia diana, son de diagnóstico para la presencia de secuencias de

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ácido nucleico del evento MIR604 en la muestra. El kit además incluye otros materiales necesarios para hacer posible métodos de hibridación o amplificación de ácido nucleico.

En otro aspecto, la presente Invención proporciona un método para detectar proteína de evento de maíz MIR604 en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer proteína de una muestra de tejido de evento de maíz MIR604; (b) ensayar la proteína extraída usando un método ¡nmunológlco que comprende anticuerpo específico para la proteína marcadora Insecticida o seleccionare producida por el evento MIR604; y (c) detectar la unión de dicho anticuerpo a la proteína marcadora insecticida o seleccionable.

En otro aspecto, la presente Invención proporciona una muestra biológica derivada de una planta, tejido o semilla de maíz de evento MIR604, en la que la muestra comprende una secuencia nucleotldlca que es o es complementaria a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, y en la que la secuencia es detectable en la muestra usando un método de amplificación o hibridación de ácido nucleico. En una realización de este aspecto, la muestra se selecciona del grupo que consiste en harina de maíz, harina molida de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados en su totalidad o en parte para contener subproductos de maíz.

En otro aspecto, la presente Invención proporciona un extracto derivado de una planta, tejido o semilla de maíz de evento MIR604 que comprende una secuencia nucleotldlca que es o es complementaria a una secuencia nucleotldica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2. En una realización de este aspecto, la secuencia es detectable en el extracto usando un método de amplificación de ácido nucleico o hibridación de ácido nucleico. En otra realización de este aspecto, la muestra se selecciona del grupo que consiste en harina de maíz, harina molida de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados en su totalidad o en parte para contener subproductos de maíz.

Según otro aspecto de la Invención, se proporcionan plantas y semillas de maíz que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la Invención.

Según otro aspecto, la presente Invención proporciona un método para producir una planta de maíz resistente a al menos infestación de gusano de raíz de maíz, que comprende: (a) cruzar sexualmente una primera planta de maíz progenltora con una segunda planta de maíz progenltora, en el que dicha primera o segunda planta de maíz progenltora comprende ADN de evento de maíz MIR604, produciendo de esa manera una pluralidad de plantas de progenie de primera generación; (b) seleccionar una planta de progenie de primera generación que es resistente a al menos infestación de gusano de raíz de maíz; (c) autofecundar la planta de progenie de primera generación, produciendo de esa manera una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación; (d) seleccionar de las plantas de progenie de segunda generación, una planta que al menos es resistente a infestación de gusano de raíz de maíz; en el que las plantas de progenie de segunda generación comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2.

Según todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir semilla de maíz, que comprende cruzar una primera planta de maíz progenltora con una segunda planta de maíz progenltora y cosechar las semillas de maíz de primera generación resultantes, en el que la primera o segunda planta de maíz progenltora es una planta de maíz endogámica de la invención.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir semillas de maíz híbridas, que comprende las etapas de: (a) sembrar semillas de una primera línea de maíz endogámica según la invención y semillas de una segunda línea de maíz endogámica que tiene un genotipo diferente; (b) cultivar plantas de maíz que resultan de dicha siembra hasta el momento de la floración; (c) emascular flores de plantas de maíz de una las líneas endogámlcas de maíz; (d) permitir que suceda la polinización de la otra línea endogámica, y (e) cosechar las semillas híbridas producidas de ese modo.

Lo anterior y otros aspectos de la invención serán más manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada. DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 1 es la unión de genoma-inserto 5’.

SEC ID NO: 2 es la unión de inserto-genoma 3’.

SEC ID NO: 3 es la secuencia de genoma + inserto 5’.

SEC ID NO: 4 es la secuencia de inserto + genoma 3’.

SEC ID NO: 5 es genoma de maíz que flanquea en 5’ al inserto.

SEC ID NO: 6 es genoma de maíz que flanquea en 3’ al inserto.

SEC ID Nos: 7-15 son cebadores de secuencias flanqueantes de 5’ útiles en la presente Invención.

SEC ID Nos: 16-20 son cebadores de la secuencia del promotor MTL útiles en la presente Invención.

SEC ID Nos: 21-28 son cebadores de la secuencia de cry3A055 útiles en la presente Invención.

SEC ID Nos: 29-30 son cebadores de la secuencia de ZmUbilnt útiles en la presente Invención.

SEC ID Nos: 31-37 son cebadores de la secuencia de pmi útiles en la presente invención.

5 SEC ID NO: 38 es un cebador de la secuencia de NOS útil en la presente invención.

SEC ID Nos: 39-46 son cebadores de secuencias flanqueantes de 3’ útiles en la presente invención.

SEC ID Nos: 47-49 son cebadores y sondas TAQMAN® de cry3A055.

SEC ID Nos: 50-52 son cebadores y sondas TAQMAN® de pmi.

SEC ID Nos: 53-55 son cebadores y sondas TAQMAN® de ZmADH.

10 SEC ID NO: 56 es una sonda de MIR604 útil en la presente invención.

SEC ID NO: 57 es la secuencia para la región de frontera derecha.

SEC ID NO: 58 es la secuencia del promotor MTL.

SEC ID NO: 59 es la secuencia del gen c/y3A055.

SEC ID NO: 60 es la secuencia del terminador de NOS.

15 SEC ID NO: 61 es la secuencia del promotor ZmUbilnt.

SEC ID NO: 62 es la secuencia del gen pmi.

SEC ID NO: 63 es la secuencia de la región de frontera izquierda.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 ilustra un vector de expresión de planta designado pZM26. El mapa identifica el sitio de restricción Kpnl 20 usado para análisis de Southern.

La Figura 2 es un mapa gráfico que ilustra la organización de los elementos que comprenden las secuencias de ácido nucleico heterólogas insertadas dentro del genoma de evento de maíz MIR604 y establece las posiciones relativas en las que las secuencias de ácido nucleico insertadas se ligan a secuencias de ADN genómico de maíz las cuales flanquean los extremos de las secuencias de ADN heterólogas insertadas. 1 = genoma vegetal 25 flanqueante 5’ (SEC ID NO: 5); 2 = región de frontera derecha (SEC ID NO: 57); 3 = promotor MTL (SEC ID NO: 58); 4 = gen cry3A055 (SEC ID NO: 59); 5 = terminador NOS (SEC ID NO: 60); 6 = promotor ZmUbiINT (SEC ID NO: 61); 7 = gen pmi (SEC ID NO: 62); 8 = terminador NOS (SEC ID NO: 60); 9 = región de frontera izquierda (SEC ID NO: 63); y 10 = genoma vegetal flanqueante 3’ (SEC ID NO: 6).

DEFINICIONES

30 Las siguientes definiciones y métodos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a aquellos de pericia normal en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, los términos usados aquí están para ser entendidos de acuerdo con el uso convencional por aquellos de pericia normal en la técnica pertinente. Las definiciones de términos comunes en biología molecular también se pueden encontrar en Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edición, Springer-Verlag: Nueva 35 York, 1994.

Como se usa aquí, el término “amplificado” significa la construcción de copias múltiples de una molécula de ácido nucleico o copias múltiples complementarias a la molécula de ácido nucleico usando al menos una de las moléculas de ácido nucleico como un molde. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), sistema de reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación basada en secuencia de ácido 40 nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), sistemas Q-Beta Replicase, sistema de amplificación basada en transcripción (TAS), y amplificación por desplazamiento de hebra (SDA). Véase, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, D. H. Persing et al., Ed. American Society for Micro biology, Washington, D. C. (1993). El producto de amplificación se denomina un amplicón.

Una “secuencia codificante” es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en ARN tal como ARNm, ARNr, 45 ARNt, ARNnp, ARN codificante o ARN no codificante. Preferiblemente, el ARN se traduce luego en un organismo para producir una proteína.

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“Kit de detección”, como se usa aquí, se refiere a un kit usado para detectar la presencia o ausencia de ADN de plantas de MIR604 en una muestra, que comprende sondas y cebadores de ácido nucleico de la presente invención, que se hibridan específicamente en condiciones muy restrictivas a una secuencia de ADN diana, y otros materiales necesarios para hacer posibles los métodos de hibridación o amplificación de ácido nucleico.

Como se usa aquí, el término “evento” transgénico se refiere a una planta recombinante producida por transformación y regeneración de una célula vegetal única con ADN heterólogo, por ejemplo un casete de expresión que incluye un gen de interés. El término “evento” se refiere al transformante original y/o progenie del transformante que incluye el ADN heterólogo. El término “evento” también se refiere a progenie producida por un cruce sexual entre el transformante y otra línea de maíz. Aún después del retrocruzamiento repetido con un progenitor recurrente, el ADN insertado y el ADN de flanqueo del progenitor transformado está presente en la progenie del cruce en la misma localización cromosómica. Normalmente, la transformación de tejido vegetal produce eventos múltiples, cada uno de los cuales representan inserción de un constructo de ADN en una localización diferente en el genoma de una célula vegetal. En base a la expresión del transgén u otras características deseables, se selecciona un evento particular. Así, “evento MIR604”, “MIR604” o “evento MIR604”, como se usa aquí, significa el transformante de MIR604 original y/o la progenie del transformante de MIR604.

“Casete de expresión”, como se usa aquí, significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia nucleotídica particular en una célula hospedante apropiada, que comprende un promotor ligado operablemente a la secuencia nucleotídica de interés que está ligada operablemente a señales de terminación. También comprende típicamente secuencias requeridas para traducción apropiada de la secuencia nucleotídica. El casete de expresión también puede comprender secuencias no necesarias en la expresión directa de una secuencia nucleotídica de interés pero que están presentes debido a sitios de restricción convenientes para la eliminación del casete de un vector de expresión. El casete de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de interés puede ser quimérico, significando que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también puede ser uno de origen natural pero que se ha obtenido en una forma recombinante útil para expresión heteróloga. Típicamente, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al hospedante, esto es, la secuencia de ácido nucleico particular del casete de expresión no aparece de forma natural en la célula hospedante y debe haber sido introducida dentro de la célula hospedante o en un ancestro de la célula hospedante mediante un proceso de transformación conocido en la técnica. La expresión de la secuencia nucleotídica en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción solamente cuando la célula hospedante se expone a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta, el promotor también puede ser específico para un tejido particular, u órgano, o etapa del desarrollo. Un casete de expresión, o fragmento de este, también puede ser referido como “secuencia insertada” o “secuencia de inserción” cuando se transforma en una planta.

Un “gen” es una región definida que se localiza dentro de un genoma y que, además de la secuencia de ácido nucleico codificante mencionada anteriormente, comprende otras secuencias de ácido nucleico, principalmente reguladoras, responsables del control de la expresión, es decir, la transcripción y traducción, de la porción codificante. Un gen también puede comprender otras secuencias no traducidas 5’ y 3’ y secuencias de terminación. Otros elementos que pueden estar presentes son, por ejemplo, intrones.

“Gen de interés” se refiere a cualquier gen el cual, cuando se transfiere a una planta, confiere en la planta una característica deseada tal como resistencia a antibióticos, resistencia a virus, resistencia a insecto, resistencia a enfermedad, o resistencia a otras plagas, tolerancia a herbicidas, valor nutricional mejorado, comportamiento mejorado en un proceso industrial o capacidad reproductiva alterada. El “gen de interés” también puede ser uno que se transfiere a plantas para la producción de enzimas o metabolitos de valor comercial en la planta.

“Genotipo”, como se usa aquí, es el material genético heredado de plantas de maíz progenitoras, el cual no todo se expresa necesariamente en las plantas de maíz descendientes. El genotipo MIR604 se refiere al material genético heterólogo transformado en el genoma de una planta además del material genético que flanquea la secuencia insertada.

Una secuencia de ácido nucleico “heteróloga” es una secuencia de ácido nucleico no asociada naturalmente con una célula hospedante en la cual se introduce, incluyendo copias múltiples de origen no natural de una secuencia de ácido nucleico de origen natural.

Una secuencia de ácido nucleico “homologa” es una secuencia de ácido nucleico asociada naturalmente con una célula hospedante dentro de la cual se introduce.

“Ligado operablemente” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico tal que la función de una afecta a la función de la otra. Por ejemplo, un promotor se liga operablemente con una secuencia codificante o ARN funcional cuando es capaz de afectar la expresión de aquella secuencia codificante o ARN funcional (esto es, que la secuencia codificante o ARN funcional está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes en orientación codificante o no codificante se pueden ligar operablemente a secuencias reguladoras.

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“Cebadores”, como se usa aquí, son ácidos nucleicos aislados que se hibridan a una hebra de ADN diana complementaria mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, luego se alargan a lo largo de la hebra de ADN diana mediante una polimerasa, tal como ADN polimerasa. Los pares o conjuntos de cebadores se pueden usar para amplificación de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos convencionales.

Una “sonda” es un ácido nucleico aislado al cual se acopla un marcador detectable convencional o molécula informadora, tales como un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima. Tal sonda es complementaria a una hebra de un ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención, a una hebra de ADN genómico de evento de maíz, MIR604. El ADN genómico de MIR604 puede ser de una planta de maíz o de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas según la presente invención incluyen no solamente ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y se pueden usar para detectar la presencia de esa secuencia de ADN diana.

Los cebadores y sondas generalmente tienen entre 10 y 15 nucleótidos o más de longitud, los cebadores y sondas también pueden ser de al menos 20 nucleótidos o más de longitud, o al menos 25 nucleótidos o más, o al menos 30 nucleótidos o más de longitud. Tales cebadores y sondas se hibridan específicamente a una secuencia diana en condiciones de hibridación muy restrictivas. Los cebadores y sondas según la presente invención pueden tener una complementariedad de secuencia completa con la secuencia diana, aunque se pueden mediante métodos convencionales diseñar sondas que difieren de la secuencia diana y que retienen la capacidad para hibridarse a secuencias diana.

“Condiciones restrictivas” o “condiciones de hibridación restrictivas” incluyen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia diana, hasta un grado detectablemente mayor que a otras secuencias. Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia diana y diferirán dependiendo de la estructura del polinucleótido. Mediante el control de la restricción de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana las cuales son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de restricción se pueden ajustar para permitir cierto desemparejamiento en las secuencias de manera que se detecten menores grados de similitud (sondeo heterólogo). Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Technigues in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic acid probes, Parte I, Capítulo 2 “OverView of principies of hibridation and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier: Nueva York; y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lntrescience: Nueva York (1995), y también Sambrook et al., (2001) Molecular cloning: A Laboratory Manual (5a Ed. Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY).

La especificidad es típicamente la función de lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la disolución de lavado final. Generalmente, las condiciones de hibridación y lavado muy restrictivas se seleccionan para ser alrededor de 5°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana se híbrida a una sonda perfectamente emparejada. Típicamente, en condiciones muy restrictivas una sonda se hibridará a su subsecuencia diana, pero no a otras secuencias.

Un ejemplo de condiciones de hibridación muy restrictivas para hibridación de ácidos nucleicos complementarios los cuales tienen más de 100 restos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42°C, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado de restricción muy elevada es NaCI 0,15M a 72°C durante alrededor de 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado muy restrictivas es un lavado SSC 0,2x a 65°C durante 15 minutos (véase, Sambrook, más abajo, para una descripción de disolución amortiguadora SSC).

Las condiciones de hibridación ejemplares para la presente invención incluyen hibridación en SDS al 7%, NaP04 0,25 M pH 7,2 a 67°C durante la noche, seguido de dos lavados en SDS al 5%, NaP04 0,20 M pH 7,2 a 65°C durante 30 minutos cada lavado, y dos lavados en SDS al 1%, NaPC>4 0,20 M pH 7,2 a 65°C durante 30 minutos cada lavado. Un lavado de restricción media ejemplar para dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1x SSC a 45°C durante 15 minutos. Un lavado de restricción baja ejemplar para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40°C durante 15 minutos.

Para sondas de alrededor de 10 hasta 50 nucleótidos, las condiciones muy restrictivas típicamente implican concentraciones de sal de menos de alrededor de 1,0 M de ion de Na, típicamente una concentración de alrededor de 0,01 a 1,0 M de ion de Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura típicamente es al menos alrededor de 30°C. Las condiciones muy restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o mayor) que aquella observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones muy restrictivas son todavía sustancialmente idénticos si

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las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético.

Los siguientes son conjuntos ejemplares de condiciones de hibridación/lavado que se pueden usar para hibridar secuencias nucleotídicas que son sustancialmente idénticas a secuencias nucleotídicas de referencia de la presente invención: una secuencia nucleotídica de referencia preferiblemente se híbrida a la secuencia nucleotídica de referencia en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaP¿4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 2X, SDS al 0,1% a 50°C, más deseablemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaP04 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 1X, SDS al 0,1% a 50°C, todavía más deseablemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPCU 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0,5X, SDS al 0,1% a 50°C, preferiblemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPCU 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0,1X, SDS 0.1% a 50°C, más preferiblemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPCU 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0,1X, SDS 0,1% a 65°C. Las secuencias de la presente invención se pueden detectar usando todas las condiciones anteriores. Con el fin de definir la invención, se usan las condiciones muy restrictivas.

“Transformación” es un proceso para introducir un ácido nucleico heterólogo en una célula u organismo hospedante. En particular, “transformación” significa la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

“Transformado/transgénico/recombinante” se refiere a un organismo hospedante tal como una bacteria o una planta en la cual una molécula de ácido nucleico heteróloga se ha introducido. La molécula de ácido nucleico puede ser integrada establemente dentro del genoma del hospedante, o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Tal molécula extracromosómica puede ser autorreplicante. Se entiende que las células, tejidos o plantas transformadas engloban no solamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica de este. Un hospedante “no transformado”, “no transgénico”, o “no recombinante” se refiere a un organismo de tipo silvestre, por ejemplo una bacteria o planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heteróloga. Como se usa aquí, “transgénico” se refiere a una planta, célula vegetal, o multitud de células vegetales estructuradas o no estructuradas que tienen integrado, vía técnicas bien conocidas de manipulación genética e inserción génica, una secuencia de un ácido nucleico que representa un gen de interés dentro del genoma de la planta, y típicamente dentro de un cromosoma de un núcleo celular, mitocondria u otro orgánulo que contiene cromosomas, en una ubicación diferente a, o en un número de copias mayor que, aquel presente normalmente en la planta o célula vegetal nativa. Las plantas transgénicas resultan de la manipulación e inserción de las secuencias de ácido nucleico, en oposición a mutaciones de origen natural, para producir una planta de origen no natural o una planta con un genotipo de origen no natural. Las técnicas para transformación de plantas y células vegetales son bien conocidas en la técnica y pueden comprender por ejemplo electroporación, microinyección, transformación mediada por Agrobacterlum, y transformación balística.

Se usa aquí la nomenclatura de bases de ADN y aminoácidos como se expone en 37 C.F.R. § 1.822.

Esta invención se refiere a una línea mejorada genéticamente de maíz que produce la proteína de control de insectos, Cry3A055, y una enzima fosfomanosa ¡somerasa (PMI) que permite a la planta utilizar mañosa como una fuente de carbono. La invención se refiere particularmente a un evento de maíz transgénico designado MIR604 que comprende un genotipo novedoso, así como a composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos de este evento en una muestra biológica. La invención se refiere además a plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604, a semillas transgénicas de las plantas de maíz, y a métodos para producir una planta de maíz que comprende el genotipo MIR604 por cruzamiento de un maíz endogámico que comprende el genotipo MIR604 con él mismo u otra línea de maíz. Las plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604 de la invención son útiles para controlar plagas de insectos coleópteros que Incluyen Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de raíz de maíz del oeste, D. virgifera zeae, el gusano de raíz de maíz mejicano, y D. longicornis barberi, el gusano de raíz de maíz del norte. Las plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604 de la Invención también son capaces de utilizar mañosa como una fuente de carbono.

En una realización, la presente Invención comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10 o más (por ejemplo, 15, 20, 25, ó 50) nucleótldos contiguos de una secuencia de ADN heteróloga Insertada dentro del genoma de planta de maíz del evento de maíz MIR604 y al menos 10 o más (por ejemplo, 15, 20, 25 ó 50) nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga Insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604. También están incluidas las secuencias nucleotídicas que comprenden 10 o más nucleótldos de secuencia de Inserto contigua del evento MIR604 y al menos un nucleótldo de ADN de flanqueo del evento MIR604 adyacente a la secuencia de inserto. Tales secuencias nucleotídicas son de diagnóstico para evento MIR604. La amplificación de ácido nucleico de ADN genómlco del evento MIR604 produce un ampllcón que comprende tales secuencias nucleotídicas de diagnóstico.

En otra realización, la invención comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos una secuencia de unión del evento MIR604 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, y sus complementos, en la que una secuencia de unión abarca la unión

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entre un casete de expresión heterólogo insertado dentro del genoma de maíz y el ADN del genoma de maíz que flanquea el sitio de inserción y es de diagnóstico para el evento.

En otra realización, la presente invención comprende un ácido nucleico aislado que liga una molécula de ADN heteróloga al genoma de la planta de maíz en el evento de maíz MIR604, que comprende una secuencia de desde alrededor de 11 hasta alrededor de 20 nucleótidos contiguos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, y sus complementos.

En otra realización, la invención comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y sus complementos.

En una realización de la presente invención, se proporciona un amplicón que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y sus complementos.

En otra realización, la presente invención comprende cebadores de secuencia de flanqueo para detectar el evento MIR604. Tales cebadores de secuencia de flanqueo comprenden una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10-15 nucleótidos contiguos de nucleótidos 1-801 de SEC ID NO: 3 (designada arbitrariamente aquí como la secuencia de flanqueo 5’), o sus complementos. En un aspecto de esta realización, los cebadores de secuencia de flanqueo se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, y sus complementos.

En otra realización, la presente invención comprende cebadores de secuencia de flanqueo que comprenden al menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 507-1570 de SEC ID NO: 4 (designada arbitrariamente aquí como la secuencia de flanqueo 3’), o sus complementos. En un aspecto de esta realización, los cebadores de secuencia de flanqueo se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, y sus complementos.

En todavía otra realización, la presente invención comprende un par de cebadores pollnucleotldlcos que comprenden un primer cebador polinucleotídico y un segundo cebador pollnucleotldlco los cuales funcionan juntos en la presencia de un molde de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz MIR604, en el que la primera secuencia de cebador es o es complementarla a un genoma de planta de maíz que flanquea el punto de Inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604, y la segunda secuencia de cebador pollnucleotldlco es o es complementaria a la secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604.

En un aspecto de esta realización, el primer cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de posición 1-801 de SEC ID NO: 3 o sus complementos. En un aspecto adicional de esta realización, el primer cebador polinucleotídico comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, o sus complementos. En otro aspecto de esta realización, el primer cebador pollnucleotldlco comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de posición 507-1570 de SEC ID NO: 4 o sus complementos. En otro aspecto de esta realización, el primer cebador polinucleotídico comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, o sus complementos. En todavía otro aspecto de esta realización, el segundo cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 63, o sus complementos. En todavía un aspecto adicional de esta realización, el segundo cebador polinucleotídico comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 16 hasta SEC ID NO: 38, o sus complementos.

En otro aspecto de esta realización, el primer cebador pollnucleotldlco, el cual se expone en SEC ID NO: 15, y el segundo cebador polinucleotídico el cual se expone en SEC ID NO: 28, funcionan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz MIR604 como se describe en el Ejemplo 4. En otro aspecto de esta realización, el primer cebador polinucleotídico, el cual se expone en SEC ID NO: 45, y el segundo cebador polinucleotídico el cual se expone en SEC ID NO: 27, funcionan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz MIR604 como se describe en el Ejemplo 4.

Por supuesto, es bien conocido dentro de la pericia en la técnica obtener secuencia adicional más externa en la secuencia genómica que flanquea cualquier extremo de las secuencias de ADN heterólogas Insertadas para uso como una secuencia cebadora que se puede usar en tales pares de cebadores para amplificar las secuencias que son de diagnóstico para el evento MIR604. Para los fines de esta descripción, la frase “más externa en la secuencia genómica que flanquea cualquier extremo de las secuencias de ADN heterólogas Insertadas” se refiere específicamente a un movimiento secuencial hacia afuera de los extremos de las secuencias de ADN heterólogas insertadas, los puntos en los cuales las secuencias de ADN insertadas son adyacentes a la secuencia de ADN

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genómico nativo, y externo en el ADN genómico del cromosoma particular en el que se insertaron las secuencias de ADN heterólogas. Preferiblemente, una secuencia cebadora que corresponde o es complementaria a una parte de la secuencia de inserto debería cebar el alargamiento transcripcional de una hebra naciente de ADN o ARN hacia la unión de secuencia de flanqueo más cercana. Consecuentemente, una secuencia cebadora que corresponde o es complementaria a una parte de la secuencia de flanqueo genómica debería cebar el alargamiento transcripcional de una hebra naciente de ADN o ARN hacia la unión de secuencia de flanqueo más cercana. Una secuencia cebadora puede ser, o puede ser complementaria a, una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del cromosoma de la planta, o una secuencia de flanqueo genómica. Un experto en la técnica podría reconocer fácilmente el beneficio de si una secuencia cebadora podría necesitar ser, o podría necesitar ser complementaria a, la secuencia como se expone dentro de la secuencia de ADN heteróloga insertada o como se expone en SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4 dependiendo de la naturaleza del producto deseado a obtener a través del uso del conjunto anidado de cebadores destinados para uso en la amplificación de una secuencia de flanqueo particular que contiene la unión entre la secuencia de ADN genómico y la secuencia de ADN heteróloga insertada.

En otra realización, la presente invención comprende un método para detectar la presencia de ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica, en el que el método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN genómico de evento de maíz MIR604 y que no se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN de una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación muy restrictivas; y (c) detectar la hibridación de la sonda al ADN. En un aspecto de esta realización, el amplicón comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y sus complementos.

En otra realización, la presente invención comprende un método para detectar la presencia de un ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica, en el que el método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN genómico del evento de maíz MIR604 y que no se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN de una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación muy restrictivas; y (c) detectar la hibridación de la sonda al ADN. La detección puede ser por cualquier medio bien conocido en la técnica que incluye pero no se limita a fluorescente, quimioluminiscente, radiológico, inmunológico, u otra manera. En el caso en el cual la hibridación está destinada a ser usada como un medio para la amplificación de una secuencia particular para producir un amplicón el cual es de diagnóstico para el evento de maíz MIR604, la producción y detección del amplicón, mediante cualquier medio bien conocido en la técnica, está destinada para ser indicativa de la hibridación pretendida a la secuencia diana en la que se utiliza una sonda o cebador, o secuencias en las que se utilizan dos o más sondas o cebadores. El término “muestra biológica” está destinado a comprender una muestra que contiene o es sospechosa de contener un ácido nucleico que comprende entre cinco y diez nucleótidos en cualquier lado del punto en el cual uno o el otro de los dos extremos terminales de la secuencia de ADN heteróloga insertada contacta la secuencia de ADN genómica dentro del cromosoma en el cual la secuencia de ADN heteróloga fue insertada, en la presente también conocidas como las secuencias de unión. Además, la secuencia de unión comprende como mínimo dos nucleótidos: siendo esos el primer nucleótido dentro del ADN genómico de flanqueo adyacente y ligado covalentemente al primer nucleótido dentro de la secuencia de ADN heteróloga insertada.

En todavía otra realización, la presente invención comprende un kit para detectar la presencia de ácidos nucleicos MIR604 en una muestra biológica, en el que el kit comprende al menos una molécula de ácido nucleico de suficiente longitud de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, que funciona como un cebador o sonda de ADN específica para el evento MIR604, y otros materiales necesarios para hacer posible la hibridación o amplificación de ácido nucleico. Se puede usar una variedad de métodos de detección que incluyen TAQMAN (Perkin Elmer), amplificación térmica, reacción en cadena de ligasa, hibridación de Southern, métodos de ELISA, y métodos de detección colorimétricos y fluorescentes. En particular, la presente invención proporciona kits para detectar la presencia de la secuencia diana, esto es, al menos una de las uniones del ADN inserto con el ADN genómico de la planta de maíz en MIR604, en una muestra que contiene ácido nucleico genómico de MIR604. El kit se compone de al menos un polinucleótido capaz de unirse al sitio diana o sustancialmente adyacente al sitio diana y al menos un medio para detectar la unión del polinucleótido al sitio diana. El medio de detección puede ser fluorescente, quimioluminiscente, colorimétrico, o isotópico, y puede estar acoplado al menos con métodos inmunológicos para detectar la unión. También se imagina un kit el cual pueda detectar la presencia del sitio diana en una muestra, esto es, al menos una de las uniones del ADN inserto con el ADN genómico de la planta de maíz en MIR604, aprovechando dos o más secuencias polinucleotídicas que juntas son capaces de unirse a secuencias nucleotídicas adyacentes a o en alrededor de 100 pares de bases, o en alrededor de 200 pares de bases, o en alrededor de 500 pares de bases o en alrededor de 1000 pares de bases de la secuencia diana y que se pueden alargar entre sí para formar un amplicón el cual contiene al menos el sitio diana.

En otra realización, la presente invención comprende un método para detectar proteína de evento MIR604 en una muestra biológica, comprendiendo el método: (a) extraer proteína de una muestra de tejido de evento de maíz MIR604; (b) ensayar la proteína extraída usando un método inmunológico que comprende anticuerpo específico para la proteína marcadora insecticida o seleccionable producida por el evento MIR604; y (c) detectar la unión de dicho anticuerpo a la proteína marcadora insecticida o seleccionable.

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Otra realización de la presente invención comprende una planta de maíz, o partes de la misma, que comprende el genotipo del evento transgénico MIR604, en la que el genotipo comprende la secuencia nucleotídlca expuesta en SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID N0:4, o sus complementos. En un aspecto de esta realización, la planta de maíz procede de las líneas de maíz endogámlco CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, BCTT609, AF031, H8431, 894, BUTT201, R327FI, 2044BT, y 2070BT. Sin embargo, el experto en la técnica reconocerá que el genotipo MIR604 se puede introgresar en cualquier variedad vegetal que procree con el maíz, Incluidas las especies de maíz salvajes, y, por lo tanto, no se pretende que las líneas endogámlcas preferidas de esta realización sean limitantes.

En otra realización, la presente invención comprende una planta de maíz que comprende al menos una primera y una segunda secuencia de ADN ligadas juntas para formar una secuencia nucleotídlca contigua, en la que la primera secuencia de ADN está dentro de una secuencia de unión y comprende al menos alrededor de 11 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en nucleótldos 792-811 de SEC ID NO:3; nucleótidos 497-516 de SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 5; SEC ID NO: 6; y sus complementos, en la que la segunda secuencia de ADN esta dentro de la secuencia de ADN de Inserto heteróloga seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 63, y sus complemento; y en la que la primera y la segunda secuencias de ADN son útiles como cebadores o sondas nucleotídicas para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico del evento de maíz MIR604 en una muestra biológica. En un aspecto de esta realización, los cebadores nucleótidos se usan en un método de amplificación de ADN para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN molde extraído de la planta de maíz, y la planta de maíz es identificable de otras plantas de maíz por la producción de un amplicón que corresponde a una secuencia de ADN que comprende SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2.

Las plantas de maíz, de la invención pueden además caracterizarse además por que la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpn\ da como resultado una única banda hibridante de cry3A055 usando una sonda específica para cry3A055 en condiciones muy restrictivas. En la presente se ejemplifica una sonda de cry3A055 que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 56 o SEC ID NO: 59.

Las plantas de maíz de la invención pueden además caracterizarse además porque la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpn\ da como resultado una única banda hibridante de pmi usando una sonda específica de pmi en condiciones muy restrictivas. En la presente se ejemplifica una sonda de pmi que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 62.

En una realización, la presente invención proporciona una planta de maíz, en la que el genotipo MIR604 confiere sobre la planta de maíz resistencia a los insectos o la capacidad para utilizar mañosa. En un aspecto de esta realización, el genotipo que confiere resistencia a insectos sobre la planta de maíz comprende un gen c/y3A055. En otro aspecto de esta realización, el genotipo que confiere sobre la planta de maíz la capacidad de utilizar mañosa comprende un gen pmi.

En una realización, la presente invención proporciona una muestra biológica derivada de una planta, tejido, o semilla de maíz de evento MIR604, en la que la muestra comprende una secuencia nucleotídica que es o es complementaria a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, y en la que la secuencia se detecta en la muestra usando un método de amplificación de ácido nucleico o hibridación de ácido nucleico. En un aspecto de esta realización, la muestra se selecciona de harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados totalmente o en parte para contener productos de maíz.

En otra realización, la presente invención proporciona un extracto derivado de una planta, tejido, o semilla de maíz de evento MIR604, que comprende una secuencia nucleotídica que es o es complementaria a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2. En un aspecto de esta realización, la secuencia se detecta en el extracto usando un método de amplificación de ácido nucleico o de hibridación de ácido nucleico. En otro aspecto de esta realización, la muestra se selecciona de harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados completamente o en parte para contener productos de maíz.

Aún en otra realización, la presente invención proporciona un método para producir una planta de maíz resistente a al menos una infestación de gusanos de raíz de maíz, que comprende: (a) cruzar sexualmente una primera planta de maíz progenitora con una segunda planta de maíz progenitora, en el que dicha primera o segunda planta de maíz progenitora comprende el ADN del evento de maíz MIR604, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de progenie de primera generación; (b) seleccionar una planta de progenie de primera generación que es resistente a al menos la infestación de gusanos de raíz del maíz; (c) autofecundar la planta de progenie de primera generación, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación; y (d) seleccionar de las plantas de progenie de segunda generación, una planta que es al menos resistente a la infestación de gusanos de raíz del maíz; en el que las plantas de progenie de segunda generación comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2.

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En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir semillas de maíz híbridas, que comprende: (a) sembrar semillas de una primera línea de maíz endogámica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, y semillas de una segunda línea endogámica que tiene un genotipo diferente; (b) cultivar las plantas de maíz que resultan de dicha siembra hasta el momento de la floración; (c) emascular dichas flores de plantas de una de las líneas endogámicas de maíz; (d) cruzar sexualmente entre sí las dos líneas endogámicas diferentes; y (e) cosechar la semilla híbrida producida de ese modo. En un aspecto de esta realización, la primera línea de maíz endogámica proporciona los progenitores femeninos. En otro aspecto de esta realización, la primera línea de maíz endogámica proporciona los progenitores masculinos. La presente invención también comprende la semilla híbrida producida por el método divisado, y plantas híbridas que se hacen crecer a partir de la semilla.

Un experto en la técnica reconocerá que el genotipo transgénico de la presente invención se puede introgresar mediante reproducción en otras líneas de maíz que comprenden diferentes genotipos transgénicos. Por ejemplo, el maíz endogámico que comprende el genotipo transgénico de la presente invención se puede cruzar con un maíz endogámico que comprende el genotipo transgénico del evento Bt11 resistente a lepidópteros, que se conoce en la técnica, produciendo de esta manera semillas de maíz que comprenden tanto el genotipo transgénico de la invención como el genotipo transgénico Bt11. Los ejemplos de otros eventos transgénicos que pueden cruzarse con un endogámico de la presente invención incluyen los eventos tolerantes al glifosato GA21 y NK603, el evento MON802 resistente a insectos lepidópteros/tolerante a glifosato, el evento DBT418 resistente a lepidópteros, el evento DAS-06275-8 resistente a lepidópteros, el evento MS3 estéril masculino, el evento B16 tolerante a la fosfinotricina, el evento MON 80100 resistente a insectos lepidópteros, los eventos T14 y T25 tolerantes a fosfinotricina, el evento 176 resistente a insectos lepidópteros, y el evento MON863 resistente a coleópteros, todos los cuales se conocen en la técnica. Se reconocerá además que se pueden realizar otras combinaciones con el genotipo transgénico de la invención y, por lo tanto, estos ejemplos no deben considerarse limitantes.

Un experto en la técnica también reconocerá que la semilla de maíz transgénico que comprende el genotipo transgénico de la presente invención puede tratarse con diversas sustancias químicas de tratamiento de semillas, incluyendo insecticidas, para aumentar o sinergizar la actividad insecticida de la proteína Cry3A055. Por ejemplo, la semilla de maíz transgénica de la presente invención puede tratarse con el insecticida comercial Cruiser®. Tal combinación puede usarse para incrementar el espectro de actividad y para incrementar la eficacia de la proteína expresada y la sustancia química.

Reproducción

El genotipo transgénico de la presente invención puede hacer introgresar en cualquier maíz endogámico o híbrido que usa las técnicas de reproducción reconocidas en la técnica. El objetivo de la reproducción vegetal es combinar en una variedad o híbrido único diversos rasgos deseables. Para cultivos de campo, estos rasgos pueden incluir resistencia a insectos y enfermedades, tolerancia a herbicidas, tolerancia al calor y la sequía, reducción del tiempo para maduración del cultivo, mayor rendimiento, y calidad agronómica mejorada. Con la cosecha mecánica de muchos cultivos, es importante la uniformidad de características de la planta tales como germinación y establecimiento en reposo, velocidad de crecimiento, madurez, y altura de la planta y la mazorca.

Los cultivos de campo se reproducen a través de técnicas que aprovechan el método de polinización de la planta. Una planta se autopoliniza si el polen de una flor se transfiere a la misma u otra flor de la misma planta. Una planta se poliniza cruzadamente si el polen proviene de una flor en una planta diferente.

Las plantas que se han autopolinizado y seleccionado por tipo para muchas generaciones se vuelven homocigotas en casi todos los loci génicos, y producen una población uniforme de progenie de reproducción verdadera. Un cruzamiento entre dos líneas homocigóticas diferentes produce una población uniforme de plantas híbridas que pueden ser heterocigotas para muchos loci génicos. Un cruzamiento de dos plantas, cada una heterocigota en un número de loci génicos, producirá una población de plantas híbridas que difieren genéticamente y no serán uniformes.

El maíz se puede reproducir mediante técnicas tanto de autopolinización y como de polinización cruzada. El maíz tiene flores masculinas y femeninas separadas en la misma planta, localizadas sobre la panoja y la mazorca, respectivamente. La polinización natural ocurre en el maíz cuando el viento hace volar el polen desde las panojas hasta las sedas que sobresalen de las puntas de las mazorcas.

Un método fiable para controlar la fertilidad masculina en plantas ofrece la oportunidad de reproducción vegetal mejorada. Esto es especialmente cierto para desarrollo de híbridos de maíz, que se basa en algún tipo de sistema de esterilidad masculina. Existen varias opciones para controlar la fertilidad masculina disponibles para los cultivadores, tales como: emasculación (o despanojado) manual o mecánica, esterilidad masculina cltoplásmica, esterilidad masculina genética, gametocidas y similares.

La semilla de maíz híbrido típicamente se produce por un sistema de esterilidad masculina que Incorpora el despanojado manual o mecánico. Se plantan filas alternas de dos maíces endogámicos en un campo, y se eliminan las panojas que portan el polen de uno de los endogámicos (femenino). Siempre y cuando hay suficiente aislamiento

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de fuentes de polen de maíz externo, las mazorcas del endogámico despanojado serán fertilizadas solamente desde el otro endogámico (masculino), y la semilla que resulta es por lo tanto híbrida y formará plantas híbridas.

El proceso de despanojado laborioso, y ocasionalmente no fiable, puede ser evitado mediante el uso de uno de muchos métodos para conferir esterilidad masculina genética en la técnica, cada uno con sus propios beneficios e inconvenientes. Estos métodos usan una variedad de enfoques tales como suministrar a la planta un gen que codifica una sustancia citotóxica asociada con un promotor específico de tejido masculino, o un sistema no codificante en el que se identifica un gen crítico para la fertilidad y un no codificante para ese gen se inserta en la planta (véase: Fabinjanski, et al., EPO 89/3010153.8 publicación n° 329.308 y solicitud PCT n° PCT/CA90/00037 publicada como WO 90/08828).

Desarrollo de líneas endogámicas de maíz

El uso de endogámicos estériles masculinos es un y solo un factor en la producción de híbridos de maíz. Las técnicas de reproducción vegetal conocidas en la técnica y usadas en un programa de reproducción de planta de maíz incluyen, pero no se limitan a, selección recurrente, retrocruzamiento, reproducción de linaje, selección mejorada de polimorfismo de longitud de restricción, selección mejorada de marcador genético y transformación. El desarrollo de híbridos de maíz en un programa de reproducción de planta de maíz requiere, en general, el desarrollo de líneas endogámicas homocigotas, el cruzamiento de estas líneas, y la evaluación de los cruces. Los métodos de reproducción de linaje y reproducción por selección recurrente se usan para desarrollar líneas endogámicas de poblaciones de reproducción. Los programas de reproducción de planta de maíz combinan los antecedentes genéticos de dos o más líneas endogámicas u otras diferentes fuentes de germoplasma en conjuntos de reproducción a partir de los cuales se desarrollan nuevas líneas endogámicas por autofecundación y selección de fenotipos deseados. Los nuevos endogámicos se cruzan con otras líneas endogámicas, y los híbridos de estos cruces se evalúan para determinar cuál de ellos tiene potencial comercial. La reproducción vegetal y el desarrollo de híbridos, como se practica en un programa de reproducción de planta de maíz, son procesos caros y consumen tiempo.

La reproducción de linaje comienza con el cruce de dos genotipos, cada uno de los cuales puede tener una o más características deseables que falta en el otro o que complementa al otro. Si los dos progenitores originales no proporcionan todas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de reproducción. En el método de linaje, las plantas superiores son autofecundadas y seleccionadas en generaciones sucesivas. En las generaciones subsiguientes, la condición heterocigota cede el paso a líneas homogéneas como resultado de la autopolinización y la selección. Típicamente en el método de reproducción de linaje, se practican cinco o más generaciones de autofecundación y selección: Fi -» F¿ F2 -» F3; F3 -» F¿ F4 -» F5; etc.

La reproducción por selección recurrente, por ejemplo retrocruzamiento, se puede usar para mejorar una línea endogámica y un híbrido que se obtiene usando aquellos endogámicos. El retrocruzamiento se puede usar para transferir un rasgo deseable específico de un endogámico o fuente a un endogámico que carece de ese rasgo. Esto se puede lograr, por ejemplo, cruzando en primer lugar un endogámico superior (progenitor recurrente) a un endogámico donante (progenitor no recurrente), que porta el o los genes apropiados para el rasgo en cuestión. La progenie de este cruce se aparea luego nuevamente con el progenitor recurrente superior seguido de la selección en la progenie resultante para el rasgo deseado a transferir del progenitor no recurrente. Después de cinco o más generaciones de retrocruzamiento con selección del rasgo deseado, la progenie será homocigota para los loci que controlan la característica que se transfiere, pero será como el progenitor superior para esencialmente todos los otros genes. La última generación de retrocruzamiento es luego autofecundada para dar progenie de reproducción pura para el o los genes que se transfieren. Un híbrido desarrollado de endogámicos que contienen el o los genes transferidos es esencialmente el mismo que un híbrido desarrollado de los mismos endogámicos sin el o los genes transferidos.

Las líneas endogámicas de élite, esto es, líneas endogámicas homocigotas de reproducción pura, también se pueden usar como materiales de partida para poblaciones de reproducción o fuentes a partir de las cuales se desarrollan otras líneas endogámicas. Estas líneas endogámicas derivadas de líneas endogámicas élite pueden desarrollarse usando los métodos de reproducción de linaje y de reproducción por selección recurrente descritos anteriormente. Como un ejemplo, cuando la reproducción de retrocruzamiento se usa para crear estas líneas derivadas en un programa de reproducción de planta de maíz, los endogámicos de élite se pueden usar como una línea parental o material de partida o población de fuente, y puede servir ya sea como el progenitor donante o recurrente.

Desarrollo de Híbridos de Maíz

Un híbrido de maíz de un solo cruce resulta del cruce de dos líneas endogámicas, cada una de las cuales tiene un genotipo que complementa el genotipo de la otra. La progenie híbrida de la primera generación se designa F-i. En el desarrollo de híbridos comerciales en un programa de reproducción de planta de maíz, solamente se buscan las plantas de híbrido F-i. Los híbridos F1 preferidos son más vigorosos que sus progenitores endogámicos. Este vigor del híbrido, o heterosis, se puede manifestar en muchos rasgos poligénicos, que incluyen crecimiento vegetativo aumentado y rendimiento aumentado.

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El desarrollo de un híbrido de maíz en un programa de reproducción de planta de maíz Implica tres etapas: (1) la selección de plantas de varios conjuntos de germoplasma para cruces de reproducción Inicial; (2) la autofecundación de las plantas seleccionadas a partir de los cruces de reproducción durante varias generaciones para producir una serie de líneas endogámicas, las cuales, aunque diferentes una de otra, se reproducen de verdad y son altamente uniformes; y (3) el cruce de las líneas endogámicas seleccionadas con diferentes líneas endogámicas para producir la progenie híbrida (F-i). Durante el proceso de reproducción en maíz, el vigor de las líneas disminuye. El vigor se restaura cuando dos líneas endogámicas diferentes se cruzan para producir la progenie híbrida (Fi). Una consecuencia importante de la homoclgosldad y homogeneidad de las líneas endogámicas es que el híbrido entre un par definido de endogámicos siempre será el mismo. Una vez que los endogámlcos que dan un híbrido superior se han identificado, la semilla híbrida se puede reproducir por un tiempo Indefinido en tanto que se mantenga la homogeneidad de los progenitores endogámlcos. Una gran parte del vigor del híbrido mostrado por los híbridos Fi se pierde en la siguiente generación (F2). Consecuentemente, la semilla de híbridos no se usa para plantar plantas madre.

La producción de semilla híbrida requiere la eliminación o inactivación del polen producido por el progenitor femenino. La eliminación o inactivación Incompleta del polen proporciona el potencial de autopollnlzaclón. Esta semilla autopolinizada inadvertidamente puede ser cosechada no intencionadamente y se puede envasar con la semilla híbrida.

Una vez que se siembra la semilla, es posible Identificar y seleccionar estas plantas autopolinizadas. Estas plantas autopolinizadas serán equivalentes genéticamente a la línea endogámica femenino usada para producir el híbrido.

Como es fácilmente manifiesto por un experto en la técnica, lo anterior es solamente algunas de las diversas formas mediante las cuales el endogámico de la presente invención se puede obtener por aquellos que buscan introgresar el genotipo transgénico de la invención en otras líneas de maíz. Están disponibles otros medios, y los ejemplos anteriores son solamente ilustrativos.

EJEMPLOS

La invención además estará descrita con referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos solamente, y no están destinados para ser limitantes a menos que se especifique de otra manera. Las técnicas de ADN recombinante y clonación molecular estándar usadas aquí son bien conocidas en la técnica y se describen por Ausubel (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Coid Spring Harbor, NY: Coid Spring Harbor Laboratory Press (2001); y porT. J. Silhavy, M. L. Berman, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY (1984).

Ejemplo 1. Transformación y selección del evento MIR604.

El evento MIR604 fue producido por transformación mediada por Agrobacterium de la línea de maíz endogámico (Zea mays) A188. El callo embriogénico tipo I se transformó esencialmente como se describe en Negrotto et al., (Plant Cell Reports 19:798-803, 2000), usando un fragmento de ADN de plásmido pZM26 (Figura 1). pZM26 contiene una secuencia nucleotídica que comprende casetes de expresión en tándem. El primer casete de expresión se compone de una secuencia de promotor MTL (Patente US 6.018.099) ligada operablemente a una secuencia codificante de cry3A055 ligada además operablemente a una secuencia de poliadenilación y terminación de trascripción del extremo 3’ de nopalina sintetasa. El segundo casete de expresión se compone de un promotor de ubiquitina de maíz (ZmUblnt) (Christensen et al., 1992 PMB 18:675) ligado operablemente a una secuencia codificante de pmi ligada además operablemente a una secuencia de poliadenilación y terminación de trascripción del extremo 3’ de nopalina sintasa.

Los embriones inmaduros se cortaron de mazorcas de 8-12 días y se enjuagaron con medio reciente en preparación para la transformación. Los embriones se mezclaron con la suspensión de células Agrobacterium que albergan el vector de transformación pZM26, se pusieron en torbellino durante 30 segundos, y se dejaron incubar durante unos 5 minutos adicionales. La disolución de Agrobacterium en exceso se aspiró, y los embriones se movieron entonces a placas que contienen un medio de cultivo no selectivo. Los embriones se cocultivaron con el Agrobacterium que queda a 22°C durante 2-3 días en la oscuridad. Los embriones se transfirieron a medio de cultivo suplementado con ticarcilina (100 mg/ml) y nitrato de plata (1,6 mg/l), y se incubaron en la oscuridad durante 10 días. Los embriones que producen callo embriogénico se transfirieron a medio de cultivo celular que contiene mañosa.

Las plántulas regeneradas se evaluaron mediante análisis de PCR de TAQMAN® (véase el Ejemplo 2) en busca de la presencia de ambos genes pmi y cry3A055, así como la ausencia del gen de espectomicina de resistencia antibiótica (Spec). Las plantas positivas para ambos transgenes, y las negativas para el gen spec, se transfirieron al invernadero para la propagación posterior. Los eventos positivos se identificaron y se cribaron usando bioensayos de insectos contra gusano de raíz de maíz. Los eventos insecticidas se caracterizaron para determinar el número de copias mediante análisis de TAQMAN®. El MIR604 se seleccionó para el análisis posterior basándose en que tiene una copia única de los transgenes, buena expresión proteica como se identifica mediante ELISA, y buena actividad insecticida contra gusano de raíz de maíz.

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El To MIR604 se retrocruzó con la linea de maíz endogámica CG00526, creando la población T-i. Las plantas Ti se autofecundaron para crear la generación T2, y este proceso se repitió para crear una generación T3. La evaluación de progenie de las plantas T3 se empleó para identificar familias homocigotas (convertidas). El endogámico CG00526 convertido de MIR604 se cruzó con otras líneas endogámlcas de élite para crear híbridos usados en estudios posteriores

Ejemplo 2. Detección de MIR604 mediante PCR de TAQMAN®

El análisis de TAQMAN® se llevó a cabo esencialmente como se describe en Ingham et al. (Blotechniques, 31:132- 140, 2001). Brevemente, el ADN genómico fue aislado de las hojas de plantas de maíz transgénicas y no transgénicas usando el kit de extracción de ADN genómico Puregene® (Gentra Systems, Mlnneapolis, MN) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que todas las etapas se llevaron a cabo en placas de 96 pocilios de 1,2 mi. El pelete de ADN seco se volvió a suspender en disolución amortiguadora TE (Tris- HCI 10 Mm, pH 8,0, EDTA 1 mM).

Las reacciones de PCR de TAQMAN® se llevaron a cabo en placas de 96 pocilios. Para el control del gen de maíz endógeno, se diseñaron cebadores y sondas específicos para el gen de alcohol deshidrogenasa (adh) Zea mays (n° de acceso Genbank AF044295). Se reconocerá por la persona experta que otros genes de maíz se pueden usar como controles endógenos. Las reacciones se multlplexaron para amplificar simultáneamente cry3A055 y adh o pmi y adh. Para cada muestra, se generó una mezcla maestra combinando 20 pl de ADN genómico extraído con 35 pl de 2x TAQMAN Universal PCR Master Mlx (Applied Blosystems) suplementada con cebadores hasta una concentración final de 900 nM cada uno, sondas hasta una concentración final de 100 nM cada una, y agua hasta un volumen final de 70 pl. Esta mezcla se distribuyó en tres réplicas de 20 pl cada una en placas de amplificación de 96 pocilios y se sellaron con película de sellado por calor ópticamente transparente (Marsh Blo Products). La PCR se ejecutó en el Instrumento ABI Prlsm 7700 usando los siguientes parámetros de amplificación: 2 mln. a 50°C y 10 min. a 95°C, seguido de 35 ciclos de 15 s a 95°C y 1 mln. a 60°C.

Los resultados del análisis de TAQMAN® demostraron que el evento MIR604 tuvo una copla del gen c/y3A055 y una copia del gen pmi.

Ejemplos de combinaciones de secuencia cebadora/sonda apropiadas las cuales que se usaron son:

Nombre del cebador Secuencia del cebador SEC ID NO:

Cry3A055-directo 5’-TACGAGAGCTGGGTGAACTTCA-3’ SEC ID NO: 47

Cry3A055-inverso 5’-CGATCAGGTCCAGCACGG-3’ SEC ID NO: 48

Cry3A055-sonda 5’-CCGCTACCGCCGCGAGATGA-3’ SEC ID NO: 49

(marcador 5’ = FAM, marcador 3’ = TAMRA)

PMI-directo

PMI-inverso

PMI-sonda

5’-CCGGGT GAAT CAGCGTTT -3’

5’-GCCGT GGCCTTT GACAGT -3’ 5’-TGCCGCCAACGAATCACCGG-3’ (marcador 5’ = FAM, marcador 3’ = TAMRA)

SEC ID NO: 50 SEC ID NO: 51 SEC ID NO: 52

ZmADH-267 directo 5’-GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT-3’

ZmADH-337 inverso 5’-TCCAGCAATCCTTGCACCTT-3’

ZmADH-316 sonda 5’-TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA-3’

(marcador 5’ = TET, marcador 3’ = TAMRA)

SEC ID NO: 53 SEC ID NO: 54 SEC ID NO: 55

Ejemplo 3. Detección de MIR604 por transferencia Southern

El ADN genómico usado para análisis de Southern se aisló del tejido de hoja reunido de diez plantas que representan la generación seis de retrocruzamiento (BC6) de MIR604 usando esencialmente el método de Thomas et al., (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993). Todas las plantas usadas para aislar ADN se analizaron individualmente usando PCR de TAQMAN® (como se describe en el Ejemplo 2) para confirmar la presencia de una

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sola copia del gen cry3A055 y el gen pmi. Para los controles segregantes negativos, el ADN se aisló de tejido de hoja reunido de cinco plantas que representan la generación BC4 del evento MIR604. Estas plantas segregantes negativas se analizaron individualmente usando PCR de TAQMAN, y los ensayos fueron negativos para la presencia del gen cry3A055 y el gen pmi, pero fueron, como se esperaba, positivos para el control interno del ensayo, el gen adh de maíz endógeno.

El análisis de Southern se llevó a cabo usando técnicas de biología molecular convencionales. EL ADN genómico (7,5 pg) se digirió con enzima de restricción Kpnl, que tiene un sitio de reconocimiento único en el inserto de T-ADN de MIR604 de plásmldo pZM26 (Figura 1). Este enfoque permite la determinación del número de copias de los elementos, que corresponden a la sonda específica usada para cada Southern, que se ha incorporado en MIR604. Esto da como resultado una banda de hibridación por copia del elemento presente en MIR604. Tras la electroforesis en gel de agarosa y transferencia alcalina a una membrana Nytran®, las hibridaciones se llevaron a cabo usando sondas generadas con PCR de longitud completa específicas del elemento. La sonda usada en las transferencias Southern de cry3A055 y pmi comprende las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 58 y SEC ID NO: 61, respectivamente. Las sondas se marcaron con 32P vía cebado aleatorio usando el sistema Rediprime™ II (Amersham Biosciences, n° de catálogo RPN1633).

Se usaron las siguientes condiciones de hibridación muy restrictivas: 1-2 millones de cpm/ml se añaden a PerfectHyb (Sigma) suplementado con 100 pg/ml de ADN de timo de ternera (Invitrogen) precalentado a 65°C. La prehibridización tiene lugar en la misma disolución como anteriormente, a la misma temperatura durante la noche o durante al menos una hora. La hibridación se llevó a cabo a 65°C durante 3 horas seguido del lavado 2X en 2X SSC, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 65°C y 2X en 0,1X SSC, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 65°C.

En cada Southern se Incluyeron tres muestras de control: (1) ADN de un segregante negativo (no transformado) usado para identificar cualesquiera secuencia de Zea mays endógenas que puedan hibridarse de forma cruzada con la sonda específica del elemento; (2) el ADN de un segregante negativo en el cual se introduce una cantidad de pZM26 digerido con Kpnl que es Igual a un número de copias basado en la longitud de la sonda, para demostrar la sensibilidad del experimento en la detección de una sola copia génica dentro del genoma de Zea mays\ y (3) el plásmldo pZM26 digerido con Kpnl que es Igual a un número de copias basado en la longitud de la sonda, como un control positivo para hibridación así como para demostrar la sensibilidad del experimento.

Los datos de hibridación proporcionan pruebas confirmatorias para apoyar el análisis de PCR de TAQMAN® de que MIR604 contiene una sola copia de los genes cry3A055 y pmi, y que MIR604 no contiene ninguna de las secuencias de soporte de vector presente en pZM26. Como se espera para ambas sondas cry3A055 y pmi, la digestión de Kpnl dio como resultado una única banda de hibridación del tamaño correcto, demostrando que una sola copia de cada gen está presente en el evento MIR604. Adlclonalmente, para la sonda de soporte la carencia de hibridación demuestra la ausencia de cualquier secuencia de soporte de vector pZM26 que se incorporan en MIR604 durante el proceso de transformación.

Ejemplo 4. Secuenciación del inserto de T-ADN

La secuencia nucleotídlca de todo el inserto de ADN transgénico presente en el evento MIR604 se determinó para demostrar la integridad global del inserto, la vecindad de los elementos funcionales, y para detectar cualesquiera cambio de pares de bases Individuales. El Inserto de MIR604 se amplificó mediante PCR a partir de ADN derivado de la generación BC5 como dos fragmentos solapantes individuales. Cada fragmento se amplificó usando un cebador polinucleotídico homólogo a secuencias genómlcas vegetales que flanquean el Inserto de MIR604, y un cebador polinucleotídico homólogo al gen cry3A055. Para generar el fragmento 5’, se combinó un primer cebador polinucleotídico homólogo a la secuencia de flanqueo 5’, 5’S1 (SEC ID NO: 15) con un segundo cebador polinucleotídico homólogo al ADN insertado dentro del gen cry3A055, 5’AS1 (SEC ID NO: 28). Para generar el fragmento 3’, se combinó un primer cebador polinucleotídico homólogo a la secuencia de flanqueo 3’, 9268AS (SEC ID NO: 45), con un segundo cebador polinucleotídico homólogo al ADN insertado dentro del gen cry3A055, 5161S (SEC ID NO: 27).

La amplificación mediante PCR se llevó a cabo usando el sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche, n° de catálogo 1732650), y los siguientes parámetros de amplificación: 2 minutos a 94°C durante 1 ciclo, seguido de 10 ciclos de 15 segundos a 94°C, 30 segundos a 55-65°C y 5 minutos a 68°C, seguido de 20 ciclos de 15 segundos a 94°C, 30 segundos a 55-65°C, y 5 minutos +5 segundos/ciclo de 72°C, seguido de 1 ciclo de 7 minutos a 72°C.

El amplicón que resulta de la amplificación mediante PCR usando la SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 28 comprendió la secuencia de unión 5’ (SEC ID NO: 1). El amplicón que resulta de la amplificación mediante PCR usando SEC ID NO: 45 y SEC ID NO: 27 comprendió la secuencia de unión 3’ (SEC ID NO: 2). Cada fragmento de secuenciación fue clonado individualmente en el vector pCR®-XL-TOPO (Invitrogen, n° de catálogo K4700-20), y se identificaron y secuenclaron tres clones distintos para cada fragmento. La secuenciación se llevó a cabo usando el analizador ABI3730XL usando química ABI BigDye® 1.1 o Blg Dye 3.1 dGTP (para moldes ricos en GC). El análisis de secuencia se hizo usando el paquete Phred, Phrap, y Consed de la Universidad de Washington, y se llevó a cabo a una tasa de error menor que 1 en 10.000 bases (Ewlng y Green, 1998). La secuencia de consenso final se determinó combinando los datos de secuencias de los seis clones individuales (tres para cada fragmento de

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secuenciación) para generar una secuencia de consenso del inserto MIR604. Para validar adicionalmente cualesquiera discrepancias de pares bases individuales entre el inserto de MIR604 y el plásmido pZM26, los productos de PCR pequeños (aproximadamente 300-500 pb) específicos para cualquiera de las regiones en las que se observó una discrepancia de pares de bases en la secuencia de consenso inicial se amplificaron usando la misma metodología anterior. Para todas las discrepancias de pares de bases putativas en el inserto MIR604, la secuenciación directa del producto de PCR dio como resultado picos claros individuales en todos los pares de bases en cuestión, indicando que estas discrepancias están presentes probablemente en el inserto MIR604. El alineamiento se realizó usando el programa ClustalW con los siguientes parámetros: matriz de puntuación blosum55, penalización de apertura de salto 15, penalización de extensión de salto 6.66 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680).

Los datos de secuencia de consenso para el inserto de T-ADN de MIR604 demuestran que se han mantenido la integridad global del inserto y la contigüidad de los elementos funcionales en el inserto como se pretende en pZM26. El análisis de secuencia reveló que se produjo cierto truncamiento en los extremos de la frontera derecha (RB) (SEC ID NO: 57) y de la frontera izquierda (LB) (SEC ID NO: 62) del inserto de T-ADN durante el proceso de transformación que dio como resultado el evento MIR604. La porción RB del inserto de T-ADN se truncó en 44 pb, y el extremo LB del inserto de T-ADN se truncó en 43 pb. Estas supresiones no tienen efecto sobre la eficacia del inserto de T-ADN, y este fenómeno se ha observado previamente en transformación mediante Agrobacterium (Tinland y Hohn, 1995. Genetic Engineering, 17:209-229). Adicionalmente, se observaron tres cambios de pares de bases en el inserto de T-ADN de MIR604. Se produjo una discrepancia en el promotor MTL, una región reguladora que no codifica una proteína. Las dos discrepancias restantes se produjeron en la secuencia codificante de pmi, y dio como resultado dos cambios de aminoácidos; la valina en la posición 61 se ha sustituido por alanina (V61 A), y la glutamina en la posición 210 se ha sustituido por histidina (Q210H). La alanina y la valina son ambas aminoácidos alifáticos que dan como resultado una sustitución conservativa. La sustitución de glutamina por histidina da como resultado la sustitución de un resto ácido por un resto básico.

Ejemplo 5. Análisis de secuencia de ADN de flanqueo

La secuencia de ADN del genoma de maíz que flanquea al ADN heterólogo insertado dentro del genoma de la planta de maíz del evento MIR604 se obtuvo usando tecnología OmniPlex™, esencialmente como se describe en Kamberov et al., (Proceedings of SPIE, Tools for Molecular Análisis and High-Throughput Screening, 4626:1-12, 2002).

Las secuencias de flanqueo y secuencias de unión 5’ y 3’ se confirmaron usando procedimientos de PCR estándar. Las secuencias de flanqueo y de unión 5’ se confirmaron usando un primer cebador polinucleotídico expuesto en SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 13, combinado con un segundo cebador polinucleotídico expuesto en SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 17. Las secuencias de flanqueo y de unión 3’ se confirmaron usando un primer cebador polinucleotídico expuesto en SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43 o SEC ID NO: 44, combinado con un segundo cebador polinucleotídico expuesto en SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 35 o SEC ID NO: 36. Se reconocerá por la persona experta que se pueden usar otras secuencias cebadoras para confirmar las secuencias de flanqueo y de unión.

Se encontró que el inserto de M1R604 está flanqueado en la frontera derecha (secuencia de flanqueo 5’) por la secuencia genómica de maíz mostrada en SEC ID NO: 5, y está flanqueada en la frontera izquierda (secuencia de flanqueo 3’) por la secuencia genómica de maíz mostrada en SEC ID NO: 6. La secuencia de unión 5’ se expone en SEC ID NO: 1. La secuencia de unión 3’ se expone en SEC ID NO: 2.

Ejemplo 6. Detección de la proteína MIR604 vía ELISA

Para caracterizar el intervalo de expresión de las proteínas Cry3A055 (el principio insecticida activo) y fosfomanosa isomerasa (PMI) (el marcador seleccionable) en plantas MIR604, se determinaron las concentraciones de proteína Cry3A055 y PMI mediante ELISA en varios tejidos vegetales y plantas completas en cuatro etapas de crecimiento (verticilo, antesis, madurez de la semilla y senescencia) en dos híbridos (MIR604-B y MIR604-C) y un endogámico (MIR604-A). Los híbridos fueron hemicigotos para los transgenes en el evento MIR604, mientras que el endogámico fue homocigoto para los transgenes.

Plantas completas y plantas individuales (excepto polen) se redujeron a un polvo fino mediante procesamiento usando un molinillo de café, una amasadora, una trituradora Grindomix™ (Brinkmann Instruments; Westbury, NY, USA), mortero con una mano de almirez, o un molino, o una combinación de estos dispositivos. Todo el procesamiento se realizó en presencia de hielo seco o de nitrógeno líquido. Las mezclas se mezclaron bien para asegurar la homogeneidad. La muestra de tejido vegetal completa, o una submuestra representativa, se retuvo para el análisis, permitiendo un tamaño de muestra suficiente para el almacenamiento de archivo de las muestras de tejido vegetal de reserva. Se determinó el porcentaje de peso seco de cada muestra, y las muestras procesadas se almacenaron a aprox. -80°C hasta liofilización.

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Se extrajeron muestras recientes de tejido (excepto polen y ensilaje) y de planta completa. Para cada muestra analizada, se pesó una alícuota de 1,0 g del material reciente en polvo en un tubo de polipropileno de 15 mi, se suspendió en 3 mi de disolución amortiguadora de extracción [CAPS 50 mM, NaCI 0,1 M, EDTA2 mM, dltlotreltol 1 mM, fluoruro de 4-(l- aminoetiljbencenosulfonllo HCI 1 mM, leupeptlna 1 mM, pH 10], y se extrajo usando un homogenizador Autogizer® (Tomtek; Hamden, CT, USA). Después de centrifugar durante 15 mln. a 10.000 x g a 4°C, el sobrenadante se usó para el análisis de Cry3A055 y PMI mediante ELISA. Después del tratamiento con yodoacetamlda como se describe por Hill y Straka (1988), la proteína total en los extractos se cuantlflcó usando el reactivo de ensayo de proteínas BCA™ (Plerce; Rockford, IL, USA).

Se prepararon extractos de polen suspendiendo polen 1:30 (p/v) en disolución amortiguadora de extracción. Después de 30 min. en hielo, las suspensiones de polen se disgregaron mediante tres pasadas a través de una cuba de presión francesa a aprox. 15.000 psl (1.054 kg/cm2), seguido de la centrifugación a 14.000 x g durante 5 min. a 4°C. Los análisis de Cry3A055 y PMI mediante ELISA se llevaron a cabo en los sobrenadantes como se describe más abajo. La proteína total se cuantlflcó como se describe anteriormente.

Los extractos de ensilaje se prepararon suspendiendo ensilaje 1:25 (p/v) en disolución amortiguadora de extracción 2X. Después de 30 min. en hielo, las suspensiones de ensilaje se extrajeron usando un homogenelzador Brlnkmann Polytron® (Brinkmann; Westbury, NY, USA). Después de centrifugar durante 15 min. a 10.000 x g a 4°C, el sobrenadante se usó para el análisis de Cry3A055 y PMI mediante ELISA. La proteína total se cuantlflcó como se describe anteriormente.

Cuantlflcaclón de Cry3A055

Los extractos preparados como se describe anteriormente se analizaron cuantitativamente para determinar Cry3A055 mediante ELISA (Tijssen, 1985) usando anticuerpos policlonales de conejo anti-Cry3A055 purificados mediante ¡nmunoafinidad y anticuerpos policlonales de cabra anti-Btt (Cry3A nativa de Badllus thuringiensis subsp. tenebríonis) purificados mediante ¡nmunoafinidad. El límite inferior de la cuantificación del ELISA de doble sándwich se estimó en base a la concentración más baja de proteína de referencia pura que se encuentra sobre la porción lineal de la curva patrón, el volumen máximo de un extracto de control que se podía analizar sin Interferencia de fondo, y el peso correspondiente de la muestra que representó la alícuota.

Se detectaron niveles cuantificables de proteína Cry3A055 en todos los tejidos vegetales derivados de MIR604 analizados, excepto el polen. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como medias de las cinco muestras tisulares repetidas. Para ensilaje, se analizó una muestra; por lo tanto, no se pudo calcular ninguna media. Los niveles de las muestras de control estaban por debajo del límite de cuantificación para todas las etapas y tejidos.

A lo largo de todas las etapas de crecimiento, los niveles medios de Cry3A055 medidos en hojas, raíces y plantas oscilaron desde aprox. 3-23 pig/g de peso reciente (4-94 pg/g peso seco), aprox. 2-14 pg/g de peso reciente (7-62 pg/g de peso seco), y alrededor de 0,9-11 pg/g de peso reciente (3-28 pg/g de peso seco), respectivamente. Los niveles medios de Cry3A055 medidos en pepitas en la madurez de las semillas y senescencia oscilaron desde alrededor de 0,6-1,4 pg/g de peso reciente (0,8-2,0 pg de peso seco). Los niveles medios de Cry3A055 medidos en tejido sedoso en antesis estuvieron por debajo del límite Inferior de cuantificación (LOQ), <0,1 pg/g de peso reciente (<1,0 pg/g de peso seco). Los niveles medios de Cry3A055 medidos en tejido sedoso en la madurez de semillas oscilaron desde alrededor de 0,6-1,9 pg/g de peso reciente (1-3 pg/g de peso seco). La proteína Cry3A055 no fue detectable en polen del endogámlco MIR604-A o de los híbridos MIR604-B y MIR604-C [límite de detección (LOD) = 0,07 p/g de peso reciente, 0,15 p/g de peso seco].

Los niveles de Cry3A055 fueron generalmente similares entre híbridos para cada tipo de tejido en cada punto de tiempo. Para la línea endogámlca, la expresión de Cry3A055 fue generalmente mayor que en los híbridos en hojas, raíces y plantas completas en las etapas de verticilo y antesls, y en raíces en la madurez de semillas. Los niveles de Cry3A055 medidos en tejidos de ensilaje fueron de media 2.5 pg/g de peso reciente (7,3 pg/g de peso seco) durante 15, 29 y 75 días. En comparación, el nivel de Cry3A055 medido en el material vegetal cortado antes del ensilaje (Día 0 previo al ensilaje) fue alrededor de 8 pg/g de peso reciente (20 pg/g de peso seco).

Cuantificación de PMI

Los extractos preparados como se describe anteriormente se analizaron cuantitativamente para determinar PMI mediante ELISA (Tijssen, 1985) usando anticuerpos policlonales de conejo purificados mediante Proteína A y anticuerpos policlonales de cabra purificados mediante ¡nmunoafinidad, específicos para PMI. El límite Inferior de cuantificación del ELISA de doble sándwich se estimó basándose en la concentración más baja de la proteína de referencia pura que se encuentra sobre la porción lineal de la curva patrón, el volumen máximo de un extracto de control que se pudo analizar sin Interferencia de fondo, y el peso correspondiente de la muestra que representó la alícuota.

La proteína PMI se detectó en la mayoría de los tejidos vegetales analizados derivados de MIR604, sin embargo a niveles bajos. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como medias de las cinco muestras tisulares

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repetidas. Para ensilaje, se analizó una réplica; por lo tanto, no se pudo calcular ninguna media. Los niveles de la muestra de control están por debajo del limite de cuantificación para todas las etapas y tejidos.

A lo largo de todas las etapas de la planta, los niveles medios de PMI medidos en hojas, raíces y plantas completas oscilaron desde indetectable (ND) hasta aprox. 0,4 pg/g de peso reciente (ND-2,1 pg/g de peso seco), por debajo del LOQ (<0,03 pg/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,2 p/g de peso reciente (<0,1 - 1,0 pg/g de peso seco), y por debajo del LOQ (<0,02 pg/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,3 pg/g de peso reciente (<0,04 - 2 pg/g de peso seco), respectivamente. Los niveles medios de PMI medidos en pepitas en la madurez de semillas y senescencia oscilaron desde debajo del LOQ (<0,06 pg/g de peso freso) hasta alrededor de 0,4 pg/g de peso reciente (<0,07 - 0,5 pg/g de peso seco). Los niveles medios de PMI medidos en tejido sedoso en antesis y madurez de la semilla oscilaron desde debajo del LOQ (<0,1 pg/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,8 pg/g de peso reciente (<0,2 - 6,8 pg/g de peso seco). PMI en polen osciló desde alrededor de 1,9 - 2,6 pg/g de peso reciente (3,9 - 5,2 pg/g de peso seco).

Los niveles de PMI fueron generalmente similares entre los genotipos endogámico e híbrido para cada tipo tisular en cada punto de tiempo. PMI no se pudo detectar en ensilaje en los tres tiempos de muestreo (día 15, 29 y 75), mientras que el nivel medido en el material vegetal cortado antes del ensilaje (Día 0 previo al ensilaje) fue alrededor de 0,3 pg/g de peso reciente (0,7 pg/g de peso seco).

Niveles de proteína Cry3A055 total estimados por acre y por hectárea

Para la línea endogámica (MIR604-A) y para ambos híbridos (MIR604-B y MIR604-C), las plantas alcanzaron su mayor biomasa en la madurez de las semillas. Las plantas también alcanzaron sus niveles medios de Cry3A055 estimados más elevados en una base por acre (y por hectárea) en la madurez de la semilla, y se estimó que contenían alrededor de 78, 141 y 240 g de Cry3A055/acre (193, 348 y 592 g/hectárea) para MIR604-A, MIR604-B y MIR604-C, respectivamente. A lo largo de la estación de crecimiento y a través de los genotipos, las estimaciones de Cry3A055 en plantas derivadas de MIR604 oscilaron desde niveles medios de alrededor de 8 g de Cry3A055/acre (21 g de Cry3A055/hectárea) en la etapa de senescencia hasta alrededor de 240 g de Cry3A055/acre (592 g Cry3A055/hectárea) en la madurez de la semilla, suponiendo una densidad de siembra de 26.500 plantas por acre (65.500 plantas/hectárea).

Ejemplo 7. Eficacia en Campo de MIR604

Gusano de raíz de maíz del oeste y del norte

Las plantas MIR604 se ensayaron para determinar la eficacia frente al gusano de raíz de maíz occidental y del norte en 12 localizaciones en los Estados Unidos de América. MIR604 se ensayó con y sin la adición del tratamiento insecticida de semillas Cruiser®. Los grupos de control consistieron en semilla tratada con dos tasas diferentes de Cruiser® y un control no tratado. Los tratamientos consistieron en cuatro réplicas de dos filas de 17,5-20 pies (5,3- 6,1 metros) separados 30” (76,2 cm) en el centro diseñado en un bloque completo aleatorizado. Se escogieron al azar diez plantas por tratamiento y se evaluaron en busca de la eficacia usando una escala de 0-3, en la que 0 = ningún daño de alimentación (la puntuación más baja que se puede dar); 1 = un nodo (círculo de raíces), o el equivalente de un nodo completo, comido en aproximadamente dos pulgadas (5 cm) del tallo (línea del suelo en el 7o nodo); 2 = dos nodos completos comidos; 3 = tres o más nodos comidos (puntuación más elevada que se puede dar). El daño entre nodos completos comidos se anotó como el porcentaje del nodo perdido, es decir, 1,50 = 1 1/4 nodos comidos, 0,25 = % de un nodo comido.

Los resultados, mostrados en la Tabla 1, demuestran que las raíces de dos líneas fraternas de MIR604, 3-11 y 3-12, sostuvieron un daño de alimentación significativamente menor que las raíces del tratamiento con Cruisei® o las raíces del control no tratado. MIR604-3-11 y MIR6004-3-12 tuvieron puntuaciones de daño de la raíz de 0,44 y 0,42, respectivamente, en comparación con los tratamientos con Cruisei® de 0,25 y 1,25 mgA/semilla, que tuvieron puntuaciones de daño de 1,6 y 0,9, respectivamente, y la línea de control con una puntuación de daño de 2,14. Hubo una tendencia hacia puntuaciones de daño de la raíz menores en las plantas MIR604, cuyas semillas se trataron con Cruiser®, sugiriendo que Cruiser® aumentó la proteína Cry3A055, o que hubo una posible sinergia entre Cruiser® y Cry3A055. Esto fue particularmente evidente en los tratamientos de semillas de 1,0 y 1,25 mgA/MIR604, con puntuaciones de daño de raíz de 0,33 y 0,29, respectivamente.

Tabla 1. Eficacia de MIR604 con y sin tratamiento de semillas Cruisei®

Línea de maíz

Tratamiento Cruiser'8’ (mgA/Semilla) Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604-3-11

0 0,44

MIR604-3-12

0 0,42

MIR604

0,25 0,43

5

10

15

Línea de maíz

Tratamiento Cruiser*' (mgA/Semilla) Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604

0,50 0,39

MIR604

1,0 0,33

MIR604

1,25 0,29

Híbrido de control

0,25 1,60

Híbrido de control

1,25 0,99

Híbrido de control

0 2,14

La eficacia de MIR604 se comparó con patrones insecticidas granulares comerciales aplicados en el surco. El diseño experimental fue como se describe anteriormente. Los resultados en la Tabla 2 demuestran que la eficacia de MIR604 fue comparable a los patrones comerciales a la hora de proteger plantas frente al daño de alimentación del gusano de raíz de maíz.

Tabla 2. Comparación de la eficacia de MIR604 con insecticidas comerciales aplicados en el surco

Tratamiento

Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604

0,43

Forcé® 3G

0,44

Aztec® 6.7G

0,32

Lorsban® 15 G

0,75

Control no tratado

2,14

Gusano de raíz de maíz mejicano

Las plantas MIR604 se evaluaron para determinar la resistencia al gusano de raíz de maíz mejicano en dos localizaciones en Tejas. El diseño experimental fue esencialmente el mismo como se describe anteriormente.

Los resultados mostrados en la Tabla 3 demuestran que ambos hermanos de MIR604 sostenían menos daño de alimentación que los controles no tratados. Hubo una respuesta positiva para el control de gusano de raíz de maíz mejicano cuando se añadió Cruiser® a la semilla de MIR604. Fue evidente una clara respuesta a la tasa. Los resultados en la Tabla 4 demuestran que la eficacia de MIR604 fue comparable a los patrones comerciales a la hora de proteger las plantas frente al daño de alimentación de gusano de raíz de maíz mejicano.

Tabla 3. Eficacia de MIR604 con y sin tratamiento de semillas Cruiser® frente a gusano de raíz de maíz mejicano.

T ratamiento

Tasa de Cruiser'0' (mgA/Semilla) Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604-3-11

0 1,14

0,125 0,19

0,25 0,18

0,50 0,09

1,25 0,02

MIR604-3-12

0 0,68

0,125 0,46

0,25 0,18

0,50 0,21

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25

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Tratamiento

Tasa de Cruiser® (mgA/Semilla) Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

1,25 0,04

Híbrido de control

0,125 1,59

1,25 0,71

0 2,76

Tabla 4. Eficacia de MIR604 en comparación con insecticidas comerciales aplicados en el surco frente a gusano de raíz de maíz mejicano

Tratamiento

Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604

0,68

Forcé® 3G

0,66

Aztec® 6.7G

0,88

Lorsban® 15 G

0,81

Control no tratado

2,76

Aunque se ha descrito la invención anterior con cierto detalle a modo ilustrativo y de ejemplo con el propósito de facilitar su comprensión, será obvio que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente invención.

Realizaciones de la invención:

En una primera realización, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos una secuencia nucleotídica de unión del evento de maíz MIR604 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y sus complementos.

La realización 2 se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10 nucleótldos contiguos de una secuencia de ADN de inserto heteróloga del evento de maíz MIR604 y al menos 10 nucleótldos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea dicha secuencia de ADN de Inserto del evento de maíz MIR604.

La realización 3 se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada de la realización 2 que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN de inserto heteróloga del evento de maíz MIR604, y al menos 20 nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea dicha secuencia de ADN de inserto del evento de maíz MIR604.

La realización 4 se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada de la realización 2 que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN de inserto heteróloga del evento de maíz MIR604, y al menos 50 nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea dicha secuencia de ADN de inserto del evento de maíz MIR604.

La realización 5 se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 y sus complementos.

La realización 6 se refiere a un ácido nucleico aislado que liga una molécula de ADN heteróloga al genoma de la planta de maíz en el evento de maíz MIR604 que comprende una secuencia de aproximadamente 11 a aproximadamente 20 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y sus complementos.

La realización 7 se refiere a un amplicón que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las realizaciones 1 a 6.

La realización 8 se refiere a una secuencia de un cebador polinucleotídico para detectar ADN del evento de maíz MIR604 en una muestra que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de la posición 1-801 como se expone en SEC ID NO: 3 o sus complementos.

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La realización 9 se refiere al cebador según la realización 8 que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 7 a SEC ID NO: 15 y sus complementos.

La realización 10 se refiere a un cebador polinucleotídlco que comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de la posición 507-1570 como se expone en SEC ID NO: 4 o sus complementos.

La realización 11 se refiere al cebador según la realización 10 que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada al grupo que consiste en SEC ID NO: 39 a SEC ID NO: 46 y sus complementos.

La realización 12 se refiere a un par de cebadores polinucleotídicos que comprende un primer cebador polinucleotídico y un segundo cebador polinucleotídico que actúan juntos en presencia de un molde de ADN del evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz MIR604, donde la secuencia del primer cebador es, o es complementaria a, un genoma de la planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604, y la segunda secuencia del cebador polinucleotídico es, o es complementaria a, la secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del genoma de la planta de maíz del evento de maíz MIR604.

La realización 13 se refiere al par de cebadores polinucleotídicos según la realización 12, donde el primer cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de la posición 1-801 como se expone en SEC ID NO: 3 o sus complementos.

La realización 14 se refiere al par de cebadores polinucleotídicos según la realización 13, donde el primer cebador polinucleotídico comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 7 a SEC ID NO: 15 y sus complementos.

La realización 15 se refiere al par de cebadores polinucleotídicos según la realización 12, donde el primer cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de la posición 507-1570 como se expone en SEC ID

NO: 4 o sus complementos.

La realización 16 se refiere al par de cebadores polinucleotídicos según la realización 15, donde el primer cebador polinucleotídico comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 39 a SEC ID NO: 46 y sus complementos.

La realización 17 se refiere al par de cebadores polinucleotídicos según la realización 12, donde el segundo cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de SEC ID O: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, SEC ID NO: 62 o SEC ID NO: 63 o sus complementos.

La realización 18 se refiere al par de cebadores polinucleotídicos según la realización 17, donde el segundo cebador polinucleotídico comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 16 a SEC ID NO: 38 y sus complementos.

La realización 19 se refiere al par de cebadores polinucleotídicos según la realización 12, donde el primer cebador polinucleotídico se expone en SEC ID NO: 15 y el segundo cebador polinucleotídico se expone en SEC ID NO: 28.

La realización 20 se refiere al par de cebadores polinucleotídicos según la realización 12, donde el primer cebador polinucleotídico se expone en SEC ID NO: 45 y el segundo cebador polinucleotídico se expone en SEC ID NO: 27.

La realización 21 se refiere a un método para detectar una secuencia de ADN en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un par de cebadores que, cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN del evento de maíz MIR604, produce un amplicón que es un elemento diagnóstico para el evento de maíz MIR604;

(b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, para producir de esta manera el amplicón; y

(c) detectar el amplicón.

La realización 22 se refiere al método de la realización 21, donde dicho amplicón comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO:4 y sus complementos.

La realización 23 se refiere a un método para detectar la presencia de un ADN correspondiente al evento MIR604 en una muestra, donde el método comprende:

(a) poner en contacto la muestra con una sonda que se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN genómico del evento de maíz MIR604 y no se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN de una planta de maíz de control;

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(b) someter la muestra y la sonda a condiciones muy restrictivas de hibridación; y

(c) detectar la hibridación de la sonda al ADN.

La realización 24 se refiere a un kit para detectar la presencia de ácidos nucleicos de MIR604 en una muestra biológica, donde el kit comprende al menos una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos contiguos con una longitud suficiente que es, o es complementaria a, SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4 que actúa como una sonda o cebador de ADN específicos para el evento de maíz MIR604.

La realización 25 se refiere a un método para detectar la proteína del evento de maíz MIR604 en una muestra biológica que comprende: (a) extraer la proteína de una muestra de tejido del evento de maíz MIR604; (b) someter a ensayo la proteína extraída utilizando un método inmunológico que comprende un anticuerpo específico para la proteína insecticida o marcadora seleccionable producida por el evento MIR604; y (c) detectar la unión de dicho anticuerpo a la proteína insecticida o marcadora seleccionable.

La realización 26 se refiere a una planta de maíz que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 o sus complementos.

La realización 27 se refiere a la planta de maíz de acuerdo con la realización 26, donde la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpn\ da como resultado una única banda hibridante de cry3A055 utilizando una sonda específica para cry3A055 en condiciones muy restrictivas.

La realización 28 se refiere a la planta de maíz de la realización 27, donde dicha sonda comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 56 o SEC ID NO: 59.

La realización 29 se refiere a la planta de maíz de acuerdo con la realización 26, donde la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpn\ da como resultado una única banda hibridante de pmi utilizando una sonda específica para pmi en condiciones muy restrictivas.

La realización 30 se refiere a la planta de maíz de la realización 29, donde la sonda comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 62.

La realización 31 se refiere a la planta de maíz de acuerdo con la realización 26, que se deriva del evento MIR604.

La realización 32 se refiere a un kit para detectar la presencia de ADN de un evento de maíz MIR604 en una muestra biológica que comprende la molécula de una primera sonda que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos que es, o es complementaria, a una secuencia nucleotídica del grupo que consiste en SEC ID NO: 3 desde aproximadamente la posición nucleotídica 792 hasta aproximadamente la posición nucleotídica 811 y la molécula de una segunda sonda que comprende al menos aproximadamente 11 nucleótidos contiguos que es, o es complementaria a, una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 4 desde aproximadamente la posición nucleotídica 497 hasta aproximadamente la posición nucleotídica 516, donde dicha molécula se híbrida específicamente con la secuencia nucleotídica en condiciones muy restrictivas de hibridación.

La realización 33 se refiere a un método para detectar la presencia de ADN del evento de maíz MIR604 en una muestra biológica, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un primer cebador polinucleotídico y un segundo cebador polinucleotídico que actúan juntos en una reacción de amplificación del ácido nucleico en presencia de un molde de ADN del evento de maíz MIR604 para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz;

(b) realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico, para producir de esta manera el amplicón; y

(c) detectar el amplicón.

La realización 34 se refiere al método de la realización 33, donde el amplicón comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 y sus complementos.

La realización 35 se refiere al método de la realización 33, donde el amplicón comprende SEC ID NO: 1, donde la secuencia del primer cebador polinucleotídico se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 7 a SEC ID NO: 15 y sus complementos, y donde la secuencia del segundo cebador polinucleotídico se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 16 a SEC ID NO: 38 y sus complementos.

La realización 36 se refiere al método de la realización 33, donde el amplicón comprende SEC ID NO: 2, donde la secuencia del primer cebador polinucleotídico se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 39 a SEC ID NO: 46 y sus complementos, y donde la secuencia del segundo cebador polinucleotídico se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 16 a SEC ID NO: 38 y sus complementos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

La realización 37 se refiere a un método para detectar ADN del evento de maíz MIR604 en una muestra biológica, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende ADN con una sonda polinucleotidica que se híbrida en condiciones muy restrictivas de hibridación y lavado con el ADN de MIR604 y que no se híbrida en condiciones muy restrictivas de hibridación y lavado con ADN de una planta de maíz que no es MIR604;

(b) someter la muestra y la sonda a las condiciones muy restrictivas de hibridación y lavado; y

(c) detectar la hibridación de la sonda al ADN del evento MIR604.

La realización 38 se refiere a una muestra biológica derivada de una planta, tejido o semilla de maíz del evento MIR604, donde la muestra comprende una secuencia nucleotídica que es, o es complementaria a, una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, y donde la secuencia se puede detectar en la muestra utilizando un método de amplificación del ácido nucleico o de hibridación del ácido nucleico.

La realización 39 se refiere a la muestra biológica de la realización 38, donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en harina de maíz, harina molida de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados en su totalidad o en parte para contener subproductos de maíz.

La realización 40 se refiere a un extracto derivado de una planta, tejido o semilla de un evento de maíz MIR604 que comprende una secuencia nucleotídica homologa o complementaria a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2.

La realización 41 se refiere al extracto de la realización 40, donde la secuencia se puede detectar en el extracto utilizando un método de amplificación del ácido nucleico o de hibridación del ácido nucleico.

La realización 42 se refiere al extracto de la realización 41, donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en harina de maíz, harina molida de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados en su totalidad o en parte para contener subproductos de maíz.

La realización 43 se refiere a un método para producir una planta de maíz resistente al menos al gusano de raíz de maíz que comprende:

(a) cruzar sexualmente una primera planta de maíz progenitora con una segunda planta de maíz progenitora, donde dicha primera o segunda planta de maíz progenitora comprende ADN del evento de maíz MIR604, para producir de esta manera una pluralidad de plantas de progenie de primera generación;

(b) seleccionar una planta de progenie de primera generación que es resistente a al menos la infestación de gusano de raíz de maíz;

(c) autofecundar la planta de progenie de primera generación, para producir de esta manera una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación;

(d) seleccionar de las plantas de progenie de segunda generación, una planta que al menos es resistente a la infestación de gusano de raíz de maíz;

donde las plantas de progenie de segunda generación comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Syngenta Participations AG

<120> Evento de maíz MIR604

<130> M2489 EP/2 BS

<150> US 60/556,260

<151 >2004-03-25

<160> 63

<170> Patentln versión 3.2 <210> 1 <211 >20

5

10

15

20

25

<212>ADN <213> Zea mays <220>

<221> característica diversa <222> (1)..(24)

<223> union de genoma-inserto 5' <400> 1

aattcaacag aaggcgggaa 20

<210>2

<211> 20

<212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> característica diversa <222> (1)..(24)

<223> unión de inserto-genoma 3' <400> 2

tgttattaag agttggtggt 20

<210> 3

<211> 1312

<212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> característica diversa

<222> (1)..(1310)

<223> secuencia de genoma+inserto 5'

<400> 3

ccccgcgttt cgttgcccot ggccggtacc catttggcgc cgattctttt cttgcccccc ggccggccgc tcgctcgcct ttggattctt ccaaagccgc tgatgggatg gtggcgaaca

60

120

eacccaccac

ccgtctttgc ccaaagcgac ccggcacagg ccgcgccggc ttcactaacc ■ 180

actagcgctt

gtactaataa aatggtttct agcgtttgtt gctctccttt ttcttttttc 240

gccggttctt

cggagccgtg tggacactgg acagegtcca gtccagcagg catagggtgg 300

tctcggcggc

ggt'cgtecga cgacgatcga tctccatgag attccgcgac aggccaggac 360

ggaaagctgg

gcccttctca ccaattcgcg tcggagccgg aacaagattc cctcccccaa 420

tcatttcgac

gcgccctttc ttcgccaccc ctcgtggocg tgtttcgcgg ccggccctta 480

tctccttccc

gtgacgcgtt cttttgtagc ttagcggccg gcacgttgct aaccaggcta 540

gcttcgttcg

ttttfcaafcct gcctatcgag aagagaagaa aaafctcgtcc atggggccac 600

ggcctcttct

gcaggcattt ggcatgtgaa ggaacccgaa ccagtgaatg gagatggacg 660

gatgctgctc

agatacgcag tcaaacctgc cggcgaaatt acggggggag ctggctggct 720

ggctggctgg

acgccagatc acacatggat gacgcggcac ggcagctagc cgagcaggcg 780

ctctgcgcac

gcaattcaac agaaggcggg aaacgacaat ctgatcatga gcggagaatt 840

aagggagtca

cgttatgacc eccgccgatg acgcgggaca agccgtttta cgtttggaac 900

tgacagaacc

gcaacgctgc aggaattggc cgcagcggcc atttaaatca attgggcgcg 960

ccgaattcga

gctcggtaca agcttgcaca tgacaacaat tgtaagágga tggagaccac 1020

aacgatccaa

caatacttct gcgacgggct gtgaagtata gagaagttaa acgcccaaaa 1080

gccattgtgt

ttggaatttt tagttattct atttttcatg atgtatcttc ctctaacatg 1140

ccttaatttg

caaatttggt átaactactg attgaaaata tatgtatgta aaaaaatact 1200

aagcatattt

ttgaagctaa acatgatgtt atttaagaaa atatgttgtt aacagaataa 1260

gattaatatc

gaaatggaaa catctgtaaa ttagaatcat cttacaagct aa 1312

<210> 4 <211> 1570 <212> ADN 5 <213>Zeamays <220>

<221 > característica diversa <222> (1)..(1570)

<223> secuencia de inserto +genoma 3’

10 <400> 4

ttgtggaaag gttctcagca gttacagctt aaaccgggtg aatcagcgtt tattgccgcc 60

aacgaatcac cggtgactgt caaaggccac ggccgtttag cgcgtgttta caacaagctg 120

taagagctta ctgaaaaaat taacatctct tgctaagctg ggagctegat ccgtcgacct 180

gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 240

gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 300

tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 3S0

tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 420

tctatgttac tagatctgct agccctgcag gaaatttacc ggtgcccggg cggccagcat 480

ggccgtatcc gcaatgtgtt attaagagtt ggtggtacgg gtactttaac taacgaggtg E40

tgtcgcgcag cgctcctgca cggatgtagc tttggattge tggataatgt ctcgcgcaag 600

ogtcgtattt atttatttat ttattacagc ctccaecgcc gtgegtgcte cgtttcggat 660

tataataaaa ctaatattaa ataaaaaaat cggattaaag gatgtttccg aaataaagat 720

ctccaccaca ggagcgaaag aaaaaaaaag agaaacgggc tatggagaaa tggtgttgcg 780

agtatacggc ggctccgtcg tcgtcggatc gacatgtaca aagtaggtgc acaaaaggca 840

aagcaaaatc acctcatcaa agaccaaaag cggagcaaag aatcgatact aaatccacat 900

gttttttttg ttcctgtcta ctacgtgctg tgcctgtgcg tgaagcacga ttagtacgtg 96Q

tactcactct tgtcatattc tttttagtgt cttgtcacta gtcacatgga gtagcaacca 1020

tggctggega tacccgcgat aaataaaaaa aagagagagg gagtaatata ttagatactc 1080

acccattata aattataaaa tattttagag tttgaatagg tagttcttgt atátttattt 1140

atagaccttc aagtttgtcc gcctctcgag agccgaactt tgtfcgcccat gcttccccgg 1200

ctcaggtcat gccacctcct tcaccaaggg cacacggaag atctggtgaa gcttgtcatc 1260

accccgcgcc cttcaaacat gtgaggatgc gtcgtcgctg gcactagtag cactcattgt 1320

aggcactact ttgacagttt cctccaaata tgtagtgagg aaacacttga acaacacgtt 1380

tgggattact tatgatgttt ggttngtcca tcaatgataa ttccttcttc ttgcttaatg 1440

attggctcta gaaccgatac ttggcacatt tcatcaggaa gggcgcatgc acnaatttaa 1500

cctgttatcg atgttccggt tcctaagttg aagaaaacaa tggctaacaa ttagcccatg 1560

tgagcataac 1570

<210> 5 <211 >801 <212> ADN 5 <213>Zeamays <220>

<221 > característica diversa <222> (1)..(801)

<223> secuencia de flanqueo 5’

10 <400> 5

ccccgcgttt

cgttgcccct ggccggtacc catttggcgc cgafctctttt cttgcccccc 60

ggccggccgc

tcgctcgcct ttggattctt ccaaagccgc tgatgggatg gtggcgaaca 120

cacccaccac

ccgtctttgc ccaaagcgac ccggcacagg ccgcgccggc ttcactaacc 180

actagcgctt

gtactaataa aatggtttct agcgtttgtt gctctccttt ttcttttttc 240

gccggttctt

cggagccgtg tggacactgg acagcgtcca gtecageagg catagggtgg 300

tctcggcggc

ggtcgtgcga cgacgatcga tctccatgag attccgcgac aggccaggac 360

ggaaagctgg

gcccttctca ccaaCtogcg tcggagccgg aacaagattc cctcccccaa 420

tcatttcgac

gcgccctttc ttcgccaccc ctcgtggccg tgtttcgcgg ccggccctta 480

tctccttccc

gtgacgcgtt cttttgtagc ttagcggccg gcacgttgct aaccaggcta 540

gcttcgttcg

tttctaatct. gcctatcgag aagagaagaa aaattcgtcc atggggccac 600

ggcctcttct

gcaggcattt ggcatgtgaa ggaacccgaa ccagtgaatg gagatggacg 660

gatgctgctc

agatacgcag tcaaacctgc cggcgaaatt acggggggag ctggctggct 720

ggctggctgg

acgccagatc acacatggat gacgcggcac ggcagctagc cgagcaggcg 780

ctctgcgcac

gcaattcaac a 801

<210> 6

<211> 1064

<212>ADN

<213> Zea mays

<220>

<221 > característica diversa

<222> (1)..(1064)

<223> secuencia de flanqueo 3’

<400>6

agttggtggt

acgggtaott taactaacga ggtgtgtcgc gcagegctcc tgcacggatg 60

tagctttgga

ttgctggata atgtctcgcg caagcgtcgt atttatttat ttatttatta 120

cagcctccac

cgccgtgcgt gctccgtttc ggattataat aaaactaata ttaaataaaa 180

aaatcggatt

aaaggatgtt tccgaaataa agatctccac cacaggagcg aaagaaaaaa 240

aaagagaaac

gggctatgga gaaatggtgt tgcgagtata cggcggctcc gtcgtcgtcg 300

gatcgacatg

taoaaagtag gtgcacaaaa ggcaaagcaa aatcacctca tcaaagacca 360

aaagcggagc

aaagaatcga tactaaatcc acatgttttt tttgttcctg tctactacgt 420

gctgtgcctg

tgcgtgaagc acgattágta cgtgfcactca ctcttgtcat attcttttta 480

gtgtcttgtc

actagtcaca tggagtagca accatggctg gcgatacccg cgataaataa - 540

aaaaaagaga

gagggagtaa tatattagat actcacccat tataaattat aaaatatttt 600

agagtttgaa

taggtagttc ttgtatattt atttatagac cttcaagttt gtccgcctct 660

cgagagccga

actfctgttgc ccatgcttcc ccggctcagg tcatgccacc tccttcacca 720

agggcacacg

gaagatctgg tgaagcttgt catcaccccg cgcccttcaa acatgtgagg 780

atgcgtcgtc

gctggcacta gtagcactca ttgtaggcac tactttgaca gtttcctcca 840

aatatgtagC

gaggaaacac ttgaacaaca cgtttgggat tacttatgat gtttggttng 900

tccatcaatg

ataattcctt cttcttgctt aatgattggc tctagaaccg atacttggca 960

catttcatca

ggaagggcgc atgcacnaat ttaacctgtt. atcgatgttc cggttccbaa 1020

gttgaagaaa

acaatggcta acaattagcc catgtgagca taac 1064

<210> 7 <211 >20 <212>ADN

5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de MIR604(59) <400>7

cgctcgcctt tggattcttc 20 10 <210>8

<211 > 19 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

15 <223> cebador de MIR604(60)

<400>8

aagccgctga tgggatggt 19 <210> 9 <211 >24 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604(54) <400> 9

25 cgttcgtttt taatctgcct atcg 24 <210> 10 <211 >22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

<223> cebador de MIR604(55) <400> 10

aggcatttgg catgtgaagg aa 22 <210> 11 <211> 21 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604(38) <400> 11

atgtgaagga acccgaacca g 21 <210> 12 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604(39) <400> 12

gtgaatggag atggacggat g 21 <210> 13 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604 (51) <400> 13

cagatcacac atggatgacg c 21 <210> 14 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de 604 SEN <400> 14

gtgacgcgtt cttttgtagc 20 <210> 15

5

10

15

20

25

30

35

<211> 23 <212>ADN

<223> cebador de 5'S1 <400> 15

tgaatggaga tggacggatg ctg 23 <210> 16 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MTL (11) <400> 16

attagaatca tcttacaagc taa 23 <210> 17 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MTL (10) <400> 17

ctaagagatg ttcacgcttt gag 23 <210> 18 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MTL AS <400> 18

gactcaacga aggctgctgc 20 <210> 19 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WRSEN-1

5

10

15

20

25

30

35

<400> 19

gcatgtctct gtgtcctcgt 20 <210> 20 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WRAS-1 <400> 20

aggcacgcta tcggaggtta 20 <210> 21 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WR-1 <400> 21

ggacatcgcc gagttctaca 20 <210> 22 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WR-2 <400> 22

gatgtgcttc ctgatgcagg 20 <210> 23 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WRSEN-2 <400> 23

caagcaaata agacgacttg 20 <210> 24 <211> 20 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

<223> cebador de WRAS-2 <400> 24

agcaccacca aggacgtgat 20 <210> 25 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WRSEN-3 <400> 25

tacaacagct tcaacctggc 20 <210> 26 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WRAS-3 <400> 26

ccgtgaacta gatctgagct 20 <210> 27 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de 5161S <400> 27

tcaaccaata ctacttcgac aa 22 <210> 28 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de 5'AS1 <400> 28

acaagaccat caacaagggc gac 23

5

10

15

20

25

30

35

<210> 29 <211> 22 <212>ADN

<223> cebador de WRSEN-4 <400> 29

atcggcgttc cggtccatgg tt 22 <210> 30 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WRAS-4 <400> 30

ggaatcctgg gatggctcta 20 <210> 31 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> PMI-1 <400> 31

gatgtgcttc ctgatgcagg 20 <210> 32 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de PMI-2 <400> 32

ctggaagtga tggcaaac 18 <210> 33 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

<223> cebador de PMI(6) <400> 33

cgctgcatga ccttagtgat a 21 <210> 34 <211> 21 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de PMI(7) <400> 34

cgggtgaatc agcgtttatt g 21 <210> 35 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de PMI(5) <400> 35

ttgccgccaa cgaatcac 18 <210> 36 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de PMI(16) <400> 36

agtcccgcaa ttatacattt aat 23 <210> 37 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WRSEN-5 <400> 37

gaaaatgccg caggtatccc 20 <210> 38 <211> 20

5

10

15

20

25

30

35

<212>ADN

<223> cebador de WRAS-5 <400> 38

caggtgcaca tccggcgatt 20 <210> 39 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604(20) <400> 39

gctcctgcac ggatgtagct 20 <210> 40 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604(21) <400> 40

gctttggatt gctggataat gtc 23 <210> 41 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> MIR604(31)

<400> 41

ccaccacagg agcgaaagaa aaa 23 <210> 42 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604(30) <400> 42

5

10

15

20

25

30

35

gggctatgga gaaatggtgt tg 22 <210> 43 <211> 19 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604(40) <400> 43

cttcaccaag ggcacacgg 19 <210> 44 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de MIR604(41) <400> 44

atgtgaggat gcgtcgtcg 19 <210> 45 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de 9268AS <400> 45

cacggatgta gctttggatt 20 <210> 46 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de WRAS-6 <400> 46

tccaccacag gagcgaaaga 20 <210> 47 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

<223> TaqMan cry3A055-directo <400> 47

atcgagagct gggtgaactt ca 22 <210> 48 <211> 18 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> TaqMan cry3A055-inverso <400> 48

cgatcaggtc cagcacgg 18 <210> 49 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> TaqMan cr3A055-sonda <400> 49

ccgctaccgc cgcgagatga 20 <210> 50 <211> 18 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> TaqMan pmi-directo <400> 50

ccgggtgaat cagcgttt 18 <210> 51 <211> 18 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> TaqMan pmi-reverse <400> 51

gccgtggcct ttgacagt 18 <210> 52

5

10

15

20

25

30

35

<211> 20 <212>ADN

<223> TaqMan pmi-sonda <400> 52

tgccgccaac gaatcaccgg 20 <210> 53 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de ZmADH-267 <400> 53

gaacgtgtgt tgggtttgca t 21 <210> 54 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de ZmADH-337 <400> 54

tccagcaatc cttgcacctt 20 <210> 55 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> sonda de ZmADH-316 <400> 55

tgcagcctaa ccatgcgcag ggta 24 <210> 56 <211> 779 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> sonda de MIR604

<400> 56

ggacatcgcc

gagttctaca agcgccagct gaagctgacc caggagtaca ccgaccactg 60

cgtgaagtgg

tacaacgtgg gtetagacaa gctccgcggc agcagctacg agagctgggt 120

gaacttcaac

cgctaccgcc gcgagatgac cctgaccgtg ctggacctga tcgcoctgtt ISO.

ccccctgtac

gacgtgcgcc tgtaccccaa ggaggtgaag accgagctga cccgcgacgt 240

gctgaccgac

cccatcgtgg gcgtgaacaa cctgcgcggc tacggcacca ccttcagcaa 300

catcgagaac

tacatccgca agccccacct gttcgactac ctgcaccgca tccagttcca 360

cacgcgtttc

cagcccggct actacggcaa cgacagcttc aactactgga gcggcaacta 420

cgtgagcacc

cgccccagca tcggcagcaa cgacatcatc accagcccct tctacggcaa 480

caagagcagc

gagcccgtgc agaaccttga gttcaacggc gagaaggtgt accgcgccgt £40

ggctaacacc

aacctggccg tgtggccctc tgcagtgtac agcggcgtga ccaaggtgga 600

gttcagccag

tacaacgacc agaccgacga ggccagcacc cagacctacg acagcaagcg 660

caacgtgggc

gccgtgagct gggacagcat cgaccagctg ccccecgaga ccaccgacga 720

gcccctggag

aagggctaca gccaccagct gaactacgtg atgtgcttcc tgatgcagg 779

<210> 57 <211> 183 5 <212> ADN

<213> Agrobacterium tumifaciens <220>

<221 > característica diversa <222> (1)..(183)

10 <223> Región de frontera derecha

<400> 57

gaaggcggga aacgacaatc tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc 60

ccgccgatga cgcgggacaa gccgbtttac gtttggaact gacagaaccg caacgctgca 120

ggaattggcc gcagcggcca tttaaatcaa ttgggcgcgc cgaattcgag ctcggtacaa' 100

9Ct 183

<210> 58

15 <211 >2556

<212>ADN <213> Zea mays <220>

<221 > característica diversa 20 <222> (1)..(2556)

<223> promotor MTL <400> 58

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para identificar una planta de maíz que comprende el inserto heterólogo MIR604 que comprende un gen c/y3A055 de la SEC ID NO: 59 flanqueado por las secuencias de nucleótidos expuestas en la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 3, y la SEC ID NO: 2 y la SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, entre otras plantas de maíz que no comprenden dicho inserto heterólogo, que comprende los pasos de:

   (a) amplificar una secuencia de ADN diana procedente de la planta de maíz que se va a identificar utilizando cebadores nucleotidicos que comprenden una primera secuencia de ADN que comprende al menos aproximadamente 11 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en los nucleótidos 792-811 de la SEC ID NO: 3; los nucleótidos 497-516 de la SEC ID NO:4; la SEC ID NO: 5; la SEC ID NO: 6; y sus complementos y una segunda secuencia de ADN, que está comprendida en la secuencia de ADN del inserto heterólogo seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 57, la SEC ID NO: 58, la SEC ID NO: 59, la SEC ID NO: 60, la SEC ID NO: 61, la SEC ID NO: 62, la SEC ID NO: 63 y sus complementos; y

   (b) identificar la planta de maíz que comprende el inserto heterólogo MIR604 entre otras plantas de maíz.
2. 2. El uso de una planta de maíz identificada con el método de la reivindicación 1 que comprende el inserto heterólogo MIR604 para controlar plagas de insectos.
3. 3. El uso de la reivindicación 2, donde la plaga de insectos coleópteros se selecciona del grupo que consiste en Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de la raíz de maíz occidental, Diabrotica virgifera zeae, el gusano de la raíz de maíz mejicano, y Diabrotica longicornis barberi, el gusano de la raíz de maíz del norte.
4. 4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde la semilla de dicha planta de maíz es tratada con agentes químicos para el tratamiento de semillas.
5. 5. El uso de la reivindicación 4, donde dicho agente químico es un insecticida.
6. 6. El uso de la reivindicación 5, donde dicho insecticida es Cruiser®.
7. 7. El uso de la reivindicación 4 para aumentar u obtener un efecto sinérgico de la actividad insecticida de la proteína Cry3A055.
8. 8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 4-6 para incrementar el espectro actividad la eficacia de la proteína expresada y del agente químico.

   imagen1

   imagen2