PT1040192E - Plantas transgénicas resistentes a insectos e métodos para melhoramento da actividade 8-endotoxina contra insectos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PLANTAS TRANSGÉNICAS RESISTENTES A INSECTOS E MÉTODOS PARA MELHORAMENTO DA ACTIVIDADE DE δ—ENDOTOXINA CONTRA INSECTOS" 1.0 Fundamento do Invento 1.1 Campo do Invento

Este invento está relacionado com métodos para a produção de δ-endotoxinas recombinantes, manipuladas geneticamente, derivadas de Bacillus thuringiensis que são úteis no controlo da lagarta da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber) e lagarta da raiz do milho do leste (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). 1.2 Descrição da Técnica Anterior

Quase todos os campos de cultura, plantas e áreas de culturas comerciais são susceptiveis a ataque de uma ou mais pragas de insectos. Particularmente problemáticas são as pragas de Coleópteros e Lepidópteros. Por exemplo, culturas hortícolas tais como alcachofras, couve-rábano, rúcula, alho-porro, espargos, lentilhas, feijões, alface (e.g. de repolho, de folhas, árabe), beterrabas, "bokchoy", 2 ΡΕ1040192 malanga, brócolos, tipos de melão (e.g., meloa, melancia, melão de Crenshaw, melão de Inverno, melão), couves de Bruxelas, couve, cardinhos, cenouras, couve napa, couve-flor, quiabo, cebolas, aipo, salsa, grão de bico, pastinaca, chicória, ervilhas, couve chinesa, pimentos, couve-de-folhas, batatas, pepino, abóboras, cucurbitácias, rabanetes, cebolas de cabeça seca, rutabaga, beringela, salsifi, escarola, chalotas, endivia, soja, alho, espinafre, cebolinhos, abóbora, verduras diversas para saladas, beterraba sacarina, batata-doce, nabo, acelgas, rábano selvagem, tomates, couve-lombarda, nabos, e diversas ervas aromáticas são sensíveis a infestações de uma ou mais das seguintes pragas de insectos: lagarta medidora da alfafa, lagarta das pastagens Pseudaletia, lagarta Spodoptera da beterraba, traça da alcachofra, lagarta dos rebentos da couve, lagarta medidora da couve, teia da couve, traça Helicoverpa do milho, lagarta das folhas do aipo, lagarta de listas cruzadas (Evergestis) da couve, broca do milho europeia (Ostrinia) , traça-das-crucíferas (traça-diamante) , lagarta verde do trevo, lagarta da couve importada (para os EUA), lagarta do melão, enrolador da folha omnívoro (Platynota), lagarta (Diaphania) do pepino, complexo das lagarta da casca do melão, lagarta do sapal (Estigmene), lagarta medidora da soja, lagarta dos rebentos do tabaco, lagarta do fruto do tomateiro, lagarta (Manduca) do tomateiro, nemátodo do tomate, lagarta da mucuna, e a lagarta da traça de listas amarelas (Spodoptera). Da mesma 3 ΡΕ1040192 forma, os pastos e forragens como a alfafa, ervas de pastagem e silagem são muitas vezes atacadas por pragas como lagartas da traça Pseudaletia, lagartas da beterraba, lagarta da alfafa, lagarta europeia, diversas lagartas medidoras e tecedeiras, assim como lagartas de traça de listas amarelas. Pomares e vinhas como maçãs, damascos, cerejas, nectarinas, pêssegos, peras, ameixas de consumo em fresco, ameixas de consumo em seco, marmelos, amêndoas, castanhas, avelãs, noz americana, pistácios, nozes, citrinos, amoras silvestres, arando, amoras de Boysen, mirtilo, groselha, framboesa americana, framboesa, morangos, uvas, pêra-abacate, bananas, kiwi, caquis, romãs, ananás, frutos tropicais são muitas vezes susceptiveis ao ataque e desfoliação pela traça esfinge "achema", amorbia, traças Pseudaletia, rosca dos citrinos, lagarta da banana, lagarta de cabeça preta Rhopobota naevana, enrolamento do arando, lagartas da família Geometridae, lagartas da cereja, rosca dos citrinos, anel do mirtilo, lagarta de tenda do leste, lagarta da teia do Outono, enrolamento da aveleira, lagarta da teia da aveleira, enrolamento das frutícolas, traça da uva, enroladora da vinha, esqueletizadora da parra (Harrisina americana), lagarta verde da fruta, gummosos-batrachedra commosae, traça cigana, lagarta da casca da noz americana, lagartas da família Sphingidae, lagartas medidoras, lagartas da laranja de umbigo, o enrolador de folhas de bandas oblíquas {Tortricidae) , o enrolador de folhas omnívoro Playnota 4 ΡΕ1040192 stultana, lagarta medidora, traça Tortrix das laranjas, lagarta "orangedog" (Papilio cresphontes), traça da fruta oriental, enrolador de folhas (Pandemis pyrusana), broca do pessegueiro, casulo da noz de pecan (Acrobasis nuxvorella) , enrolador da folha de lista vermelha, lagarta de bossa vermelha (Schizura concinna), rosca de pele enrugada, lagarta do sapal (Estigmene acrea), lagarta medidora, lagarta de tenda, "thecla-thecla basillides", lagarta dos rebentos do tabaco, traça pandemis, traça de tufos dos gomos da macieira, enrolador de folhas variegado (Platynota flavedana) , lagarta das nozes, lagarta de tenda do oeste, e traça de listas amarelas.

Campos de culturas como a canola/semente de colza, primola da noite, prado-espuma, milho (forrageiro, doce, para pipocas), algodão, lúpulos, jojoba, amendoins, arroz, açafroa, gramineas (centeio, aveia, cevada, trigo, etc.), sorgo, sojas, girassol, e tabaco são muitas vezes alvo de infestação por insectos que incluem a larva da traça Pseudaletia, broca asiática e outras do milho, traça listada do girassol, traça da beterraba, lagarta Helicoverpa, lagarta medidora da couve, lagarta da raiz do milho (incluindo as variedades do Sul e do Oeste), lagarta roedora da folha do algodão, traça-das-cruciferas (traça-diamante) , broca do milho europeia, lagarta verde do trevo, traça da cabeça do girassol, lagarta da espiga do sorgo, lagarta da couve importada, lagartasmedidoras (incluindo Anacamptodes spp.), o enrolador de folhas de bandas 5 ΡΕ1040192 oblíquas (Tortricidae) , lagarta da folha omnívora Cnephasia longana, lagarta da vagem, lagarta do sapal, broca do milho do Sudoeste, lagarta medidora da soja, broca malhada, traça do girassol, lagarta dos rebentos do tabaco, larva do tabaco (Manduca sexta), lagarta da soja.

Plantas de canteiro, flores, plantas ornamentais, vegetais e plantas de viveiro são frequentemente atacadas por um grande número de pragas de insectos como a lagarta Pseudaletia, a traça da azálea, a lagarta da beterraba (Spodoptera exígua), traça-das-crucíferas (traça-diamante) , a traça Ello (Erinnyis ello), lagarta do feto da Flórida, traça de Io (Automeris io) , lagartas medidoras, traça do oleandro, enrolador de folhas omnívoro Playnota stultana, lagarta medidora omnívora Sabulodes caberata, e lagarta dos rebentos do tabaco. Árvores de floresta, fruteiras, ornamentais e produtoras de nozes, assim como arbustos e outras de viveiro são muitas vezes susceptíveis ao ataque de diversos insectos como a lagarta da vagem, lagarta dos rebentos de cabeça preta Aderis variana, traça de cauda castanha ou portésia (Euproctis chrysorrhoea) , lagarta do carvalho da califórnia, traça de tufo do abeto de Douglas, lagarta medidora do olmeiro, lagarta da teia do Outono, enroladora das frutícolas, lagarta do bordo (Acer) de listas verdes, traça cigana, lagarta dos rebentos de Pinus banksiana, teia da acácia mimosa, borboleta do pinheiro, lagarta de bossa vermelha, a lagarta de sela, lagarta de sela proeminente, 6 ΡΕ1040192 lagartas medidoras da Primavera e do Outono, lagarta dos rebentos do abeto Spruce, lagarta da teia, lagarta tortrix, e traça de tufo do oeste. Da mesma forma ervas para relvados são muitas vezes atacadas por pragas como a lagarta das pastagens (Pseudaletia), teia da relva e teia da relva tropical.

Devido às culturas agrícolas com interesse comercial serem muitas vezes o alvo do ataque por insectos, em muitos casos são desejáveis métodos ambientalmente sensíveis para o controlo ou erradicação da infestação por insectos. Isto é particularmente importante para agricultores, viveiristas, plantadores e áreas comerciais e residenciais em que se pretenda controlar populações de insectos usando composições amigas do ambiente.

As formulações insecticidas ambientalmente sensíveis mais largamente usadas e desenvolvidas nos últimos anos têm sido compostas por pesticidas microbianos derivados da bactéria Bacillus thuringiensis. B. thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva que produz proteínas formadoras de cristais, ou corpos de inclusão, que são especificamente tóxicas para determinadas ordens e espécies de insectos. Muitas estirpes diferentes de B. thuringiensis mostraram produzir proteínas insecticidas formadoras de cristais. Composições incluindo estirpes de B. thuringiensis que produzem proteínas insecticidas têm sido comercializadas e usadas como insecticidas aceitáveis em termos ambientais devido a serem muito tóxicas para o insecto alvo especí- 7 ΡΕ1040192 fico, mas serem inofensivas para plantas e outros organismos não alvo. 1.2.1 ô-Entotoxinas

As δ-endotoxinas são usadas para controlar uma larga gama de lagartas e escaravelhos comedores de folhas, assim como mosquitos. Estes cristais paraspóricos proteicos, também referidos como proteínas cristais insecticidas, proteínas do cristal, inclusões Bt, inclusões cristalinas, corpos de inclusão e toxinas Bt, são uma grande colecção de proteínas insecticidas produzidas por B. thuringiensis que são tóxicas quando da ingestão por um hospedeiro insecto susceptível. Ao longo da última década, a pesquisa na estrutura e função das toxinas de B. thuringiensis cobriu a totalidade das principais categorias de toxinas e, apesar destas toxinas diferirem na estrutura e função específicas, são assumidas semelhanças gerais na estrutura e função. Baseado no conhecimento acumulado das toxinas de B. thuringiensis, foi criado um modo generalizado de actuação para as toxinas de B. thuringiensis que inclui: ingestão pelo insecto, solubilização no tubo digestivo do insecto (uma combinação de estômago e intestino delgado), resistência às enzimas digestivas por vezes com digestão parcial "activando" de facto a toxina, ligação às células do tubo digestivo, formação de um poro nas células de insecto e a disrupção da homeostasia celular (English and Slatin, 1992) . ΡΕ1040192 1.2.2 Genes Codificadores de Proteínas do Cristal

Muitas das δ-endotoxinas estão relacionadas com vários graus de semelhanças nas suas sequências de aminoácidos. Historicamente, as proteínas e os genes que as codificam foram classificados largamente com base no seu espectro de actividade insecticida. A revisão por Hõfte and Whiteley (1989) discute os genes e proteínas que foram identificadas em B. thuringiensis antes de 1990 e descrevem a nomenclatura e esquema de classificação que tem sido tradicionalmente aplicado aos genes e proteínas de B. thuringiensis. Os genes cryl codificam as proteínas Cryl tóxicas para lepidópteros. Os genes cryll codificam proteínas Cryll que são tóxicas para lepidópteros e dípteros. Os genes crylll codificam proteínas CrylII tóxicas para coleópteros, enquanto que os genes crylV codificam proteínas CrylV tóxicas para dípteros.

Com base no grau de semelhança de sequências, as proteínas foram ainda classificadas em subfamílias; às proteínas mais estreitamente relacionadas dentro de cada família foram atribuídas letras tais como CrylA, CrylB, CrylC, etc. Às proteínas ainda mais estreitamente relacionadas dentro de cada divisão foram dados nomes tais como CrylCl, CryIC2, etc.

Recentemente, foi desenvolvida uma nova nomenclatura que sistematicamente classifica as proteínas Cry com ΡΕ1040192 base na homologia da sua sequência de aminoácidos em lugar das especificidades para os insectos alvo. 0 esquema de classificação para muitas toxinas conhecidas, não incluindo variações alélicas em proteínas individuais, está sumari-zada na Tabela 1.

Tabela 1 δ-ENDOTOXINAS de B. THORINGIENSIS CONHECIDAS, NÚMEROS DE ACESSO GenBaNK e Nomenclatura Revista* Nova Antiga Acesso GenBank # OylAíd CãrylÀtA) Ml!» OyIAi2 Cr?W® mm? CrylJMái €?$&(«) mmm GfylAftt xnm mmm a&m wsm OylAb! ctmm mmm CrylâM OyUm mmt CíviàbS CryíA(b) umn Cr>-?Àb4 C^lAífà DÍK>! *7 o$im C^IÃCfe) mm* C0im CrylA(b) Mmm C^IAps) XI32J3 CiylA^) m&m c wim QyíÂ(&) mmm €íy!A|b) OtfíMl CàylA<è) mam CryíÀ&2 c&m msm Ctfim DyM(e) mim C^!ác4 CiyIA{e> mmm 10 ΡΕ1040192

Tabela 1 (continuação)

Nova Antiga Acesso GenBank # CrylAeS CryiA(c) M7324I CrylÀcô CrylÀ(c) 1143606 CrylAc? CryíA(c) U87793 CtylAcS CryíA(c) mim CrylAc9 CryíA(c) ummi CrylAc !0 Cry!A(c) AJ002514 GrylAdl CryíA(d) M732S0 CrylAel OrylA(e) M652S2 CrylBal CrylB X0671Í Ciy 1 Bs2 X95704 CrylBbl ET5 02020 CrylBcl Crylfe(e) Z46442 CrylBdl CryEI 070726 CrylCal CrylC X075.lt Cry s C«2 CrylC XI3620 CryICa3 CrylC M7325I Cryí€a4 CrylC A27642 CrylCaS Cry.EC x%m- CrylCaé CrylC X96683 CrylCa? CryíC X%6§4 CryiCfol CrylCíb) M97880 Cryl Dal CrylD X54I60 CrylDfa] PrtB Z22S11 QylEal CrylE xmm CrylBaS CrylE X56Í44 OtylEaS CrylE M732S.2 QyiEat 094323 CrylEèl Cryll(Í5) M73253 CrylFal CrylP M0197 11 ΡΕ1040192

Tabela 1 (continuação) Nova Antiga Acesso GenBank # CíylFa2 CryíF M63897 CryíFbl Frtl> 222:0.: GrylGal PftA. Z22510 CrylGá2 CrvIM YÍSÍ26, CfvlGfel Çryffi U70725 CrylHal PrtC Z22513 CtyíRM 105780 Cryllal CryV X62821 Oyim CryV M98544 Crylía3 CryV L36338 Ctylla4 CiyV L49-39I CryilaS CryV YÕS920 Qyllhl CryV 007642 Crylíal BT4 LI52019 CryUbl BTí 05!52? OylKal U28S0I Cry2Aal CrylIA M31738 Cry2As2 CrylíÁ M23T23 Qy2Aa3 DM084 Cry2AhJ CrylIB M23724 Ciy2Ab2 CrylIB X55416 Cry2Ac! CsrylíC X572S2 CryjÂal CrylílA M22472 Cíy3Aa2 CrylílA 102978 Cry3Aa3 CrylílA Υ08420 Cry3Âa4 CrylílA M3ÕS03 Gry3Aa5 CrylílA M37207 Oy3AaÔ CrylHA 010985 CryãBa] CiyUIB XI703 12 ΡΕ1040192

Tabela 1 (continuação)

Nova Antiga Acesso GenBank # Ciy3Bi2 CjrvliíB Ν' ÂQ72M OyJBb.1 CryIÍIB2 MS9794 Qy3Bb2 CrylIIC(b) 1)31633 C?y3Csl OylIID XS9797 , Cty4Aal CiyrvA Y00423 Cry4Aa2 CrytVÀ D0Ô248 €ry4Ba! GylVB XQ7423 Qy4Ba2 CryíVB XO 7082 Cry4Ba3 CiylVB M29242 Cry4Ba4 CjyíVB DQ0247 CrySAal CryYÂ(a) 1.07025 CrySAM CiyVA(b) LD7026 CrySBal. FSMQ3 UI 9725 CtytSAíi I CryVIA LO7022 CtyâBal ôryVÍB mm Cry7Aal CryíífC M6447S Cry7Abl CryUiCb U0436? CrySAal CiylIIE U04364 CrySBal CryíIIO 1)04365 CrySCat CiylIIF 004366 Qy9Aa! CsylO x$mn Cry9Aâ2 CrylO X58534 CjyOBal CrylX X750I0 CryfCal OyiH XI752? CYyODaí N14I D8556Ô CrymAal QyfYC unmi €iy'11 Aal CrylVD mm? CryUAâl CrvIVD M22m QyilBal legBCf X869Q8 aAdaptado de: http://epunix.biols. susx. ac. uk/Home/Nil_ _Crickmore/Bt/índex.html 13 ΡΕ1040192 1.2.3 Composições Polpeptídicas Bioinsecticidas A utilidade das proteínas cristais bacterianas como insecticidas foi estendida para além das larvas de lepidópteros e dípteros quando da descrição do primeiro isolamento de uma estirpe de B. thuringiensis tóxica para coleópteros (Krieg et al., 1983; 1984). Esta estirpe (descrita na Patente U.S. 4 766 203, especificamente aqui incluída como referência), designada B. thuringiensis var. tenebrionis, está descrita como sendo tóxica para larvas dos insectos coleópteros Agelastica alni (escaravelho da folha do amieiro azul) e Leptinotarsa decemlineata (escaravelho da batateira do Colorado). A Patente US 5 024 837 também descreve estirpes híbridas de B. thuringiensis var. kurstaki que mostraram actividade contra insectos lepidópteros. A patente US 4 797 279 (correspondendo a EP 0221024) descreve um B. thuringiensis híbrido contendo um plasmídeo derivado de B. thuringiensis var. kurstaki codificador de um gene codificador da proteína do cristal tóxica para lepidópteros e um plasmídeo derivado de B. thuringiensis tenebrionis codificador um gene codificador da proteína do cristal tóxica para coleópteros. A estirpe híbrida de B. thuringiensis produz proteínas do cristal características das produzidas por B. thuringiensis kurstaki e B. thuringiensis tenebrionis. A Patente U.S. 4 910 016 (correspondendo a EP 0303379) descreve um isolado de B. thuringiensis identificado como B. thuringiensis MT 104 que possui actividade insecticida contra coleópteros e lepidópteros. 14 ΡΕ1040192 1.2.4 Técnicas de Genética Molecular que Facilitam a Engenharia de Proteínas A revolução na genética molecular da última década tem facilitado uma abordagem lógica e organizada da manipulação de proteínas com propriedades melhoradas. Métodos de mutagénese dirigida e ao acaso, o advento de metodologias da reacção em cadeia da polimerase (PCR™) e avanços relacionados na técnica forneceram uma extensa colecção de ferramentas para alteração da sequência de aminoácidos e das sequências genéticas subjacentes para uma variedade de proteínas de interesse comercial, médico e agrícola.

Após o aumento rápido do número e tipos de proteínas do cristal que foram identificadas na última década, os investigadores começaram a teorizar acerca de usar tais técnicas para melhorar a actividade insecticida de várias proteínas do cristal. Teoricamente, os melhoramentos das δ-endotoxinas deverão ser possíveis usando os métodos de que os engenheiros de proteínas a trabalharem na técnica dispõem e foi lógico assumir que seria possível isolar variantes melhoradas das proteínas cristais selvagens até agora isoladas. Ao fortalecer-se um ou mais dos passos de actuação da toxina referidos, moléculas melhoradas deverão proporcionar melhoria da actividade e, portanto, representam um avanço na técnica. Se os resíduos de aminoácidos específicos na proteína forem identificados como sendo responsáveis por um passo específico no modo de acção, 15 ΡΕ1040192 então estes resíduos podem ser alvo de mutagénese para melhoramento do desempenho. 1.2.5 Análise Estrutural de Proteínas do Cristal A combinação de análises estruturais de toxinas de B. thuringiensis seguido de uma investigação da função de tais estruturas, motivos e similares ensinou que regiões específicas das proteínas cristais endotoxinas são, em geral, responsáveis por funções particulares.

Encontrou-se que o domínio 1, por exemplo, de Cry3Bb e CrylAc é responsável pela actividade de canal iónico, o passo inicial na formação de um poro (Walters et al., 1993; Von Tersch et al., 1994). Encontrou-se que os domínios 2 e 3 são responsáveis pela ligação ao receptor e especificidade insecticida (Aronson et al., 1995; Caramori et al., 1991; Chen et al. 1993; de Maagd et al., 1996; Ge et al., 1991; Lee et al., 1992; Lee et al., 1995; Lu et al., 1994; Smedley and Ellar. 1996; Smith e Ellar, 1994;

Rajamohan et al., 1996; Wu and Dean, 1996). As regiões no domínio 2 e 3 podem também influenciar a actividade de canal iónico de algumas toxinas (Chen et al., 1993, Wolfersberger et al., 1996; Von Tersch et al., 1994). 1.3 Deficiências na Técnica Anterior

Infelizmente, se bem que muitos laboratórios tenham tentado produzir proteínas do cristal mutagenizadas, poucas tiveram êxito na obtenção de proteínas do cristal 16 ΡΕ1040192 mutagenizadas com melhor toxicidade para lepidópteros. Em quase todos os exemplos de toxinas de B. thuringiensis manipuladas geneticamente na literatura, a actividade biológica da proteína do cristal mutada não é melhor do que a da proteína selvagem e, em muitos casos, a actividade diminui ou é mesmo destruída (Almond and Dean, 1993; Aronson et ai., 1995; Chen et ai., 1993, Chen et ai., 1995; Ge et ai., 1991; Kwak et ai., 1995; Lu et ai., 1994; Rajamohan et ai., 1995; Rajamohan et ai., 1996; Smedley and Ellar, 1996; Smith and Ellar, 1994; Wolfersberger et ai., 1996; Wu and Aronson, 1992).

Para uma proteína do cristal tendo aproximada-mente 650 aminoácidos na sequência da sua toxina activa e para a possibilidade de 20 aminoácidos diferentes em cada posição nesta sequência, a probabilidade de arbitrariamente criar uma nova estrutura com êxito é remota, mesmo que uma função geral possa ser atribuída a um segmento de 250-300 aminoácidos. De facto, os trabalhos anteriormente descritos relativamente à mutagénese do gene da proteína do cristal têm estado relacionados com o estudo da estrutura e função das proteínas do cristal, usando mutagénese para alterar algum passo no modo de acção, em vez de manipulação para melhoramento das toxinas.

Colectivamente, os sucessos limitados na técnica para desenvolver toxinas sintéticas com actividade insecti-cida melhorada têm abafado o progresso nesta técnica e confundido a pesquisa de endotoxinas ou proteínas do cristal melhoradas. Em vez de seguir regras simples e previsíveis, 17 ΡΕ1040192 a manipulação com êxito de uma proteína do cristal pode envolver estratégias diferentes, dependendo da proteína do cristal a ser melhorada e das pragas de insectos alvo. Deste modo, o processo é altamente empírico.

Assim, a tecnologia de DNA recombinante tradicional não é claramente a experimentação de rotina para a obtenção de proteínas cristais insecticidas melhoradas. 0 que falta nos trabalhos anteriores são métodos racionais para a produção de proteínas do cristal de B. thuringiensis geneticamente manipuladas, possuidoras de actividade insec-ticida melhorada e, em particular, toxicidade melhorada para uma larga gama de pragas de insectos lepidópteros. 2.0 Sumário do Invento 0 presente invento pretende ultrapassar estes e outros obstáculos inerentes de trabalhos anteriores ao proporcionar δ-endotoxinas de B. thuringiensis modificadas por engenharia genética (Cry*) e, em particular, δ-endotoxinas Cry3 modificadas (designadas endotoxinas Cry3*). São igualmente proporcionadas sequências de ácido nucleico compreendendo um ou mais genes que codificam tais proteínas modificadas.

Em particular, o presente invento está relacionado com um polipeptídeo Cry3Bb de B. thuringiensis modificado, compreendendo alterações de um a cinco amino-ácidos na sequência primária do polipeptídeo Cry3Bb de SEQ 18 ΡΕ1040192 ID NO:98, em que as referidas alterações de aminoácidos são seleccionadas entre:

Aspl03 é substituída por ácido glutâmico; Thrl54 é substituída por glicina ou fenilalanina; Prol55 é substituída por histidina; Leul56 é substituída por histidina; Leul58 é substituída por arginina; Serl60 é substituída por asparagina; Lysl61 é substituída por prolina; Argl62 é substituída por histidina; Aspl65 é substituída por glicina; Lysl89 é substituída por glicina; Ser223 é substituída por prolina; Tyr230 é substituída por leucina ou serina; His231 é substituída por arginina, asparagina, serina ou treonina; Thr241 é substituída por serina; Tyr287 é substituída por fenilalanina; Asp288 é substituída por asparagina; Ile289 é substituída por treonina ou valina; Arg290 é substituída por asparagina, leucina ou valina; Leu291 é substituída por arginina; Tyr292 é substituída por fenilalanina; Ser293 é substituída por arginina ou prolina; Phe305 é substituída por serina; Ser311 é substituída por alanina, isoleucina ou treonina; Leu312 é substituída por prolina ou valina; Asn313 e substituída por arginina, histidina, treonina ou valina; Thr314 é substituída por asparagina; Leu315 é substituída por prolina; Gln316 é substituída por ácido aspártico, leucina, metionina ou triptofano; Glu317 é substituída por alanina, asparagina, lisina ou valina, Tyr318 é substituída por cisteína; Gln348 é substituída por arginina; Val365 é substituída por alanina; e Alal04 é eliminada. São igualmente descritos novos métodos para a construção de proteínas Cry3*, sequências de ácido nucleico 19 ΡΕ1040192 sinteticamente modificadas codificadoras de tais proteínas e composições que surjam a partir delas. São igualmente proporcionado vectores de expressão de cry3* sintéticos e vários métodos de utilização dos genes e vectores melhorados. As proteínas Cry3* do invento possuem melhores propriedades insecticidas. São descritos métodos de projecção de toxinas formadoras de canais que têm sido usados para produzir uma série específica de toxinas designada Cry3Bb* com melhor actividade biológica. Estas proteínas Cry3Bb* melhoradas estão enumeradas na Tabela 2 juntamente com as respectivas alterações de aminoácidos de Cry3Bb selvagem (WT), as alterações nucleotídicas presentes no gene cry3Bb* alterado codificador da proteína, o número de vezes de aumento da bioactividade relativamente a Cry3Bb WT, o local estrutural da alteração e o ou os métodos usados para criar as novas toxinas. preferidos in cry3Bb.11223, cry3Bb.11227, cry3Bb.11231, cry3Bb.11235, cry3Bb.11239, cry3Bb.11035, cry3Bb.11051, cry3Bb.11082, cry3Bb.11098. los de gene luem cry3Bb.6C cry3Bb.11224, cry3Bb.11228, cry3Bb.11232, cry3Bb .11236, cry3Bb.11241, cry3Bb .11036, cry3Bb. 11057, cry3Bb.11083, s codificadore Ί, cry3Bb. 11221, cry3Bb.11225, cry3Bb.11229, cry3Bb.11233, cry3Bb. 11237, cry3Bb.11242, cry3Bb. 11046, cry3Bb.11058, cry3Bb.11084, 3 de Cry2Bb* cry3Bb.11222, cry3Bb. 11226, cry3Bb.11230, cry3Bb.11234, cry3Bb.11238, cry3Bb.11032, cry3Bb.11048, cry3Bb.11081, cry3Bb.11095 e - 20 - ΡΕ1040192

Tabela 2 _Proteínas Cry3Bb* Apresehtahdo Melhor Aciividade Contra Larvas SCRW_

Designação da Designação Alterações da sequência Alterações de Local Número de Método proteína do plasmídeo de nucleótidos cry3Bb* aminoácidos estrutural vezes do usado Cry3Bb* crySBb* Cry3Bb* das aumento de _alterações actividade HT_

ΡΕ1040192 - 21 -

Tabela 2 (Continuação) Designação da Designação Alterações da sequência de Alterações de Local Número de Método usado proteína do plasmídeo nucleótidos cry3Bb* aiinoácidos estrutural vezes do Cry3Bb* cry3Bb* Cry3Bb* das aumento de alterações actividade WT Cry3Bb.ll228 pEG1714 C93Zr,A938C,T942G,G949A) S311L,N313T, Ip!,a8 4.1* T954C E3I7K . Cry3Bb,li229 pEGUIS T931 A, A933C, 1“942Α, T945A, S3liT,E3l7K, ipi;a$ 2.5x 2,4 G949A, A953G. T954C Y318C Cry3BbJI230 pEG)7!6 _TBiaA933C,C534G,TM5G1 S3IIA.L3I2V, $Ι,α8 4.7x 2,48 C946T,A947G,C951A,T954C Q316W Cry3Bb.ll23l pEGl717 WKmiGMMC, H23IR.SJUL, ot6;ip!,a8 7.9* 2,4.1,8, T942G} G949A, T954C N3I3T.0I7K 10 Cry3Bb.H232 pEGl7l8 T931 A, A933G, T935C,T936A, S3IIT.U12P, ΐρΐ,αϋ 5.1* 4 A938C, T939C, Í942C J945A, N313T, E317N GWIT.T9S4C Cry3Bb.li233 pEG!7!9 TBIC,A933C(T936G,TM2C, C943TJ945A,C946G,G948C( S3!IA,Q316D |Ι,α8' 2.2x 2,4 - 22 - ΡΕ1040192

Tabela 2 (Continuação)

Designação da Designação Alterações da Alterações de Local estrutural Número de vezes Método proteína Cry3Bb* do plasmídeo sequência de aminoácidos das alterações do aumento de usado _cryúfiõ* nucleótidos cryíBb* Cry3Bb* actividade WI

TBIA,C932T.A933C,T506C. S3!lt

T942G, 'Γ945Λ. T954C

T9}|A,«A933C/!W, S3IH.N3I3H Ã937Q, A938T, C94IA, T942C, 3.1x M 5,4x 2,4

A933C,TM,A«7C.A9MT1 NJIJV,TJ!4N, C941 A,T942C,T945À,C946A, Q3l6MtE3l7V

IM 2,4 » ΡΕ1040192 - 23 -

Tabela 2 (Continuação)

Designação da Designação proteína do plasmídeo Cry3Bb* crySBb* Alterações da sequência de nucleótidos cry3Bb* Alterações de aminoácidos Cry3Bb* Local estru- Número de vezes do Método tural das aumento de usado alterações actividade WT Cry3Db.U239 pBGI725 N313R.13I5P, 2Jx 2,4 T944C J945A, A§47T, G948Tt Q3I6UE317A A950C.T954C Cry3Bb.lt24! pEGI726 AtMICjaOT. ' Y2S7F, D2SSN, l«?|l 2,3.4.6 GMlMWT.m mi 07IGtAS79T Cf}'3Bb lI242 pEGí727 C868G, G869T R290V la?|l 1U 2,3,4,6, l Crj3Bt),11032 pEGISHI km DI03G «4 3Jx 2,4,8 Cry3Bb.ll035 pEGI046 0479Λ, A48IC,A482Ct SI60N.KI61P, α4 2.7x 8 PI62H, D165G Ciy3Bb.ll036 pEG1047 ktmm I289V, S293P k?|l 43» 4 Cry3Bb.l!046 pEOIOSl G479A, A481C, A482C, SliWIÓIP, α4; Ια?,βϊ 2ix 2,4,8,10 A484C G485A, A4S6C, PIÔ2H, D165G, A494G, A865G,T8?7C !289V, S293P ΡΕ1040192 - 24 -

Tabela 2 (Continuação) Designação da Designação proteína Cry3Bb* do plasmídeo cry3Bb* Alterações da sequência de nucleótidos cry3Bb* Alterações de aminoácidos Cry3Bb* Local estrutural das alterações Número de vezes Método do aumento de usado actividade WT »11941! pEG1054 Τ309Α,Δ3Ι0,Λ3Ι1,Δ312 D!03E,MI04 l«2a,2b 4,3x 8 Cry38b.!105l pEGI057 A565G, A566G K189G Ía4,5 3.0x 2,3,4 Cry3Bb.l 1057 pEOlOfô T3M0JIU3I2, DIÔ3MAI04, Ia2a,2bia4 3.4x 2,4,8,10' G479A.A4SIC.AW2C. S!60N,Ki61P, A4MC,C48SA.A486Ç,A4940 PI62H;D!65G Cry3Bb.l 1058 pECil063 ' T3<M,à31Ô,è3ll,à312, DI03E,âAlfl4, Ia2a,2b,la3,4 3.5x 1,8,10 A460T,C46!T,A462TfC464A> T!54FfP155H, T46SC, T466C, T467A, A468T, U56H,L158R A469T» G470C, T472C, T473G, G474T,A477r,A478T,G470C Cry3Bb.!1081 pEG!084 A494GtT93!A>A933C,T942A, D!65G,S3!IT, <x4; ΙβΙ,α8 í.lx 2,4,8,10 T945A, G949A, T954C E317K. ΡΕ1040192 - 25 -

Tabela 2 (Continuação)

Designação da Designação proteína Cry3Bb* do plasmídec cry3Bb* Alterações da sequência de nucleótidos cry3Bb* Alterações de aminoácidos Cry3Bb* Local estrutural das alterações Número de vezes do aumento de actividade WT Método usado Cry3Bb.ll082 pEGIOSS A4ÍMG, A865G, T877C.T91_4C, DI65G, I289V, α4;Ια7,βΙ; (31; m UH T931G, A933C, C934G, T945G, S293P, F305S, IPU1;|12; 9, IO C946T,A947G,G95IA,T954C, S3MA.13I2V. p3b AI043G, TI094C Q316W,Q348R, V365A Cry3Bb.ll083 pEG!086 A865G.T877C, AI043G I289V, S293P, Wíl;P 7.4x 4,5,9,10 Q348R Cr}'3Bb.ll084 pEGI087 A494G, C932T D165G.S3IIL α4;ΙβΙ,α8 7.2χ 2,4,8,10 Crv3Bb.ll095 pEG!095 AI043G Q348R P2 4.6x ' 5,9 Cry3Bb.ll098 pEGI098 A494G, T687C, A692G, C9321; DI65G.H23IR, α4;α6, Ιβ),α8 7,9x 2,4,7,8 A938C, T942G, G949A. T954C S3IIL.N3I3T, E317K 26 ΡΕ1040192

Numa variedade de realizações ilustrativas, os inventores demonstraram êxito na geração de toxinas com actividade insecticida melhorada usando estes métodos. Em particular, os inventores identificaram métodos únicos de análise e projecção de toxinas tendo propriedades insec-ticidas melhoradas in vitro e in vivo.

Face à presente descrição, a mutagénese de um ou mais codões dentro da sequência de uma toxina pode resultar na geração de um hospedeiro de proteínas insecticidas relacionadas tendo actividade melhorada. Se bem que tenham sido descritos exemplos de mutações para cada uma das estratégias de projecção empregues no presente invento, os inventores consideram que também podem ser feitas mutações nas proteínas do cristal insecticidas incluindo as regiões das ansas, regiões das hélices, locais activos das toxinas, regiões envolvidas na oligomerização de proteínas e similares, que darão origem a proteínas do cristal bioinsecticidas funcionais. Todas essas mutações são consideradas dentro do âmbito desta descrição.

Numa realização ilustrativa, são obtidos os genes cry3Bb* mutagenizados que codificam variantes Cry3Bb*, geralmente baseados na sequência Cry3Bb selvagem mas que possuem uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos da proteína usando uma ou mais estratégias de projecção aqui descritas e reivindicadas.

Os genes mutados codificadores das proteínas do cristal são modificados de forma a alterar um, dois, três, 27 ΡΕ1040192 quatro ou cinco ou mais aminoácidos na sequência primária do polipeptideo codificado.

Para efectuar tais alterações na sequência primária dos polipeptideos codificados, pode ser desejável mutagenizar ou deletar um ou mais nucleótidos das sequências de ácido nucleico dos genes codificadores de tais polipeptídeos. Frequentemente, vários resíduos de nucleótidos podem ser alterados para produzir o polipeptideo pretendido. Como tal, os inventores consideram que em determinadas realizações pode ser desejável alterar apenas um, dois, três, quatro ou cinco ou mais nucleótidos na sequência primária. Noutras realizações, em que são desejáveis mais alterações, a mutagénese pode envolver alteração ou deleção de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou mesmo 20 ou mais resíduos de nucleótidos na sequência do gene. A alteração de um grande número dos codões na sequência nucleotídica de um gene codificador de endotoxina pode ser particularmente desejável e muitas vezes necessário para se atingir os resultados pretendidos, particularmente na situação de "plantizar" uma sequência de DNA de forma a expressar um DNA de origem não vegetal numa célula vegetal transformada. Tais métodos são rotina para os especializados no campo da genética de plantas e frequentemente muitos resíduos de uma sequência génica primária são alterados para facilitar a expressão do gene na célula vegetal. De preferência, as alterações na sequência dos genes não introduzem alterações na sequência 28 ΡΕ1040192 de aminoácidos ou introduzem apenas substituições conservadas na sequência de aminoácidos, de forma que o polipeptideo produzido na célula veqetal da sequência nucleotidica "plantizada" seja ainda totalmente funcional e tenha as qualidades pretendidas quando expresso na célula vegetal.

Genes e respectivas proteínas codificadas alterados de acordo com o invento podem ser operacionalmente ligados a outras sequências de ácidos nucleicos codificadores de proteínas ou expressos como proteínas de fusão. São consideradas tanto as proteínas de fusão N-terminal como C-terminal. Virtualmente qualquer sequência de DNA codificadora de proteínas ou peptídeos, ou suas combinações, podem ser fundidos com uma sequência mutante cry3* de forma a codificar uma proteína de fusão. Isto inclui sequências de DNA que codificam peptídeos alvo, proteínas para expressão recombinante, proteínas a que um ou mais peptídeos alvo são ligados, subunidades proteicas, domínios derivados de uma ou mais proteínas do cristal e similares. Tais modificações nas sequências nucleotídicas primárias para aumentar, atingir ou optimizar a expressão da sequência génica numa célula hospedeira, tecido ou localização celular particular, são bem conhecidas dos familiarizados com a engenharia de proteínas e biologia molecular e será facilmente aparente para estes especialistas, tendo acesso aos ensinamentos desta especificação, como facilitar tais trocas na sequência nucleo-tídica para produzir os polipeptídeos e polinucleótidos aqui descritos. 29 ΡΕ1040192

Num aspecto, o invento descreve e reivindica

células hospedeiras compreendendo uma ou mais das proteínas do cristal modificadas aqui descritas e, em particular, células de B. thuringiensis estirpes EG11221, EG11222, EG11223, EG11224, EG11225, EG11226, EG11227, EG11228, EG11229, EG11230, EG11231, EG11232, EG11233, EG11234, EG11235, EG11236, EG11237, EG11238, EG11239, EG11241, EG11242, EG11032, EG11035, EG11036, EG11046, EG11048, EG11051, EG11057, EG11058, EG11081, EG11082, EG11083, EG11084, EG11095 e EG11098 que compreendem segmentos de DNA recombinante codificadores de proteínas do cristal Cry3Bb* sinteticamente modificadas que demonstram actividade insecticida melhorada.

Igualmente , o invento também descreve e reivin- dica culturas celulares de B. thuringiensis EG11221, EG11222, EG11223, EG11224, EG11225, EG11226, EG11227, EG11228, EG11229, EG11230, EG11231, EG11232, EG11233, EG11234, EG11235, EG11236, EG11237, EG11238, EG11239, EG11241, EG11242, EG11032, EG11035, EG11036, EG11046, EG11048, EG11051, EG11057, EG11058, EG11081, EG11082, EG11083, EG11084, EG11095 e EG11098.

Tais culturas celulares podem ser culturas biologicamente puras consistindo numa única estirpe ou, como alternativa, podem ser culturas celulares consistindo numa ou mais estirpes. Tais culturas celulares podem ser cultivadas nas condições em que uma ou mais estirpes 30 ΡΕ1040192 adicionais de B. thuringiensis ou de outras bactérias são simultaneamente cocultivadas com uma ou mais das culturas descritas ou, em alternativa, uma ou mais das culturas celulares do presente invento podem ser combinadas com uma ou mais estirpes de B. thuringiensis ou de outras bactérias após a cultura independente de cada uma delas. Tais procedimentos podem ser úteis quando são pretendidas suspensões de células contendo duas ou mais proteínas do cristal diferentes.

As presentes culturas foram depositadas nas condições que asseguram que o acesso às culturas será disponibilizado durante a pendência deste pedido de patente a quem seja determinado pelo Comissário de Patentes e Marcas Registadas a ser autorizado em 37 C.F.R. §1.14 e 35 U.S.C. §122. , Os depósitos são disponibilizados de acordo com as leis internacionais de patentes nos países em que as contrapartes do presente pedido ou sua progénie sejam solicitadas. No entanto, deverá ser compreendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para a realização do presente invento com prejuízo dos direitos de patente concedidos pela acção governamental.

Ainda, os presentes depósitos de culturas serão armazenados e disponibilizados de acordo com as condições do Tratado de Budapeste para o depósito de microrganismos, i.e., serão guardados com todo o cuidado necessário para os manter viáveis e não contaminados, durante um período de pelo menos cinco anos após o pedido mais recente para a 31 ΡΕ1040192 finalização de uma amostra do depósito e em qualquer caso, durante um período de pelo menos 30 (trinta) anos após a data de depósito ou durante a viqência de qualquer patente que possa descrever as culturas. O depositante reconhece o dever de substituir os depósitos se o depositário for incapaz de fornecer uma amostra quando pedida, devido à condição dos depósitos. Todas as restrições relativas à disponibilidade ao público dos presentes depósitos de culturas serão irrevogavelmente removidas quando da concessão de uma patente que os descreva.

As culturas apresentadas na Tabela 3 foram depositadas na colecção permanente do Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL) sob os termos do Tratado de Budapeste.

Tabela 3

Estirpes do Presente Invento Depositadas Sob os Termos do Tratado de

Budapeste

Estirpe Data do Depósito Proteína Numero de Acesso (Número NRRL) BOI 1032 5/27/97 Cry3Bb,U032 B-2! 744 BOI 103Í EG1103Í 5ãim smm CrySBbJ 1035 Qy3Bfe/ll036 B-21745 B-21746 egíkib: EGIÍ046 5/2 im 5/27/97 Ciy38bJl®37 CryCffih. 11046 B-21747 32 ΡΕ1040192

Tabela 2 (Continuação)

Estirpe Data do Depósito Proteína Numero de Acesso (Número NRRL) BGllíMS 5/27/97 Cry3BbJ 1048 B-2J.749 EGI1051 5/27/97 Cry3Bb,11051 B-21750 EG11057 s/27/97 Cry3Bb. 11057 B-2175J EG1105S 5/27/97 Gry3fíb,HQS8 B-2I752 ΕΟΠΜΙ mim OrylBbJ 108! 8-21753 EG 11082 5/27/97 Çry3Bb,l 1082 B-21754 EG11083 S/27/97 Cty3Bb. 11083 B-2175.5 EG11084 5/27/97 Cry3Bb,11084 B-217S6 EG! 1095 5/27/97 OrOBbJ 1.095 B-21757 EG! 1204 5/27/97 Qy3Bb. 11204 B-21758 EG! 1221 5/27/9? CrySBbJ 1221 B-217S9 EG11222 5/27/97 Qy38feJ1222 B-21760 E0I1223 5/27/97 Cry3Bkll223 B-21761 EGU224 5/27/97 Cry3&feJ1224 B4Í762 E01122S 5/27/97 Cry 3 B621225 11-2176.3 EG1Í226 5/27/97 CrySBb.l 1226 B-21764 EG! 1227 5/27/97 Cfy3Bb.it 227 B-1276S EG 11228 S/27/97 Oy3Bh, 11228 B-12766 EG 11229 S/27/97 Cry3BbJ1229 B-2I767 EG! 1230 5/27/97 Oy3Bb.ll 230 B-21768 BOI 123! 5/27/97 Cry3Bb.ll23I B-21769 EG11232 S/27/97 €fy3Bb.H232 B-12770 EGi tm S/27/97 Ciy3Bkl!233 B-21771 EG! 1234 S/27/97 Ciy3BbJ1234 B-21772 EG! 1235 5/27/97 Cry3BbJÍ23S 8-21 '773 EG 11236 5/27/97 Csy3Bb. 11236 8-21774 &nm7 mm Oy3Sb>11237 B~2Í775 EG11238 5/27/97 CrySBbJ 1238 Β-2Ϊ776 33 ΡΕ1040192

Tabela 2 (Continuação)

Estirpe Data do Depósito Proteína Número de Acesso (Número NRRL) ECH1239 5?W97 Ciy3Bb.!1239 B*217?7 mi 1241 5/27/97 Cty3Bb.l 1241 B-2177S ΕΟΠ.242 5/27/97 CryIBb.,11242 B-21779 São igualmente descritos métodos de controlo ou erradicação de uma população de insectos num ambiente. Tais métodos, de um modo geral, compreendem o contacto da população de insectos a ser controlada ou erradicada com uma quantidade eficaz como insecticida de uma composição de proteínas cristal Cry3*. As composições de Cry3* preferidas incluem composições polipeptídicas Cry3A*, Cry3B* e Cry3C*, sendo as composições Cry3B * particularmente preferidas. Exemplos de tais polipeptídeos incluem proteínas seleccionadas do grupo consistindo em Cry3Bb.60, Cry3Bb.11221, Cry3Bb.11222, Cry3Bb.11223, Cry3Bb.11224, Cry3Bb.11225, Cry3Bb.11226, Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242, Cry3Bb.11032, Cry3Bb.11035, Cry3Bb.11036, Cry3Bb.11046, Cry3Bb.11048, Cry3Bb.11051, Cry3Bb.11057, Cry3Bb.11058, Cry3Bb.11081, Cry3Bb.11082, Cry3Bb.11083, Cry3Bb.11084, Cry3Bb.11095 e Cry3Bb.11098. 34 ΡΕ1040192

Nas realizações preferidas, estas composições de proteínas cristais Cry3Bb* compreendem a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:3 0, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:3 8, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:10 0, SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO:108. 2.1 Métodos para a Produção de Proteínas Cry* Modificadas

Os polipeptídeos Cry* modificados do presente invento são preparáveis por um processo que, de um modo geral, envolve os passos de obtenção de uma sequência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo Cry*; análise da estrutura do polipeptídeo para identificar locais "alvo" particulares para mutagénese da sequência génica subjacente; introdução de uma ou mais mutações na sequência de ácido nucleico para produzir uma alteração de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência polipeptí-dica codifiada; e expressão numa célula hospedeira transformada da sequência de ácido nucleico mutagenizada sob condições eficazes para obter a proteína Cry* modificada codificada pelo gene cry*. 35 ΡΕ1040192

Meios para obtenção das estruturas dos cristais dos polipeptideos do invento são bem conhecidas. Exemplos de séries de soluções de alta resolução para estruturas de cristais estão apresentados na Secção 9.0 da descrição e incluem a estrutura cristalina dos polipeptideos Cry3A e Cry3B aqui descritos. A informação proporcionada na Secção 9.0 permite a análise descrita em cada um dos métodos apresentados, a qual se baseia na estrutura cristalina 3D para diriqir a mutagénese dos polipeptideos para regiões particulares das sequências de aminoácidos primárias das δ-endotoxinas, de modo a serem obtidos mutantes com maior actividade insecticida ou maior especificidade insecticida.

Um primeiro método para a produção de uma δ-endotoxina Cry3Bb de B. thuringiensis modificada tendo actividade ou especificidade insecticida melhorada aqui descrito envolve a obtenção de uma estrutura cristalina 3D de alta resolução da endotoxina, localização na estrutura do cristal de uma ou mais regiões de água ligada, em que a água ligada forma uma superfície contígua hidratada separada por não mais de aproximadamente 16 Ã; aumento do número de moléculas de água nesta superfície através do aumento da hidrofobicidade de um ou mais aminoácidos da proteína na região; e obtenção da δ-endotoxina modificada assim produzida. Exemplos de δ-endotoxinas incluem Cry3Bb.11032, Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11051, Cry3Bb.11242 e Cry3Bb.11098. 36 ΡΕ1040192

Um segundo método para a produção de uma δ- endo-toxina Cry3Bb de B. thuringiensis modificada tendo activi-dade insecticida melhorada compreende a identificação de uma região em ansa numa δ-endotoxina; modificação de um ou mais aminoácidos na ansa para aumentar a hidrofobicidade dos aminoácidos; e obtenção da δ-endotoxina modificada assim produzida. A δ-endotoxina produzida por este método inclui Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242, Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238 e Cry3Bb.11239.

Um método para aumentar a mobilidade das hélices do canal iónico de uma δ-endotoxina Cry3B de B. thuringiensis é igualmente proporcionado pelo presente invento. O método, de um modo geral, compreende disrupção de uma ou mais ligações de hidrogénio formadas entre um primeiro aminoácido de uma ou mais hélices formadoras de canais e um segundo aminoácido da δ-endotoxina. As ligações de hidrogénio podem ser formadas inter- ou intramolercular-mente e a disrupção pode consistir na substituição de um primeiro ou segundo aminoácido com um terceiro aminoácido cuja distância espacial é superior a cerca de 3 Ã, ou cujo ângulo de ligação da orientação espacial não é igual a 180+60 graus relativamente ao local da ligação de hidrogénio do primeiro ou segundo aminoácido. As δ-endotoxinas produzidas por este método e aqui descritas incluem Cry3Bb.11222, Cry3Bb.11223, Cry3Bb.11224, Cry3Bb.11225, Cry3Bb.11226, Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11241 e Cry3Bb.11242 e Cry3Bb.11098. 37 ΡΕ1040192 É também aqui descrito um método para aumentar a flexibilidade de uma região em ansa num dominio formador de canais de uma δ-endotoxina Cry3Bb de B. thuringiensis. Este método compreende a obtenção de uma estrutural de cristal de uma δ-endotoxina Cry3Bb tendo uma ou mais regiões em ansa; identificação dos aminoácidos compreendendo a região em ansa; e alteração de um ou mais dos aminoácidos para reduzir o bloqueio espacial na região da ansa, em que a alteração aumenta a flexibilidade da região da ansa na δ-endotoxina. Exemplos de δ-endotoxinas produzidas usando este método incluem Cry3Bb.11032, Cry3Bb.11051, Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242, Cry3Bb.11036 e Cry3Bb.11098.

Um outro aspecto do invento é um método para aumentar a actividade de uma δ-endotoxina, compreendendo a redução ou eliminação da ligação da δ-endotoxina a um açúcar num tubo digestivo do insecto alvo. A eliminação ou redução pode ser conseguida através da remoção de uma ou mais hélices α do dominio 1 da δ-endotoxina, por exemplo, para remoção das hélices a, a2a/b e a3. Um exemplo de δ-endotoxina produzida usando o método é Cry3Bb.60.

Como alternativa, a redução ou eliminação pode ser conseguida através da substituição de um ou mais aminoácidos dentro da ansa pi , a8, com um ou mais aminoácidos 38 ΡΕ1040192 tendo maior hidrofobicidade. Tal método dá origem a δ-endotoxinas tais como Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11237 e Cry3Bb.11098, as quais são aqui descritas detalhadamente.

Como alternativa, a redução ou eliminação é conseguida através da substituição de um ou mais aminoáci-dos específicos, com um outro aminoácido. Tais substituições estão descritas na Tabela 2 e nos exemplos aqui apresentados. Um exemplo é a δ-endotoxina aqui designada como Cry3Bb.11221.

Um método de identificação de uma região de uma δ-endotoxina Cry3Bb para mutagénese dirigida compreende: obtenção de uma estrutura cristalina da δ-endotoxina; identificação a partir da estrutura cristalina de um ou mais aminoácidos expostos na superfície da proteína; substituição ao acaso de um ou mais dos aminoácidos expostos na superfície para obter uma pluralidade de polipe-ptídeos mutados, em que pelo menos 50% dos polipeptídeos mutados possuem menor actividade insecticida; e identificação a partir da pluralidade de polipeptídeos mutados de uma ou mais regiões da δ-endotoxina Cry3Bb para mutagénese dirigida. 0 método pode ainda compreender determinação das sequências de aminoácidos de uma pluralidade de polipeptí-deos mutados tendo menor actividade e identificação de um ou mais resíduos de aminoácidos necessários para a actividade insecticida. 39 ΡΕ1040192

Numa outra realização, o invento proporciona um processo para a produção de uma δ-endotoxina Cry3Bb tendo actividade insecticida melhorada. 0 processo, de um modo geral, envolve os passos de obtenção de uma estrutura cristalina de alta-resolução da proteína; determinação da distribuição da superfície electrostática da proteína; identificação de uma ou mais regiões de elevada diversidade electrostática; modificação da diversidade electrostática da região através da alteração de um ou mais aminoácidos na região; e obtenção de uma δ-endotoxina Cry3Bb com melhor actividade insecticida. Numa realização, a diversidade electrostática pode baixar relativamente à diversidade electrostática de uma δ-endotoxina Cry3Bb nativa. Exemplos de δ-endotoxinas com menor diversidade electrostática incluem Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11241 e Cry3Bb.11242. Como alternativa, a diversidade electrostática pode ser aumentada relativamente à diversidade electrostática de uma δ-endotoxina Cry3Bb nativa. Um exemplo de δ-endotoxina com maior diversidade electrostática é Cry3Bb.11234.

Ainda, o invento também proporciona um método de produção de uma δ-endotoxina Cry3Bb tendo maior capacidade insecticida, o qual envolve a obtenção de uma estrutura cristalina de alta resolução; identificação da presença de um ou mais locais de ligação a metais na proteína; alteração de um ou mais aminoácidos no local de ligação; e obtenção de uma proteína alterada, em que a proteína possui maior actividade insecticida. A alteração pode envolver a eliminação de um ou mais locais de ligação a metais. Exem- 40 ΡΕ1040192 pios de δ-endotoxinas incluem Cry3Bb.11222, Cry3Bb.11224, Cry3Bb.11225 e Cry3Bb.11226.

Um outro aspecto do invento envolve um método de identificação de uma δ-endotoxina Cry3Bb de B. thuringien-sis tendo maior actividade de canal. Este método, de forma geral, envolve a obtenção de uma δ-endotoxina Cry3Bb suspeita de ter melhor actividade de canal; e determinação de uma ou mais das seguintes caracteristicas na δ-endotoxina e comparação de tais caracteristicas com as obtidas para a δ-endotoxina selvagem não modificada: (1) a velocidade de formação de canais, (2) a velocidade de crescimento da condutância dos canais ou (3) a duração do estado de canal aberto. A partir desta comparação, pode-se então seleccionar uma δ-endotoxina que tenha maior velocidade de formação de canais comparativamente com a δ-endotoxina selvagem. Exemplos de δ-endotoxinas Cry3Bb preparadas por este método incluem Cry3Bb.60, Cry3Bb.11035, Cry3Bb.11048, Cry3Bb.11032, Cry3Bb.11223, Cry3Bb.11224, Cry3Bb.11226, Cry3Bb.11221, Cry3Bb.11242, Cry3Bb.11230 e Cry3Bb.11098. É igualmente proporcionado um método para a produção de uma δ-endotoxina Cry3Bb tendo melhor actividade insecticida que envolve a alteração de um ou mais amino-ácidos, que não sejam de superfície, situados perto ou no ponto de maior convergência de duas ou mais regiões de ansa da δ-endotoxina Cry3Bb, de forma que a alteração diminua a mobilidade de uma ou mais regiões das ansas. A mobilidade 41 ΡΕ1040192 pode, por conveniência, ser determinada por comparação da desnaturação térmica da proteína modificada com a δ-endotoxina Cry3Bb selvagem. Cry3Bb.11095 é um exemplo de proteína do cristal produzida por este método.

Um outro aspecto do invento envolve um método para a preparação de uma δ-endotoxina Cry3Bb modificada, tendo actividade insecticida melhorada compreendendo a modificação de um ou mais aminoácidos na ansa para aumentar a hidrofobicidade dos referidos aminoácidos; e alteração de um ou mais dos referidos aminoácidos para reduzir restrições espaciais na região da ansa, em que a alteração aumenta a flexibilidade da região da ansa na endotoxina. Exemplos de δ-endotoxinas Cry3Bb produzidas podem ser seleccionados do grupo consistindo em Cry3Bb.11057, Cry3Bb.11058, Cry3Bb.11081, Cry3Bb.11082, Cry3Bb.11083, Cry3Bb.11084, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11235 e Cry3Bb.11098. 0 invento também proporciona um método para melhorar a actividade insecticida de uma δ-endotoxina Cry3Bb de B. thuringiensis que, de um modo geral, compreende a inserção de um ou mais locais sensíveis a proteases numa ou mais regiões de ansa do domínio da δ-endotoxina. De preferência, a região da ansa é a3,4, e um exemplo de δ-endotoxina assim produzida é Cry3Bb.11221. 2.2 Composições de Polipeptídeos

As proteínas do cristal produzidas por cada um 42 ΡΕ1040192 dos métodos aqui descritos também representam aspectos importantes do invento. Tais > proteínas do cristal, de preferência, incluem uma proteína ou peptídeo seleccionado do grupo consistindo em Cry3Bb.60, Cry3Bb.11221, Cry3Bb.11222, Cry3Bb.11223, Cry3Bb.11224, Cry3Bb.11225, Cry3Bb.11226, Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242, Cry3Bb.11032, Cry3Bb.11035, Cry3Bb.11036, Cry3Bb.11046, Cry3Bb.11048, Cry3Bb.11051, Cry3Bb.11057, Cry3Bb.11058, Cry3Bb.11081, Cry3Bb.11082, Cry3Bb.11083, Cry3Bb.11084, Cry3Bb.11095 e Cry3Bb.11098.

Em realizações preferidas, a proteína compreende uma sequência de aminoácidos contígua seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO:4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO :10 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: : 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 100 , SEQ ID NO: 102 e SEC ! ID NO : 108 . São muito preferidas as proteínas do cristal codificadas pela sequência de ácido nucleico SEQ ID N0:1, 43 ΡΕ1040192 SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 13 , SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:2 7, SEQ ID NO: 29 , SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37 , SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45 , SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53 , SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:99, SEQ ID NC 1:101 ou SEQ ID NO:107, ou uma sequência de ácido nucleico que híbrida com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: ] SEQ ID NO:3, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:17 , SEQ ID NO:19 , SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:4 7, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101 ou SEQ ID NO : 107 em condições de restringência moderada.

As sequências de aminoácidos, peptídeos e proteínas dentro do âmbito do presente invento incluem, e nao estão limitados às sequências descritas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO:12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2 0, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO:2 4, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:2 8, SEQ ID NO : 3 0 , SEQ ID NO : 32 , SEQ ID NO:34, SEQ ID 44 ΡΕ1040192 NO: : 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: : 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 00 SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: : 52, SEQ ID NO: k·. LO SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 00 LO SEQ ID NO: : 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 00 SEQ ID NO: : 10 0, SEQ ID NO:102 e SEQ ID NO: 108, e alterações nas sequências de aminoácidos, incluindo alterações, deleções, mutações e homólogos. São aqui proporcionadas composições que compreendem entre 0,5% e 99% por peso da proteína do cristal, ou mais de preferência entre 5% e 75%, ou entre 25% e 50% por peso da proteína do cristal. Tais composições podem ser facilmente preparadas usando técnicas de produção e purificação de proteínas conhecidas dos familiarizados com a matéria e os métodos aqui descritos. Tal processo para a preparação de uma proteína do cristal Cry3Bb* envolve, de um modo geral, os passos de cultura de uma célula hospedeira que expressa a proteína Cry3Bb* (como seja uma célula de B. thuringiensis EG11221, EG11222, EG11223, EG11224 , EG11225 , EG11226, EG11227, EG11228, EG11229, EG11230, EG11231, EG11232, EG11233, EG11234, EG11235, EG11236, EG11237, EG11238, EG11239, EG11241, EG11242, EG11032, EG11035, EG11036, EG11046, EG11048, EG11051, EG11057, EG11058, EG11081, EG11082, EG11083, EG11084, EG11095 e EG11098) em condições eficaz es para a produção da proteína do cristal e depois obtenção da proteína do cristal assim produzida. A proteína pode estar presente em células 45 ΡΕ1040192 intactas e, como tal, podem não ser necessário quaisquer passos subsequentes de isolamento ou purificação de proteínas. Como alternativa, as células podem ser rebentadas, sonicadas, lisadas, destruídas ou plasmolisadas para libertar uma ou mais proteínas do cristal a partir dos detritos celulares residuais. Em tais casos, pode ser desejável isolar, concentrar ou ainda purificar os cristais resultantes contendo as proteínas antes de serem usadas como seja, por exemplo, na formulação de composições insectici-das. A composição pode ainda ser purificada para consistir quase totalmente em proteína pura ou, como alternativa, ser purificada ou isolada num grau tal que a composição compreenda as proteínas do cristal numa quantidade entre 0,5% e 99% por peso, ou numa quantidade entre 5% e 95% por peso, ou numa quantidade entre 15% e 85% por peso, ou numa quantidade entre 25% e 75% por peso, ou numa quantidade entre 40% e 60% por peso. 2.3 Vectores Recombinantes Expressando Genes Cry3*

Uma realização importante do invento é um vector recombinante que compreende um segmento de ácido nucleico codificador de uma ou mais das novas proteínas cristais de B. thuringiensis aqui descritas. Tal vector pode ser transferido e replicado num hospedeiro procariótico ou eucariótico, sendo as células bacterianas as particularmente preferidas como hospedeiros procariotas e as células vegetais sendo as particularmente preferidas como hospedeiros eucarióticos. 46 ΡΕ1040192

Επί realizações preferidas, o vector recombinante compreende um segmento de ácido nucleico codificador da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:3 0, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:3 8, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:6 6, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:10 0 , SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO:108. Segmentos de ácido nucleico muito preferidos são aqueles que possuem a

sequência : SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:3 9, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:4 7, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101 ou SEQ ID NO:107.

Uma outra realização importante do invento é uma célula hospedeira transformada que expressa um ou mais destes vectores recombinantes. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica, e células hospedeiras parti- 47 ΡΕ1040192 cularmente preferidas são aquelas que expressam um ou mais segmentos de ácido nucleico compreendendo o vector recom-binante, o qual codifica uma ou mais proteínas do cristal de B. thuringiensis compreendendo sequências de aminoácidos modificadas numa ou mais regiões de ansa do domínio 1, ou entre a hélice α 7 do domínio 1 e a cadeia β 1 do domínio 2. As células bacterianas são particularmente preferidas como hospedeiros procarióticos e as células vegetais são particularmente preferidas como hospedeiros eucarióticos.

Numa realização importante, o invento descreve e reivindica uma célula hospedeira em que as sequências de aminoácidos modificadas compreendem uma ou mais regiões de ansa entre as hélices α 1 e 2, hélices α 2 e 3, hélices α 3 e 4, hélices α 4 e 5, hélices α 5 e 6 ou hélices α 6 e 7 do domínio 1, ou entre a hélice α 7 do domínio 1 e a cadeia β 1 do domínio 2. Uma célula hospedeira particularmente preferida é aquela que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO O i—1 SEQ ID NO: : 12, SEQ ID NO: : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: : 38, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: : 46, SEQ ID NO oo SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: : 54, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: : 62, SEQ ID NO : 6 4, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: : 100 , SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO : 108 e < ] mais de preferência, uma que compreenda a sequência de ácido 48 ΡΕ1040192

nucleico SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:3 9, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:4 7, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO :101 ou SEQ ID NO:107. São aqui descritas e reivindicadas células hospedeiras bacterianas transformadas com um segmento de ácido nucleico codificador de uma proteína do cristal Cry3Bb de acordo com o presente invento e, em particular, uma célula de B. thuringiensis tendo a designação EG11222, EG11228, EG11234, EG11241, EG11048, EG11083, EG11223, EG11229, EG11235, EG11242, EG11051, EG11224, EG11230, EG11236, EG11032, EG11057, EG11225, EG11231, EG11237, EG11035, EG11058, EG11084, EG11095 ou EG11098. EG11226, EG11232, EG11238, EG11036, EG11081, EG11221, EG11227, EG11233, EG11239, EG11046, EG11082,

Numa outra realização, o invento engloba um método de utilização de um segmento de ácido nucleico do presente invento que codifica um gene cry3Bb*. O método, de um modo geral compreende os passos de: (a) preparação de um vector recombinante em que o gene cry3Bb* está posicionado sob o controlo de um promotor; (b) introdução no vector 49 ΡΕ1040192 recombinante numa célula hospedeira: (c) cultura da célula hospedeira em condições eficazes para permitir a expressão da proteína do cristal Cry3Bb* codificada pelo referido gene cry3Bb*; e (d) obtenção da proteína do cristal ou peptídeo Cry3Bb*.

Uma larga variedade de formas estão disponíveis para a introdução de um gene de B. thuringiensis expressando uma toxina no microrganismo hospedeiro em condições gue permitem a manutenção estável e expressão do gene. Pode-se proporcionar construções de DNA que incluem sinais reguladores da transcrição e da tradução para a expressão do gene da toxina, o gene da toxina sob o seu controlo de regulação e uma sequência de DNA homóloga de uma sequência do organismo hospedeiro, pelo que ocorrerá integração, e/ou um sistema de replicação que seja funcional no hospedeiro, pelo que ocorrerá a integração ou manutenção estável.

Os sinais de iniciação da transcrição incluirão um promotor e um local de iniciação da transcrição. Nalguns casos, poderá ser desejável proporcionar expressão regulada da toxina, pelo que a expressão da toxina ocorrerá apenas após lançamento no ambiente. Isto pode ser conseguido com operadores ou uma região de ligação a um activador ou estimuladores, os quais são capazes de fazer indução quando de uma alteração do ambiente físico ou químico dos microrganismos. Por exemplo, pode ser empregue uma região reguladora sensível à temperatura, pelo que os organismos podem ser cultivados no laboratório sem expressão de uma 50 ΡΕ1040192 toxina, mas quando da libertação no ambiente a expressão será iniciada. Outras técnicas podem empregar um meio nutritivo específico no laboratório, o qual inibe a expressão da toxina, pelo que o meio nutritivo no ambiente permitirá a expressão da toxina. Para a iniciação da tradução, estará presente um local de ligação ao ribossoma e um codão de iniciação.

Podem ser empregues várias manipulações para estimular a expressão do RNA mensageiro, particularmente através da utilização de um promotor activo, assim como através do emprego de sequências, as quais aumentam a estabilidade do RNA mensageiro. A região de terminação da transcrição e da tradução envolverá um ou mais codões de paragem, uma região terminadora e, facultativamente, um sinal de poliadenilação. Uma sequência "leader" hidrofóbica pode ser empregue no extremo amina da sequência polipeptídica traduzida de forma a promover a secreção da proteína através da membrana interna.

Na direcção da transcrição, nomeadamente na direcção 5' para 3' da sequência codificadora, a construção envolverá a região reguladora da transcrição, caso exista, e o promotor, em que a região reguladora pode estar 5' ou 3' relativamente ao promotor, o local de ligação ao ribossoma, o codão de iniciação, o gene estrutural tendo uma grelha de leitura aberta em fase com o codão de iniciação, um ou mais codões de paragem, a sequência sinal de poliadenilação, caso exista, e a região terminadora. 51 ΡΕ1040192

Esta sequência, como cadeia dupla, pode ser usada por si só na transformação de um microrganismo hospedeiro, mas incluirá de forma geral uma sequência de DNA envolvendo um marcador, em que a segunda sequência de DNA pode ser ligada à construção de expressão da toxina durante a introdução do DNA no hospedeiro.

Por marca pretende-se significar um gene estrutural que proporciona selecção destes hospedeiros que foram modificados ou transformados. Geralmente, a marca proporcionará vantagem selectiva, por exemplo, proporcionando resistência biocida, e.g., resistência a antibióticos ou a metais pesados; complementação, de forma a proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, ou similares. De preferência, a complementação é empregue, de forma a que o hospedeiro modificado possa não só ser seleccionado, como também seja competitivo no campo. Uma ou mais marcas podem ser empregues no desenvolvimento das construções, assim como para a modificação do hospedeiro. Os organismos podem ainda ser modificados ao proporcionar-se uma vantagem competitiva contra outros microrganismos selvagens no campo. Por exemplo, os genes que expressam agentes quelan-tes de metais, e.g., sideróforos, podem ser introduzidos no hospedeiro juntamente com o gene estrutural expressando a toxina. Desta forma, o aumento da expressão de um sideró-foro poderá proporcionar uma vantagem competitiva para o hospedeiro produtor de toxinas, de forma a que possa eficazmente competir com os microrganismos selvagens e estavelmente ocupar um nicho no ambiente. 52 ΡΕ1040192

Sempre que não esteja presente um sistema de replicação funcional, a construção incluirá também uma sequência de pelo menos 50 pares de bases (pb), de preferência pelo menos cerca de 100 pb, mais de preferência pelo menos cerca de 1000 pb, e geralmente não mais de cerca de 2000 pb de uma sequência homóloga com uma sequência no hospedeiro. Desta forma, é aumentada a probabilidade de recombinação legitima, de forma a que o gene seja integrado no hospedeiro e estavelmente mantido no hospedeiro. É desejável, que o gene da toxina esteja em estreita proximidade com o gene que proporciona complementação assim como o gene que proporciona vantagem competitiva. Desta forma, no caso de se perder o gene de uma toxina, o organismo resultante com grande probabilidade também perderá o gene de complementação e/ou o gene que proporciona vantagem competitiva, de forma a que seja incapaz de competir no ambiente com o gene mantendo a construção intacta.

Um grande número de regiões reguladoras da transcrição estão disponíveis a partir de uma variedade de microrganismos hospedeiros, tais como bactérias, bacterió-fagos, cianobactérias, algas, fungos e similares. Várias regiões reguladoras da transcrição incluem as regiões associadas ao gene trp, gene lac, gene gal, os promotores XL e XR, o promotor tac, os promotores naturais associados ao gene da δ-endotoxina, quando funcionais no hospedeiro. Ver por exemplo, Patentes U.S. 4332898, 4342832 e 4356270 (cada uma das quais é aqui especificamente incorporada como 53 ΡΕ1040192 referência) . A região de terminação pode ser a região de terminação normalmente associada à região de iniciação da transcrição ou uma região de iniciação da transcrição diferente, de forma a que as duas regiões sejam compatíveis e funcionais no hospedeiro.

Quando se pretenda a manutenção ou integração epissómica estável, empregar-se-á um plasmídeo que tenha um sistema de replicação funcional no hospedeiro. 0 sistema replicativo pode derivar do cromossoma, de um elemento epissómico normalmente presente no hospedeiro ou num hospedeiro diferente ou de um sistema replicativo derivado de um vírus que seja estável no hospedeiro. Existe um grande número de plasmídeos, tais como pBR322, pACYC184, RSF1010, pR01614 e similares. Ver, por exemplo, Olson et al. (1982); Bagdasarian et al. (1981), Baum et al., 1990 e Patentes U.S. 4356270; 4362817; 4371625 e 5441884, aqui incluídos especificamente como referência. O gene de B. thuringiensis pode ser introduzido entre a região de iniciação da transcrição e da tradução e a região de terminação da transcrição e da tradução, de forma a estar sob o controlo regulador da região de iniciação. Esta construção será incluída num plasmídeo, o qual possuirá pelo menos um sistema de replicação, mas pode incluir mais de um, neste caso um sistema replicativo é empregue para clonagem durante o desenvolvimento do plasmídeo e o segundo sistema replicativo é necessário para o funcionamento no hospedeiro final. Ainda, podem estar 54 ΡΕ1040192 presente uma ou mais marcas, as quais foram anteriormente descritas. Quando se pretende integração, o plasmideo incluirá de preferência uma sequência homóloga do genoma do hospedeiro.

Os transformantes podem ser isolados de acordo com meios convencionais, geralmente empregando uma técnica de selecção, a qual permite a selecção do organismo pretendido face aos organismos não modificados ou organismos de transferência, quando presentes. Os transformantes podem ser então testados relativamente à actividade pesticida. Caso se pretenda, as sequências de DNA indesejáveis ou auxiliares podem ser selectivamente removidas da bactéria recombinante usando sistemas de recombinação específicos de local, tais como os descritos na Patente U.S. 5441884 (especificamente incluída aqui como referência) . 2.4 Segmentos de DNA cry3

Um gene cry3* de B. thuringiensis codificador de uma proteína do cristal tendo uma ou mais mutações numa ou mais regiões do peptídeo representa um aspecto importante do invento. De preferência, o gene cry3* codifica uma sequência de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram alterados com base nos métodos aqui descritos e, particularmente, as alterações que foram feitas com o objectivo de alterar a actividade ou especificidade insecticida da proteína do cristal. 55 ΡΕ1040192

De acordo com o presente invento, sequências de ácido nucleico incluem e não estão limitadas a DNA, incluindo e não limitado a mRNA e tRNA; sequências complementares da cadeia codificadora, nucleósidos e sequências de ácido nucleico adequadas, tais como as descritas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:2 7, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID \—1 LO O SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:6 7, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101 ou SEQ ID NO : 10 7, e alterações nas sequências ; de ácido nucleico incluindo alterações, deleções, mutações e homólogos capazes de expressar as toxinas modificadas de B. thuringiensis do presente invento.

Como tal, o presente invento também está relacionado com segmentos de DNA que não possuem DNA genómico total e que codificam as novas proteínas do cristal modificadas sinteticamente aqui descritas. Os segmentos de DNA codificadores destes peptídeos podem codificar proteínas, polipeptídeos, subunidades, domínios funcionais e similares dos produtos de genes relacionados ou não com as proteínas do cristal. Ainda, estes segmentos de DNA podem ser sintetizados totalmente in vitro usando métodos bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. 56 ΡΕ1040192

Tal como aqui é usado, o termo "segmento de DNA" refere-se a uma molécula de DNA que foi isolada sem a presença de DNA genómico total de uma espécie particular. Assim, um segmento de DNA codificador de uma proteína do cristal ou peptídeo refere-se a um segmento de DNA que contem sequências codificadoras de proteínas do cristal ainda que isolado ou purificado a partir de DNA genómico total da espécie de onde o segmento de DNA é obtido, o qual no caso vertente é o genoma de bactérias Gram-positivas do género Bacillus e, em particular, a espécie de Bacillus conhecida como B. thuringiensis. Estão incluídos no termo "segmento de DNA", segmentos de DNA e fragmentos mais pequenos de tais segmentos e também vectores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagomideos, fagos, virus e similares.

De forma semelhante, um segmento de DNA compreendendo um gene codificador de proteína do cristal isolada ou purificada refere-se a um segmento de DNA que pode incluir, para além das sequências codificadoras de peptídeos, outros elementos tais como sequências reguladoras, isolados sem outros genes naturais ou sequências codificadoras de proteínas. Neste aspecto, o termo "gene" é usado por simplicidade para referir uma unidade funcional codificadora de proteína, polipeptídeo ou peptídeo. Conforme será compreendido pelos familiarizados com a matéria, este termo funcional inclui sequências genómicas, sequências de operão e segmentos de genes mais pequenos manipulados geneti- 57 ΡΕ1040192 camente ou podem ser adaptados para expressar proteínas, polipeptídeos ou peptídeos. "Substancialmente isolado sem outras sequências codificadoras" significa que o gene com interesse, neste caso um gene codificador de uma proteína do cristal bacteriana, forma a parte significativa da região codificadora do segmento de DNA e que o segmento de DNA não possui grandes porções de DNA codificador natural, como sejam fragmentos cromossómicos grandes ou outros genes funcionais ou regiões codificadoras de operões. Certamente, isto refere-se ao segmento de DNA como originalmente isolado e não exclui genes, genes recombinantes, adaptadores sintéticos ou regiões codificadoras mais tarde adicionadas ao segmento pela mão humana.

Sao particularmente preferidas as sequências de DNA codificadoras das proteínas do cristal Cry3Bb.60, Cry3Bb.11221, Cry3Bb.11222, Cry3Bb.11223, Cry3Bb.11224, Cry3Bb.11225, Cry3Bb.11226, Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242, Cry3Bb.11032, Cry3Bb.11035, Cry3Bb.11036, Cry3Bb.11046, Cry3Bb.11048, Cry3Bb.11051, Cry3Bb.11057, Cry3Bb.11058, Cry3Bb.11081, Cry3Bb.11082, Cry3Bb.11083, Cry3Bb.11084, Cry3Bb.11095 e Cry3Bb.11098 e, em particular, genes cry3Bb* tais como cry3Bb.60, cry3Bb.11221, cry3Bb.11222, cry3Bb.11223, cry3Bb.11224, cry3Bb.11225, 58 ΡΕ1040192 cry3Bb.11226, cry3Bb. 11227, cry3Bb.11228, cry3Bb.11229, cry3Bb.11230, cry3Bb.11231, cry3Bb.11232, cry3Bb.11233, cry3Bb.11234, cry3Bb.11235, cry3Bb.11236, cry3Bb. 11237, cry3Bb.11238, cry3Bb.11239, cry3Bb.11241, cry3Bb.11242, cry3Bb.11032, cry3Bb.11035, cry3Bb .11036, cry3Bb. 11046, cry3Bb.11048, cry3Bb.11051, cry3Bb. 11057, cry3Bb.11058, cry3Bb.11081, cry3Bb.11082, cry3Bb.11083, cry3Bb.11084, cry3Bb.11095 e cry3Bb.11098. Em realizações particulares, o

invento diz respeito a segmentos de DNA isolados e vectores recombinantes que incluem sequências de DNA codificadoras de peptideos Cry que incluem na sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos essencialmente como descrito em SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID

NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:2 4, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:6 4, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO:108. 0 termo " uma sequência essencialmente : como descrito em SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:2 4, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID 59 ΡΕ1040192

NO :40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID

NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID

NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID

NO:6 4, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID N0:100, SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO:108" significa que a sequência corresponde substancialmente a uma porção da sequência de SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO:4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO:8, SEQ ID O \—1 O SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:3 4, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:6 6, SEQ ID NO:68, SEQ ID NC u 100, SEQ ID NO :102 ou SEQ ID NO:10 8 e tem relativamente : poucos aminoácidos que não são idênticos ou equivalentes biologicamente funcionais dos aminoácidos de qualquer uma destas sequências. O termo "equivalente biologicamente funcional" é óbvio na técnica e está ainda aqui definido detalhadamente (e.g., ver Exemplos de Realizações).

Assim, as sequências que tenham entre 70% e 75% ou entre 75% e 80%, ou mais de preferência entre 81% e 90%, ou mesmo mais de preferência entre 91% ou 92% ou 93% e 97% ou 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos ou equivalência funcional dos aminoácidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID 60 ΡΕ1040192 NO:2 0, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:2 8, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID O QO O S SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:6 6, SEQ ID NO:6 8, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO:108 serão sequências que são "es sencialmente como descrito em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22 , SEQ ID NO:24 , SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:2 8, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID O 0Ω O iz; SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:6 6, SEQ ID NO:6 8, SEQ ID NO:100, : SEQ id : NO:102 ou SEQ ! ID NO:108 ff Será igualmente entendido que as sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos N- ou C-terminais ou sequências 5' ou 3' e ainda são essencialmente como descrito numa das sequências aqui descritas, desde que a sequência preencha os critérios atrás descritos, incluindo a manutenção de actividade proteica biológica no caso de estar em questão a expressão proteica. A adição de sequências terminais aplica-se, particularmente, a sequências de ácido nucleico que podem, por exemplo, incluir várias sequências não codificadoras flanqueantes das porções 5' ou 61 ΡΕ1040192 3' da região codificadora ou podem incluir várias sequências internas, i.e., intrões, os quais existem nos genes.

Os segmentos de ácido nucleico do presente invento, independentemente do comprimento da sua sequência codificadora, podem ser combinados com outras sequências de DNA, tais como promotores, sinais de poliadenilação, locais para enzimas de restrição adicionais, múltiplos locais de clonagem, outros segmentos codificadores e similares, de forma a que o seu comprimento global possa variar consideravelmente. Está portanto contemplado que possa ser empregue um fragmento de ácido nucleico de qualquer tamanho, estando o comprimento total preferencialmente limitado pela facilidade de preparação e utilização do protocolo de DNA recombinante pretendido.

Por exemplo, podem ser preparados fragmentos de ácido nucleico que incluam um pequeno segmento contíguo codificador da sequência peptídica descrita em SEQ ID NO:2,

SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO:8 , SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2 0, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:2 8, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:6 0, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:6 6, SEQ ID NO:6 8, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO: 108, OU que seja idêntica ou complementar das sequências de DNA que 62 ΡΕ1040192 codificam o peptídeo descrito em SEQ ID NO:2 , SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ! ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 20 , SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 24 , SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:3 0, SEQ ID NO: 32 , SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO: 40 , SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO: 48 , SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO: 56 , SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO: 64 , SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:100 , SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO:108, e particularmente os segmentos de DNA descritos em SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, r SEQ ID : NO: 7, SEQ ID NO:9 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23 , SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:2 9, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:3 7, SEQ ID NO: 39 , SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO: 47 , SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55 , SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO: 63 , SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:9 9, SEQ : ID NO:101 ou SEQ ID i NO:107 . São muito preferidos os segmentos de ácido nucleico do presente invento que compreendem um ou mais genes cry do invento, ou uma porção de um ou mais genes cry do invento. Para determinadas aplicações, são preferidas pequenas sequências de ácido nucleico contíguas, tais como as de aproximadamente 14 ou 15 ou 16 ou 17 ou 18 ou 19 ou 20, ou 30-50, 51-80, 81-100 ou mais nucleótidos de comprimento. Como alternativa, nalgumas realizações, e 63 ΡΕ1040192 particularmente nas que envolvem a preparação de vectores recombinantes, transformação de células hospedeiras adequadas e preparação de células veqetais transgénicas, são preferidos segmentos de ácido nucleico mais longos, particularmente os que incluem a totalidade da região codificadora de um ou mais genes cry. Como tal, os segmentos preferidos podem incluir os que possuem até cerca de 20000 ou mais nucleótidos de comprimento ou, como alternativa, sequências mais curtas como as com cerca de 19000, cerca de 18000, cerca de 17000, cerca de 16000, cerca de 15000, cerca de 14000, cerca de 13000, cerca de 12000, cerca de 11000, cerca de 10000, cerca de 9000, cerca de 8000, cerca de 7000, cerca de 6000, cerca de 5000, cerca de 4500, cerca de 4000, cerca de 3500, cerca de 3000, cerca de 2500, cerca de 2000, cerca de 1500, cerca de 1000, cerca de 500 ou cerca de 200 ou mais pares de bases de comprimento. Certamente, estes números não se destinam a ser exclusivos de todos os possíveis comprimentos intermédios na gama entre cerca de 20000 e cerca de 15 nucleótidos, uma vez que todos estes comprimentos intermédios são considerados úteis e caem dentro do âmbito do presente invento. Será facilmente compreendido que "comprimentos intermédios", nestes contextos, significam qualquer comprimento entre os limites seleccionados tais como 14, 15, 16, 17, 18 Oh s—1 20, etc. ; 21, 2 ,2, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, etc., ; 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 . . . etc .; 50, 51, 52 , 53 ____ etc. ; 60, i—1 62, 63 etc.; 70, 80, 90, 100, 110, 120, . 130 etc. ; 200, 210 , 220, 230, 240, 250, . . . etc.; incluindo todos os números inteiros em toda a gama entre cerca e 14 e 64 ΡΕ1040192 cerca de 10000, incluindo os inteiros nas gamas de 200-500; 500-1000; 1000-2000; 2000-3000; 3000-5000 e similares.

Numa realização preferida, os segmentos de ácido nucleico compreendem uma sequência entre cerca de 1800 e cerca de 18000 pares de bases de comprimento e compreendem um ou mais genes que codificam um polipeptídeo Cry3* modificado aqui descrito que tem maior actividade contra pragas de insectos coleópteros.

É igualmente entendido que este invento nao está limitado a sequências de ácido nucleico particulares que codificam peptideos do presente invento ou que codificam a sequência de aminoácidos de ; SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:3 0, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:3 8, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:10 0 , SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO:108, incluindo as sequências de DNA que sao particularmente descritas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID 65 ΡΕ1040192 NO: 49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 5 7, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101 ou SEQ ID NO:107. Vectores recombinantes e segmentos de DNA isolados podem portanto incluir, de forma variável, as próprias regiões codificadoras de peptídeos, regiões codificadoras portadoras de alterações ou mutações seleccionadas na região codificadora básica, ou sequências codificadoras de polipeptídeos maiores que, no entanto, incluem estas regiões codificadoras de peptídeos ou que podem codificar proteínas ou peptídeos equivalentes do ponto de vista funcional, possuidoras de variantes das sequências de aminoácidos.

Os segmentos de DNA do presente invento incluem peptídeos equivalentes biologicamente funcionais. Tais sequências podem surgir como consequência da redundância de codões e da equivalência funcional que se sabe ocorrer naturalmente nas sequências de ácido nucleico e proteínas codificadas. Como alternativa, proteínas ou peptídeos funcionalmente equivalentes podem ser criados via aplicação de tecnologia de DNA recombinante, em que as alterações na estrutura proteica podem ser manipuladas com base em considerações das propriedades dos aminoácidos a ser alterados. As alterações projectadas pelo homem podem ser introduzidas através da aplicação de técnicas de mutagénese dirigida, e.g., para introduzir melhoramentos na antigenicidiade da proteína ou para testar mutantes de forma a examinar a actividade ao nível molecular. ΡΕ1040192 - 6 6 -

Caso se pretenda, pode-se também preparar proteínas e peptídeos de fusão, e.g. em que as regiões codificadoras dos peptídeos são alinhadas dentro da mesma unidade de expressão com outras proteínas ou peptídeos tendo as funções pretendidas, como seja para a purificação ou imunodetecção (e.g., proteínas que possam ser purificadas por cromatografia de afinidade e regiões codificadoras de marcas enzimáticas, respectivamente).

Os vectores recombinantes formam outros aspectos do presente invento. São considerados particularmente úteis os vectores em que a porção codificadora do segmento de DNA, codificadora de uma proteína de tamanho completo ou peptídeo mais pequeno, esteja posicionada sob o controlo de um promotor. 0 promotor pode ser na forma do promotor naturalmente associado ao gene codificador de peptídeos do presente invento, tal como pode ser obtido através do isolamento de sequências não codificadoras 5' localizadas a montante do segmento codificador ou exão, por exemplo, usando tecnologia recombinante de clonagem e/ou PCR™, em associação com as composições aqui descritas. 2.5 Vectores , Células Hospedeiras e Expressão Proteica

Noutras realizações, é considerado que serão adquiridas determinadas vantagens através do posicionamento do segmento de DNA codificador sob o controlo de um promotor recombinante ou heterólogo. Tal como aqui é usado, um promotor recombinante ou heterólogo destina-se a referir 67 ΡΕ1040192 um promotor que não está normalmente associado a um segmento de DNA codificador de uma proteína ou peptídeo cristal no seu ambiente natural. Tais promotores podem incluir promotores normalmente associados a outros genes e/ou promotores isolados a partir de qualquer célula bacteriana, vírus, célula eucariótica ou célula vegetal. Naturalmente, será importante empregar um promotor que eficazmente dirija a expressão do segmento de DNA no tipo de célula, organismo ou mesmo animal escolhido para expressão. A utilização de combinações de promotor e tipo de célula para a expressão proteica é de um modo geral conhecida dos familiarizados com a técnica da biologia molecular, por exemplo, ver Sambrook et al., 1989 . Os promotores empregues podem ser constitutivos ou induzíveis e podem ser usados nas condições adequadas para dirigir nível elevado de expressão do segmento de DNA introduzido, tal como é vantajoso na produção em larga escala de proteínas ou peptídeos recombinantes. Sistemas promotores adequados contemplados para usar em elevados níveis de expressão incluem, mas não estão limitados ao sistema vector de expressão de Pichia (Pharmacia LKB Technology).

Associado às realizações de expressão para preparar proteínas ou peptídeos recombinantes, é considerado que os segmentos de DNA mais longos serão mais frequentemente usados, sendo mais preferidos os segmentos de DNA codificadores da totalidade da sequência peptídica. No entanto, será óbvio que a utilização de segmentos de DNA mais pequenos para dirigir a expressão de peptídeos do cristal 68 ΡΕ1040192

ou regiões centrais epitópicas, tal como pode ser usado para gerar anticorpos anti-proteínas do cristal, também estão dentro do âmbito do invento. São considerados como particularmente úteis os segmentos de DNA que codificam antigénios peptídicos entre cerca de 8, 9, 10 ou 11 ou mais aminoácidos, e até os que incluem cerca de 30, 40 ou 50 ou mais aminoácidos de comprimento, ou mais de preferência, entre cerca de 8 e cerca de 30 aminoácidos de comprimento, ou mesmo mais de preferência, entre cerca de 8 e cerca de 20 aminoácidos de comprimento são considerados particularmente úteis. Tais epitopos peptídicos podem ser sequências de aminoácidos que compreendem uma sequência de aminoácidos contíguas de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID

NO: 8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:2 4, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:6 4, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO:108. 2.6 Células Hospedeiras Transformadas e Plantas Transgénicas

Numa realização, o invento proporciona uma planta transgénica tendo incorporado no seu genoma um transgene que codifica uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, 69 ΡΕ1040192

SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO:10, SEQ I D NO : 12, SEQ ID NO: 1—1 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:20 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO : 2 8, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 3 4 , SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO : 42 , SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO : 50 , SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO : 58 , SEQ ID NO : 6 0, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO : 66, r SEQ ID NO: co > SEQ H u o 1—* O O SEQ ID NO:102 ou SEQ ID NO:108.

Um outro aspecto do invento é uma planta trans-génica tendo incorporado no seu genoma um transgene cry3Bb*, desde que o transgene compreenda uma sequência de ácido nucleico seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 13 , SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:2 7, SEQ ID NO: 29 , SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37 , SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45 , SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53 , SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:6 7, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101 ou SEQ ID NO:107. T ambém é descrita e ; reivindicada a progénie de tal planta transgénica , assim como as suas sementes e sementes que surjam das plantas derivadas de tal planta transgénica, da segunda geraçao e gerações subsequentes. O invento também descreve e reivindica células 70 ΡΕ1040192 hospedeiras, nativas e geneticamente manipuladas, que expressam os novos genes cry3Bb* para produzir polipeptí-deos Cry3Bb*. Exemplos preferidos de células hospedeiras bacterianas incluem B. thuringiensis EG11221, EG11222 EG11223, EG11224 , EG11225, EG11226, EG11227, , EG11228 EG11229, EG11230, EG11231, EG11232, EG11233, EG11234 EG11235, EG11236, EG11237, EG11238, EG11239, EG11241 EG11242, EG11032, EG11035, EG11036, EG11046, EG11048 EG11051, EG11057, EG11058, EG11081, EG11082, EG11083 EG11084, EG11095 e EG11098. Métodos de utilização de tais células para pro duzir proteínas cristais Cry3 * sao igualmente descritos

Tais métodos, de um modo geral, envolvem a cultura da célula hospedeira (como seja B. thuringiensis EG11221, EG11222, EG11223, EG11224 , EG11225, EG11226, EG11227, EG11228, EG11229, EG11230, EG11231, EG11232, EG11233, EG11234, EG11235, EG11236 , EG11237, EG11238, EG11239, EG11241, EG11242, EG11032, EG11035, EG11036, EG11046, EG11048, EG11051, EG11057, EG11058, EG11081, EG11082, EG11083, EG11084, EG11095 ou EG11098) em condições eficazes para produzir uma protéina cristal Cry3* e obtenção de proteína do cristal Cry3* a partir da referida célula.

Ainda num outro aspecto, o presente invento proporciona método para a produção de uma planta transgénica que expressa um segmento de ácido nucleico codificador das novas proteínas do cristal recombinantes do presente invento. O processo de produção de plantas transgénicas é 71 ΡΕ1040192 bem conhecido na técnica. Em geral, o método compreende transformação de uma célula hospedeira adequada com um ou mais segmentos de DNA que contêm um ou mais promotores operacionalmente ligados a uma região codificadora que codifica uma ou mais das proteínas do cristal descritas para B. thuringiensis. Tal região codificadora está, de um modo geral, operacionalmente ligada a uma região de terminação da transcrição, pelo que o promotor é capaz de dirigir a transcrição da região codificadora na célula e portanto proporcionar à célula a capacidade de produzir a proteína recombinante in vivo. Como alternativa, no caso em que é desejável controlar, regular ou diminuir a quantidade de uma proteína do cristal recombinante particular expressa numa célula transgénica particular, o invento também proporciona a expressão do mRNA complementar da sequência codificadora de proteína do cristal. A utilização de mRNA complementar de sequência codificadora como meio de controlar ou diminuir a quantidade de uma determinada proteína com interesse numa célula é conhecido na técnica.

Um outro aspecto do invento compreende uma planta transgénica que expressa um gene ou um segmento de gene codificador de uma ou mais das novas composições poli- peptídicas aqui descritas. Como aqui é usado, 0 termo "planta transgénica" destina-se a referir uma planta que tem sequências de DNA incluídas, incluindo mas não estando limitado a genes que talvez não estejam normalmente presentes, sequências de DNA normalmente não transcritas em RNA ou traduzidas numa proteína ("expressas"), ou quaisquer outros genes ou sequências de DNA que se pretenda intro- 72 ΡΕ1040192 duzir na planta não transformada, como sejam genes que possam normalmente estar presentes na planta não transformada mas que se pretende manipular geneticamente ou que tenha expressão alterada.

Considera-se que nalguns casos o genoma de uma planta transgénica do presente invento tenha sido aumentado através da introdução estável de um ou mais transgenes codificadores de Cry3Bb* nativos, modificados sinteticamente ou mutagenizados. Nalguns casos, mais de um transgene será incluído no genoma da célula vegetal hospedeira transformada. Assim acontece quando mais de um segmento de DNA codificador de proteína do cristal é incluído no genoma de tal planta. Em determinadas situações, pode ser desejável ter uma, duas, três, quatro ou mesmo mais proteínas do cristal de B. thuringiensis (nativas ou manipuladas por engenharia genética) incorporadas e estavel-mente expressas na planta transgénica transformada.

Um gene preferido que pode ser introduzido inclui, por exemplo, uma sequência de DNA codificadora de uma proteína do cristal de origem bacteriana e, particularmente, uma ou mais das aqui descritas, as quais são obtidas a partir e Bacillus spp. Sequências de ácido nucleico altamente preferidas são as obtidas a partir de B. thuringiensis ou qualquer uma das sequências que tenham sido geneticamente manipuladas para diminuir ou aumentar a actividade insecticida da proteína do cristal em tal célula hospedeira transformada. 73 ΡΕ1040192

Meios para a transformação de uma célula vegetal e preparação de uma linha celular transgénica são conhecidos e são aqui discutidos. Vectores, plasmídeos, cosmí-deos, YACs (cromossomas artificiais de levedura) e segmentos de DNA para usar na transformação de tais células certamente compreenderão, de um modo geral, operões, genes ou sequências derivadas de genes do presente invento, nativas ou derivadas sinteticamente e, particularmente, as codificadoras das proteínas cristais descritas. Estas construções de DNA podem ainda incluir estruturas tais como promotores, estimuladores, poli-adaptadores ou mesmo sequências de genes as quais possuem actividade reguladora positiva ou negativa sobre genes particulares com interesse conforme pretendido. 0 segmento de DNA ou gene pode codificar uma proteína do cristal nativa ou modificada, que será expressa nas células recombinantes resultantes e/ou conferirá um fenótipo melhorado à planta regenerada.

Tais plantas transgénicas podem ser desejáveis para aumentar a resistência a insecticida de uma planta monocotiledónea ou dicotiledónea, através da incorporação em tal planta, de um segmento de DNA transgénico codificador de uma proteína do cristal Cry3*Bb que é tóxica para insectos coleópteros. Plantas particularmente preferidas incluem cereais tais como milho, trigo, centeio, arroz, cevada e aveia; legumes tais como feijão de soja; tubérculos tais como batatas; culturas de fibras tais como linho e algodão; turfa e gramímeas de pastagens; plantas ornamentais; arbustos; árvores; vegetais, bagas, citrinos, frutos, cactos, suculentas e outras culturas com impor- 74 ΡΕ1040192 tância comercial incluindo plantas de jardim e de interiores.

Num aspecto relacionado, o presente invento também engloba uma semente produzida pela planta transformada, uma progénie derivada de tal semente e uma semente produzida pela progénie da planta transgénica original, produzida de acordo com o processo descrito. Tal progénie e sementes terão um ou mais genes de proteínas do cristal incorporados no seu genoma e tais plantas de progénie herdarão de forma Mendeliana as características proporcionadas pela introdução de um transgene estável. Todas essas plantas transgénicas possuindo incorporados no seu genoma segmentos de DNA transgénicos codificadores de uma ou mais proteínas ou polipeptídeos cristais Cry3Bb* são aspectos deste invento. Transgenes particularmente preferidos para a realização do invento incluem segmentos de ácido nucleico compreendendo um ou mais genes cry3Bb*. 2.7 Equivalentes Biológicos Funcionais

Podem ser efectuadas modificações e alterações na estrutura dos peptídeos do presente invento e segmentos de DNA que os codificam e ainda obter uma molécula funcional que codifique uma proteína ou peptídeos com características desejáveis. Segue-se uma discussão baseada na alteração dos aminoácidos de uma proteína para criar uma molécula de segunda geração equivalente, ou mesmo melhorada. Em realizações particulares do invento, as proteínas do cristal mutagenizadas são consideradas como úteis no aumento da 75 ΡΕ1040192 actividade insecticida da proteína e, consequentemente, no aumento da actividade insecticida e/ou expressão do transgene recombinante numa célula vegetal. As alterações de aminoácidos podem ser conseguidas através da alteração dos codões da sequência de DNA, de acordo com os codões apresentados na Tabela 4.

Tabela 4

Aminoácidos Codões

Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Ácido Aspártico Asp D GAC GAU Ácido glutâmico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina Ile I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gin Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Vai V GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU 76 ΡΕ1040192

Por exemplo, determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos numa estrutura proteica sem perda apreciável da capacidade de ligação interactiva com estruturas tais como, por exemplo, regiões de ligação a antigénios dos anticorpos ou locais de ligação nas moléculas de substrato. Uma vez que é a capacidade interactiva e a natureza de uma proteína que define a actividade biológica funcional da proteína, podem ser feitas determinadas substituições na sequência de aminoácidos da proteína e, certamente, na sua sequência de DNA codificadora subjacente e, no entanto, obter-se uma proteína com propriedades semelhantes. É assim contemplado pelos inventores que várias alterações podem ser feitas nas sequências peptídicas das composições descritas, ou sequências de DNA correspondentes que codificam os referidos peptídeos, sem perda apreciável da sua utilidade ou actividade biológica.

Na preparação de tais alterações, pode ser considerado o índice hidropático dos aminoácidos. A importância do índice hidropático dos aminoácidos na função biológica interactiva de uma proteína é, de um modo geral, entendido na técnica (Kyte and Doolittle, 1982, aqui incluído como referência). É aceite que o carácter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, o que por sua vez define a interacção da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antigénios e similares. 77 ΡΕ1040192 A cada um dos aminoácidos foi atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidro-fobicidade e de carga (Kyte and Doolittle, 1982), estas são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,,9) ; e arginina (-4,5) . É conhecido na técnica gue determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou pontuação hidropática semelhante e ainda resultar numa proteína com actividade biológica semelhante, i.e., ainda obter uma proteína funcionalmente eguivalente em termos biológicos. Ao serem feitas tais alterações, prefere-se que a substituição seja entre aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ±2, sendo particularmente preferidos os que estão dentro de ±1 e os que estão dentro de ±0,5 são mesmo mais particularmente preferidos. É igualmente entendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. A Patente U.S. 4554101, aqui especificamente incluída como referência, estabelece que hidrofilicidade média local mais elevada de uma proteína, conforme determinado pela hidrofilicidade dos 78 ΡΕ1040192 seus aminoácidos adjacentes, está correlacionada com uma propriedade biológica da proteína.

Conforme detalhado na Patente U.S. 4554101, foram atribuídos aos resíduos de aminoácidos os valores de hidrofilicidade que se seguem: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (3,0 ± 1); glutamato (3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

Deve ser entendido que um aminoácido pode ser substituído por um outro tendo um valor de hidrofilicidade semelhante e ainda obter um equivalente biológico e, em particular, uma proteína imunologicamente equivalente. Em tais alterações, é preferida a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2, sendo particularmente preferidos os que estão dentro de ±1 e ainda mais particularmente preferidos os que estão dentro de ± 0,5.

Conforme descrito atrás, as substituições de aminoácidos são, de um modo geral baseadas na semelhança relativa dos substituintes das cadeias laterais de aminoácidos, por exemplo, na sua hidrofobicidade, hidrofilici-dade, carga, tamanho e similares. Exemplos de substituições que têm em consideração várias das características anterio- 79 ΡΕ1040192 res são conhecidas dos familiarizados com a matéria e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina. 3.0 Breve Descrição dos Desenhos

Os desenho fazem parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar determinados aspectos do presente invento. 0 invento pode ser melhor compreendido com referência a um ou mais dos desenhos em combinação com a descrição detalhada de realizações específicas aqui apresentadas. FIG. 1 Representação esquemática da estrutura monomérica de Cry3Bb. FIG. 2 Visão estereoscópica da estrutura monomérica de Cry3Bb com moléculas de água associadas (representadas por pontos). FIG. 3A. Representação esquemática do domínio de

Cry3Bb. FIG. 3B. Diagrama das posições das 7 hélices que compreendem o domínio 1. FIG.4. 0 domínio 1 de Cry3Bb está organizado em sete hélices α ilustradas na FIG. 3A (representação 80 ΡΕ1040192 esquemática) e FIG. 3B (diagrama esquemático) . Estão apresentadas as hélices a e os resíduos de aminoácidos. FIG. 5A. Representação esquemática do domínio 2 de Cry3Bb.

Fig. 5B. Diagrama das posições das 11 cadeias β que compõem as 3 folhas β do domínio 2. FIG. 6. O domínio 2 de Cry3Bb é uma colecção de três folhas β anti-paralelas ilustradas na FIG. 5. Os aminoácidos que definem estas folhas estão apresentados abaixo (a8, aminoácidos 322-328, também está incluído no domínio 2); FIG. 7A. Representação esquemática do domínio 3 de Cry3Bb. FIG. 7B. Diagrama das posições das cadeias β que compreendem o domínio 3. FIG. 8. O domínio 3 (FIG. 7) é uma colecção pouco estruturada de cadeias β e ansas; não estão presentes folhas β. As cadeias β possuem os aminoácidos limitados abaixo: FIG. 9A. Uma visão "lateral" da estrutura dimé-rica de Cry3Bb. Os feixes helicoidais do domínio 1 podem ser observados no meio da molécula. 81 ΡΕ1040192 FIG. 9B. Uma visão "de topo" da estrutura dimé-rica de Cry3Bb. Os feixes helicoidais do domínio 1 podem ser observados no meio da molécula. FIG. 10. Uma representação gráfica do crescimento na condutância com tempo de canais formados por Cry3A e Cry3Bb em bicamadas lipídicas planares. Cry3A forma canais com condutâncias mais elevadas muito mais rapidamente do que Cry3Bb. FIG. 11. Um mapa de pEG1701 que contem o gene cry3Bb com o terminador crylF. FIG. 12. Os resultados dos ensaios de 1 dose, em duplicado, contra larvas SCRW das proteínas Cry3Bb alteradas na região 1B2,3. FIG. 13. Os resultados dos ensaios de 1 dose, em duplicado, das proteínas Cry3Bb alteradas na região 1B6,7 contra larvas SCRW. FIG. 14. Os resultados dos ensaios de 1 dose, em duplicado, das proteínas Cry3Bb alteradas na região 1B10.11 contra larvas SCRW. FIG. 15. Registos de canais isolados dos canais formados por Cry3Bb.11230 e Cry3Bb WT em bicamadas lipídicas planares. Cry3Bb.11230 forma canais com estados 82 ΡΕ1040192 abertos e fechados bem resolvidos enquanto Cry3Bb raramente o faz. FIG. 16. Registos de canais isolados dos canais formados por Cry3Bb e Cry3Bb.60, uma forma truncada de Cry3Bb. Cry3Bb.60 forma canais mais rapidamente do que Cry3Bb e, ao contrário de Cry3Bb, produz canais com estados abertos e fechados bem resolvidos. FIG. 17A. Alinhamento das sequências de amino-ácidos de cry3A, Cry3B e Cry3C. FIG. 17B. Mostra-se a continuação do alinhamento da sequência de aminoácidos de Cry3A, Cry3B e Cry3C apresentado na FIG. 17A. FIG. 17C. Mostra-se a continuação do alinhamento da sequência de aminoácidos de Cry3A, Cry3B e Cry3C apresentado na FIG. 17A. 4.0 Descrição das Realizações Ilustrativas 0 invento define novas proteínas insecticidas δ-endotoxinas de B. thuringiensis (Bt) e as estratégias bioquímicas e biofísicas usadas para projectar as novas proteínas. As delta-endotoxinas são uma classe de proteínas insecticidas produzidas por B. thuringiensis que formam canais catiónicos selectivos em bicamadas lipídicas planares (English and Slatin, 1992). As novas δ-endotoxinas são 83 ΡΕ1040192 baseadas na estrutura parental da δ-endotoxina Cry3Bb acti-va em coleópteros. Tal como outros membros da classe de δ-endotoxinas activa em coleópteros, incluindo Cry3A e Cry3B, Cry3Bb apresenta excelente actividade insecticida contra o escaravelho da batata do Colorado (Leptinotarsa decemli-neata). No entanto, ao contrário de Cry3A e Cry3B, Cry3Bb é igualmente activo contra a rosca das raízes do milho do Sul ou SCRW (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber) e a rosca das raízes do milho Ocidental ou WCRW (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). As novas proteínas insecti-cidas aqui descritas foram especificamente projectadas para melhorar a actividade biológica da proteína parental Cry3Bb. Ainda, as próprias estratégias de projecção são novos inventos capazes de serem aplicados no melhoramento de δ-endotoxinas de B. thuringiensis em geral. As δ-endo-toxinas de B. thuringiensis são igualmente membros de uma classe mais larga de toxinas bacterianas que formam canais iónicos (ver English and Slatin 1992, para uma revisão). Os inventores, pensam, assim, que estas estratégias de projecção podem ser igualmente aplicadas a qualquer proteína formadora de canais biologicamente activa para melhorar as suas propriedades biológicas.

As proteínas Cry3Bb projectadas foram manipuladas usando uma ou mais das seguintes estratégias incluindo (1) identificação e alteração de locais sensíveis a proteases e processamento proteolítico; (2) análise e manipulação de água ligada; (3) manipulação de ligações de hidrogénio à volta de regiões móveis; (4) análise da ansa e projecção de 84 ΡΕ1040192 nova ansa à volta das hélices flexíveis; (5) projecção de ansas à volta de cadeias β e folhas β; (6) identificação e nova projecção de superfícies electrostáticas complexas; (7) identificação e remoção de locais de ligação a metais; (8) alteração da estrutura quaternária; (9) identificação e projecção de resíduos estruturais; e (10) combinações de quaisquer dos locais definidos pelas estratégias 1-9. Estas estratégias de projecção permitem a identificação e nova projecção de locais específicos em Cry3Bb, criando em última análise novas proteínas com actividades insecticidas melhoradas. Estas novas proteínas são designadas Cry3Bb e referidas como Cry3Bb seguido de um ponto final e um sufixo (e.g., Cry3Bb.60, Cry3Bb.11231). As novas proteínas estão apresentadas na Tabela 2 juntamente com os locais específicos na molécula que foram modificados, as alterações dos aminoácidos nesses locais que melhoram a actividade biológica, as actividades insecticidas melhoradas e o método de projecção usado para identificar aquele local específico. 4.1 Algumas Vantagens do Invento

Os estudos de mutagénese com os genes cry falharam a identificação de um número significativo de proteínas do cristal mutantes possuidoras de actividade insecticida de largo espectro melhorada, ou seja com melhor toxicidade para uma gama de espécies de insectos que são pragas. Uma vez que as culturas agrícolas são tipicamente ameaçadas por pragas de insectos de mais de uma espécie, são desejáveis proteínas do cristal mutantes que apresentem melhor toxici- 85 ΡΕ1040192 dade contra múltiplas pragas de insectos de múltiplas espécies. Insucessos anteriores na identificação de tais mutantes podem ser atribuídos à escolha dos locais alvo de mutagénese. Por exemplo, relativamente à proteína relacionada, CrylC, os locais dentro dos domínios 2 e 3 têm sido os principais alvos dos esforços de mutagénese, principalmente devido a se pensar que estes domínios como importantes para a ligação a receptores e na determinação da especificidade insecticida (Aronson et al., 1995; Chen et al., 1993; de Maagd et al., 1996; Lee et al., 1992; Lee et al., 1995; Lu et al., 1994; Smedley and Ellar, 1996; Smith and Ellar, 1994; Rajamohan et al., 1995; Rajamohan et al., 1996) .

Pelo contrário, os presentes inventores pensaram que a toxicidade das proteínas Cry3 e, especificamente, a toxicidade da proteína Cry3Bb, pode ser melhorada contra uma gama mais larga de pragas de insectos ao serem atingidas regiões envolvidas na função de canal, em lugar das regiões da molécula directamente envolvidas nas interacções com receptores, nomeadamente os domínios 2 e 3. Assim, os inventores optaram por ter como alvo de mutagénese regiões dentro do domínio 1 de Cry3Bb com o objectivo de isolar mutantes Cry3Bb com um espectro mais alargado de toxicidade. De facto, no presente invento são descritos mutantes Cry3Bb que apresentam melhor toxicidade contra várias pragas de coleópteros.

Pelo menos uma, e provavelmente mais de uma, 86 ΡΕ1040192 hélice α do domínio 1 está envolvida na formação de canais iónicos e poros dentro do epitélio do tubo digestivo do insecto (Gazit and Shai, 1993; Gazit and Shai, 1995). Em lugar de ter como alvo de mutagénese as sequências codificadoras de hélices α do domínio 1 como outros o fizeram (Wu and Aronson, 1992; Aronson et al. , 1995; Chen et al., 1995), os presentes inventores optaram por atingir exclusivamente sequências codificadoras dos resíduos de amino-ácidos adjacentes ou situados dentro das regiões de ansa previstas de Cry3Bb que separam as hélices a. Os resíduos de aminoácidos dentro destas regiões de ansa ou os resíduos de aminoácido que tapam o extremo de uma hélice α e adjacentes a estas regiões de ansa podem afectar as relações espaciais entre estas hélices a. Consequentemente, a substituição destes resíduos de aminoácidos podem resultar em alterações discretas na estrutura terciária ou mesmo na estrutura quaternária, que têm um impacto positivo na função do canal iónico. Os resíduos de aminoácidos nas regiões em ansa do domínio 1 estão expostas ao solvente e assim estão disponíveis para várias interacções moleculares. A alteração destes aminoácidos poderá resultar numa maior estabilidade da proteína através da eliminação ou oclusão dos locais sensíveis a proteases. As substituições de aminoácidos que alteram a carga da superfície do domínio 1 poderão alterar a eficiência do canal iónico ou alterar interacções com a membrana de bordadura em escova ou com outras porções da molécula de toxina, permitindo uma ligação ou inserção mais eficaz. 87 ΡΕ1040192

De acordo com este invento, as substituições de bases são feitas nos resíduos de ácido nucleico cry3Bb subjacentes de forma a alterar codões particulares dos polipeptídeos correspondentes e, particularmente, nas regiões de ansa entre as hélices α. A actividade insecticida de uma proteína do cristal determina por último o nível de proteína do cristal necessária para o controlo eficaz de insectos. A potência de uma proteína insecticida deverá ser maximizada o mais possível de forma a proporcionar uma utilização económica e eficiente no campo. A potência melhorada de uma proteína insecticida numa formulação de bioinsecticida espera-se que melhor o desempenho no campo do produto bioinsecticida. Como alternativa, um aumento da potência de uma proteína insecticida numa formulação bioinsecticida pode promover o uso de quantidades reduzidas de bioinsecticida por unidade de área de cultura tratada, permitindo assim uma utilização mais eficaz em termos de custos do produto bioinsecticida. Quando expresso in planta, espera-se que a produção de proteínas cristais com melhor actividade insecticida melhor a resistência a pragas de insectos susceptíveis. 4.2 Métodos de Cultura de B. thuringiensis para Produzir Proteínas do Cristal

As estirpes de B. thuringiensis aqui descritas podem ser cultivadas usando meios e técnicas de fermentação conhecidos. Quando completado o ciclo de fermentação, as bactérias podem ser colhidas separando primeiro os esporos ΡΕ1040192 de B. thuringiensis e cristais do caldo de fermentação por meios conhecidos. Os esporos de B. thuringiensis e cristais podem ser formulados num pó molhável, num concentrado liquido, grânulos ou outras formulações através da adição de tensioactivos, dispersantes, veiculos inertes e outros componentes para facilitar a manipulação e aplicação em pragas alvo particulares. Os processos de manipulação e aplicação são bem conhecidos na técnica. 4.3 Células Hospedeiras Recombinantes Para a Expressão de Genes cry*

As sequências nucleotidicas do presente invento podem ser introduzidas numa larga variedade de hospedeiros microbianos. A expressão de genes das toxinas resulta, directamente ou indirectamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Com hospedeiros adequados, e.g., Pseudomonas, os microrganismos podem ser aplicados nos locais de insectos coleópteros, onde proliferarão e serão ingeridos pelos insectos. 0 resultado é um controlo dos insectos indesejáveis. Como alternativa, o microrganismo possuidor do gene da toxina pode ser tratado em condições que prolonguem a actividade da toxina produzida na célula. A célula tratada pode então ser aplicada no ambiente das pragas alvo. 0 produto resultante retém a toxicidade da toxina de B. thuringiensis. Células hospedeiras adequadas, em que as células contendo pesticida serão tratadas para prolongar a actividade da toxina na célula quando a célula tratada é apli- 89 ΡΕ1040192 cada no ambiente das pragas alvo, podem incluir procariotas ou eucariotas, normalmente estando limitado às células que não produzem substâncias tóxicas para organismos superiores, tais como mamíferos. No entanto, poderão ser usados organismos que produzem substâncias tóxicas para organismos superiores, em que a toxina é instável ou o nível de aplicação suficientemente baixo para evitar qualquer possibilidade de toxicidade para um hospedeiro mamífero. Como hospedeiros, serão de particular interesse os procariotas e os eucariotas inferiores, tais como fungos. Procariotas ilustrativos, tanto Gram-negativos como Gram-positivos, incluem Enterobacteriaceae, tais como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tais como Rhizobium; Spirillaceae, tais como fitobactérias, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tais como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae, Actinomyceta-les e Nitrobacteraceae. Entre os eucariotas estão fungos, tais como Phycomycetes e Ascomycetes, o que inclui leveduras, tais como Saccharomyces e Schizosaccharomyces; e leveduras Basidiomycetes, tais como Rhodotorula, Aureobasi-dium, Sporobolomyces e similares.

Características de particular interesse na selec-ção de uma célula hospedeira para fins de produção incluem facilidade de introdução do gene de B. thuringiensis no hospedeiro, disponibilidade de sistemas de expressão, eficiência de expressão, estabilidade do pesticida no hospedeiro e a presença de capacidades genéticas auxiliado- 90 ΡΕ1040192 ras. Características com interesse para usar como micro-cápsula de pesticida incluem qualidades protectoras para o pesticida, tais como paredes celulares espessas, pigmentação e armazenamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; afinidade foliar; ausência de toxicidade para mamíferos; atracção por pragas para ingestão; facilidade de morte e fixação sem destruição da toxina; e similares. Outras considerações incluem facilidade de formulação e manipulação, economia, estabilidade de armazenamento e similares.

Organismos hospedeiros de particular interesse, tais como Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp., e Sporobolomyces sp.; organismos filoplanos tais como Pseudomonas sp., Erwinia sp. e Flavobacterium sp.; ou organismos tais como Escherichia, Lactobacilli sp., Bacillus sp., Streptomyces sp., e similares. Organismos específicos incluem Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, B. thuringiensis, Escherichia coli, B. subtilis, B. megaterium, B. cereus, Streptomyces lividans e similares. O tratamento da célula microbiana, e.g., um microrganismo contendo o gene da toxina de B. thuringiensis, pode ser por meios químicos e físicos, ou através de uma combinação de meios químicos e/ou físicos, desde que a técnica não afecte de forma prejudicial as propriedades da toxina, nem diminua a capacidade celular na protecção da toxina. São exemplos de reagentes químicos os agentes de 91 ΡΕ1040192 halogenação, particularmente halogéneos de n° atómico 17-80. Mais particularmente, o iodo pode ser usado em condições suaves e durante tempo suficiente para se atingir os resultados pretendidos. Outras técnicas adequadas incluem tratamento com aldeídos, como seja formaldeído e glutaral-deído; anti-infecciosos, tais como cloreto de zefirano e cloreto de cetilpiridino; álcoois, tais como isopropílico e etanol; vários fixadores histológicos, tais como iodo de Lugol, fixador de Bouin e fixador de Helly, (ver e.g., Humason, 1967) ; ou uma combinação de agentes físicos (calor) e químicos que preservam e prolongam a actividade da toxina produzida na célula quando a célula é administrada ao animal hospedeiro. São exemplos de meios físicos radiação de comprimento de onda curto como seja radiação γ e radiação X, congelação, radiação UV, liofilização e similares. As células empregues geralmente estarão intactas e essencialmente na forma proliferativa quando tratadas, em lugar da forma de esporo, se bem que nalguns casos possam ser empregues esporos.

Sempre que o gene da toxina de B. thuringiensis seja introduzido através de um vector adequado num microrganismo hospedeiro e o referido hospedeiro seja aplicado no ambiente num estado vivo, é essencial que sejam usados determinados microrganismos hospedeiros. São seleccionados microrganismos hospedeiros que ocupam a "fitosfera" (filo-plano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de uma ou mais culturas com interesse. Estes microrganismos são assim seleccionados de forma a serem capazes de competir com 92 ΡΕ1040192 êxito no ambiente particular (cultura e outros habitats de insectos) com os microrganismos selvagens, proporcionar manutenção estável e expressão do gene que expressa o poli-peptídeo pesticida e, de preferência, proporcionar protec-ção melhorada do pesticida relativamente à degradação ambiental e inactivação.

Conhece-se um grande número de microrganismos que habitam o filoplano (a superfície das folhas das plantas) e/ou rizosfera (o solo que envolve as raízes da planta) de uma larga variedade de culturas importantes. Estes microrganismos incluem bactérias, algas e fungos. São de particular interesse os microrganismos, tais como bactérias, e.g., género Bacillus (incluindo as espécies e subespécies de B. thuringiensis kurstaki HD-1, B. thuringiensis kurstaki HD-73, B. thuringiensis sotto, B. thuringiensis berliner, B. thuringiensis thuringiensis, B. thuringiensis tolworthi, B. thuringiensis dendrolimus, B. thuringiensis alesti, B. thuringiensis galleriae, B. thuringiensis aiza-wai, B. thuringiensis subtoxicus, B. thuringiensis entomo-cidus, B. thuringiensis tenebrionis e B. thuringiensis san diego) ; Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Zantho-monas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methyli-philius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthro-bacter, Azotobacter, Leuconostoc e Alcaligenes; fungos, particularmente leveduras, e.g., géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Hodotorula e Aureobasidium. São de particular interesse as espécies bacterianas da fitosfera tais como Pseudomonas syringae, 93 ΡΕ1040192

Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroi-des, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus e Azotobacter vinlandii; e espécies de leveduras da fitosfera tais como Rhodotorula rubra, R. Glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans. 4.4 Definições

De acordo com o presente invento, sequências de ácido nucleico incluem e não estão limitadas a DNA (incluindo e não limitado a DNA genómico ou extragenómico), genes, RNA (incluindo e não limitado a mRNA e tRNA), nucle-ósidos, e segmentos de ácido nucleico adequados obtidos a partir de fontes nativas, obtidos por síntese química, modificados quimicamente ou de outra forma preparados pela mão do homem. As palavras e as frases que se seguem têm o significado descrito abaixo.

Um, uma, uns, umas: De acordo com a convenção das leis vigentes sobre patentes, as palavras "um, uma, uns, umas" quando usadas neste pedido de patente, incluindo as reivindicações, significam "um ou mais".

Largo espectro: Refere-se a uma larga gama de espécies de insectos. ΡΕ1040192

Actividade de largo espectro: A toxicidade contra uma larga gama de espécies de insectos.

Expressão: A combinação de processos intracelulares, incluindo transcrição e tradução sofrida por uma molécula de DNA codificadora como seja um gene estrutural para produzir um polipeptideo.

Actividade insecticida: A toxicidade contra insectos.

Especificidade insecticida: A toxicidade apresentada por uma ou mais proteínas do cristal, microrganismo ou planta, contra múltiplas espécies de insectos.

Especificidade intra-ordem: A toxicidade de uma proteína do cristal particular contra uma espécie de insecto dentro de uma Ordem de insectos (e.g., Ordem Coleoptera).

Especificade inter-ordem: A toxicidade de uma proteína do cristal particular contra espécies de insectos de diferentes Ordens (e.g., Ordens Coleoptera e Diptera). LC50: A concentração letal de proteína do cristal que causa 50% de mortalidade dos insectos tratados. LC95: A concentração letal de proteína do cristal que causa 95% de mortalidade dos insectos tratados. 95 ΡΕ1040192

Promotor: Um local de reconhecimento numa sequência de DNA ou grupo de sequências de DNA que proporciona um elemento de controlo da expressão para um gene estrutural e a que a RNA polimerase se liga especificamente e inicia a síntese de RNA (transcrição) daquele gene.

Regeneração: 0 processo de crescimento de uma planta a partir de uma célula vegetal (e.g., protoplasto vegetal ou explante).

Gene estrutural: Uum gene que é expresso para produzir um polipeptídeo.

Transformação: Um processo de introdução de uma sequência de DNA exógena (e.g., um vector, uma molécula de DNA recombinante) numa célula ou protoplasto em que aquele DNA exógeno é incorporado num cromossoma ou é capaz de replicação autónoma. Célula transformada: Uma célula cujo DNA foi alterado através da introdução de uma molécula de DNA exógeno naquela célula. Célula transgénica: Qualquer célula derivada ou regenerada a partir de uma célula transformada ou derivada de uma célula transgénica. Exemplos de células transgénicas incluem calos de plantas derivados de uma célula vegetal transformada e células particulares tais como folha, raiz, 96 ΡΕ1040192 caule, e.g., células somáticas, ou células reprodutoras (germinais) obtidas a partir de uma planta transgénica.

Planta transgénica: Uma planta ou sua progénie derivada de uma célula vegetal ou protoplasto transformado, em que o DNA vegetal contem uma molécula de DNA exógena não presente originalmente numa planta nativa não transgénica da mesma estirpe. Os termos "planta transgénica" e "planta transformada" têm por vezes sido usados como termos sinónimos para definir uma planta cujo DNA contem uma molécula de DNA exógeno. No entanto, é cientificamente mais correcto referir-se a uma planta ou calo regenerado, obtido a partir de uma célula ou protoplasto vegetal transformado, como sendo uma planta transgénica e essa utilização será aqui seguida.

Vector: uma molécula de DNA capaz de se replicar numa célula hospedeira e/ou a que foi operacionalmente ligada um outro segmento de DNA de forma a fazer-se a replicação do segmento ligado. Um plasmideo é um exemplo de vector.

Tal como aqui são usadas, as designações "CrylII" e Cry3" são sinónimas, tal como o são as designações "CryIIIB2" e Cry3Bb". Igualmente, os inventores utilizaram o termo genérico Cry3Bb* para significar qualquer uma das variantes de Cry3Bb que compreendem as sequências de aminoácidos modificadas na proteína. De forma semelhante, cry3Bb* pretende significar quaisquer segmentos e/ou genes que codificam uma proteína Cry3Bb*, etc. 97 ΡΕ1040192 4.5 Preparação de Polinucleotídeos cry3*

Uma vez analisada a estrutura do peptídeo pretendido a ser mutagenizado usando uma ou mais das estratégias de projecção aqui descritas, será desejável introduzir uma ou mais mutações na proteína ou, em alternativa, na sequência de DNA codificadora da proteína com o objectivo de produzir uma proteína alterada com propriedades bioinsecticidas alteradas.

Com este objectivo, o presente invento inclui métodos de mutagénese dirigida e mutagénese ao acaso de um segmento de ácido nucleico codificador de uma proteína do cristal como aqui descrito. Em particular, são descritos métodos para a mutagénese de segmentos de ácido nucleico codificadores das sequências de aminoácidos usando uma ou mais estratégias de projecção aqui descritas. Usando os métodos de ensaio aqui descritos, pode-se identificar mutantes conseguidos com estes processos que tenham melhorado as propriedades insecticidas ou alterado a especificidade, intra-ordem e inter-ordem.

Os métodos de mutagenização de um segmento de DNA codificador de uma proteína do cristal são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. Podem ser feitas modificações ao acaso ou através de procedimentos de mutagénese dirigida. 0 ácido nucleico pode ser modificado através da alteração da sua estrutura pela adição ou deleção de um ou mais nucleótidos da sequência. 98 ΡΕ1040192 A mutagénese pode ser realizada de acordo com qualquer uma das técnicas conhecidas na especialidade como seja, mas não lhe estando limitado, a síntese de um oligonucleótido tendo uma ou mais mutações na sequência de uma proteína do cristal particular. Um "hospedeiro adequado" é qualquer hospedeiro que expresse Cry3Bb, como seja, mas não estando limitado a B. thuringiensis e E. coli. 0 rastreio da actividade insecticida, no caso de Cry3Bb inclui e não está limitado a actividade tóxica para coleópteros que pode ser testada por técnicas conhecidas na especialidade.

Em particular, a mutagénese específica é uma técnica útil na preparação de peptídeos individuais ou proteínas ou peptídeos equivalentes biologicamente funcionais, através de mutagénese específica do DNA subjacente. A técnica ainda proporciona uma capacidade rápida de preparar e testar variantes de sequência, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações discutidas, através da introdução de uma ou mais alterações na sequência nucleotídica do DNA. A mutagénese específica permite a produção de mutantes através da utilização de sequências oligonucleotídicas específicas que codificam a sequência de DNA da mutação pretendida, assim como um número suficiente de nucleótidos adjacentes, para proporcionar uma sequência iniciadora com tamanho e complexidade suficientes para formar um duplex estável de ambos os lados da junção da deleção atravessada. Tipicamente, prefere-se uma sequência 99 ΡΕ1040192 iniciadora de 17 a 75 nucleótidos ou mais de comprimento, com 10 a 25 ou mais resíduos de ambos os lados da junção da sequência a ser alterada.

Em geral, a técnica de mutagénese dirigida é bem conhecida na especialidade, conforme exemplificado por várias publicações. Conforme será apreciado, a técnica tipicamente emprega um vector fágico que existe na forma de cadeia simples e de cadeia dupla. Tipicamente os vectores úteis na mutagénese dirigida incluem vectores tais como o fago M13. Estes fagos podem ser facilmente comprados e o seu uso é, de um modo geral, bem conhecido dos familiarizados com a técnica. Os plasmídeos de cadeia dupla são também empregues de rotina em mutagénese dirigida, o que elimina o passo de transferência do gene com interesse de um plasmídeo para um fago.

Em geral, a mutagénese dirigida de acordo com o que aqui é descrito é realizada obtendo primeiro um vector de cadeia simples ou separando as duas cadeias de um vector de cadeia dupla que inclui na sua sequência uma sequência de DNA que codifica o peptídeo pretendido. Geralmente, prepara-se por síntese química uma sequência iniciadora oligonucleotídica portadora da sequência alterada pretendida. Esta sequência iniciadora é então emparelhada com o vector de cadeia simples e sujeita à acção de enzimas de polimerização de DNA, tais como fragmento Klenow da polimerase I de E. coli, de forma a completar a síntese da cadeia portadora da mutação. Assim, forma-se um 100 ΡΕ1040192 heteroduplex em que uma cadeia codifica a sequência não alterada original e a segunda cadeia é portadora da mutação pretendida. Este vector heteroduplex é então usado para transformar ou transfectar células adequadas, tais como células de E. coli, e seleccionados clones que incluem vectores recombinantes portadores do arranjo da sequência mutada. Um esquema de selecção genética foi descrito por Kinkel et al. , (1987) para enriquecimento em clones contendo o oligonucleótido mutagénico. Como alternativa, a utilização de PCR™ com enzimas termostáveis comerciais tais como polimerase Taq pode ser contemplada para incorporar uma sequência oligonucleotidica mutagénica num fragmento de DNA amplificado, o qual pode então ser clonado num vector de clonagem ou expressão adequado. Os processos de mutagénese mediada por PCR™ de Tomic et al., (1990) e Upender et al. (1995) proporcionam dois exemplos de tais protocolos. Um PCR™ empregando uma ligase termostável para além de uma polimerase termostável pode também ser empregue para incorporar um oligonucleótido mutagénico fosforilado num fragmento de DNA amplificado, o qual pode então ser clonado num vector de clonagem ou expressão adequado. O processo de mutagénese descrito por Michael (1994) proporciona um exemplo de tal protocolo. A preparação de variantes da sequência dos segmentos de DNA codificadores do peptídeo seleccionado usando mutagénese dirigida é proporcionada como um meio de produzir espécies potencialmente úteis e não pretende ser limitante uma vez que existem outras formas através das 101 ΡΕ1040192 quais as variantes da sequência dos peptídeos e das sequências de DNA codificadoras dos mesmos. Por exemplo, os vectores recombinantes codificadores da sequência peptidica pretendida podem ser tratados com agentes mutagénicos, tais como hidroxilamina, para se obter variantes da sequência.

Tal como aqui usado, o termo "processo de muta-génese dirigida com oligonucleótidos" refere-se a processos dependentes de matriz e propagação mediada pelo vector que resulta num aumento na concentração de uma molécula de ácido nucleico especifica relativamente à sua concentração inicial, ou num aumento na concentração de um sinal detectável, como seja amplificação. Tal como aqui é usado, o termo "processo de mutagénese dirigida com oligonu-cleótidos" pretende referir-se a um processo que envolve a extensão de uma molécula iniciadora dependente de matriz. O termo "processo dependente de matriz" refere-se a à síntese de ácido nucleico, de uma molécula de RNA ou DNA, em que a sequência da nova cadeia de ácido nucleico sintetizada é ditada pelas regras conhecidas de emparelhamento de pares de bases (ver, por exemplo, Watson, 1987).

Tipicamente, as metodologias mediadas por vectores envolvem a introdução do fragmento de ácido nucleico num vector de DNA ou RNA, a amplificação clonal do vector e a recuperação do fragmento de ácido nucleico amplificado. Exemplos de tais metodologias são proporcionados na Patente U.S. 4237224. 102 ΡΕ1040192

Uma série de processos dependentes de matriz estão disponíveis para amplificar as sequências alvo com interesse presentes na amostra. Um dos métodos de amplificação melhor conhecidos é a reacção em cadeia da polimerase (PCR™) que está descrito detalhadamente nas Patentes U.S. 4683195, 4683202 e 4800159. Resumidamente, em PCR™, são preparadas duas sequências iniciadoras que são complementares de regiões em cadeias complementares opostas da sequência alvo. Um excesso de trifosfatos de desoxi-nucleótidos é adicionado a uma mistura de reacção juntamente com uma DNA polimerase (e.g., polimerase Taq) . Se a sequência alvo estiver presente numa amostra, as sequências iniciadoras ligar-se-ão ao alvo e a polimerase fará com que as sequências iniciadoras sejam prolongadas ao longo da sequência alvo através da adição de nucleótidos. Através do aumento e abaixamento da temperatura da mistura de reacção, as sequências iniciadoras prolongadas dissociar-se-ão do alvo para formar produtos de reacção, as sequências iniciadoras em excesso ligar-se-ão ao alvo e aos produtos de reacção e o processo é repetido. De preferência, pode ser realizado um processo de amplificação por PCR™ com transcriptase reversa de forma a quantificar a quantidade de mRNA amplificado. As metodologias de reacção em cadeia da polimerase são conhecidas na técnica.

Um outro método de amplificação é a reacção em cadeia com ligase (referido como LCR), descrito no Pedido de Patente Europeia Publ. N° 320308. Em LCR, são preparados dois pares de sondas complementares e, na presença da 103 ΡΕ1040192 sequência alvo, cada par ligar-se-á às cadeias complementares opostas da sequência alvo de forma a que elas sejam contíguas. Na presença de uma ligase, os dois pares de sondas ligar-se-ão para formar uma única unidade. Através da aplicação de ciclos de temperatura, tal como em PCR™, as unidades ligadas associadas dissociam-se do alvo e depois servem como "sequências alvo" para a ligação dos pares de sonda em excesso. A patente U.S. 4883750 descreve um método alternativo de amplificação semelhante a LCR para a ligação de pares de sondas a uma sequência alvo.

Qbeta Replicase™ descrito no Pedido de Patente Internacional Publicação N° PCT/US87/00880 pode também ser usado no presente invento como outro método de amplificação. Neste método, uma sequência replicativa de RNA que possui uma região complementar de um alvo é adicionada a uma amostra na presença de uma RNA polimerase. A polimerase copiará a sequência replicativa que pode então ser detec-tada.

Um método de amplificação isotérmico, em que as endonucleases de restrição e ligases são usadas para se conseguir a amplificação das moléculas alvo possuidoras de 5'-[α-tio]trifosfatos de nucleótidos numa das cadeias de um local de restrição (Walker et al., 1992), pode igualmente ser útil na amplificação de ácidos nucleicos no presente invento.

Amplificação com deslocamento de cadeia ("Strand 104 ΡΕ1040192

Displacement Amplification", SDA) é um outro método de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos que envolve múltiplos ciclos de deslocamento de cadeias e síntese, i.e., translação de corte "nick translation"). Um método semelhante, designado Reacção de Reparação de Cadeias ("Repair Chain Reaction", RCR) é um outro método de amplificação que pode ser útil no presente invento e envolve o emparelhamento de várias sondas ao longo de uma região que se pretende amplificar, seguido de uma reacção de reparação em que apenas duas das quatro bases estão presentes. As outras duas bases podem ser adicionadas como derivados biotinilados para detecção fácil. Uma abordagem semelhante é usada em SDA.

As sequências podem também ser detectadas usando uma reacção cíclica de sondas ("Cyclic probe reaction", CPR). Em CPR, uma sonda tendo sequências 3' e 5' de DNA não específicas de Cry e uma sequência interna de um RNA específico de Cry é hibridada com DNA que está presente numa amostra. Quando da hibridação, a reacção é tratada com RNase H e os produtos da sonda identificados como produtos distintos geradores de um sinal que são libertados após digestão. A matriz original é emparelhada com uma outra sonda de ciclização e a reacção repetida. Assim, CPR envolve a amplificação de um sinal gerado por hibridação de uma sonda com um ácido nucleico expresso específico de cry.

Ainda outros métodos de amplificação descritos no Pedido de Patente da Grã-Bretanha N° 2202328 e no Pedido de 105 ΡΕ1040192

Patente Internacional Publicação N° PCT/US89/01025 podem ser usados de acordo com o presente invento. No primeiro pedido de patente, sequências iniciadoras "modificadas" são usadas numa síntese tipo PCR™, dependente de matriz e de enzimas. As sequências iniciadoras podem ser modificadas através da marcação com um grupo de captura (e.g., biotina) e/ou um grupo detector (e.g., enzima). No último pedido, é adicionado um excesso de sondas marcadas a uma amostra. Na presença da sequência alvo, a sonda liga-se e é clivada cataliticamente. Após clivagem, a sequência alvo é libertada intacta para ser ligada pela sonda em excesso. A clivagem da sonda marcada sinaliza a presença da sequência alvo.

Outros processos de amplificação de ácido nu-cleico incluem sistemas de amplificação baseados em transcrição (TAS) (Kwoh et al., 1989; Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 88/10315) incluindo amplificação baseada na sequência de ácidos nucleicos (NASBA) e 3SR. Em NASBA, os ácidos nucleicos podem ser preparados para amplificação através de extracção convencional com fenol/cloro-fórmio, desnaturação pelo calor de uma amostra, tratamento com tampão de lise e minicolunas de centrifugação para o isolamento de DNA e RNA ou extracção de RNA com cloreto de guanidina. Estas técnicas de amplificação envolvem empare-lhamento de uma sequência iniciadora, o qual possui sequências específicas das proteínas do cristal. Após polime-rização, os híbridos de DNA/RNA foram digeridos com RNase H, enquanto que as moléculas de DNA foram novamente 106 ΡΕ1040192 desnaturadas pelo calor. Em qualquer dos casos, o DNA de cadeia simples é convertido em cadeia dupla pela adição de uma segunda sequência iniciadora especifica das proteínas do cristal, seguido de polimerização. As moléculas de DNA de cadeia dupla são então repetidamente transcritas por uma polimerase, como seja a de T7 ou de SP6. Numa reacção isotérmica cíclica, os RNAs foram sujeitos a transcrição reversa num DNA de cadeia dupla e transcritos novamente com uma polimerase, como seja a de T7 ou SP6. Os produtos resultantes, truncados ou completos, indicam sequências específicas de proteínas do cristal. O Pedido de Patente Europeia Publicação No 329822 descreve um processo de amplificação de ácido nucleico envolvendo a síntese cíclica de RNA de cadeia simples ("ssRNA"), ssDNA e DNA de cadeia dupla (dsDNA), que podem ser usados de acordo com o presente invento. O ssRNA constitui uma primeira matriz para um primeiro oligonucleótido iniciador, o qual é prolongado pela transcriptase reversa (DNA polimerase dependente de RNA). O RNA é então removido do duplex de DNA:RNA resultante pela acção da ribonuclease H (RNase H, uma RNase específica de RNA num duplex com DNA ou RNA) . O ssDNA resultante é uma segunda matriz para uma segunda sequência iniciadora, a qual também inclui as sequências de um promotor de RNA polimerase (exemplificado pela RNA polimerase de T7) 5' relativamente à sequência de homologia com a matriz. Esta sequência iniciadora é então prolongada pela DNA polimerase (exemplificada pelo fragmento grande "Klenow" da DNA polimerase I de E. coli), 107 ΡΕ1040192 resultando numa molécula de DNA de cadeia dupla ("dsDNA"), tendo uma sequência idêntica à do RNA original entre as sequências iniciadoras e tendo ainda, num extremo, uma sequência de promotor. Esta sequência de promotor pode ser usada pela RNA polimerase adequada para produzir muitas cópias de RNA do DNA. Estas cópias podem então entrar novamente no ciclo que conduz a amplificação muito rápida. Com a escolha adequada das enzimas, esta amplificação pode ser feita isotermicamente sem a adição de enzimas em cada ciclo. Devido à natureza cíclica deste processo, a sequência de partida pode ser escolhida para ser na forma de DNA ou RNA. 0 Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 89/06700, aqui incluído como referência na sua totalidade, descreve o esquema de amplificação de sequências de ácido nucleico baseado na hibridação de uma sequência de promotor/sequência iniciadora com um DNA alvo de cadeia simples ("ssDNA") seguido da transcrição de muitas cópias de RNA da sequência. Este esquema não é cíclico; i.e., novas matrizes não são produzidas a partir dos transcritos de RNA resultantes. Outros métodos de amplificação incluem "RACE" (Frohman, 1990) e "PCR™ unilateral" (Ohara, 1989) que são conhecidos dos familiarizados com a técnica. Métodos baseados na ligação de dois (ou mais) oligonucleótidos na presença de ácido nucleico tendo a sequência do "di-oligonucleótido" resultante, amplificando assim o di-oligonucleótido (Wu and Dean, 1996, aqui 108 ΡΕ1040192 incluído como referência na sua totalidade) , podem também ser usados na amplificação de sequências de DNA do presente invento. 4.6 Variantes Resistentes a Fagos

Em determinadas realizações, pode-se pretender preparar uma ou mais variantes dos mutantes de B. thuringiensis resistentes a fagos preparados pelos métodos aqui descritos. Para tal, uma alíquota de uma lisado fágico é espalhado em agar nutritivo e deixado secar. Uma alíquota da estirpe bacteriana sensível a fagos é então semeada directamente sobre o lisado seco e deixada a secar. As placas são incubadas a 30°C. As placas são incubadas durante 2 dias e, nessa altura, numerosas colónias podem ser cultivadas em agar. Algumas destas colónias são picadas e subcultivadas em placas de agar nutritivo. Estas culturas aparentemente resistentes são testadas relativamente à resistência por riscado cruzado com o lisado de fagos. Uma linha do lisado de fagos foi riscada na placa e deixada a secar. As culturas pressupostamente resistentes foram então riscadas ao longo da linha de fagos. As culturas bacte-rianas resistentes não mostram qualquer lise ao longo da linha de fagos após incubação durante a noite a 30°C. A resistência aos fagos foi então confirmada semeando uma camada da cultura resistente numa placa de agar nutritivo. A estirpe sensível foi também semeada da mesma forma para servir como controlo positivo. Após secagem, semeou-se uma gota do lisado fágico no centro da placa e deixou-se secar. 109 ΡΕ1040192

As culturas resistentes não apresentaram lise na área onde o lisado fágico foi colocado após incubação a 30°C durante 24 horas. 4.7 Composições de Proteínas do Cristal como Insecticidas e Métodos de Utilização A Ordem Coleoptera compreende numerosas espécies de escaravelhos incluindo escaravelhos do solo, escaravelhos reticulados, escaravelhos das espécies Anthrenus werbasci e Dermestes lardarius, escaravelhos da espécie Anoplophora glabripennis, escaravelhos das folhas, gorgulhos, joaninhas, escaravelhos da família Cantharidae, escaravelhos da Lucanidae e escaravelhos hidrofílicos da família Hydrophilidae e uma série de outros escaravelhos. Uma breve taxonomia da Ordem é dada no local da rede http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html. São particularmente importantes entre os Coleó-pteros as pragas agrícolas incluídas nas infra-ordens Chrysomeliformia e Cucujiformia. Os membros da infra-ordem Chrysomeiiformia, incluindo os escaravelhos das folhas (Chrysomelidae) e os gorgulhos (Curculionidae) , são particularmente problemáticos para a agricultura e são responsáveis por uma variedade de danos causados por insectos em culturas agrícolas e plantas. A infra-ordem Cucujiformia inclui as famílias Coccinellidae, Cucujidae, Lagridae, Meloidae, Rhipiphoridae e Tenebrionidae. Dentro desta infra-ordem, os membros da família Chrysomelidae (que 110 ΡΕ1040192 inclui os géneros Exema, Chrysomela, Oreina, Chrysolina, Leptinotarsa, Gonioctena, Oulema, Monozia, Ophraella, Cerotoma, Diabrotica e Lachnaia), são conhecidas pelo seu potencial destruidor de culturas agrícolas.

Demonstrou-se que as toxinas do presente invento são eficazes no combate de uma variedade de membros da ordem Coleoptera, os inventores consideram que os insectos de muitos géneros de coleópteros podem ser controlados ou erradicados usando as composições de polipeptídeos aqui descritas. Igualmente, os métodos aqui descritos para a geração de polipeptídeos modificados tendo uma maior especificidade para insectos podem também ser úteis no alargamento da gama de actividade insecticida dos polipeptídeos modificados contra outras espécies de insectos dentro e fora da ordem Coleoptera.

Como tal, os inventores consideram que as composições de proteínas cristais aqui descritas encontrarão particular utilidade como insecticidas para aplicação tópica e/ou sistémica a culturas agrícolas, incluindo mas não estando limitado a arroz, trigo, alfafa, milho, soja, tabaco, batata, cevada, canola, beterraba sacarina, cana sacarina, linho, centeio, cevada, algodão, girassol; gramíneas, tais como pastagens e turfas; frutos, citrinos, nozes, árvores, arbustos e vegetais; assim como plantas ornamentais, cactos, suculentas e similares. É descrita e reivindicada uma composição compre- 111 ΡΕ1040192

endendo uma quantidade eficaz como insecticida da composição da proteína do cristal Cry3Bb*. A composição, de preferência, compreende a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID O i—1 O 5 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:3 4, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:6 6, SEQ ID NO:68, SEQ ID NC >:100, SEQ ID NO :102 ou SEQ ID NO:108 ou seus equivalentes biologicamente funcionais.

A composição insecticida pode também compreender uma proteína do cristal Cry3Bb* que é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 2 7, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID

NO: 3 5, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID

NO: 43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID

NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID

NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID

NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:99 ou SEQ ID NO:108, ou como alternativa, uma sequência de ácido nucleico que hibrida com a sequência de ácido nucleico de NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:ll, SEQ ID ΡΕ1040192 NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:2 9, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:3 7, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:6 9, SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO : 10 7 em condições de restringência moderada.

As composições insecticidas podem compreender um ou mais tipos de células de B. thuringiensis, ou uma ou mais culturas de tais células, ou como alternativa, uma mistura de uma ou mais células de B. thuringiensis que expressam uma ou mais das novas proteínas do cristal do invento em combinação com uma outra composição insecticida. Em certos aspectos pode ser desejável preparar composições que possuem uma pluralidade de proteínas do cristal, nativas ou modificadas, para tratamento de um ou mais tipos de insectos susceptíveis. As células de B. thuringiensis do invento podem ser tratadas antes da formulação para prolongar a actividade insecticida quando as células são aplicadas no ambiente dos insectos alvo. Tal tratamento pode ser por meios químicos ou físicos ou uma combinação de meios químicos e/ou físicos, desde que as técnicas não afectem de forma prejudicial as propriedades do insecticida nem diminuam a capacidade celular de protecção do insecticida. São exemplos de reagentes químicos os que geram halogéneos, particularmente halogéneos de n° atómico 113 ΡΕ1040192 17-80. Mais particularmente, o iodo pode ser usado em condições suaves e durante tempo suficiente para se conseguir os resultados pretendidos. Outras técnicas adequadas incluem o tratamento com aldeídos, tais como formaldeido e glutaraldeído, anti-infecciosos, tais como cloreto de zefirano; álcoois, tais como isopropílico e etanol; vários fixadores histológicos, como sejam fixador de Bouin e fixador de Helly (ver Humason, 1967) ; ou uma combinação de agentes físicos (calor) e químicos que prolongam a actividade da δ-endotoxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente das pragas alvo. São exemplos de meios físicos radiação de comprimento de onda curto como seja radiação gama e radiação X, congelação, radiação UV e liofilização.

Os inventores consideram que quaisquer métodos de formulação conhecidos dos familiarizados com a matéria poderão ser empregues usando as proteínas aqui descritas para preparar tais composições bioinsecticidas. Poderá ser desejável formular preparações de células totais, extractos celulares, suspensões celulares, homogenatos celulares, lisados celulares, sobrenadantes celulares, filtrados celulares ou sedimentos de células de uma cultura celular (de preferência uma cultura de células bacterianas como seja uma cultura de células de B. thuringiensis descrita na Tabela 3) que expressa um ou mais segmentos de DNA cry3Bb* para produzir as proteínas ou peptídeos Cry3Bb* codificados. Os métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos dos familiarizados com a matéria e podem 114 ΡΕ1040192 incluir, e.g., desidratação, liofilização, homogeneização, extracção, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma ou mais culturas de células bacterianas, tais como células de B. thuringiensis descritas na Tabela 3, que expressam os peptídeos Cry3Bb* com interesse.

Numa realização preferida, a composição bioinsec-ticida compreende uma suspensão fluida de óleo contendo células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos ou cristais que possuem uma ou mais das novas proteínas do cristal aqui descritas. De preferência, as células são células de B. thuringiensis, no entanto, qualquer célula hospedeira bacteriana expressando os novos segmentos de ácido nucleico aqui descritos e produtora de uma proteína do cristal é considerada útil, como seja Bacillus spp., incluindo B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, Escherichia spp., incluindo E. coli e/ou Pseudomonas spp., incluindo P. ceppacia, P. aeruginosa e P. fluorescens. Como alternativa, a suspensão fluida de óleo pode consistir numa combinação de uma ou mais das seguintes composições: células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos, cristais e/ou proteínas do cristal purificadas.

Numa segunda realização preferida, a composição bioinsecticida compreende uma granulado ou pó dispersável em água. Este granulado ou pó pode compreender células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos ou cristais que contenham uma ou mais das novas proteínas do cristal aqui descritas. As fontes preferidas para estas composições 115 ΡΕ1040192 incluem células bacterianas tais como células de B. thuringiensis, no entanto as bactérias dos géneros Bacillus, Escherichia e Pseudomonas que foram transformadas com um segmento de DNA aqui descrito e expressando a proteína do cristal são igualmente consideradas como úteis. Como alternativa, o granulado ou pó pode consistir numa combinação de uma ou mais das seguintes composições: células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos, cristais e/ou proteínas do cristal purificadas.

Numa terceira realização importante, a composição bioinsecticida compreende um pó molhável, líquido pulve-rizáve, emulsão, colóide, solução aquosa ou orgânica, poeira, pastilhas ou concentrado coloidal. Tal composição poderá conter células bacterianas não lisadas ou lisadas, esporos cristais ou extractos celulares como descrito atrás, que contêm uma ou mais das novas proteínas do cristal aqui descritas. As células bacterianas preferidas são células de B. thuringiensis, no entanto, bactérias tais como células de B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, E. coli ou Pseudomonas spp. transformadas com um segmento de DNA aqui descrito e expressando a proteína do cristal são também consideradas como úteis. Tais formas secas das composições insecticidas podem ser formuladas para dissolver imediatamente quando são molhadas ou, como alternativa, dissolvidas numa forma de libertação controlada, libertação sustida ou outra forma dependente do tempo. Como alternativa, tal composição pode consistir numa combinação de uma ou mais das seguintes composições; células bacte- 116 ΡΕ1040192 rianas lisadas ou não lisadas, esporos, cristais e/ou proteínas do cristal purificadas.

Numa quarta realização importante, a composição insecticida compreende uma solução aquosa ou suspensão ou cultura celular de células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos, cristais ou uma mistura de células bacterianas lisadas ou não lisadas, esporos, e/ou cristais, tais como os descritos atrás que contêm uma ou mais das proteínas do cristal aqui descritas. Tais soluções aquosas ou suspensões podem ser proporcionadas como uma solução stock concentrada que é diluída antes da aplicação, ou como alternativa, como uma solução diluída pronta a aplicar.

Para estes métodos, envolvendo a aplicação de células bacterianas, o hospedeiro celular contendo um ou mais genes de proteínas do cristal pode ser cultivado em qualquer meio nutritivo conveniente, em que a construção de DNA proporciona uma vantagem selectiva na presença de um meio selectivo de forma a que todas, ou substancialmente todas, as células mantenham o gene de B. thuringiensis. Estas células podem ser então colhidas de acordo com formas convencionais. Como alternativa, as células podem ser tratadas antes da colheita.

Quando as composições insecticidas compreendem células de B. thuringiensis, esporos e/ou cristais contendo uma ou mais proteínas do cristal modificadas com interesse, tais composições podem ser formuladas numa variedade de 117 ΡΕ1040192 formas. Elas podem ser empregues como pós molháveis, grânulos ou poeiras, através da mistura com vários materiais inertes, tais como minerais inorgânicos (filo-silicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos e similares) ou materiais botânicos (pó de carolo, farelo de arroz, cascas de avelã e similares). As formulações podem incluir adjuvantes difusores-colantes, agentes estabilizadores, outros aditivos pesticidas ou tensioactivos. As formulações liquidas podem ser de base aquosa ou não aquosa e empregues como espumas, suspensões, concentrados emulsionáveis ou similares. Os ingredientes podem incluir agentes reoló-gicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes ou polímeros.

Como alternativa, as novas proteínas do cristal derivadas de Cry3Bb mutagenizadas podem ser preparadas in vitro através de sistemas de expressão bacterianos nativos ou recombinantes e isoladas para subsequente aplicação no campo. Tal proteína pode ser na forma de lisados brutos de células, suspensões, colóides, etc., ou, como alternativa, pode ser purificada, refinada, tamponada e/ou ainda processada, antes de ser formulada numa formulação biocida activa. Igualmente, em certas circunstâncias, poderá ser desejável isolar cristais e/ou esporos a partir de culturas bacterianas expressando a proteína do cristal e aplicar soluções, suspensões ou preparações coloidais de tais cristais e/ou esporos como composição bioinsecticida activa. 118 ΡΕ1040192

Um outro aspecto importante do invento é um método de controlo de insectos coleópteros que sejam susceptiveis às novas composições aqui descritas. Tal método, de um modo geral, compreende o contacto do insecto ou população de insectos, colónia, etc., com uma quantidade eficaz em termos insecticidas de uma composição de proteina do cristal Cry3Bb*. 0 método pode utilizar proteinas do cristal Cry3Bb* tais como as descritas em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, r SEQ ID I NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: : 2 0, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: : 2 8, SEQ ID NO : 3 0, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: : 36, SEQ ID NO : 3 8, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: : 44, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: : 52, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: : 60, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: : 68, SEQ ID NO : 100, SEQ ID NO : 102 ou SEQ ID NO : 108 ou seus equivalentes biologicamente funcionais.

Como alternativa, o método pode utilizar uma ou mais proteínas do cristal Cry3Bb* que sejam codificadas pelas sequências de ácido nucleico de SEQ ID N0:1, SEQ ID

NO: 3, SEQ : ID NO:5 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ! ID NO:13, SEQ ID NO:15 , seq : ID NO:17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, ! SEQ ID NO: 23 , SEQ ID NO:25 , SEQ ID NO :27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO : 3 9, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO : 4 7, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 5 7, SEQ ID NO: 59, SEQ ID 119 ΡΕ1040192

NO :61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO: 6 9, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101 ou SEQ ID NO:107 ou por uma ou mais sequências de ácido nucleico que hibridam com as sequências de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ : ID NO:9, SEQ ID NO :H, SEQ ID NO: : 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: : 101 ou SEQ ID NO: 107, em i condiç ões de restri: ngênc ia moderada ou elevada 1 Os métodos para identificação de sequências que hibridam com as descritas nas condições de restringência moderada ou elevada são conhecidos dos familiarizados com a matéria e são aqui discutidos.

Independentemente do método de aplicação, a quantidade de um ou mais dos componentes activos é aplicada numa quantidade que seja eficaz como insecticida, a qual variará dependendo de factores tais como, por exemplo, os insectos coleópteros específicos a serem controlados, a planta ou cultura específica a ser tratada, as condições ambientais e o método, velocidade e quantidade de aplicação da composição activa como insecticida.

As composições insecticidas descritas podem ser 120 ΡΕ1040192 preparadas através da formulação da célula bacteriana, cristal e/ou suspensão de esporos, ou componente proteico isolado com o veiculo aceitável em termos agrícolas. As composições podem ser formuladas antes da administração por meios adequados tais como nas formas liofilizada, seca sob congelação, ou num veículo aquoso, meio ou diluente adequado, como seja soro fisiológico ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granulado, ou como uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como pó molhável, ou em combinação com qualquer outro material veículo adequado para aplicação agrícola. Veículos adequados para agricultura podem ser sólidos ou líquidos e são conhecidos na técnica. O termo "veículo aceitável em termos agrícolas" cobre todos os adjuvantes, e.g., componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, substâncias gomosas, aglutinantes, etc., que são normalmente usados na tecnologia de formulação de insecticidas; estes são conhecidos dos familiarizados com a formulação de insecticidas. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes líquidos e preparados por vários meios, e.g., através de mistura homogénea, combinação e/ou moagem da composição insecticida com adjuvantes adequados usando técnicas de formulação convencionais.

As composições insecticidas deste invento são aplicadas no ambiente do insecto coleóptero alvo, tipicamente na folhagem da planta ou cultura a ser protegida, por métodos convencionais, de preferência por vaporização. A 121 ΡΕ1040192 força e duração da aplicação insecticida será estabelecida relativamente a condições especificas para as pragas, culturas a serem tratadas e condições ambientais particulares. A proporção de ingrediente activo relativamente ao veículo dependerá naturalmente da natureza química, solubilidade e estabilidade da composição insecticida, assim como da formulação particular contemplada.

Outras técnicas de aplicação, e.g. pulverização, aspersão, imbebição, injecção no solo, ladrilhamento do solo, revestimento das sementes, revestimento de plântulas, vaporização, arejamento, nebulização e atomização são igualmente praticáveis e podem ser necessárias em determinadas circunstâncias, tais como e.g., com insectos que causam infestação de raízes ou caules, ou para aplicação a vegetação delicada ou plantas ornamentais. Estes procedimentos de aplicação são igualmente bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. A composição insecticida do invento pode ser empregue no método do invento de forma isolada ou combinada com outros compostos, incluindo e não estando limitados a outros pesticidas. 0 método do invento pode também ser usado conjuntamente com outros tratamentos tais como os que incluem tensioactivos, detergentes, polímeros ou formulações de libertação controlada. As composições insecticidas do presente invento podem ser formuladas para uso sistémico ou tópico. 122 ΡΕ1040192 A concentração da composição insecticida que é usada para aplicação ambiental, sistémica ou foliar variará largamente dependendo da natureza da formulação particular, meios de aplicação, condições ambientais e grau de actividade biocida. Tipicamente, a composição bioinsecti-cida estará presente na formulação aplicada numa concentração de pelo menos 1% por peso e pode ir até 99% por peso inclusive. As formulações secas das composições podem ser de 1% a 99% ou mais por peso da composição, enquanto que as formulações liquidas podem, de um modo geral, compreender entre 1% e 99% ou mais do ingrediente activo por peso. As formulações que compreendem células bacterianas intactas conterão de um modo geral 104 a 1012 células/mg. A formulação insecticida pode ser administrada a uma planta particular ou área alvo, numa ou mais aplicações conforme necessário, com uma taxa de aplicação no campo típica por hectare variando entre 1 g e 1 Kg, 2 Kg, 5 Kg ou mais de ingrediente activo. 4.8 Segmentos de Ácido Nucleico como Sondas de Hibridação e Sequências Iniciadoras

Para além da sua utilização na direcção da expressão de proteínas ou peptídeos do cristal do presente invento, as sequências de ácido nucleico aqui consideradas também possuem uma variedade de outras utilizações. Por exemplo, elas apresentam também utilidade como sondas ou sequências iniciadoras em aplicações de hibridação de ácido 123 ΡΕ1040192

nucleico. Como tal, considera-se que os segmentos de ácido nucleico que compreendem uma região da sequência consistindo em pelo menos uma sequência contígua de 14 nucleó-tidos de comprimento possuidora da mesma sequência, ou sendo complementar, de um segmento de DNA contíguo de 14 nucleótidos de comprimento de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: V i—1 i—1 SEQ ID NO: : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO: :19, SEQ ID NO: : 21, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: : 2 7, SEQ ID NO: : 29, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO: : 35, SEQ ID NO: :37, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO: : 43, SEQ ID NO: : 45, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO: : 51, SEQ ID NO: : 53, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO: : 59, SEQ ID NO: : 61, SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO : 65, SEQ ID NO: : 6 7, SEQ ID NO: : 69, SEQ ID NO:9 9, SEQ ID NO: : 101 ou SEQ ID NO: 107 econtrará utilidade particular. Sequências contíguas mais longas, idênticas ou complementares, e.g., as de cerca de 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, etc., (incluindo todos os comprimentos intermediários e até sequências de tamanho completo, inclusive, serão também usadas em determinadas realizações). A capacidade de tais sondas de ácido nucleico para especificamente hibridarem com sequências codificadoras de proteínas do cristal permitirá a sua utilização na detecção da presença de sequências complementares numa determinada amostra. No entanto, podem ser previstas outras utilizações, incluindo a utilização da informação de sequências para a preparação de sequências iniciadoras 124 ΡΕ1040192 mutantes ou sequências iniciadoras para usar na preparaçao de outras construções genéticas.

As moléculas de ácido nucleico tendo regiões da sequência consistindo em segmentos de nucleótidos contíguos de 10-14, 15-20, 30, 50 ou mesmo 100-200 nucleótidos ou

mais, idênticos ou complementares das sequências de DNA de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:5 7, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101 ou SEQ ID NO: 107 são particularmente consideradas como sondas de hibridação para usar em, e.g., transferências Southern e Northern. Os fragmentos mais pequenos, de um modo geral, encontrarão utilização nas em ensaios de hibridação, em que o comprimento da região complementar pode variar, como seja entre cerca de 10-14 e cerca de 100 ou 200 nucleótidos, mas podem ser igualmente usados segmentos complementares contiguos maiores, de acordo com o tamanho das sequências complementares que se pretende detectar. A utilização de uma sonda de hibridação de aproximadamente 14 nucleótidos de comprimento permite a 125 ΡΕ1040192 formação de uma molécula duplex que é estável e selectiva. Moléculas tendo sequências complementares contíguas ao longo de segmentos superiores a 14 bases de comprimento são geralmente preferidas, se bem que, para aumentar a estabilidade e selectividade do híbrido, e assim melhorar a qualidade e grau de moléculas híbridas específicas obtidas, seja geralmente preferido projectar moléculas de ácido nucleico tendo segmentos complementares de genes de 15 a 20 nucleótidos contíguos ou mesmo mais caso se pretenda.

Certamente, podem também ser obtidos fragmentos por outras técnicas tais como, e.g., por fricção mecânica ou digestão com enzimas de restrição. Pequenos segmentos ou fragmentos de ácido nucleico podem ser facilmente preparados por exemplo através da síntese directa do fragmento por meios químicos, como é normalmente praticado usando um sintetizador de oligonucleótidos automático. Igualmente, podem ser obtidos fragmentos através da aplicação de tecnologia de reprodução de ácidos nucleicos, como seja tecnologia de PCR™ das Patentes U.S. 4683195 e 4683202, através da introdução de sequências seleccionadas em vectores recombinantes para a produção recombinante e por outras técnicas de DNA recombinante conhecidas de um modo geral dos familiarizados com a biologia molecular.

Assim, as sequências nucleotídicas do invento podem ser usadas pela sua capacidade para selectivamente formarem moléculas de cadeia dupla com segmentos complementares de fragmentos de DNA. Dependendo da aplicação 126 ΡΕ1040192 pretendida, pretender-se-á empregar condições diferentes de hibridação para se conseguir graus variáveis de selecti-vidade da sonda contra a sequência alvo. Para aplicações que necessitem de elevada selectividade, tipicamente desejar-se-á empregar condições relativamente restringentes para formar híbridos, e.g., seleccionar-se-á condições de concentração salina baixa e/ou temperatura elevada, tais como as proporcionadas por NaCl aproximadamente 0,02M a 0,15M, a temperaturas entre cerca de 50°C e cerca de 70°C. Tais condições selectivas toleram pouco ou nenhum desempa-relhamento entre a sonda e a cadeia matriz ou alvo e serão particularmente adequadas para isolamento de segmentos de DNA codificadores de proteína do cristal. A detecção de segmentos de DNA por hibridação é bem conhecida dos familiarizados com a matéria e os ensinamentos das Patentes U.S. 4965188 e 5176995 são exemplos dos métodos de análises de hibridação. Os ensinamentos tais como os encontrados nos textos de Maloy et al., 1994; Segai 1976; Prokop, 1991; e Kuby, 1994, são particularmente relevantes.

Certamente, para algumas aplicações, por exemplo quando se pretende preparar mutantes empregando uma cadeia de sequência iniciadora mutante hibridada com uma matriz existente ou quando se pretende isolar sequências codificadoras de proteína do cristal de espécies relacionadas, equivalente funcionais, ou similares, tipicamente serão necessárias condições de hibridação menos restringentes de forma a permitir a formação do heteroduplex. Nestas circunstâncias, pode-se desejar empregar condições tais 127 ΡΕ1040192 como concentração salina de aproximadamente 0,15M a 0,9M, a temperaturas variando entre cerca de 20°C e cerca de 55°C. Espécies que originem hibridação cruzada podem assim ser facilamente identificadas como sinais de hibridação positivos relativamente a hibridações testemunha. Em qualquer dos casos, é geralmente apreciado que condições menos restringentes podem ser tornadas mais restringentes através da adição de quantidades crescentes de formamida, a qual serve para destabilizar o duplex híbrido da mesma forma que o aumento da temperatura. Assim, as condições de hibridação podem ser facilmente manipuladas, e portanto será, de um modo geral, um método de eleição dependendo dos resultados pretendidos.

Em determinadas realizações, será vantajoso empregar sequências de ácido nucleico do presente invento em combinação com um meio adequado, como seja uma marca, para determinar a hibridação. Uma larga variedade de indicadores adequados são conhecidos na técnica, incluindo ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos ou outros, tais como avidina/biotina, que são capazes de dar um sinal detectável. Nas realizações preferidas, pretende-se empregar uma marca fluorescente ou uma marca enzimática, como seja urease, fosfatase alcalina ou peroxidase, em vez de reagentes radioactivos ou outros indesejáveis para o ambiente. No caso das marcas enzimáticas, são conhecidos substratos indicadores colorimétricos que podem ser empregues para proporcionar um meio visível para o olho humano ou espectrofotometricamente, para identificar hibridação 128 ΡΕ1040192 específica com amostras contendo ácido nucleico complementar .

Em geral, pretende-se que as sondas de hibridação aqui descritas sejam úteis tanto como reagentes em soluções de hibridação como em realizações que empregam uma fase sólida. Nas realizações envolvendo uma fase sólida, o DNA a testar (ou RNA) é adsorvido ou de outra forma fixado a uma matriz ou superfície seleccionada. Este ácido nucleico de cadeia simples fixado é então sujeito a hibridação específica com sondas seleccionadas nas condições pretendidas. As condições seleccionadas dependerão das circunstâncias particulares baseado em critérios particulares necessários (dependendo, por exemplo, do teor G+C, tipo de ácido nucleico alvo, fonte de ácido nucleico, tamanho da sonda de hibridação). Após lavagem da superfície hibridada, de forma a remover as moléculas de sonda ligadas inespecificamente, detecta-se a hibridação específica através da marca. 4.9 Características das ô-Endotoxinas Cry3 Modificadas 0 presente invento proporciona novos polipeptí-deos que definem a totalidade ou uma porção de uma proteína do cristal cry3Bb.11222, cry3Bb.11226, cry3Bb.11230, cry3Bb.11234, cry3Bb.11238, codificada por cry3Bb.60, cry3Bb.11221, cry3Bb.11223, cry3Bb.11224, cry3Bb.11225, cry3Bb.11227, cry3Bb.11228, cry3Bb.11229, cry3Bb.11231, cry3Bb.11232, cry3Bb.11233, cry3Bb.11235, cry3Bb.11236, cry3Bb.11237, cry3Bb.11239, cry3Bb.11241, cry3Bb.11242, 129 ΡΕ1040192 cry3Bb.11032, cry3Bb.11035, cry3Bb.11036, cry3Bb.11046, cry3Bb.11048, cry3Bb.11051, cry3Bb.11057, cry3Bb.11058, cry3Bb.11081, cry3Bb.11082, cry3Bb.11083, cry3Bb.11084, cry3Bb.11095 e cry3Bb.11098 de B. thuringiensis. 4.10 Nomenclatura da Proteína do Cristal Os inventores atribuíram arbitrariamente as designações Cry3Bb.60, Cry3Bb.11221, Cry3Bb.11222, Cry3Bb.11223, Cry3Bb.11224, Cry3Bb.11225, Cry3Bb.11226, Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242, Cry3Bb.11032, Cry3Bb.11035, Cry3Bb.11036, Cry3Bb.11046, Cry3Bb.11048, Cry3Bb.11051, Cry3Bb.11057, Cry3Bb.11058, Cry3Bb.11081, Cry3Bb.11082, Cry3Bb.11083, Cry3Bb.11084, Cry3Bb.11095 e Cry3Bb.11098 às novas proteínas do invento. Igualmente as designações arbitrárias de cry3Bb.60, cry3Bb.11221, cry3Bb.11222, cry3Bb.11223, cry3Bb.11224, cry3Bb.11225, cry3Bb. 11226, cry3Bb .11227, cry3Bb.11228, cry3Bb.11229, cry3Bb.11230, cry3Bb.11231, cry3Bb.11232, cry3Bb.11233, cry3Bb.11234, cry3Bb.11235, cry3Bb.11236, cry3Bb. 11237, cry3Bb.11238, cry3Bb.11239, cry3Bb.11241, cry3Bb.11242, cry3Bb.11032, cry3Bb.11035, cry3Bb.11036, cry3Bb .1104 6, cry3Bb.11048, cry3Bb.11051, cry3Bb.11057, cry3Bb.11058, cry3Bb.11081, cry3Bb.11082, cry3Bb.11083, cry3Bb.11084, cry3Bb.11095 e cry3Bb.11098 130 ΡΕ1040192 foram atribuídas às novas sequências de ácido nucleico que codificam estes polipeptídeos, respectivamente. Ainda que a atribuição formal das designações de gene e proteína baseado na nomenclatura revista das endotoxinas de proteína do cristal (Tabela 1) possa ser feita pelo comité para a nomenclatura de B. thuringiensis, quaisquer novas designações das composições do presente invento são consideradas como estando no âmbito da presente descrição. 4.11 Células Hospedeiras Transformadas e Plantas Transgénicas

Uma bactéria, uma célula de levedura ou uma célula vegetal ou uma planta transformada com um vector de expressão do presente invento é igualmente considerada. Uma bactéria, célula levedura, célula vegetal ou planta trans-génica derivada de uma célula transformada ou transgénica é igualmente um aspecto do invento.

Tais células hospedeiras transformadas são muitas vezes desejáveis para usar na produção de endotoxinas e na expressão das várias construções de genes de DNA aqui descritas. Nalguns aspectos do invento, é muitas vezes desejável modular, regular ou de outra fora controlar a expressão dos segmentos de genes aqui descritos. Tais métodos são de rotina para os familiarizados com a técnica da genética molecular. Tipicamente, quando se pretende uma expressão aumentada de um gene particular, podem ser empregues várias manipulações para aumentar a expressão do RNA mensageiro, particularmente usando um promotor activo, 131 ΡΕ1040192 assim como empregando sequências que aumentam a estabilidade do RN A mensageiro na célula hospedeira particular transformada.

Tipicamente, a região de iniciação e terminação da tradução envolverá um ou mais codões de paragem, uma região terminadora e, facultativamente, um sinal de poli-adenilação. Na direcção da transcrição, nomeadamente na direcção 5' para 3' da sequência codificadora, a construção envolverá a região reguladora da transcrição, se existir, e o promotor, em que a região reguladora pode estar 5' ou 3' relativamente ao promotor, local de ligação ao ribossoma, codão de iniciação, gene estrutural tendo a grelha de leitura em fase com o codão de iniciação, um ou mais codões de paragem, sequência do sinal de poliadenilação, se existir, e a região do terminador. Esta sequência como cadeia dupla pode ser usada por si só para a transformação de um microrganismo hospedeiro, mas, de um modo geral, incluirá uma sequência de DNA envolvendo uma marca, em que a segunda sequência de DNA pode ser ligada à construção de expressão da δ-endotoxia durante a introdução do DNA no hospedeiro.

Por marca pretende-se significar um gene estrutural que proporciona selecção dos hospedeiros que tenham sido modificados ou transformados. A marca proporcionará normalmente vantagem selectiva, por exemplo, proporcionando resistência a biocida, e.g., resistência a antibióticos ou a metais pesados; complementação, de forma a proporcionar 132 ΡΕ1040192 prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, ou similares. De preferência, emprega-se complementação, de forma a que o hospedeiro modificado possa não só ser seleccionado, como também ser competitivo no campo. Podem ser empregues uma ou mais marcas no desenvolvimento das construções, assim como na modificação do hospedeiro. Os organismos podem ainda ser modificados ao ser proporcionada uma vantagem competitiva contra outros microrganismo selvagens no campo. Por exemplo, genes que expressam agentes quelantes de metais, e.g., sideróforos, podem ser introduzidos no hospedeiro juntamente com o gene estrutural expressando a δ-endo-toxina. Desta forma, o aumento da expressão de um side-róforo pode proporcionar uma vantagem competitiva para o hospedeiro produtor da δ-endotoxina, de forma a que possa competir eficazmente com os microrganismos selvagens e estavelmente ocupar um nicho no ambiente.

Quando não existir um sistema de replicação funcional, a construção também incluirá uma sequência de pelo menos 50 pares de bases (pb), de preferência pelo menos cerca de 100 pb, e geralmente não mais de cerca de 1000 pb de uma sequência homóloga de uma sequência do hospedeiro. Desta forma, a probabilidade de recombinação legitima é aumentada, de forma que o gene será integrado no hospedeiro e estavelmente mantido pelo hospedeiro. De forma desejável, o gene da δ-endotoxina estará em estreita proximidade com o gene que proporciona complementação, assim como com o gene que proporciona vantagem competitiva. Assim, no caso de um gene de δ-endotoxina ser perdido, o 133 ΡΕ1040192 organismo resultante provavelmente também perderá o gene de complementação e/ou o gene que proporciona vantagem competitiva, de forma que será incapaz de competir no ambiente com o gene mantendo a construção intacta. 0 gene codificador da proteína do cristal pode ser introduzido entre a região de iniciação da transcrição e da tradução e a região de terminação da transcrição e da tradução, de forma a permanecer sob o controlo regulador da região de iniciação. Esta construção será incluída num plasmídeo, o qual incluirá pelo menos um sistema de replicação, mas pode incluir mais de um, em que um sistema de replicação é empregue para a clonagem durante o desenvolvimento do plasmídeo e o segundo sistema de replicação é necessário para o funcionamento no hospedeiro final. Ainda, estarão presentes uma ou mais marcas, as quais foram anteriormente descritas. Sempre que se pretenda integração, o plasmídeo incluirá de preferência uma sequência homóloga do genoma do hospedeiro.

Os transformantes podem ser isolados de acordo com meios convencionais, geralmente empregando uma técnica de selecção, o que permite a selecção do organismo pretendido contra organismos não modificados ou organismos de transferência, quando presentes. Os transformantes podem então ser testados relativamente a actividade pesticida. Células hospedeiras adequadas, em que as células contendo pesticida serão tratadas para prolongar a acti- 134 ΡΕ1040192 vidade de δ-endotoxina na célula quando a célula tratada é aplicada no ambiente de uma ou mais pragas alvo, podem incluir procariotas ou eucariotas, normalmente estando limitadas às células que não produzem substâncias tóxicas para organismos superiores, tais como mamíferos. No entanto, organismos que produzem substâncias tóxicas contra organismos superiores poderão ser usados, em que a δ-endotoxina é instável ou o nível de aplicação suficientemente baixo de forma a evitar qualquer possibilidade de toxicidade para um hospedeiro mamífero. Como hospedeiros, são de particular interesse os procariotas e os eucariotas inferiores, tais como fungos. Exemplos de procariotas, tanto Gam-negativos como Gram-positivos, incluem Enterobac-teriaceae, tais como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmo-nella e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tais como Rhizo-bium; Spirillaceae, tais como fitobactérias, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; organismos do filoplano tais como membros das Pseudomonadaceae (incluindo Pseudomonas spp. e Aceto-bacter spp.); Azotobacteraceae e Nitrobacteraceae; Flavobacterium spp; membros das Bacillaceae tais como Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., e similares. Células hospedeiras particularmente preferidas incluem Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Bacillus thurigiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis e similares.

Entre os eucariotas estão fungos, tais como

Phycomycetes e Ascomycetes, o que inclui leveduras, tais 135 ΡΕ1040192 como Schizosaccharomyces; e Basidiomycetes, Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, Saccharomyces spp. e Sporobolomyces spp. e similares.

Características de interesse particular na selec-ção de uma célula hospedeira com o objectivo de produção incluem a facilidade de introdução do gene da δ-endotoxina no hospedeiro, disponibilidade de sistemas de expressão, eficiência de expressão, estabilidade do pesticida no hospedeiro e presença de capacidades genéticas auxiliares. Características com interesse para usar como microcápsula de pesticida incluem qualidades protectoras para o pesticida, como sejam paredes celulares espessas, pigmentação e armazenamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; afinidade foliar; ausência de toxicidade para mamíferos; capacidade para induzir a ingestão por pragas; facilidade de matar e fixação sem destruição da δ-endotoxina; e similares. Outras considerações incluem facilidade de formulação e manipulação, economia, estabilidade no armazenamento e similares. A célula estará geralmente intacta e substancialmente na forma proliferativa quando tratada, em vez de uma forma de esporo, se bem que nalguns casos os esporos possam ser empregues. 0 tratamento da célula microbiana recom-binante pode ser feito como descrito infra. As células tratadas, de um modo geral, terão maior estabilidade estrutural que aumentará a resistência a condições ambientais. 136 ΡΕ1040192

Os genes ou outros segmentos de ácido nucleico, conforme aqui descrito, podem ser inseridos nas células hospedeiras usando uma variedade de técnicas que são bem conhecidas dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, existe um grande número de vectores de clonagem compreendendo um sistema de replicação em E. coli e uma marca que permite a selecção das células transformadas para preparação da inserção de genes estranhos em organismos superiores, incluindo plantas. Os vectores compreendem, por exemplo, pBR322, série pUC, série M13mp, pACYC184, etc. Assim, a sequência codificadora da δ-endotoxina pode ser inserida no vector num local de restrição adequado. 0 plasmideo resultante é usado para transformação em E. coli. As células de E. coli são cultivadas num meio nutritivo adequado, depois colhidas e lisadas. 0 plasmideo é recuperado. A análise da sequência, análise de restrição, electroforese e outros métodos de bioqumica-biologia molecular são geralmente realizados como métodos de análise. Após cada uma das manipulações, a sequência de DNA usada pode ser clivada e ligada à sequência de DNA seguinte. Cada sequência de plasmideo pode ser clonada no mesmo plasmideo ou noutros plasmideos. Dependendo do método de inserção dos genes pretendidos na planta, outras sequências de DNA podem ser necessárias. Métodos para a transformação de células vegetais com DNA incluem transformação de plantas mediada por Agrobacterium, transformação de protoplastos, transferência de genes para pólen, injecção de órgãos reprodutores, 137 ΡΕ1040192 injecção de embriões maduros e bombardeamento com partículas. Cada um destes métodos possui vantagens e desvantagens distintas. Assim, um método particular de introdução de genes numa estirpe vegetal particular pode não ser necessariamente o mais eficaz para uma outra estirpe vegetal, mas são conhecidos quais os métodos úteis para uma estirpe vegetal particular.

Pensa-se que métodos adequados incluam virtualmente qualquer método através do qual DNA possa ser introduzido numa célula, como seja través da infecção por Agrobacterium, libertação directa do DNA como tal, por exemplo, pela transformação de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993), através de internalização de DNA mediada por desidratação/hidratação, por electroporação, por agitação com fibras de silicone Carbide, por aceleração de partículas revestidas com DNA, etc. Em determinadas realizações, os métodos de aceleração são preferidos e incluem, por exemplo, bombardeamento com microprojécteis e similares. A tecnologia para introdução do DNA nas células é conhecida dos familiarizados com a técnica. Foram descritos quatro métodos gerais para introdução de um gene nas células: (1) métodos químicos (Graham and van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992); (2) métodos físicos tais como microinjecção (Capecchi, 1980), electroporação (Wong and Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) e pistola de genes (Johnston and Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) vectores 138 ΡΕ1040192 virais (Clapp, 1993; Lu et ai., 1993; Eglitis and Anderson, 1988; Eglitis et al., 1988); e (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992) .

Existe um grande número de técnicas para a inserção de DNA numa célula hospedeira vegetal. Estas técnicas incluem transformação com T-DNA usando Agrobac-terium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transformação, fusão, injecção ou electroporação assim como outros métodos possíveis. Se forem usadas agrobacté-rias na transformação, o DNA a ser inserido tem de ser clonado em plasmídeos especiais, nomeadamente num vector intermediário ou num vector binário. Os vectores intermediários podem ser integrados no plasmídeo Ti ou Ri por recombinação homóloga devido às sequências homólogas de sequências no T-DNA. 0 plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA.

Os vectores intermediários não se podem replicar em agrobactérias. 0 vector intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). Os vectores binários podem replicar-se em E. coli e em agrobactérias. Eles compreendem um gene de marca de selecção e um adaptador ou poli-adaptador flanqueados pelas regiões de fronteira direita e esquerda de T-DNA. Eles podem ser usados para transformar directamente agrobactérias (Holsters et al., 1978). A agrobactéria usada como célula hospedeira deverá compre- 139 ΡΕ1040192 ender um plasmídeo portador de uma região vir. A região vir é necessária para transferência do T-DNA para a célula vegetal. Outro T-DNA pode estar incluso. A bactéria assim transformada é usada para a transformação de células vegetais. Explantes vegetais podem, com vantagem, ser cultivados com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes para a transferência do DNA para a célula vegetal. Plantas completas podem ser regeneradas a partir do material da planta infectada (por exemplo, pedaços de folha, segmentos de caule, raízes, mas também protoplastos ou células cultivadas em suspensão) num meio adequado, o qual pode conter antibióticos ou biocidas para selecção. As plantas assim obtidas podem então ser testadas quanto à presença do DNA inserido. Não são necessários requisitos especiais para os plasmídeos no caso de injecção e electroporação. É possível usar plasmídeos normais, tais como, por exemplo, derivados de pUC. Se, por exemplo, o plasmídeo Ti ou Ri for usado para a transformação da célula vegetal, então pelo menos a fronteira direita, mas muitas vezes as fronteiras direita e esquerda do T-DNA do plasmídeo Ti ou Ri, tem de ser ligada como região flanqueante dos genes a serem inseridos. A utilização do T-DNA para a transformação das células vegetais foi intensivamente pesquisada e suficientemente descrita no Pedido de Patente Europeia N° EP 120516; Hockema (1985); Na et al., 1985, Herrera-Estrella et al., (1983), Bevan et al., (1983) e Klee et al., (1985).

Um vector cassete do plasmídeo Ti particularmente 140 ΡΕ1040192 útil para a transformação de plantas dicotiledóneas consiste no promotor CaMA35S (EN35S) e no extremo 3' incluindo sinais de poliadenilação derivados de um gene de soja codificador da subunidade a' de β-conglicinina. Entre estes dois elementos está um multi-adaptador contendo múltiplos locais de restrição para a inserção de genes com interesse. 0 vector, de preferência, contem um segmento de pBR322 que proporciona uma origem de replicação em E. coli e uma região de recombinação homóloga com o T-DNA sem braços na estirpe ACO de Agrobacterium; a origem oriV derivada do plasmideo RK1 de larga gama de hospedeiros; o gene de resistência à estreptomicina/espectinomicina derivado de Tn7; e um gene NPTII, contendo o promotor CaMV35S e o extremo 3' da nopalina sintetase (NOS), o qual proporciona resistência à canamicina em células vegetais transformadas.

Facultativamente, o promotor CaMV35S pode ser substituído pelo promotor da manopina sintetase (MAS) de 1,5 Kb (Velten et al., 1984). Após incorporação de uma construção de DNA no vector, este é introduzido numa estirpe ACO de A. tumefaciens que contem um plasmideo Ti sem braços. Os vectores do plasmideo Ti cointegrados são seleccionados e, subsequentemente, podem ser usados para transformar uma planta dicotiledónea. A. tumefaciens ACO é uma estirpe "disarmed" (sem 141 ΡΕ1040192 braços) semelhante a pTiBôSE descrita por Fraley et al. (1985). Para a construção de ACO a estirpe Agrobacterium de partida foi a estirpe A208 que contem um plasmideo Ti tipo nopalina. 0 plasmideo Ti foi destituídos dos braços de forma semelhante ao descrito por Fraley et al. (1985) para que essencialmente todo o T-DNA nativo fosse removido exceptuando a fronteira esquerda e algumas centenas de pares de bases do T-DNA dentro da fronteira esquerda. 0 restante T-DNA prolongando-se até um ponto para lá da fronteira esquerda foi substituído com um novo segmento de DNA incluindo (da esquerda para a direita) um segmento de pBR322, a região oriv derivada do plasmideo RK2 e o gene de resistência da canamicina de Tn601. Os segmentos de pBR322 e oriv são semelhantes a estes segmentos e proporcionam uma região de homologia para formação cointegrada.

Uma vez integrado no genoma o DNA inserido, permanece aí de forma relativamente estável e, como regra, não torna a sair. Normalmente contem uma marca de selecção que confere às células vegetais transformadas resistência a um biocida ou um antibiótico, como seja canamicina, G418, bleomicina, higromicina ou cloranfenicol, inter alia. A marca individualmente empregue deverá assim permitir a selecção das células transformadas versus células que não contêm o DNA inserido. 4.11.1 Electroporação A aplicaçao de breves pulsos eléctricos de alta 142 ΡΕ1040192 voltagem a uma variedade de células animais e vegetais conduz à formação de poros com dimensões de nanómetros na membrana plasmática. 0 DNA é internalizado directamente para o citoplasma celular através destes poros ou como consequência da redistribuição dos componentes membranares que acompanha o enceramento dos poros. A electroporação pode ser extremamente eficiente e pode ser usada para a expressão transitória dos genes clonados e para o estabelecimento de linhas celulares portadoras de cópias integradas do gene com interesse. A electroporação, ao contrário da transfecção mediada por fosfato de cálcio e fusão de protoplastos, frequentemente origina linhas celulares portadoras de uma ou, no máximo algumas, cópias integradas do DNA estranho. A introdução de DNA por meio de electroporação, é bem conhecida dos familiarizados com a matéria. Neste método, determinadas enzimas que degradam a parede celular, como sejam enzimas que degradam pectina, são empregues para tornar as células recipientes alvo mais susceptiveis a transformação por electroporação do que as células não tratadas. Como alternativa, as células recipientes são tornada mais susceptiveis à transformação, por ferimento mecânico. Para efectuar a transformação por electroporação pode-se empregar tecidos friáveis, tais como culturas de células em suspensão ou calos embriogénicos, ou como alternativa pode-se transformar directamente embriões imaturos ou outros tecidos organizados. Degradar-se-á parcialmente as paredes celulares das células escolhidas 143 ΡΕ1040192 através da sua exposição a enzimas que degradam pectina (pectoliases) ou ferimento mecânico de forma controlada. Tais células serão então recipientes da transferência de DNA por electroporação, a qual pode ser realizada nesta fase e as células transformadas depois identificadas através de um protocolo de selecção ou rastreio adequado, dependendo da natureza do DNA incorporado. 4.11.2 Bombardeamento com MicroProjécteis

Um outro método vantajoso para a introdução de segmentos de DNA transformantes em células vegetais é o bombardeamento com microprojécteis. Neste método, as partículas podem ser revestidas com ácidos nucleicos e introduzidas por uma força propelente. Exemplos de partículas incluem as constituídas por tungsténio, ouro, platina e similares.

Uma vantagem do bombardeamento com microprojéc-teis, para além de ser um meio eficaz de transformar estavelmente e de forma reprodutível monocotiledóneas, é que nem o isolamento de protoplastos (Cristou et al., 1988) nem a susceptibilidade a Agrobacterium ê necessária. Um exemplo de realização de um método para a introdução de DNA em células de milho através da aceleração é um Biolistic Particle Delivery system, que pode ser usado para impulsionar partículas revestidas com DNA ou células através de um écran, como seja um écran de aço inoxidável ou Nytex, numa superfície de filtro coberta com células cultivadas em 144 ΡΕ1040192 suspensão. 0 écran dispersa as partículas de forma a não serem libertados nas células recipientes em grandes agregados. Pensa-se que um écran interposto entre o dispositivo que lança os projécteis e as células a serem bombardeadas reduz o tamanho dos agregados de projécteis e pode contribuir para uma frequência mais elevada de transformação através da redução dos danos infligidos às células recipientes por projécteis que sejam demasiado grandes.

Para o bombardeamento, as células em suspensão são, de preferência, concentradas em filtros ou meio de cultura sólido. Como alternativa, embriões imaturos ou outras células alvo podem ser arranjadas em meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas a uma distância apropriada abaixo da placa de paragem do macropro jéctil. Caso se pretenda, um ou mais écrans são igualmente posicionados entre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Através da utilização de técnicas aqui descritas pode-se obter até 1000 ou mais focos de células que expressam transitoriamente um gene de uma marca. O número de células num foco que expressam o produto do gene exógeno 48 horas pós-bombardeamento muitas vezes varia entre 1 e 10 e em média entre 1 e 3.

Na transformação por bombardeamento, pode-se optimizar as condições de cultura pré-bombardeamento para dar números máximos de transformantes estáveis. Tanto os parâmetros físicos como biológicos para o bombardeamento 145 ΡΕ1040192 são importantes nesta tecnologia. Os factores físicos são os que envolvem a manipulação do precipitado de DNA/micro-projéctil ou os que afectam o voo e velocidade dos macro-ou microprojécteis. Factores biológicos incluem todos os passos envolvidos na manipulação de células antes e imediatamente após o bombardeamento, o ajuste osmótico das células alvo para ajudar a aliviar o trauma associado ao bombardeamento e também a natureza do DNA transformante, como seja DNA linearizado ou plasmídeos super-enrolados intactos. Pensa-se que as manipulações pré-bombardeamento sejam especialmente importantes para a transformação com êxito dos embriões imaturos.

Assim, considera-se que se pode pretender ajustar vários parâmetros do bombardeamento em estudos de pequena escala para optimizar totalmente as condições. Particularmente, pode-se ajustar os parâmetros físicos tais como a distância da abertura, distância do voo, distância do tecido e pressão do hélio. Pode-se também minimizar os factores de redução de trauma (TRFs) através da modificação de condições que influenciam o estado fisiológico das células recipientes e que podem portanto influenciar as eficiências de transformação e integração. Por exemplo, o estado osmótico, hidratação do tecido e fase de subcultura ou ciclo celular das células recipientes podem ser ajustados para uma transformação óptima. A execução de outros ajustamentos de rotina será conhecida dos familiarizados com a matéria face à presente descrição. 146 ΡΕ1040192 4.11.3 Transferência Mediada por Agrobacterium A transferência mediada por Agrobacterium é um sistema largamente aplicado para a introdução de genes em células vegetais devido ao DNA ser introduzido nos tecidos de plantas completas, ultrapassando assim a necessidade de regeneração de uma planta intacta a partir de um proto-plasto. A utilização de vectores de integração em plantas, mediada por Agrobacterium, para introduzir DNA nas células vegetais é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, os métodos descritos (Fraley et al. , 1985; Rogers et al., 1987) . Ainda, a integração de DNA Ti é um processo relativamente preciso resultando em poucos rearranjos. A região do DNA a ser transferido é definida pelas sequências de fronteira e o DNA interveniente é geralmente introduzido no genoma da planta como descrito (Spielman et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).

Os modernos vectores de transformação de Agrobacterium são capazes de se replicarem em E. coli assim como em Agrobacterium, permitindo manipulações adequadas conforme descrito (Klee et al. , 1985). Ainda, avanços tecnológicos recentes em vectores para a transferência de genes mediada por Agrobacterium melhorou o arranjo de genes e os locais de restrição nos vectores para facilitar a construção de vectores capazes de expressar vários genes codificadores de polipeptídeos. Os vectores descritos (Rogers et al., 1987) possuem regiões multi-adaptadoras flanqueadas por um promotor e um local de poliadenilação para a 147 ΡΕ1040192 expressão directa dos genes inseridos codificadores de polipeptideos e são adequados para os presentes objectivos. Ainda, Agrobacterium contendo genes Ti com e sem braços pode ser usada nas transformações. Nas estirpes vegetais em que a transformação mediada por Agrobacterium é eficiente, é o método de eleição devido à natureza fácil e definida da transferência de genes. A transformação, mediada por Agrobacterium, de discos foliares e de outros tecidos tais como cotilédones e hipocótilos parece estar Imitada a plantas naturalmente infectadas por Agrobacterium. A transformação mediada por Agrobacterium é mais eficiente em plantas dicotiledóneas. Poucas monocotiledóneas parecem ser hospedeiros naturais de Agrobacterium, se bem que tenham sido produzidas plantas transgénicas em espargos usando vectores de Agrobacterium como descrito (Bytebier et al. , 1987). Assim, culturas de cereais economicamente importantes, tais como arroz, milho e trigo, geralmente devem ser transformadas usando métodos alternativos. No entanto, conforme referido atrás, a transformação de espargos usando Agrobacterium pode também ser conseguida (ver, por exemplo, Bytebier et al., 1987).

Uma planta transgénica, formada usando os métodos de transformação por Agrobacterium tipicamente, contem tipicamente um único gene num só cromossoma. Tais plantas transgénicas podem ser referidas como sendo heterozigóticas para o gene adicionado. No entanto, apesar de a utilização da palavra "heterozigótico" geralment implicar a presença 148 ΡΕ1040192 de um gene complementar no mesmo locus do segundo cromossoma de um par de cromossomas e não haver tal gene numa planta contendo um gene adicionado como aqui, pensa-se que um termo mais preciso para tal planta é um segregante independente, devido ao gene exógeno adicionado segregar independentemente durante a mitose e a meiose.

Mais preferida é uma planta transgénica que é homozigótica para o gene estrutural adicionado, i.e., uma planta transgénica que contem dois genes adicionados, um gene no mesmo locus em cada um dos cromossomas de um par. Uma planta transgénica homozigótica pode ser obtida por conjugação (autofertilização) sexuada de uma planta transgénica segregante independente que contem um único gene adicionado, germinação de algumas das sementes produzidas e análise das plantas resultantes produzidas de forma a ter actividade carboxilase aumentada relativamente a um controlo (nativa, não transgénica) ou uma planta transgénica segregante independente.

Deve ser considerado que duas plantas transgé-nicas diferentes podem também ser conjugadas para produzir progénie que contem dois genes exógenos adicionados com segregação independente. A autofertilização de progénie adequada pode produzir plantas que são homozigóticas para ambos os genes exógenos adicionados que codificam um polipeptideo com interesse. 0 cruzamento com uma planta parental e o cruzamento com uma planta não transgénica são igualmente considerados. 149 ΡΕ1040192 A transformação de protoplastos vegetais pode ser conseguida usando métodos baseados na precipitação com fosfato de cálcio, tratamento com polietilenoglicol, electroporação e combinações destes tratamentos (ver, e.g., Potrykus et ai., 1985; Lorz et al. , 1985; Fromm et al. , 1985; Uchimiya et al., 1986; Callis et al. , 1987; Marcotte et al., 1988) . A aplicação destes sistemas a diferentes estirpes vegetais depende da capacidade para regenerar a estirpe vegetal particular a partir de protoplastos. Métodos ilustrativos da regeneração de cereais a partir de protolastos foram descritos (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

Para transformar estirpes vegetais que não podem ser regeneradas com êxito a partir de protoplastos, podem ser utilizadas outras vias para introduzir DNA nas células ou tecidos intactos.

Por exemplo, a regeneração de cereais a partir de embriões imaturos ou explantes pode ser efectuada como descrito (Vasil, 1988). Ainda, pode ser utilizada a "pistola de partículas" ou tecnologia de microprojécteis de alta velocidade (Vasil, 1992). o DNA é levado

Usando esta última tecnologia 150 ΡΕ1040192 através da parede celular e para o citoplasma na superfície de pequenas partículas de metal como descrito (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; McCabe et al., 1988). As partículas de metal penetram através de várias camadas de células e assim permitem a transformação de células dentro dos explantes de tecidos. 4.11.4 Expressão de Genes em Plantas

Se bem que nos últimos anos tenha sido feito grande progresso relativamente à preparação de plantas transgénicas que expressam proteínas bacterianas, tais como proteínas do cristal de B. thuringiensis, os resultados da expressão de genes bacterianos nativos em plantas são muitas vezes desapontantes. Ao contrário da genética microbiana, os primeiros geneticistas de plantas pouco sabiam sobre factores que afectam a expressão heteróloga de genes estranhos em plantas. Nos últimos anos, no entanto, vários factores potenciais foram implicados como responsáveis, em grau variável, pelo nível de expressão proteica a partir de uma sequência codificadora particular. Por exemplo, os cientistas sabem agora que a manutenção de um nível significativo de um mRNA particular na célula é de facto um factor crítico. Infelizmente, as causas dos baixos níveis de mRNA codificador de proteínas heterólogas são muitas. Em primeiro lugar, a síntese de RNA de tamanho completo pode não ocorrer numa frequência elevada. Isto poderá, por exemplo, ser causado pela terminação prematura de RNA durante a transcrição ou devido ao processamento inesperado 151 ΡΕ1040192 de mRNA durante a transcrição. Em segundo lugar, o mRNA de tamanho completo pode ser produzido na célula vegetal, mas depois processado ("splicing", adição de poliA) no núcleo de forma a criar um mRNA não funcional. Se o RNA não for correctamente sintetizado, terminado e poliadenilado, não pode transitar para o citoplasma para ser traduzido. De forma semelhante, no citoplasma, se os mRNAs tiverem semi-vidas reduzidas (as quais são determinadas pela sua sequência primária ou secundária) será produzido produto proteico insuficiente. Ainda, existe um efeito, cuja dimensão é incerta, da eficiência de tradução na semi-vida do mRNA. Ainda, todas as moléculas de RNA enrolam-se numa estrutura particular, ou talvez em famílias de estruturas, que é determinada pela sua sequência. A estrutura particular de qualquer RNA deverá conduzir a uma maior ou menor estabilidade no citoplasma. A estrutura per se é, provavelmente, também um determinante do processamento de mRNA no núcleo. Infelizmente, é impossível prever, e quase impossível determinar, a estrutura de qualquer RNA (excepto o tRNA) in vitro ou in vivo. No entanto, é provável que a alteração dramática da sequência de um RNA tenha um grande efeito na sua estrutura enrolada. É provável que a estrutura per se ou características estruturais particulares tenham um papel na determinação da estabilidade do RNA.

Para ultrapassar estas limitações na expressão dos genes estranhos, os investigadores identificaram sequências e sinais particulares em RNAs que tenham o potencial para terem um efeito específico na estabilidade 152 ΡΕ1040192 do RNA. Em determinadas realizações do invento, existe pois o objectivo de optimizar a expressão dos segmentos de ácido nucleico in planta. Um método particular de o fazer, é através da alteração do gene bacteriano para remover sequências ou motivos que diminuam a expressão numa célula vegetal transformada. 0 processo de manipulação de uma sequência codificadora para expressão óptima in planta é muitas vezes referido como "plantização" de uma sequência de DNA.

As sequências ricas em A+T são particularmente problemáticas. Infelizmente, uma vez que B. thuringiensis tem um genoma rico em A+T, sequências de genes da proteína do cristal nativa devem, muitas vezes, ser modificadas para a expressão óptima numa planta. 0 motivo com a sequência ATTTA (ou AUUUA tal como surge no RNA) tem sido implicado como uma sequência destabilizante em mRNA de células de mamífero (Shaw and Kamen, 1986). Muitos mRNAs com uma vida curta têm regiões não traduzidas 3' ricas em A+T, e estas regiões muitas vezes possuem a sequência ATTTA, por vezes presentes em múltiplas cópias ou como multímeros (e.g., ATTTATTTA...). Shaw e Kamen mostraram que a transferência do extremo 3' de um mRNA instável para um RNA estável (globina ou VAI) diminui dramaticamente a semi-vida de RNAs estáveis. Mostraram ainda que um pentâmero de ATTTA possui um profundo efeito destabilizador num mensageiro estável e que este sinal poderá exercer o seu efeito quer esteja localizado no extremo 3' quer dentro da sequência codificadora. No entanto, o número de sequências ATTTA e/ou o contexto da sequência em que ocorre também parece ser 153 ΡΕ1040192 importante na determinação da sua função como sequências destabilizantes. Shaw e Kanen mostraram que um trimero de ATTTA tem muito menos efeito do que um pentâmero na estabilidade do mRNA e um dimero ou um monómero não tem efeito na estabilidade (Shaw and Kamen, 1987). Note-se que os multimeros de ATTTA tais como um pentâmero criam automaticamente uma região rica em A+T. Demonstrou-se que este é um efeito citoplasmático, não um efeito nuclear. Noutros mRNAs instáveis, a sequência ATTTA pode estar presente apenas numa única cópia, mas está muitas vezes contida numa região rica em A+T. Dos dados de células animais até agora obtidos, parece que ATTTA, pelo menos nalguns contextos, é importante na estabilidade, mas não é ainda possível prever quais as situações em que ATTTA é um elemento destabilizador ou se qualquer um destes efeitos tem probabilidade de ocorrer em plantas.

Alguns estudos sobre a degradação de mRNA em células animais podem também indicar que a degradação de RN A pode começar nalguns casos com ataque nucleolítico em regiões ricas em A+T. Não é claro se estas clivagens ocorrem em sequências ATTTA. Existem também exemplos de mRNA que possuem estabilidade diferencial, dependendo do tipo de célula em que são expressos ou da fase do ciclo celular em que são expressos. Por exemplo, os mRNAs das histonas são estáveis durante a síntese de DNA mas instáveis se a síntese de DNA for interrompida. 0 extremo 3' de alguns mRNAs de histonas parece ser responsável por este efeito (Pandey and Marzluff, 1987) . Não parece ser mediado por ATTTA nem é claro o que controla a estabilidade 154 ΡΕ1040192 diferencial deste mRNA. Um outro exemplo é a estabilidade diferencial do mRNA de IgG em linfócitos B durante a maturação das células B (Genovese and Milcarek, 1988). Um exemplo final é a instabilidade de um mRNA de globina mutante β-talassémica. Nas células da medula óssea, onde este gene é normalmente expresso, o mRNA mutante é instável, enquanto que o mRNA selvagem é estável. Quando o gene mutante é expresso em células HeLa ou L in vitro, o mRNA mutante não mostra instabilidade (Lim et al., 1988). Estes exemplos também proporcionam evidência de que a estabilidade do mRNA pode ser mediado pelo tipo de células ou factores específicos do ciclo celular. Ainda, este tipo de instabilidade não está ainda associado a equências específicas. Tendo em conta estas incertezas, não é possível prever quais os RNAs que têm probabilidade de serem instáveis numa determinada célula. Ainda, mesmo o motivo ATTTA pode actuar diferencialmente dependendo da natureza da célula em que o RNA está presente. Shaw and Kamen (1987) descreveram que a activação de uma proteína cinase C pode bloquear a degradação mediada por ATTTA. A adição de uma cadeia de poliadenilato ao extremo 3' é comum à maior parte dos mRNAs eucarióticos, tanto vegetais como animais. 0 conceito normalmente aceite da adição de poli A é que o transcrito nascente se estende para lá do extremo 3' maduro. Neste transcrito estão contidos sinais de poliadenilação e formação correcta do extremo 3' . Este processamento no extremo 3' envolve a clivagem do mRNA e a adição de poli A ao extremo 3' maduro. Ao pesquisar-se sequências de consenso perto da cauda poli 155 ΡΕ1040192 A em mRNAs vegetais e animais, foi possível identificar sequências de consenso que aparentemente estão envolvidas na adição de poli A e na clivagem do extremo 3'. As mesmas sequências de consenso parecem ser importante para ambos os processo. Estes sinais são tipicamente uma variação da sequência AATAAA. Nas células animais, foram identificadas algumas variantes desta sequência que são funcionais; nas células vegetais parece existir uma larga gama de sequências funcionais (Wickens ad Stephenson, 1984; Dean et al., 1986). Devido a todas estas sequências de consenso serem variações de AATAAA, elas são sequências ricas em A+T. Esta sequência é tipicamente encontrada 15 a 20 pb antes da cauda poli A num mRNA maduro. Os estudos em células animais indicam que esta sequência está envolvida na adição de poli A e na maturação 3' . Mutações dirigidas nesta sequência podem destruir estas funções (Conway and Wickens, 1998 ; Wickens et al., 1987) . No entanto, foi também observado que sequências até 50 a 100 pb 3' relativamente ao sinal poli A putativo são igualmente necessárias; i.e., um gene que tem uma AATAAA normal mas que sofreu substituições ou foi destruído a jusante não é correctamente poliadenilado (Gil and Proudfoot, 1984; Sadofsky and Alwine, 1984; McDevitt et al. , 194). Ou seja, o próprio sinal poli A não é suficiente para um processamento completo e adequado. Não é ainda conhecido quais as sequências específicas a jusante que são necessárias para além do sinal poli A, ou se existe uma sequência específica que possui esta função. Assim, a análise de sequências pode apenas identificar potenciais sinais poli A. 156 ΡΕ1040192

Nos mRNAs naturais que são normalmente poliadeni-lados, foi observado que através da destruição deste processo, pela alteração do sinal poli A ou de outras sequências no mRNA, podem ser obtidos efeitos profundos ao nivel do mRNA funcional. Isto foi observado em vários mRNAs naturais, com resultados que até agora são específicos dos genes.

Foi demonstrado que nos mRNAs naturais a poliadenilação correcta é importante na acumulação de mRNA e a destruição deste processo pode afectar significativamente os níveis de mRNA. No entanto, não temos conhecimento suficiente para prever o efeito de alterações num gene normal. Num gene heterólogo, é ainda mais difícil prever as consequências. No entanto, é possível que os locais putativos identificados sejam disfuncionais. Ou seja, estes locais podem não actuar como locais poli A correctos. Ou seja, estes locais podem não actuar como locais poli A adequados, mas funcionarem como locais aberrantes que dão origem a mRNAs instáveis.

Em todos os sistemas celulares animais, AATAAA é de longe o sinal mais vulgarmente identificado em mRNAs a montante do poli A, mas pelo menos quatro variantes foram também encontradas (Wickens and Stephenson, 1984) . Nas plantas não foi feita análise tão extensa, mas é claro que múltiplas sequências semelhantes a AATAAA podem ser usadas. Os locais vegetais na Tabela 5 designados por "maior" e "menor" referem-se apenas ao estudo de Dean et al., (1986) que analisaram apenas três tipos de genes vegetais. A 157 ΡΕ1040192 designação de locais de poliadenilação como "maior" e "menor" refere-se apenas à frequência da sua ocorrência como locais funcionais em genes naturais que foram analisados. No caso das plantas esta é uma base de dados muito limitada. É difícil prever com certeza que um local designado maior ou menor funcione parcial ou completamente quando encontrados num gene heterólogo como os codificadores das proteínas do cristal do presente invento.

Tabela 5

Locais de Poliadenilação nos Genes Vegetais PA AATAAA Local de consenso maior PIA AATAAT Local vegetal maior P2A AACCAA Local vegetal menor P3A ATATAA 11 P4A AATCAA 11 P5A ATACTA 11 P6A ATAAAA 11 P7A ATGAAA 11 P8A AAGCAT 11 P9A ATTAAT 11 Pl OA ATACAT 11 PI IA AAAATA 11 P12A ATTAAA Local animal menor P13A AATTAA 11 P14A AATACA 11 P15A CATAAA 11 158 ΡΕ1040192 0 presente invento proporciona um método para a preparação de genes vegetais sintéticos que expressam o seu produto proteico em niveis significativamente superiores aos genes selvagens, que têm até aqui sido normalmente empregues na transformação de plantas. Num outro aspecto, o presente invento também proporciona novos genes vegetais sintéticos que codificam proteínas não vegetais.

Como descrito atrás, a expressão de genes de B. thuringiensis nativos em plantas é muitas vezes problemática. A natureza das sequências codificadoras dos genes de B. thuringiensis distingue-as dos genes vegetais assim como de muitos outros genes heterólogos expressos em plantas. Em particular, os genes de B. thuringiensis são muito ricos (-62%) em adenina (A) e timina (T) , enquanto que os genes vegetais e a maior parte dos genes bacterianos que foram expressos em plantas têm na ordem de 45-55% A+T.

Devido à degenerescência do código genético e ao número limitado de escolhas de codões para qualquer aminoácido, a maior parte do "excesso" de A+T das sequências codificadoras estruturais de algumas espécies de Bacillus é encontrada na terceira posição dos codões. Ou seja, os genes de algumas espécies de Bacillus possuem A ou T como terceiro nucleótido em muitos codões. Assim o teor A+T, em parte, pode determinar o enviesamento da utilização de codões. Ainda, é óbvio que os genes evoluem para uma 159 ΡΕ1040192 função óptima no organismo em que estão a evoluir. Isto significa que as sequências nucleotidicas particulares encontradas num gene de um organismo, onde podem não desempenhar qualquer papel excepto codificar um segmento particular de aminoácidos, têm o potencial de ser reconhecidos como elementos de controlo do gene num outro organismo (como sejam promotores ou terminadores da transcrição, locais de adição de poliA, locais de "splicing" de intrões ou sinais de degradação de mRNA específicos) . É talvez surpreendente que tais sinais mal lidos não sejam uma característica comum da expressão de genes heterólogos, mas isto pode ser explicado, em parte, pelo teor A+T relativamente homogéneo (-50%) de muitos organismos. Este teor A+T mais a natureza do código genético coloca restrições na probabilidade de ocorrência de qualquer sequência oligonucleotídica particular. Assim, um gene de E. coli com um teor de A+T de 50% tem menos probabilidade de possuir qualquer segmento rico em A+T particular do que um gene de B. thuringiensis.

Tipicamente, para se obter um nível elevado de expressão dos genes de δ-endotoxinas em plantas, sequências codificadoras estruturais ("gene estrutural") existentes que codificam a δ-endotoxina são modificadas através da remoção de sequências ATTTA e de sinais de poliadenilação putativos por mutagénese dirigida do DNA compreendendo o gene estrutural. Prefere-se que substancialmente todos os sinais de poliadenilação e sequências ATTTA sejam 160 ΡΕ1040192 removidos, se bem que sejam observados níveis de expressão elevados apenas com a remoção parcial das sequências atrás identificadas. Como alternativa, se for preparado um gene sintético que codifique a expressão da proteína com interesse, são seleccionados codões de forma a evitar a sequência ATTTA e sinais de poliadenilação putativos. Para fins do presente invento os sinais de poliadenilação putativos incluem, mas não estão necessariamente limitados a AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA e CATAAA. Na substituição das sequências ATTTA e sinais de poliadenilação, são de preferência utilizados codões que evitem os codões raramente encontrados nos genomas vegetais. A sequência de DNA seleccionada é varrida para identificar regiões com mais de quatro nucleótidos consecutivos de adenina (A) ou timina (T) . As regiões A+T são varridas relativamente a potenciais sinais de poliadenilação vegetais. Se bem que a ausência de cinco ou mais nucleótidos consecutivos A ou T elimine a maior parte dos sinais de poliadenilação, caso exista mais de um dos dos sinais de poliadenilação menor identificados num espaço de dez nucleótidos de distância então a sequência de nucleótidos desta região é de preferência alterada para remover estes sinais, mantendo ao mesmo tempo a sequência de aminoácidos original codificada. 161 ΡΕ1040192 0 segundo passo é considerar os cerca de 15 a cerca de 30 ou mais resíduos de nucleótidos na vizinhança da região rica em A+T identificada no passo um. Se o teor A+T da região envolvente for inferior a 80%, a região deverá ser examinada relativamente a sinais de poliade-nilação. A alteração da região baseada em sinais de poli-adenilação está dependente de (1) número dos sinais de poliadenilação presentes e (2) presença de um sinal de poliadenilação vegetal maior. A região prolongada é analisada relativamente à presença de sinais de poliadenilação vegetais. Os sinais de poliadenilação foram removidos por mutagénese dirigida da sequência de DNA. A região prolongada é igualmente avaliada relativamente a múltiplas cópias da sequência ATTTA que são igualmente removidas por mutagénese. É igualmente preferido que as regiões compreendendo muitas bases A+T ou G+C consecutivas sejam destruídas uma vez que se prevê que estas regiões possuam uma maior probabilidade de formar estruturas em gancho de cabelo devido a autocomplementaridade. Assim, a inserção de pares de bases heterogéneos poderá reduzir a probabilidade de formação de estruturas secundárias por autocomplementaridade que se sabe inibirem a transcrição e/ou tradução nalguns organismos. Na maior parte dos casos, os efeitos adversos podem ser minimizados usando sequências que não contenham mais de cinco A+T ou G+C. 162 ΡΕ1040192 4.11.5 Oligonucleótidos Sintéticos para Mmdtagénese

Quando se usa oligonucleótidos na mutagénese, pretende-se manter a seguência de aminoácidos na grelha de leitura adequada, sem introdução de locais de restrição comuns tais como BglII, HindIII, Saci, Kpnl, EcoRI, Ncol, PstI e Sall no gene modificado. Estes locais de restrição são encontrados em locais de inserção de poli-adaptadores de muitos vectores de clonagem. Certamente, a introdução de novos sinais de poliadenilação, sequências ATTTA ou segmentos consecutivos de mais de cinco A+T ou G+C, deverá ser evitada. 0 tamanho preferido dos oligonucleótidos é cerca de 40 a 50 bases, mas fragmentos variando entre cerca de 18 e cerca de 100 bases têm sido utilizados. Na maior parte dos casos, um mínimo de cerca de 5 a cerca de 8 pares de bases de homologia com o DNA matriz em ambos os extremos do fragmento sintetizado são mantidos para assegurar a hibridação adequada da sequência iniciadora com a matriz. Os oligonucleótidos deverão evitar sequências com mais de cinco pares de bases A+T ou G+C. Os codões usados na substituição dos codões selvagem deverão, de preferência, evitar o dubleto TA ou CG sempre que possível. Os codões são seleccionados de uma tabela de codões preferidos das plantas (como seja a Tabela 6 abaixo) de forma a evitar que sejam raramente encontrados nos genomas vegetais e deverão ser feitos esforços para seleccionar codões para se ajustarem ao teor G+C de aproximadamente 50%. ΡΕ1040192 163

Tabela 6

Utilização de Codões Preferida em Plantas

Aminoácido Codao Percentagem de utilização em plantas ARG CGA 7 CGC 11 CGG 5 CGU 25 AGA 29 AGG 23 LEU CUA 8 CUC 20 CUG 10 CUU 28 UUA 5 UUG 30 SER UCA 14 UCC 26 UCG 3 UCU 21 AGC 21 AGU 15 TRE ACA 21 ACC 41 ACG 7 ACU 31 ΡΕ1040192 164

Tabela 6 (Continuação)

Aminoácido Codão Percentagem de utilização em plantas PRO CCA 45 CCC 19 CCG 9 CCU 26 ALA GCA 23 GCC 32 GCG 3 GCU 41 GLI GGA 32 GGC 20 GGG 11 GGU 37 ILE AUA 12 AUC 45 AUU 43 VAL GUA 9 GUC 20 GUG 28 GUU 43 LIS AAA 36 AAG 64 ASN AAC 72 AAU 28 GLN CAA 64 CAG 36 165 ΡΕ1040192

Tabela 6 (Continuação)

Aminoácido Codão Percentagem de utilização em plantas HIS CAC 65 CAU 35 GLU GAA 48 GAG 52 ASP GAC 48 GAU 52 TIR UAC 68 UAU 32 CIS UGC 78 UGU 22 FEN UUC 56 UUU 44 MET AUG 100 TRP UGG 100

Prevê-se que as regiões com muitas bases A+T ou G+C consecutivas possuam uma maior probablidade de formar estruturas em gancho de cabelo devido a autocomple-mentaridade. A disrupção destas regiões através da inserção de pares de bases heterogéneas é preferida e deverá reduzir a probabilidade da formação de estruturas secundárias autocomplementares tais como ganchos de cabelo que são conhecidas nalguns organismos como inibindo a transcrição (terminadores da transcrição) e tradução (atenuadores). 166 ΡΕ1040192

Como alternativa, pode ser preparado um gene totalmente sintético para uma determinada sequência de aminoácidos sendo evitadas regiões de cinco ou mais nucle-ótidos A+T ou G+C consecutivos. São seleccionados, sempre que possível, codões evitando os dubletos TA e CG nos codões. A utilização de codões pode ser normalizada face a uma tabela de utilização de codões preferidos de plantas (como seja a Tabela 6) e o teor G+C de preferência é ajustado a cerca de 50%. A sequência resultante deverá ser analisada para assegurar que existe o mínimo possível de sinais de poliadenilação vegetais putativos e sequências ATTTA. Os locais de restrição normalmente encontrados nos vectores de clonagem deverão ser preferencialmente evitados. No entanto, a colocação de vários locais de restrição únicos ao longo do gene é útil para a análise da expressão de genes ou construção de variantes dos genes. 4.11.6 Construções de Genes "Plantizados" A expressão de um gene vegetal que exista na forma de DNA de cadeia dupla envolve a transcrição de RNA mensageiro (mRNA) a partir de uma cadeia do DNA pela enzima RNA polimerase e o subsequente processamento do transcrito primário de mRNA dentro do núcleo. Este processamento envolve uma região não traduzida 3' que adiciona nucleó-tidos poliadenilados ao extremo 3' do RNA. A transcrição de DNA em mRNA é regulada por uma região de DNA geralmente referida como "promotor". A região do promotor contem uma sequência de bases que sinaliza a RNA polimerase para se 167 ΡΕ1040192 associar ao DNA e iniciar a transcrição de mRNA usando uma das cadeias de DNA como matriz para produzir uma cadeia correspondente de RNA.

Uma série de promotores que são activos em células vegetais têm sido descritos na literatura. Estes incluem os promotores da nopalina sintetase (NOS) e octo-pina sintetase (OCS) (os quais existem em plasmídeos indutores de tumores de Agrobacterium tumefaciens), os promotores 19S e 35S do virus do mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor induzido pela luz da subunidade pequena da ribulose bi-fosfato carboxilase (ssRUBISCO, um polipeptideo vegetal muito abundante) e o promotor da manopina sintetase (MAS) (Velten et al., 1984 e Velten and Schell, 1985). Todos estes promotores têm sido usados para criar vários tipos de construções de DNA, as quais têm sido expressas em plantas (ver, e.g., Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 84/02913).

Os promotores que causam a transcrição de RNA em células vegetais podem ser usados no presente invento. Tais promotores podem ser obtidos a partir de plantas ou de virus de plantas e incluem, mas não estão limitados ao promotor CaMV35S e a promotores isolados a partir de genes vegetais tais como genes ssRUBISCO. Conforme descrito abaixo, prefere-se que o promotor particular seleccionado seja capaz de causar expressão suficiente de forma a resultar na produção de uma quantidade eficaz de proteína. ΡΕ1040192

Os promotores usados nas construções de DNA (i.e. genes vegetais quiméricos) do presente invento podem ser modificados, caso se pretenda, para alterar as caracte-rísticas de controlo. Por exemplo, o promotor CaMV35S pode ser ligado à porção do gene ssRUBISCO que reprime expressão de ssRUBISCO na ausência de luz, para criar promotor que seja activo nas folhas mas não nas raízes. 0 promotor quimérico resultante pode ser usado como aqui descrito. Para fins desta descrição, o termo promotor "CaMV35S" inclui assim variações do promotor CaMV35S, e.g., promotores obtidos através da ligação a regiões do operador, mutagénese ao acaso ou controlada, etc. Ainda, os promotores podem ser alterados de forma a conterem múltiplas "sequências estimuladoras" para ajudar ao aumento da expressão génica. 0 RN A produzido por uma construção de DNA do presente invento também contem uma sequência líder 5' não traduzida. Esta sequência pode ser obtida a partir de uma promotor seleccionado de forma a expressar o gene e pode ser especificamente modificada de forma a aumentar a tradução do mRNA. As regiões não traduzidas 5' podem ser igualmente obtidas a partir do RNA virai, a partir de genes eucarióticos adequados ou a partir de uma sequência de gene sintético. 0 presente invento não está limitado a construções como as apresentadas nos exemplos que se seguem. Assim, a sequência líder não traduzida pode ser parte do extremo 5' da região não traduzida da sequência codificadora da proteína da cápside virai ou parte da 169 ΡΕ1040192 sequência do promotor, ou pode derivar de um promotor ou sequência codificadora não relacionada. Em qualquer dos casos, prefere-se que a sequência flanqueante do local de iniciação esteja de acordo com as reqras de sequências de consenso da tradução descritas por Kozak (1984) para uma maior eficácia de iniciação da tradução.

As construções de DNA cry do presente invento podem também conter uma ou mais sequências codificadoras estruturais totalmente sintéticas que foram alteradas para estimular o desempenho do gene cry em plantas. Os genes estruturais do presente invento podem facultativamente codificar uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo amino-terminal de trânsito para o cloroplasto ou sequência sinal secretória. A construção de DNA também contem uma região não traduzida 3'. A região 3' não traduzida contem um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleótidos de poliadenilato ao extremo 3' do RNA virai. São exemplos de regiões 3' adequadas (1) as regiões transcritas 3' não traduzidas contendo o sinal de poliadenilação dos genes do plasmídeo indutor de tumores (Ti) de Agrobacterium, tais como o gene da nopalina sintetase (NOS) e (2) gene vegetais, como sejam genes da proteína de armazenamento da soja (7 S) e a subunidade pequena do gene RuBP carboxilase (E9). 170 ΡΕ1040192 4.12 Métodos para a Produção de Plantas Transgénicas Resistentes a Insectos

Através da transformação de uma célula hospedeira adequada, como seja uma célula vegetal, com um segmento contendo o gene cry* recombinante, a expressão da proteína do cristal codificada (i.e., uma proteína do cristal bacteriana ou polipeptídeo tendo actividade insecticida contra coleópteros) pode resultar na formação de plantas resistentes a insectos.

Como exemplo, pode-se utilizar um vector de expressão contendo uma região codificadora de uma proteína do cristal de B. thuringiensis e uma marca seleccionável adequada para transformar uma suspensão de células vegetais embrionárias, como sejam células de trigo ou milho, usando um método como seja o bombardeamento de partículas (Maddock et ai., 1991; Vasil et ai., 1992) para introduzir nas células recipientes o DNA que reveste microprojécteis. As plantas transgénicas são então regeneradas a partir de calos embrionários transformados que expressam as proteínas insecticidas. A formação de plantas transgénicas pode também ser conseguida usando outros métodos de transformação celular que são conhecidos na técnica, como seja transferência de DNA mediada por Agrobacterium (Fraley et al., 1983) . Como alternativa, o DNA pode ser introduzido em plantas por transferência de DNA directa em pólen (Zhou et 171 ΡΕ1040192 al., 1983; Hess, 1987; Luo et al., 1988), por injecção do DNA em órgãos reprodutores de uma planta (Pena et al., 1987) ou por injecção directa do DNA nas células de embriões imaturos seguido de re-hidratação dos embriões desidratados (Neuhaus et al. , 1987; Benbrook et al., 1986). A regeneração, desenvolvimento e cultura de plantas a partir de transformantes isolados de protoplastos vegetais ou a partir de vários explantes transformados são conhecidos na técnica (Weissbach and Weissbach, 1988) . Este processo de regeneração e crescimento tipicamente inclui os passos de selecção das células transformadas, cultura das células individualizadas através das fases usuais do desenvolvimento embrionário, através da fase de plântula com raiz. Os embriões e sementes transgénicos são regenerados de forma semelhante. Os rebentos transgénicos com raiz resultantes são depois plantados num meio de crescimento de plantas adequado, como seja o solo. 0 desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o gene exógeno estranho que codifica um polipeptídeo com interesse introduzido por Agrobacterium em explantes de folhas pode ser conseguido pelos métodos conhecidos na técnica e como descritos (Horsch et al., 1985). Neste processo, os transformantes são cultivados na presença de um agente de selecção e num meio que induza a regeneração de rebentos na estirpe vegetal a ser transformada como descrito (Fraley et al., 1983). 172 ΡΕ1040192

Este procedimento tipicamente produz rebentos dentro de dois a quatro meses e esses rebentos são então transferidos para um meio indutor de raízes adequado contendo o agente selectivo e um antibiótico para evitar o crescimento bacteriano. Os rebentos que enraizarem na presença do agente selectivo para formar plântulas são então transplantados para o solo ou outros meios para permitir a produção de raízes. Estes processo varia dependendo da estirpe vegetal particular empregue, tais variações sendo conhecidas na técnica.

De preferência, as plantas regeneradas são auto-polinizadas para proporcionar plantas transgénicas homozi-góticas, como discutido anteriormente. Como alternativa, pólen obtido a partir de plantas regeneradas é cruzado com plantas crescidas a partir de sementes de linhas importantes em termos agronómicos e, de preferência, singe-neicas. Pelo contrário, pólen de plantas dessas linhas importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgénica do presente invento contendo um poli-peptídeo pretendido é cultivada usando métodos bem conhecidos dos familiarizados com a técnica.

Tais plantas podem formar células germinais e transmitir uma ou mais características transformadas para as plantas da progénie. Igualmente, as plantas transgénicas podem ser crescidas de forma normal e cruzadas com plantas que possuem os mesmos factores hereditários transformados ou outros factores hereditários. Os indivíduos híbridos 173 ΡΕ1040192 resultantes possuem as propriedades fenotípicas correspondentes. Uma planta transgénica deste invento tem assim uma maior quantidade de uma região codificadora (e.g., um gene cry alterado) que codifica o polipeptídeo Cry mutado com interesse. Uma planta transgénica preferida é um segregante independente e pode transmitir aquele gene e a sua acti-vidade à sua progénie. Uma planta transgénica mais preferida é homozigótica para aquele gene e transmite o gene a toda a descendência na reprodução sexuada.

As sementes de uma planta transgénicas podem ser semeadas no campo ou numa estufa e as plantas transgénicas sexualmente maduras resultantes são auto-polinizadas para gerar plantas homozigóticas. A progénie derivada destas plantas tornam-se linhas homozigóticas que, por exemplo, são avaliadas relativamente a uma maior capacidade insec-ticida contra insectos coleópteros, de preferência no campo, numa série de condições ambientais. Os inventores consideram que o presente invento encontrará utilidade particularmente na criação de plantas transgénicas de interesse comercial incluindo várias forragens, cereais, fibras, tubérculos,legumes, plantas ornamentais, cactos, suculentas, frutos, bagas e vegetais, assim como uma série de árvores e plantas de nozes e frutos. 4.13 Métodos para a Produção de Variantes Combinatórias Cry3*

Mutantes de proteínas do cristal contendo substituições num ou mais domínios podem ser construídos via uma 174 ΡΕ1040192 série de técnicas. Por exemplo, sequências de genes estreitamente relacionados podem ser facilmente combinadas usando a técnica baseada em PCR™ descrita por Stemmer (1994). Como alternativa, se estiverem disponíveis locais de restrição adequados, as mutações de um gene cry podem ser combinadas com as mutações de um segundo gene cry através de metodologias de suclonagem de rotina. Se não houver disponível um local de restrição, pode-se gerar um por mutagénese dirigida com oligonucleótidos usando qualquer um de uma série de processos conhecidos dos familiarizados com a matéria. Como alternativa, o PCR™ com extensão sobre-ponível aos locais de "splicing"(Horton et al., 1989) pode ser usado para combinar mutações em diferentes regiões de uma proteína do cristal. Neste processo, fragmentos de DNA sobreponíveis gerados por PCR™ e contendo diferentes mutações dentro das suas sequências únicas podem ser emparelhados e usados como matriz para a amplificação usando sequências iniciadoras flanqueantes para gerar uma sequência híbrida do gene. Finalmente, os mutantes cry* podem ser combinados usando simplesmente um mutante cry como matriz para a mutagénese dirigida com oligonucleótidos usando qualquer um de uma série de protocolos, tais como os aqui descritos. 4.14 Isolamento de Genes Homólogos e de Fragmentos de Genes

Os genes de δ-endotoxinas de acordo com o presente invento incluem não só as sequências de tamanho completo aqui descritas como também fragmentos destas sequên- 175 ΡΕ1040192 cias, ou proteínas de fusão, as quais retêm a actividade insecticida característica das sequências aqui especifi-camente exemplificadas.

Deverá ser óbvio para os familiarizados com a matéria que as δ-endotoxinas insecticidas podem ser identificadas e obtidas através de vários meios. Os genes específicos, ou porções dos mesmos, podem ser obtidos a partir de uma depositário de culturas ou construídos sinteticamente, por exemplo, usando um sintetizador de DNA. As variações destes genes podem ser facilmente construídas usando técnicas convencionais para obtenção de mutações pontuais. Igualmente, fragmentos destes genes podem ser preparados usando exonucleases ou endonucleases de acordo com processos convencionais. Por exemplo, enzimas tais como .Ba 131 ou mutagénese dirigida podem ser usadas para sistematicamente cortar nucleótidos dos extremos destes genes. Igualmente, genes que codificam fragmentos activos podem ser obtidos usando uma variedade de outras enzimas de restrição. As proteases podem ser usadas directamente para se obter fragmentos activos destas δ-endotoxinas. δ-Endotoxinas equivalentes e/ou genes codificadores destas δ-endotoxinas equivalentes podem ser igualmente isolados a partir de estirpes de Bacillus e/ou bibliotecas de DNA usando os ensinamentos aqui proporcionados. Por exemplo, anticorpos contra as δ-endotoxinas aqui descritas e reivindicadas podem ser usados para identificar e isolar outras δ-endotoxinas a partir de uma 176 ΡΕ1040192 mistura de proteínas. Especificamente, podem ser induzidos anticorpos contra porções das δ-endotoxinas que são mais constantes e mais distintas relativamente a outras δ-endotoxinas de B. thuringiensis. Estes anticorpos podem então ser usados para identificar especificamente δ-endotoxinas equivalentes com a actividade insecticida característica por imunoprecipitação, imunoensaio com ligação a enzimas (ELISA) ou transferência Western.

Um outro método para a identificação das δ-endotoxinas e genes do presente invento é através da utilização de sondas oligonucleotídicas. Estas sondas são sequências nucleotídicas tendo uma marca detectável. Como é conhecido na técnica, se a molécula sonda e a amostra de ácido nucleico hibridarem formando uma ligação forte entre as duas moléculas, pode-se assumir que a sonda e a amostra são essencialmente idênticas. A marca detectável da sonda proporciona um meio para determinar, de forma conhecida, se a hibridação ocorreu. Tal análise com sondas proporciona um método rápido para a identificação de genes de δ-endotoxinas formicidas do presente invento.

As sequências nucleotídicas que são usadas como sondas de acordo com o invento podem ser sintetizadas através da utilização de um sintetizador de DNA usando processos convencionais. Na utilização dos segmentos nucleotídicos como sondas, a sonda particular é marcada com qualquer marca adequada conhecida dos familiarizados com a matéria, incluindo marcas radioactivas e não radioactivas. 177 ΡΕ1040192

Marcas radioactivas típicas incluem 32P, 125I, 35S ou similares. Uma sonda marcada com um isótopo radioactivo pode ser construída a partir de uma sequência nucleotídica complementar da amostra de DNA por uma reacção de translação de corte ("nick translation") convencional usando DNase e DNA polimerase. A sonda e a amostra podem ser então combinadas numa solução tampão de hibridação e mantidas a uma temperatura adequada até ocorrer empare-lhamento. Em seguida a membrana é lavada para remoção de materiais estranhos, sendo a amostra e as moléculas de sonda ligadas tipicamente detectadas e quantificadas por auto-radiografia e/ou contagem de cintilação líquida.

As marcas não radioactivas incluem, por exemplo, ligandos tais como biotina ou tiroxina, assim como enzimas tais como hidrolases ou peroxidases, ou os vários quimi-oluminescentes tais como luciferina ou compostos fluorescentes tipo fluoresceína e seus derivados. A sonda pode ser marcada em ambos os extremos com diferentes tipos de marcas para facilitar a separação, como, por exemplo, usando uma marca isotópica num extremo e uma marca de biotina no outro extremo. A formação e estabilidade de duplexes depende de complementaridade substancial entre as duas cadeias de um híbrido e, como referido atrás, um certo grau de desempa-relhamento pode ser tolerado. Assim, as sondas do presente invento incluem mutações (simples e múltiplas), deleções, inserções das sequências descritas, e suas combinações, em 178 ΡΕ1040192 que as referidas mutações, inserções e deleções permitem a formação de híbridos estáveis com o polinucleótido alvo com interesse. Mutações, inserções e deleções podem ser produzidas numa determinada sequência polinucleotídica de muitas formas, por métodos normalmente conhecidos dos familiarizados com a matéria, e talvez por outros métodos que se tornaram conhecidos na literatura.

Potenciais variações nas sondas descritas atrás são devidas, em parte, à redundância do código genético. Devido à redundância do código genético, i.e., mais de um tripleto de nucleótidos codificador (codão) pode ser usado para a maior parte dos aminoácidos usados para produzir proteínas. Assim, diferentes sequências de nucleótidos podem codificar o mesmo aminoácido particular. Portanto, as sequências de aminoácidos das δ-endotoxinas e peptídeos de B. thuringiensis podem ser preparadas com sequências nucleotídicas equivalentes codificadoras da mesma sequência de aminoácidos da proteína ou peptídeo. Assim, o presente invento inclui tais sequências nucleotídicas equivalentes. Igualmente, sequências inversas ou complementares são um aspecto do presente invento e podem ser facilmente usadas pelos familiarizados com a matéria. Ainda, foi demonstrado que as proteínas da estrutura e função identificadas podem ser construídas alterando a sequência de aminoácidos, se tais alterações não alterarem a estrutura secundária da proteína (Kaiser and Kzdy, 1984). Assim, o presente invento inclui mutantes da sequência de aminoácidos aqui descrita que não altera a estrutura secundária da proteína, ou se a 179 ΡΕ1040192 estrutura for alterada, a actividade biológica é substancialmente mantida. Ainda, o invento também inclui mutantes de organismos portadores da totalidade ou parte de um gene codificador das δ-endotoxinas do invento. Tais mutantes podem ser preparados por técnicas bem conhecidas dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, a irradiação com UV pode ser usada para preparar mutantes de organismos hospedeiros. Igualmente, tais mutantes podem incluir células asporogéneas que podem também ser preparadas por processos bem conhecidos na técnica. 4.15 Ribozimas

As ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas que clivam as espécies de mRNA. Em determinadas realizações, os inventores consideram a selecção e utilização de ribozimas capazes de clivar os segmentos de RNA do presente invento e a sua utilização para reduzir a actividade dos mRNAs alvo em tipos particulares de células ou tecidos.

Actualmente são conhecidas seis variedades básicas de RNAs enzimáticos naturais. Cada uma delas catalisa a hidrólise de ligações fosfodiéster do RNA in trans (e assim pode clivar outras moléculas de RNA) em condições fisiológicas. Em geral, os ácidos nucleicos enzimáticos actuam ligando-se primeiro a um RNA alvo. Tal ligação ocorre através da porção de ligação ao alvo de um ácido nucleico enzimático, o qual é mantido em estreita proximidade com uma porção enzimática da molécula que actua 180 ΡΕ1040192 de forma a clivar o RNA alvo. Assim, o ácido nucleico enzi-mático reconhece primeiro e depois liga-se a um RNA alvo através de extenso emparelhamento de bases e uma vez ligado ao local correcto, actua enzimaticamente de forma a cortar o RNA alvo. A clivagem estratégica de tal RNA alvo destruirá a sua capacidade para dirigir a síntese de uma proteína codificada. Após um ácido nucleico enzimático se ter ligado e clivado o seu RNA alvo, é libertado do RNA para procurar um outro alvo e pode repetidamente ligar-se e clivar novos alvos. A natureza enzimática de uma ribozima é vantajoso relativamente a muitas tecnologias, como seja a tecnologia "antisense" (em que uma molécula de ácido nucleico simplesmente se liga a um alvo de ácido nucleico para bloquear a sua tradução) uma vez que a concentração de ribozima necessária para afectar um tratamento terapêutico é inferior ao de um oligonucleótido "antisense". Esta vantagem reflecte a capacidade da ribozima actuar enzimaticamente. Assim, uma única molécula de ribozima é capz de clivar muitas moléculas de RNA alvo. Ainda, a ribozima é um inibidor altamente específico, com a especificidade de inibição dependendo não só do mecanismo de emparelhamento de bases da ligação ao RNA alvo, mas também do mecanismo de clivagem do RNA alvo. Os desemparelhamentos isolados ou substituições de bases, perto do local de clivagem podem eliminar completamente a actividade catalítica de uma ribozima. Desemparelhamentos semelhantes em moléculas "antisense" não inibem a sua acção (Woolf et al., 1992). Assim, a especifi- 181 ΡΕ1040192 cidade de acção de uma ribozima é superior à da ligação de uma oligonucleótido "antisense" que se liga ao mesmo local do RNA. A molécula de ácido nucleico enzimático pode ter a forma de uma cabeça de martelo, gancho de cabelo, vírus da hepatite δ, grupo I de intrões ou RNA de RnaseP (em associação com uma sequência guia de RNA) ou motivo de RNA VS de Neurospora. Exemplos de motivos em cabeça de martelo estão descritas por Rossi et ai., (1992); exemplos de motivos em gancho de cabelo estão descritos por Hampel et ai., (Patente Europeia EP 0360257), Hampel and Triz (1989), Hampel et ai., (1990) and Cech et ai., (Patente U.S. 5631359; um exemplo do motivo do vírus da hepatite δ está descrito por Perrotta and Been (1992); um exemplo do motivo RnaseP está descrito por Guerrier-Takada et ai., (1983); o motivo de ribozima de RNA VS de Neurospora está descrito por Collins (Saville and Collins, 1990; Saville and Collins, 1991; Collins and Olive, 1993); e um exemplo do intrão do Grupo I está descrito por Cech et ai., (Patente U.S. 4987071) . Tudo o que é importante numa molécula de ácido nucleico enzimático deste invento é que tenha um local específico de ligação ao substrato que é complementar de uma ou mais das regiões de RNA do gene alvo e que possua sequências nucleotídicas dentro ou na vizinhança do local de ligação ao substrato que confere à molécula uma actividade de clivagem ao RNA. Assim, as construções de ribozima não necessitam de ser limitadas aos motivos específicos aqui referidos. 182 ΡΕ1040192 0 invento proporciona um método para a produção de uma classe de agentes de clivagem enzimática que apresenta um elevado grau de especificidade do RNA de um alvo pretendido. A molécula de ácido nucleico enzimática é, de preferência, dirigida contra uma região altamente conservada da sequência de um mRNA alvo, de forma que o tratamento especifico de uma doença ou condição pode ser proporcionada por um ou mais ácidos nucleicos enzimáticos. Tais moléculas de ácido nucleico enzimáticas podem ser introduzidas exogenamente em células especificas conforme necessário. Como alternativa, as ribozimas podem ser expressas a partir de vectores de DNA ou RNA que são introduzidos em células especificas.

Pequenos motivos de ácido nucleico enzimático (e.g., da estrutura em cabeça de martelo ou em gancho de

cabelo) podem ser usados para introdução exógena. A

estrutura simples destas moléculas aumenta a capacidade do ácido nucleico enzimático para invadir regiões alvo da estrutura do mRNA. Como alternativa, as moléculas de RNA catalíticas podem ser expressas em células a partir de promotores eucarióticos (e.g., Scanlon et ai., 1991; Kashani-Sabet et ai., 1992; Dropulic et ai., 1992; Weerasinghe et ai., 1991; 0jwang et al.t 1992; Chen et al., 1992; Sarver et ai., 1990). Os familiarizados com a matéria compreenderão que qualquer ribozima pode ser expressa em células eucarióticas a partir de um vector de DNA adequado. A actividade de tais ribozimas pode ser aumentada através 183 ΡΕ1040192 da sua libertação do transcrito primário por uma segunda ribozima (Draper et ai., Pedido de Patente Internacional Publ. N° WO 93/23569 e Sullivan et al., Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 94/02595; Ohkawa et al., 1992; Taira et al., 1991; Ventura et al., 1993).

As ribozimas podem ser adicionadas directamente ou podem ser complexadas com lípidos catiónicos, lipidos complexos, encapsidadas dentro de lipossomas ou de outra forma introduzidas nas células alvo. O RNA ou complexos de RNA podem ser localmente administrados a tecidos importantes ex vivo ou In vivo através da injecção, inalação de aerossol, bomba de infusão ou tubos perfurados ("stents"), com ou sem a sua incorporação em biopolímeros.

Podem ser projectadas ribozimas como descrito em Draper et ai. (Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 93/23569) ou Sullivan et ai., (Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 94/02595) e sintetizadas para serem testadas in vitro e in vivo, como descrito. Tais ribozimas podem ser igualmente optimizadas para administração. Se bem que sejam proporcionados exemplos específicos, os familiarizados com a matéria reconhecerão que alvos de RNA equivalentes noutras espécies podem ser utilizados quando necessário.

As ribozimas em cabeça de martelo ou em gancho de cabelo podem ser individualmente analisadas por enrolamento conseguido com ferramentas informáticas (Jaeger et al., 184 ΡΕ1040192 1989) para avaliar se as sequências da ribozima adquirem a estrutura secundária adequada. As ribozimas com interacções intramoleculares desfavoráveis entre os braços de ligação e o centro catalítico não são consideradas. Podem ser escolhidos vários comprimentos do braços de ligação para optimizar a actividade. De um modo geral, pelo menos 5 bases em cada braço são capazes de se ligar ao RNA alvo ou de outra forma interagir com ele.

As ribozimas do motivo em cabeça de martelo ou em gancho de cabelo podem ser projectadas para emparelhar em vários locais no mRNA mensageiro e podem ser sintetizadas quimicamente. 0 método de síntese usado é de acordo com o procedimento normal de síntese de RNA como descrito em Usman et al. (1987) e em Scaringe et al., (1990) e utiliza grupos de protecção e acoplagem de ácidos nucleicos comuns, como sejam dimetoxitritilo no extremo 5' e fosforamidetos no extremo 3'. Os rendimentos médios do passo de acoplagem são tipicamente >98%. As ribozimas em gancho de cabelo podem ser sintetizadas em duas partes e emparelhadas para reconstruir uma ribozima activa (Chowrira and Burke, 1992). As ribozimas podem ser extensivamente modificadas para aumentar a estabilidade através de modificação com grupos resistentes a nucleases, por exemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-o-metil, 2'-H (para uma revisão ver Usman and Cdergren, 1992). As ribozimas podem ainda ser purificadas por electroforese em gel usando métodos gerais ou por cromatografia líquida de alta resolução e ressuspensas em agua. 185 ΡΕ1040192 A actividade de ribozima pode ser optimizada através da alteração do comprimento dos braços de ligação da ribozima ou sintetizando quimicamente as ribozimas com modificações que inibem a sua degradação por ribonucleases séricas (ver, e.g., Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 92/07065; Perrault et al. , 1990; Pieken et al., 1991; Usman and Cedergren, 1992; Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 93/15187; Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 91/03162; Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 92110298.4; Pedido de Patente U.S. 5334711; e Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 94/13688, que descreve várias modificações quimicas que podem ser efectuadas aos grupos de açúcar das moléculas de RNA enzimáticas), modificações que aumentam a sua eficácia nas células, e remoção das bases do "pé" para encurtar o tempo de síntese de RNA e reduzir os requisitos químicos.

Sullivan et al., (Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO94/02595) descreve os métodos gerais para a libertação de moléculas de RNA enzimáticas. As ribozimas podem ser administradas a células através de uma variedade de métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria, incluindo, mas não estando restringido a encapsulação em lipossomas, por iontoforese, ou por incorporação noutros veículos, tais como hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis e microsferas bioadesivas. Para algumas indicações, as ribozimas podem ser directamente libertadas 186 ΡΕ1040192 ex vivo às células ou tecidos com ou sem os referidos veículos. Como alternativa, a combinação RNA/veículo pode ser localmente libertada por inalação directa, por injecção di-recta ou usando um catéter, bomba de infusão ou tubos perfurados. Outras vias de libertação incluem, mas não estão limitadas a injecção intravascular, intramuscular, subcutânea ou articular, inalação de aerossóis, administração oral (forma de comprimido ou pílula), tópica, sistémica, ocular, intraperitoneal e/ou intratecal. Descrições mais detalhadas de libertação e administração de ribozimas são proporcionadas em Sullivan et al., (Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 94/02595) e Draper et al., (Pedido de Patente Internacional Publicação N° WO 93/23569).

Um outro meio de acumular elevadas concentrações de uma ou mais ribozimas dentro das células é incorporar as sequências codificadoras de ribozima num vector de expressão de DNA. A transcrição das sequências de ribozima é dirigida a partir de um promotor eucariótico da RNA polimerase I (poli), RNA polimerase II (pol II) ou RNA polimerase III (pol III). Os transcritos dos promotores pol II ou pol III serão expressos em níveis elevados em todas as células; os níveis de um determinado promotor pol II num determinado tipo celular dependerá da natureza das sequências reguladoras génicas (estimuladores, silenciadores, etc.) presentes na vizinhança. Os promotores de RNA polimerases procarióticas podem também ser usados, desde que a enzima seja expressa nas células adequadas (Elroy-Stein and Moss, 1990; Gao and Huang, 1993; Lieber et al., 187 ΡΕ1040192 1993; Zhou et al., 1990) . As ribozimas expressas a partir de tais promotores podem funcionar em células de mamífero (e.g. Kashani-Saber et al., 1992; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Yu et al., 1993; L'Huillier et al., 1992; Lisziewicz et al., 1993). Tais unidades de transcrição podem ser incorporadas numa variedade de vectores para introdução em células de mamífero, incluindo mas não estando restringido a vectores plasmídicos de DNA, vectores de DNA virai (tais como adenovírus ou vectores adeno-associados) ou vectores de RNA virai (tais como retrovírus, vírus da floresta de Semliki, vectores de vírus Sindbis).

As ribozimas deste invento podem ser usadas como ferramentas de diagnóstico para avaliar a deriva genética e mutações nas linhas celulares ou tipos celulares. Elas podem ser igualmente usadas para avaliar os níveis da molécula de RNA alvo. A estreita relação entre a actividade de ribozima e a estrutura do RNA alvo permite a detecção de mutações em qualquer região da molécula que altere o emparelhamento de bases e a estrutura tridimensional do RNA alvo. Usando as múltiplas ribozimas descritas neste invento, pode-se mapear as alterações de nucleótidos que são importantes para a estrutura de RNA e função in vitro, assim como em células e tecidos. A clivagem de RNAs alvo com ribozimas pode ser usada para inibir a expressão de genes e definir o papel (essencialmente) dos produtos de genes especificados em células ou tipos de células particulares. ΡΕ1040192 5.0 Exemplos

Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar realizações preferidas do invento. Deverá ser apreciado pelos familiarizados com a matéria que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor como funcionando bem na execução do invento, e portanto poderão ser consideradas como constituindo modos preferidos da sua realização. 5.1 Exemplo 1 — Estrutura Tridimensional de Cry3Bb A estrutura tridimensional de Cry3Bb foi determinada por cristalografia de raios X. A cristalização de Cry3Bb e a colheita dos dados de difracção de raios X foram realizados como descrito por Cody et al., (1992) . A estrutura do cristal de Cry3Bb foi refinada para um factor R residual de 18,0% usando os dados colhidos numa resolução de 2,4 Ã. Os cristais pertencem ao grupo espaçador C222i com as dimensões de unidades celulares a = 122,44, b = 131,81 e c = 105,37 Ã e contêm uma molécula na unidade assimétrica. As coordenadas atómicas para Cry3Bb estão descritas no Exemplo 31 e apresentadas na Secção 9. A estrutura de Cry3Bb é semelhante à de Cry3A (Li et al., 1991) . Consiste em 5825 átomos da proteína derivados de 588 resíduos (aminoácidos 64-652) formando três domínios discretos (FIG. 1) . Um total de 251 moléculas de 189 ΡΕ1040192 água foram identificadas na estrutura de Cry3Bb (FIG.2). O domínio 1 (resíduos 64-294) é um feixe de sete hélices formado por seis hélices enroladas à volta de uma hélice central, a5 (FIG.3). Os aminoácidos formadores de cada hélice estão apresentados na FIG.4. 0 domínio 2 (resíduos 295-502) possui três folhas β antiparalelas (FIG. 5A e FIG. 5B) . As folhas 1 e 2, cada uma composta por 4 cadeias β, formam o motivo distinto "chave grega". A superfíce externa da folha 3, composta por 3 cadeias β, faz contacto com a hélice a7 do domínio 1. A FIG. 6 apresenta os aminoácidos constituintes de cada uma das cadeias β no domínio 2. Uma hélice α pequena, a8 que se segue à cadeia βΐ, está também incluído no domínio 2. 0 domínio 3 (resíduos 503-652) tem uma topologia de barril β em forma de chave grega ("jelly roll") que tem um núcleo hidrofóbico e está quase paralelo ao eixo a e perpendicular ao eixo c da malha (FIG. 7A e FIG. 7B). Os aminoácidos constituintes de cada cadeia β do domínio 3 estão apresentados na FIG. 8.

Os monómeros de Cry3Bb no cristal formam uma estrutura quaternária dimérica ao longo de um eixo binário paralelo ao eixo a (FIG. 9A e FIG. 9B). A hélice a6 situa-se numa fenda formada pela interface do domínio 1 e domínios 1 e 3 da molécula de simetria com a qual está relacionada. Existem numerosos contactos estreitos de ligações de hidrogénio ao longo desta superfície, confirmando a estabilidade estrutural do dímero. 190 ΡΕ1040192 5.2 Exemplo 2 - Preparação de Cry3Bb.60 B. thuringiensis EG7231 foi cultivada até à esporulação em meio C2 com selecção por cloranfenicol (Cml). Os sólidos desta cultura foram recuperadas por centrifugação e lavados com água. A toxina foi purificada por recristalização a partir de NaBr 4,0 M (Cody et al., 1992). A Cry3Bb purificada foi solubilizada em 10 ml de KOH 50mM/100 mg de Cry3Bb e tamponado para pH 9,0 com CAPS 100 mM (pH 9,0). A toxina solúvel foi tratada com tripsina numa proporção de 50 mg de toxina para 1 mg de tripsina. Após 20 min de digestão com tripsina, a proteína predominante visualizada por electrforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) tinha 60 KDa. Não se observou subsequente digestão da toxina de 60 KDa. FIG. 4 ilustra Cry3Bb e Cry3Bb.60 coradas por Coomassie após SDS-PAGE. 5.3 Exemplo 3 — Purificação e Sequenciação de Cry3Bb.60

Cry3Bb.60 foi electroforeticamente purificada por SDS-PAGE e electrotransferida para membrana Immobilon-P® (Millipore) por transferência semi-seca a 15V durante 30 min. A membrana foi então lavada duas vezes com água e corada com 0,025% de R-250, 40% de metanol. Para reduzir o fundo, a membrana foi descorada com 50% de metanol até as bandas de proteína coradas serem visíveis. A transferência foi então seca e a banda Cry3Bb.60 corada foi retirada da membrana. Esta banda foi mandada para o Tufts University Sequencing Laboratory (Boston, MA) para sequenciação N- 191 ΡΕ1040192 terminal. A sequência de aminoácidos N-terminal determinada experimentalmente está apresentada na Tabela 7 assim como a sequência de aminoácido conhecida começando no resíduo de aminoácido 160.

Tabela 7

Sequência de Aminoácidos do Extremo N de Cry3Bb.60 e Comparação com a

Sequência Conhecida de Cry3Bb

Sequência deduzida Sequência conhecida Residuo# S S 160 K K 161 R R 162 S S 163 Q Q 164 D D 165 R R 16 6 5.4 Exemplo 4 - Bioactividade de Cry3Bb.60

Cry3Bb foi preparado para bioensaio através da solubilização numa quantidade mínima de KH 50 mM, 10 ml por 100 mg de toxina e tamponado para pH 9,0 com CAPS 100 mM, pH 9,0. Cry3Bb.60 foi preparado como descrito no Exemplo 1. Ambas as preparações foram mantidas à temperatura ambiente 12 a 16 horas antes do bioensaio. Após sete dias a mortalidade da população foi detemrinada e analisada para determinar a concentração letal de cada toxina. Estes resultados estão descritos na Tabela 8. 192 ΡΕ1040192

Tabela δ

Bioactividade de Cry3Bb e Cry3Bb.60 Contra a Lagarta das Raízes do Milho do Sul (Diabiotica undecimpunctata) LC50 mg/alvéolo 95% C.I. Cry3Bb 24, 09 15-39 Cry3Bb.60 6, 72 5,25-8,4 5.5 Exemplo 5 - Formação de Canais Iónicos por Cry3Bb e CryB2.60

Cry3Bb.60 e Cry3Bb foram avaliadas quanto à sua capacidade para formar canais iónicos em bicamadas de lípidos planares. As bicamadas de fosfatidilcolina foram formadas em suportes de Teflon® sobre um buraco de 0,7 mm.

Uma solução de banho de 3,5 ml de KOH 100 mM, CaCl2 10 mM, CAPS 100 mM (pH 9,5) foi colocada de cada um dos lados da partição de Teflon®. A toxina foi adicionada a um lado da partição e uma voltagem de 60 mM foi imposta através da bicamada de fosfatidilcolina. Qualquer fuga de iões através da membrana foi amplificada e registada. Uma análise da frequência das condutâncias criadas por Cry3Bb ou Cry3Bb.60 está ilustrada na FIG. 5A e FIG. 5B. Cry3Bb.60 facilmente formou canais iónicos enquanto que Cry3Bb raramente formou canais. 5.6 Exemplo 6 — Formação de Oligómeros de Alto Peso Molecular

Moléculas individuais de Cry3Bb ou Cry3Bb.60 193 ΡΕ1040192 formam um complexo com uma outra molécula do mesmo tipo. A capacidade de Cry3Bb para formar um oligómero não é aparente de forma reprodutível. A formação do complexo não é repetidamente observada em condições não desnaturantes. Cry3Bb.60 formou uma quantidade significativamente superior de um complexo com um peso molecular mais elevado (> 120 KDa) com outras moléculas Cry3Bb.60. Os oligómeros de Cry3Bb são demonstrados pela intensidade do gel de SDS-poliacrilamida corado com Coomassie. A oligomerização é visualizada em SDS-PAGE quando não se aquece as amostras antes da aplicação no gel para reter alguma toxina não desnaturante. Estes dados sugerem que Cry3Bb.60 mais facilmente forma o complexo de ordem superior do que Cry3Bb sozinho. A oligomerização é igualmente observada através do estudo da condutância produzida por estas moléculas e o aumento da condutância dependente do tempo. Esta alteração na condutância pode ser atribuída à oligomerização da toxina. 5.7 Exemplo 7 — Método de Projecção 1: Identificação e Alteração de Locais Sensíveis a Proteases e Processamento Proteolítico

Foi descrito na literatura que o tratamento da proteína toxina Cry3A com tripsina, uma enzima que cliva proteínas no lado carboxilo dos resíduos de lisina e arginina disponíveis, dá um produto de clivagem estável de 55 KDa a partir da proteína nativa de 67 KDa (Carrol et al., 1989). A sequenciação N-terminal do produto de 55 KDa mostrou que a clivagem ocorre no resíduo de aminoácido 194 ΡΕ1040192 R158. Encontrou-se que a proteína truncada Cry3A retem o mesmo nível de actividade insecticida da proteína nativa. A proteína toxina Cry3Bb foi também tratada com tripsina. Após digestão, o tamanho da proteína diminuiu de 68 KDa, o peso molecular da toxina Cry3Bb nativa, para 60 KDa. Não se observou qualquer outra digestão. A sequenciação N-terminal revelou o local de clivagem da tripsina da toxina truncada (Cry3Bb.60) como sendo o resíduo de aminoácido R159 em 1α3,4 de Cry3Bb. Inesperadamente, observou-se que a bioac-tividade da toxina Cry3Bb truncada aumentou.

Usando este método, a digestão com protease de uma proteína toxina de B. thuringiensis, foi identificado um local proteoliticamente sensível em Cry3Bb e uma forma mais activa da proteína (Cry3Bb.60) foi encontrada. Modificações deste local sensível à proteólise, através da introdução de um local de reconhecimento por proteases adicional, também resultou no isolamento de uma proteína biologicamente mais activa. É igualmente possível que a remoção de um ou mais locais de outros locais sensíveis a proteases pode melhorar a actividade. As regiões proteo-liticamente sensíveis, uma vez identificadas, podem se modificadas ou utilizadas para produzir toxinas biologicamente mais activas. 5.7.1 Cry3Bb. 60 0 tratamento da proteína toxina Cry3Bb solubi-lizada com tripsina resulta no isolamento de uma proteína 195 ΡΕ1040192 toxina Cry3Bb truncada, estável, com um peso molecular de 60 KDa (Cry3Bb.60). A sequenciação N-terminal de Cry3Bb.60 mostra o local sensível à tripsina como sendo R159 em lcx3,4 da toxina nativa. A digestão com tripsina resulta na remoção das hélices 1-3 a partir da Cry3Bb nativa mas igualmente aumenta a actividade da toxina contra larvas de SCRW em aproximadamente quatro vezes.

Cry3Bb.60 é uma toxina única com maior utilização insecticida relativamente a Cry3Bb parental. O aumento da actividade biológica, é apenas um parâmetro que distingue a nova toxina. Para além do tamanho reduzido, Cry3Bb.60 é igualmente uma proteína mais solúvel. Cry3Bb precipita da solução a pH 6,5 enquanto que Cry3Bb.60 permanece em solução desde pH 4,5 até pH 12. Cry3Bb.60 também forma canais iónicos com maior frequência do que Cry3Bb.

Cry3Bb.60 é produzida pela remoção proteolítica dos primeiros 159 reíduos de aminoácidos ou pela produção in vivo desta toxina, por bactérias ou plantas que expressem o gene Cry3Bb.60, ou seja o gene Cry3Bb sem os primeiros 483 nucleótidos.

Resumindo, Cry3Bb.60 é distinto de Cry3Bb de várias formas importantes: maior actividade insecticida; maior gama de solubilidade; maior capacidade; maior capacidade para formar canais; e menor dimensão. 196 ΡΕ1040192 5.7.2 EG11221 A mutagénese semi ao acaso da região 1α3,4 sensível à tripsina de cry3Bb resultou no isolamento de Cry3Bb.11221, uma determinada proteína Cry3Bb que apresenta um aumento superior a 6 vezes na actividade contra larvas SCRW comparativamente com a toxina selvagem. Cry3Bb.11221 tem alterações de 4 aminoácidos na região 1α3,4. Uma destas alterações, L158R, introduz um local adicional para tripsina adjacente a R159, o local proteoliticamente sensível usado para produzir Cry3Bb.60 (exemplo 4.1.). Cry3Bb.11221 é produzido por B. thuringiensis como uma proteína toxina de tamanho completo mas é presumivelmente digerido por proteases do tubo digestivo do insecto para o mesmo tamanho de Cry3Bb.60 (ver os resultados de Cry3A de Carroll et al., 1989). 0 local adicional de reconhecimeno por proteases pode tornar a região 1α3,4 ainda mais sensível à digestão, aumentando assim a actividade. 5.8 Exemplo 8 - Método de Projecção 2: Determinação e Manipulação da Água Ligada

Existem várias formas de as moléculas de água se associarem a uma proteína, incluindo a água de superfície que é facilmente removida e a água ligada que é mais difícil de extrair (Dunitz, 1994; Zhang and Matthews, 1994). A função da água ligada foi sujeita a extrapolação académica significativa, mas a função precisa tem pouca validação experimental. Alguma da água ligada ou estrutural mais 197 ΡΕ1040192 interessante é a água que participa na estrutura da proteína no interior da própria proteína. A ocupação de um local por uma molécula de água pode indicar uma bolsa estável dentro de uma proteína ou menor compactação criada por pontes de sal mediadas por água e ligações de hidrogénio a água. Isto pode reduzir o grau de ligação entre aminoácidos, possivelmente tornando a região mais flexível. Uma sequência de aminoácidos diferente à volta do mesmo local poderá resultar em melhor compactação, colapsando a bolsa à volta de aminoácidos polares ou carregados. Isto pode resultar em menor flexibilidade. Assim, o grau de hidratação de uma região de uma proteína pode determinar a flexibilidade ou mobilidade daquela região e a manipulação da hidratação pode alterar a flexibilidade. Métodos para aumentar a hidratação de uma região exposta a água incluem o aumento do número de resíduos hidrofóbicos ao longo da superfície. Está descrito na literatura que os resíduos hidrofóbicos expostos necessitam de significativamente mais água para hidratar do que os resíduos hidrofílicos (CRC Handbook of Chemistry and Physics, CRC Press, Inc.). No entanto, não está descrito que ao fazer-se isto, possam ser conseguidos aumentos da actividade biológica da proteína. A água estrutural não foi previamente identificada em δ-endotoxinas de B. thuringiensis, incluindo Cry3Bb. Ainda, não existem descrições da função desta água estrutural nas δ-endotoxinas ou toxinas bacterianas. Na análise de Cry3Bb, foi observado que uma colecção de 198 ΡΕ1040192 moléculas de água estão situadas à volta de 1α3,4, um local definido pelos inventores igualmente importante para o aumento da bioactividade. A ansa da região a3,4 está exposta na superfície e pode definir uma charneira na proteína permitindo a sua remoção ou movimento das três primeiras hélices do domínio 1. A hidratação encontrada à volta desta região pode conferir flexibilidade e mobilidade a esta ansa. A observação da água estrutural no local 1α3,4 proporcionou uma ferramenta analítica para posterior análise da estrutura. Se este local importante estiver rodeado pela água, então outros locais importantes podem também estar completamente ou parcialmente rodeados por água. Usando esta perspectiva, foi então identificada água estrutural a rodear as hélices 5 e 6. Esta água estrutural forma uma coluna ao longo da proteína, separando eficazmente as hélices 5 e 6 do resto da molécula. As estruturas de Cry3A e Cry3b sugerem que as hélices 5 e 6 estão altamente associadas, ligadas uma à outra por intereacções de Van der Waals. Por si só a hélice 5 de Cry3A, apesar de insuficiente para actividade biológica, foi demonstrado ter capacidade para formar canais iónicos numa membrana artificial (Gazit and Shai, 1993). Os canais iónicos formados pela hélice 5 são 10 vezes mais pequenos do que os canais da toxina de tamanho completo sugerindo que significativamente mais estrutura de toxina é necessária para os canais iónicos de tamanho completo. Em Cry3Bb, observou-se que a hélice 5, como parte de um conjunto de hélices a (domínio 1), forma canais iónicos (Von Tersch et al., 1994). Observações experimentais não publicadas pelos inventores demonstram que a hélice 6 também atravessa a 199 ΡΕ1040192 membrana biológica. Assim as hélices 5 e 6 são as hélices formadoras de canais putativos necessários para a toxicidade. A hidratação à volta destas hélices pode indicar que a flexibilidade desta região é necessária para a toxicidade. Pensamos que se for possível aumentar a hidratação à volta das hélices 5 e 6, poder-se-á criar uma melhor proteína toxina. No entanto, há que ter cuidado em evitar a criação de superfícies hidrofóbicas contínuas entre as hélices 5-6 e qualquer outra parte da proteína que poderão, por interacções hidrofóbicas, actuar para restringir o movimento de hélices móveis. A mobilidade das hélices 5 e 6 podem também depender da flexibilidade das ansas que lhes estão associadas, assim como doutras regiões da molécula Cry3Bb, particularmente no domínio 1, que pode sofrer alterações conformacionais para permitir a inserção das 2 hélices na membrana. A alteração da hidratação destas regiões da proteína pode também afectar a sua bioactividade. 5.8.1 Cry3Bb. 11032

Uma colecção de resíduos de água ligados indicou a relativa flexibilidade da região 1α3,4. A flexibilidade desta ansa pode ser aumentada através do aumento da hidratação da região ao substituir-se resíduos relativamente hidrofóbicos pelos resíduos hidrofílicos expostos. Um exemplo de uma proteína projectada melhorada tendo este tipo de substituição é Cry3Bb.11032. Cry3Bb.11032 tem 200 ΡΕ1040192 alteração do aminoácido D165G; glicina é mais hidrofóbica do que aspartato (escala de hidrofobicidade de Kyte and Doolittle de -0,4 vs -3,5 para aspartato). Cry3Bb.11032 é aproximadamente 3 vezes mais activo do que Cry3Bb selvagem. 5.8.2 Cry3Bb. 11051

Para aumentar a hidratação da região 1α4,5 de

Cry3Bb, glicina foi substituída na superfície exposta pelo resíduo K189. A glicina é mais hidrofóbica do que a lisina (escala de hidrofobicidade de Kyte and Doolittle de -0,4 vs -3,9 para lisina) e pode resultar num aumento da água ligada. 0 aumento da água ligada pode conferir maior flexi-ilidade à região da ansa que precede a hélice formadora de canais, a5. A proteína projectada Cry3Bb com a alteração K189G, Cry3Bb.11051, apresenta um aumento de 3 vezes na actividade comparativamente com Cry3Bb selvagem. 5.8.3 Alterações para La7,pi (Cry3Bb. 11241 e 11242)

As alterações de aminoácidos feitas na ansa exposta na superfície que liga a hélice α 7 e a cadeia β 1 (1α7,β1) resultou na identificação de 2 proteínas Cry3Bb alteradas. Com bioactividades aumentadas, Cry3Bb.11241 e Cry3Bb.11242. A análise do índice de hidropatia de 2 destas proteínas ao longo da sequência de 20 aminoácidos de 281 a 300 inclusive da região 1α7,β1, revelou que as substituiões de aminoácidos nestas proteínas tornaram a região 1α7, Pi muito mais hidrofóbica. O grau médio do valor de hidropatia (GRAVY) foi determinado para cada uma das sequências 201 ΡΕ1040192 proteicas usando o programa informático de análise de sequências proteicas PC/GENE® (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, CA, publicação 6.85), SOAP e um intervalo de 7 aminoácidos. O aumento de hidrofobicidade da região 1α7,β1 para cada proteina pode aumentar a hidratação da ansa e, portanto, a flexibilidade. As proteínas alteradas, as suas respectivas alterações de aminoácidos, o número de vezes do aumento da bioactividade selvagem e os valores de GRAVY estão apresentados na Tabela 9.

Tabela 9

Valores de HIdropatia para a Região loí.7 , βΐ de Cry3Bb e 2 Proteínas Cry3Bb Alteradas com Bioactividade SCRW Aumentada

Proteína Cry3Bb* Alterações de aminoácidos Número de vezes do to da bioactividade vamente à proteína aumen- relati- selvagem GRAVY (aminoácidos 305-324) Selvagem - - 4, 50 Cry3Bb.11241 Y287F,D288N,R290L 2, 6x 10,70 Cry3Bb.11242 R290V 2, 5x 8, 85 5.8.4 Alterações para ίαΐ,βδ (Cry3Bb. 11228, Cry3Bb. 11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb. 11238 e Cry3Bb. 11239) A ansa exposta na superfície entre a cadeia β 1 e a hélice α 8 (1α1,β8) define a fronteira entre os domínios 1 e 2 de Cry3Bb. A introdução de alterações de aminoácidos semi ao acaso nesta região resultou na identificação de várias proteínas Cry3Bb alteradas com maior bioactividade. 202 ΡΕ1040192 A análise do índice de hidropatia das substituições de aminoácidos encontradas nas proteínas alteradas mostra que as alterações tornaram a região exposta mais hidrofóbica, o que resulta num aumento de hidratação e flexibilidade. A Tabela 10 apresenta as proteínas alteradas, as suas respectivas alterações de aminoácidos e o número de vezes de aumento relativamente a Cry3Bb selvagem e o grau médio do valor de hidropatia (GRAVY) determindo através do programa informático de análise de sequências proteicas PC|GENE® (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, CA, publicação 6.85), SOAP, ao longo da sequência de 20 aminoácidos 305-324 inclusive de Ιαί,βδ, usando um intervalo de 7 aminoácidos.

Tabela 10

Valores de Hidropatia para a Região lcx7 , βΐ de Cry3Bb e 2 Proteínas Cry3Bb Projectadas com Bioactividade SCRW Aaumentada

Proteína Cry3Bb* Alterações de aminoácidos Número de vezes do da bioactividade vamente à proteína aumento relati- selvagem GRAVY (aminoácidos 281-300) Selvagem - - 0,85 Cry3Bb.11228 S311L,N313T,E317K 4, lx 4,35 Cry3Bb.11229 S311T,E317K,Y318C 2,5x 2,60 Cry3Bb.11230 S311A,L312V,Q316W 4,7x 3,65 Cry3Bb.11233 S311A,Q316D 2,2x 2,15 Cry3Bb.11236 S311I 3, lx 3,50 Cry3Bb.11237 S311I,N313H 5, 4x 3, 65 Cry3Bb.11238 N313V,T314N, 2,6x 9, 85 Q316M,E317V Cry3Bb.11239 N313R,L315P, 2,8x 3, 95

Q316L,E317A 203 ΡΕ1040192 5.8.5 Cry3Bb. 11227, Cry3Bb. 11241 e Cry3Bb. 11242 O aminoácido Q238, situado na hélice 6 de Cry3Bb, foi identificado como um resíduo que, pelo seu grande tamanho e ligação de hidrogénio a R290, bloqueia a hidratação completa do espaço entre a hélice 6 e a hélice 4. A substituição de R290 com aminoácidos que não formam ligações de hidrogénio, ou que possuem cadeias laterais que não podem abranger a distância física à ligação de hidrogénio com Q238, pode resultar num aumento da hidratação à volta de Q238. Q238, incapaz de se ligar através de pontes de hidrogénio a R290, pode não se ligar a água. Isto pode aumentar a flexibilidade da região de formação de canais iónicos. As proteínas projectadas Cry3Bb.ll27 (R290N), Cry3Bb.11241 (R290L) e Cry3Bb.11242 (R290V) apresentam aumentos de actividade de aproximadamente 2 vezes, 2,6 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, contra larvas SCRW comparativamente com a selvagem. 5.9 Exemplo 9 - Método de Projecção 3: Manipulação de Ligações de Hidrogénio à Volta das Regiões Móveis A mobilidade de regiões de uma proteína pode ser necessária para a actividade. A mobilidade da região a.5,6, a região formadora dos canais putativos de Cry3Bb, pode ser melhorada através da diminuição do número de ligações de hidrogénio, incluindo pontes de sal (pontes de hidrogénio entre cadeias laterais de aminoácidos com cargas opostas), 204 ΡΕ1040192 entre as hélices 5-6 e qualquer outra parte da molécula ou estrutura do dímero. A diminuição do número de ligações de hidrogénio e pontes de sal pode melhorar a actividade biológica. A substituição dos aminoácidos das pontes de hidrogénio com resíduos hidrofóbicos deverá ser feita com cuidado para evitar criar superfícies hidrofóbicas contínuas entre as hélices 5-6 e qualquer outra parte do dímero. Isto pode diminuir a mobilidade através do aumento das interacções entre superfícies hidrofóbicas. 5.9.1 Cry3Bb. 11222 e Cry3Bb. 11223

Tyr230 está situada na hélice 6 e, na estrutura quaternária do dímero de Cry3Bb, este aminoácido é coordenado com Tyr230 da molécula adjacente. Três pontes de hidrogénio são formadas entre as duas hélices 6 nos dois monómeros devido a este aminoácido. De forma a melhorar a flexibilidade das hélices 5-6, as hélices teoricamente capazes de penetrar na membrana e formar um canal iónico, as pontes de hidrogénio ao longo do dímero foram removidas ao alterar-se este aminoácido e um correspondente aumento na actividade biológica foi observado. As proteínas Cry3Bb, Cry3Bb.11222 e Cry3Bb.EG11223, apresentam um aumento de 4 vezes e 2,8 vezes na actividade de SCRW, respectivamente, comparativamente com a proteína selvagem. 5.9.2 Cry3Bb. 11051 A proteína Cry3Bb projectada Cry3Bb.11051 tem a alteração de aminoácidos K189G em 1α4,5 do domínio 1. Na 205 ΡΕ1040192 estrutura Cry3Bb selvagem, a cadeia lateral exposta de K189 está suficientemente perto da alteração lateral exposta de E123, situada em la2b,3, para formar pontes de hidrogénio. A substituição de K189 com glicina, conforme encontrado nesta posição em Cry3A, remove a possibilidade de formação de ligações de hidrogénio neste local e resulta numa proteína com uma bioactividade três vezes superior a Cry3Bb selvagem. 5.9.3 Cry3Bb. 11227, Cry3Bb. 11241 E Cry3Bb. 11242 O aminoácido Q238, situado na hélice 6 de Cry3Bb, foi identificado como um resíduo que, devido ao seu tamanho grande e ligação de hidrogénio a R290, bloqueia a hidratação completa do espaço entre a hélice 6 e a hélice 4. A substituição de R290 com os aminoácidos que não formam pontes de hidrogénio ou que possuem cadeias laterais que não podem atravessar a distância física até à ponte de hidrogénio com Q238 pode aumentar a flexibilidade da região formadora de canais. As proteínas projectadas Cry3Bb.11227 (R290N), Cry3Bb.11241 (R290L) e Cry3Bb.11242 (R290V) apresentam actividades aumentadas de aproximadamente 2 vezes, 2,6 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, contra larvas SCRW comparativamente com a proteína selvagem. 5.10 Exemplo 10 - Método de Projecção 4: Análise da Ansa e Projecção da Ansa à Volta das Hélices Flexíveis

As regiões de ansa da estrutura de uma proteína podem estar envolvidas em numerosas funções da proteína 206 ΡΕ1040192 incluindo, mas não estando limitado à formação de canais iónicos, formação e manutenção da estrutura quaternária e ligação a receptores. Cry3Bb é uma proteína formadora de canais. A disponibilidade das hélices formadoras de canais iónicos das δ-endotoxinas para se moverem para a bicamada depende da ausência de forças que impedem o processo. Uma destas forças que possivelmente limita este processo é a ocupação espacial das cadeias laterais de aminoácidos nas regiões das ansas à volta das hélices críticas. A literatura sugere que em pelo menos uma outra toxina bacte-riana, não uma toxina de B. thuringiensis, a molécula de toxina abre-se ou, em termos científicos, perde alguma da estrutura quaternária para expor uma região activa da membrana (Cramer et al., 1990) . Esta literatura não ensina como melhorar a probabilidade deste evento ocorrer e desconhece-se se as toxinas de B. thuringiensis usam este mesmo processo para penetrar na membrana. A redução da ocupação espacial das cadeias laterais de aminoácidos nestas regiões críticas através da redução do tamanho ou alteração do posicionamento da cadeia lateral com o correspondente aumento na actividade biológica foi o passo inovado. 5.10.1 Análise da Ansa Entre as Hélices 3 e 4 (Cry3Bb. 11032)

Os inventores descobriram que as três primeiras hélices do domínio um poderão ser separadas do resto da toxina por digestão proteolítica da ansa entre as hélices a3 e a4 (Cry3Bb.60). Esforços iniciais para truncar o gene cry3Bb para produzir esta molécula Cry3Bb encurtada, mas mais activa, falharam. Por razões desconhecidas, B. thurin- 207 ΡΕ1040192 giensis não sintetiza esta molécula de 60 KDa. Pensou-se então que talvez as primeiras três hélices do domínio 1 não tivessem de ser removidas proteoliticamente, ou de forma equivalente, a proteína não tinha de ser sintetizada nesta forma truncada para tirar partido da alteração de Cry3Bb.60. Observou-se que a proteína Cry3A tinha um pequeno aminoácido perto de 1α3,4 que poderia conferir maior flexibilidade na região da ansa permitindo assim que as três primeiras hélices do domínio 1 se movessem para fora do caminho, expondo a região activa da membrana. Ao projectar-se uma molécula Cry3Bb com um resíduo glicina perto desta ansa, a ocupação espacial dos resíduos na ansa deverá ser encurtada. A proteína projectada de novo, Cry3Bb.11032, tem a alteração de aminoácido D165G, que substitui o resíduo de aspartato maior (massa média de 115,09) com o aminoácido mais pequeno, glicina (massa média de 57,05). A actividade de Cry3Bb.11032 é aproximadamente 3 vezes superior à da proteína selvagem. Desta forma, a ansa entre as hélices a3 e a4 foi racionalmente projectada com um aumento correspondente na actividade biológica. 5.10.2 Cry3Bb.11051 A região da ansa que liga as hélices a4 e a5 em Cry3Bb deve ser flexível de forma a que as hélices α5-α6 formadoras de canais possam penetrar na membrana. Foi notado que Cry3A possui um resíduo de glicina no meio desta ansa que pode conferir maior flexibilidade. A correspondente alteração, K189G, foi feita em Cry3Bb e a proteína resultante, Cry3Bb.11051, apresenta um aumento de 3 vezes 208 ΡΕ1040192 na actividade contra larvas de SCRW comparativamente com Cry3Bb selvagem. 5.10.3 Análise da Ansa Entre a Cadeia β 1 e a Hhelice 8 (Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb. 11238 e Cry3Bb.11239) A região da ansa situada entre a cadeia β 1 do domínio 2 e a hélice α 8 no domínio 2 está muito perto da ansa entre as hélices α 6 e 7 no domínio 1. Algumas das cadeias laterais dos aminoácidos de Ιβί,αδ surgem como se pudessem impedir espacialmente o movimento de 1α6,7. Uma vez que 1α6,7 deve ser flexível para as hélices formadoras de canais α5-αδ se inserirem na membrana, pensou-se que a manipulação desta ansa poderia alterar o posicionamento das cadeias laterais resultando em menos impedimento espacial. Isto foi conseguido criando proteínas com actividades biológicas aumentadas, variando entre 2,2 e 5,4 vezes mais do que a proteína selvagem. Estas proteínas toxina projectadas e as suas alterações de aminoácidos estão apresentadas na Tabela 2 como Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237,

Cry3Bb.11238 e Cry3Bb.11239. 5.10.4 Análise da Ansa Entre a Hélice 7 e a Cadeia β 1 (Cry3Bb.11228, Cry3Bb.11229, Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb. 11238 e Cry3Bb.11239)

Se Cry3Bb for semelhante a uma toxina bacteriana que se deve abrir para expor uma região activa de membrana 209 ΡΕ1040192 para toxicidade, é possível que outras hélices, para além das hélices formadoras de canais, sofram alterações das posições. Deduziu-se que, se as hélices α5-α6 se inserirem na membrana, então a hélice al pode ter também de alterar posições. Demonstrou-se no exemplo 4.4.3 que o aumento da flexibilidade entre a hélice a6 e al pode aumentar a actividade, maior flexibilidade na ansa após a hélice al, 1α7,β1 pode também aumentar a bioactividade. Alterações da região 1α7,β1 de Cry3Bb resultaram no isolamento de várias proteínas com actividades aumentadas variando entre 1,9 e 4,3 vezes mais do que a proteína selvagem. Estas proteínas projectadas estão apresentadas na Tabela 7 como Cry3Bb.11227, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242 e Cry3Bb.11236. 5.11 Exemplo 11 - Método de Pprojecção 5: Desenho da Ansa à Volta das Cadeias β e Folhas β

As regiões de ansas da estrutura de uma proteína podem estar envolvidas em numerosas funções da proteína incluindo, mas não estando limitado à formação de canais, formação e manutenção da estrutura quaternária e ligação a receptores. Uma superfície de ligação é muitas vezes definida por uma série de ansas, como é o caso da imunoglobu-lina G (IgG) (ver Branden and Tooze, 1991, para revisão). No entanto, o que não pode ser determinado nesta altura é quais as ansas que serão importantes para as interacções de receptores olhando apenas para a estrutura da proteína em questão. Uma vez que não foi identificado um receptor para Cry3Bb, não é mesmo possível comparar a estrutura de Cry3Bb 210 ΡΕ1040192 com outras proteínas que possuem o mesmo receptor devido a semelhanças estruturais. Para identificar ansas Cry3Bb que contribuem para as interacções de receptores, foi efectuada mutagénese ao acaso em ansas expostas na superfície. À medida que cada ansa foi alterada, o perfil das bioactividades globais das proteínas resultantes foi examinado e comparado. As ansas, especialmente no domínio 2 que parecem ser desnecessárias para a actividade de canal, dividem-se em duas categorias: (1) as ansas que podem ser modificadas sem muita alteração no nível de bioactividade das proteínas resultantes e (2) as ansas em que as alterações resultaram na perda global da bioactividade da proteína resultante. Usando este método de projecção, é possível identificar várias ansas importantes para a actividade . 5.11.1 Análise da Ansa β2,3

Mutagénese semi ao acaso da região da ansa entre as cadeias β 2 e 3 resultou na produção de proteínas toxina estruturalmente estáveis com actividades significativamente reduzidas contra larvas SCRW. A região 1β2,3 é altamente sensível às alterações de aminoácidos indicando que amino-ácidos ou sequências de aminoácidos específicos são necessárias para a actividade proteica de toxina. Considera-se, portanto, que alterações específicas na região 1β2,3 aumentará a ligação e, portanto, a actividade da proteína toxina desenhada de novo. 211 ΡΕ1040192 5.11.2 Análise da Ansa β6,7

As mutações semi ao acaso introduzidas na região da ansa entre as cadeias 6 e 7 resultaram em proteínas estruturalmente estáveis com uma perda global de bioacti-vidade contra SCRW. A região 1β6,7 é altamente sensível a alterações de aminoácidos indicando que os aminoácidos específicos ou sequências de aminoácidos são necessários para actividade da proteína toxina. Considera-se, portanto, que alterações específicas na região 1βδ,7 aumentará a ligação e, portanto, a actividade da proteína toxina pro-jectada de novo. 5.11.3 Análise da Ansa βΙΟ,ΙΙ

As mutações ao acaso na região da ansa entre as cadeias β 10 e 11 resultou em proteínas tendo uma perda global de bioactividade contra SCRW. A ansa βίο,11 está estruturalmente perto e interage com as ansas β2,3 e βδ, 7. Alterações específicas dos resíduos individuais dentro da região ΙβΙΟ,ΙΙ podem também resultar num aumento da inte-racção com a membrana de insectos, aumentando a bioactividade da proteína toxina. 5.11.4 Cry3Bb.11095

As ansas β2,3, βδ, 7 e βΙΟ,ΙΙ foram identificadas como importantes para a bioactividade de Cry3Bb. As 3 ansas estão expostas na superfície e estruturalmente próximas 212 ΡΕ1040192 umas das outras. 0 aminoácido Q348 na estrutura selvagem, situado na cadeia β2 imediatamente antes de 1β2,3, não forma quaisquer contactos intramoleculares. No entanto, a substituição Q348 com arginina (Q348R) resulta na formação de 2 novas pontes de hidrogénio entre R348 e os carbonilos do esqueleto de R487 e R488, ambos situados em ipi 0,11. As novas ligações de hidrogénio podem actuar para estabilizar a estrutura formada pelas 3 ansas. A proteína projectada portadora desta alteração, Cry3Bb.11095, é 4,6 vezes mais activa do que Cry3Bb selvagem. 5.12 Exemplo 12 - Método de Projecção 6: Identificação e Nova

Alteração das Superfícies Electrostáticas Complexas

As interacções das proteínas incluem interacções hidrofóbicas (e.g., forças de Van der Waals), interacções hidrofílicas, incluindo entre cargas opostas nas cadeias de aminoácidos (pontes de sal) e ligações de hidrogénio. Sabe-se muito pouco acerca das interacções entre a δ-endotoxina e o receptor. Actualmente, não existem descrições na literatura que identifiquem os tipos de interacções que predominam entre toxinas e receptores de B. thuringiensis.

No entanto, experimentalmente, é importante aumentar a força da interacção toxina de B. thuringiensis-receptor não permitindo a determinação precisa da interacção química que a suporta tendo em vista a sua melhoria. Para conseguir isto, a superfície electrostática de Cry3Bb foi definida resolvendo a distribuição Poisson- 213 ΡΕ1040192

Boltzman à volta da molécula. Uma vez resolvida esta superfície electricamente definida, esta pode ser então analisada relativamente a regiões de maior diversidade. Deduziu-se que estas regiões electrostaticamente diversas terão a maior probabilidade de participar nas interacções específicas entre as proteínas da toxina de B. thurin-giensis e o receptor, em vez de interacções mais gerais e não específicas. Assim, estas regiões foram escolhidas para nova projecção, continuando a aumentar a diversidade elec-trostática das regiões. Ainda, a análise da interacção electrostática à volta da região putativa formadora de canais da toxina criou perspectivas para a nova projecção. Isto inclui a identificação de um resíduo electropositivo num canal que de outra forma estaria carregado negativamente (ver exemplo 4.6.1). 5.12.1 R290 (Cry3Bb. 11227, Cry3Bb. 11241 E cry3Bb. 11242) A análise da interface do dímero de Cry3Bb ao longo do eixo do domínio 1 sugere que um poro ou canal de catiões possa ser formado entre os monómeros. 0 exame elec-trostático deste eixo deu credibilidade adicional a esta sugestão. De facto, o hipotético canal está essencialmente carregado negativamente, uma observação consistente com a análise biofísica de canais de δ-endotoxina selectivos para catiões. Se um canal catiónico se formar ao longo do eixo do dímero, então o catião poderá mover-se entre os monómeros de forma relativamente fácil com apenas um obstáculo significativo. Um resíduo de arginina carregado positiva- 214 ΡΕ1040192 mente (R290) situa-se no canal carregado negativamente. Este resíduo poderá impedir o movimento catiónico ao longo do canal. Baseado nesta análise, R290 foi alterado para um resíduo não carregado. A bioactividade das proteínas pro-jectadas de novo Cry3Bb.11227 (R290N), Cry3BB.11241 (R290L) e Cry3Bb.11242 (R290V) foi melhorada aproximadamente 2 vezes, 2,6 vezes e 2,5 vezes, respectivamente. 5.12.2 Cry3Bb.60 A digestão com tripsina de Cry3Bb solubilizada dá uma proteína truncada estável com um peso molecular de 60 KDa (Cry3Bb.60). A digestão com tripsina ocorre no lado carboxilo do resíduo R159, removendo eficazmente as hélices 1 a 3 da estrutura nativa Cry3Bb. A clivagem das primeiras 3 hélices expõe uma superfície eslectrostática diferente da encontrada na estrutura nativa. A nova superfície tem uma combinação de características hidrofóbicas polares e carregadas que podem desempenhar um papel nas interacções com membranas. A bioactividade de Cry3Bb.60 é 3,6 vezes superior à de Cry3Bb selvagem. 5.13 Exemplo 13 - Método de Projecção 7: Identificação e Remoção de Locais de Ligação a Metais A literatura ensina que o comportamento in vitro das toxinas de B. thuringiensis pode melhorar através da quelatação de catiões divalentes no sistema experimental (Crawford and Harvey 1988) . No entanto, desconhecia-se como 215 ΡΕ1040192 é que estes catiões divalentes inibiam a actividade in vitro. Crawford and Harvey (1988) demonstraram que a corrente de curto circuito através do intestino é mais fortemente inibida por B. thuringiensis na presença de EDTA, um quelator de iões divalentes, do que na ausência deste agente, sugerindo assim que este passo no modo de actuação de B. thuringiensis poderá ser potenciado através da remoção de iões divalentes. Observações semelhantes foram feitas usando membranas de lípidos negras e medindo um aumento na corrente criada pelas δ-endotoxinas na presença de EDTA para quelatar iões divalentes. Houve pelo menos três possíveis explicações para estas observações. A primeira explicação poderia ser a dos iões divalentes serem demasiado grandes para se moverem através de um canal iónico mais adequado para iões monovalentes, bloqueando assim o canal. Segundo, os iões divalentes podem cobrir a proteína de forma muito geral, tamponando assim as interac-ções de carga necessárias para a interacção das toxinas de membrana e limitando a actividade de canal. A terceira possibilidade é que exista um local específico de ligação a metais na proteína e, quando ocupado por iões divalentes, a função de canal iónico seja inibida. Se bem que a literatura não possa diferenciar o valor de uma possibilidade relativamente a outra, a terceira possibilidade conduziu a uma análise da estrutura Cry3Bb de pesquisa de um local específico de ligação a metal que possa alterar a probabilidade de uma toxina poder formar um canal iónico. 216 ΡΕ1040192 5.13.1 Η231 ( (Cry3Bb. 11222, Cry3Bb11224, Cry3Bb. 11225 e

Cry3Bb. 11226)

Um local putativo de ligação a metal é formado na estrutura do dimero de Cry3Bb pelos residuos de H231 de cada monómero. Os residuos H231, situados na hélice αβ, situam-se adjacentes uns aos outros e perto do eixo de simetria do dimero. A remoção deste local por substituição da histidina com outros aminoácidos foi avaliada pela ausência da actividade de canal iónico dependente de EDTA. As bioactividades das proteínas toxina projectadas, Cry3Bb.11222, Cry3Bb.11224, Cry3Bb.11225 e Cry3Bb.11226, são aumentadas 4, 5 3,6 e 3 vezes, respectivamente, em relação a Cry3Bb selvagem. As respectivas alterações de aminoácidos estão apresentadas na Tabela 2. 5.14 Exemplo 14 - Método de Projecção 8: Alteração da Estrutura Quaternária

Cry3Bb pode existir em solução como um dimero semelhante a uma proteína relacionada, Cry3A (Walters et ai., 1992) . No entanto, a importância do dimero para a actividade biológica é desconhecida devido à toxina como um monómero ou como estrutura de ordem superior não ter sido exaustivamente avaliada. Assume-se que os resíduos de aminoácidos específicos contribuam para a formação e estabilidade da estrutura quaternária. Uma vez identificado um resíduo que contribui, podem ser feitas alterações para diminuir ou aumentar o efeito daquele resíduo afectando 217 ΡΕ1040192 assim a interacção entre monómeros. A actividade de canal é uma forma útil, mas de forma alguma a única, de avaliar a estrutura quaternária de Cry3Bb e seus derivados. Foi observado que Cry3Bb cria condutâncias controladas em membranas que crescem de tamanho com o tempo, resultando no final em grandes poros na membrana (a actividade canal de Cry3Bb selvagem está descrita na Secção 12.1). Foi observado que Cry3A forma um dimero mais estável do que Cry3Bb e por coincidência forma mais depressa níveis mais elevados de condutância (FIG. 10). Esta observação levou os inventores a propor que a oligomerização e a formação de canais iónicos (tamanho da condutância e velocidade de formação do canal) estejam relacionadas. Baseado nesta observação Cry3Bb foi novamente manipulado para preparar oligómeros maiores e mais estáveis a uma velocidade maior. Assume-se nesta análise que a velocidade de formação de canais iónicos e crescimento reflecte este processo. É também possível que as alterações na estrutura quaternária possam não afectar a actividade de canal iónico. Alterações à estrutura quaternária podem também afectar as interacções com receptores, processamento de proteínas no ambiente do tubo digestivo de insectos, assim como outros aspectos de bioactividade desconhecidos. 5.14.1 Cry3Bb.11048 A análise estrutural comparativa de Cry3A e Cry3Bb conduz à identificação de diferenças estruturais entre as duas toxinas no domínio de formação de canais 218 ΡΕ1040192 iónicos; especificamente, uma inserção de um aminoácido entre a hélice 2a e a hélice 2b em Cry3Bb. A remoção deste aminoácido adicional em Cry3B2, A104, e uma substituição D103E, como em Cry3A, resultou na perda de controlo do canal e na formação de poros simétricos. Uma vez formados os poros eles permanecem abertos e permitem uma condutância estável variando entre 25-130 pS. Esta proteina projectada, Cry3Bb.11048, é 4,3 vezes mais activa do que Cry3Bb selvagem contra larvas SCRW. 5.14.2 Oligomerização de Cry3Bb.60

Moléculas individuais de Cry3Bb ou Cry3Bb.60 podem formar um complexo com uma outra molécula semelhante. A oligomerização de Cry3Bb é demonstrada por SDS-PAGE, em que as amostras não são aquecidas em tampão de amostra antes de serem aplicadas no gel. A ausência do tratamento pelo calor permite que permaneça alguma toxina não desnaturada. A oligomerização é visualizada após coloração com Coomassie através do aparecimento de uma banda com 2 vezes o peso molecular do monómero. A intensidade da banda de peso molecular mais elevado reflete o grau de oligomerização. A capacidade de Cry3Bb para formar um oligómero não é aparente de forma reprodutível. O complexo não pode ser observado repetidamente. No entanto, Cry3Bb.60 forma uma quantidade significativamente maior de um complexo de peso molecular mais elevado (120 KDa) . Estes dados sugerem que Cry3Bb.60 forma mais facilmente o complexo de ordem mais elevada do que Cry3Bb sozinho. Cry3Bb.60 forma canais 219 ΡΕ1040192 iónicos com maior frequência do que Cry3Bb selvagem (ver secção 5.12.9). 5.14.3 Cry3Bb.11035

Foram feitas alterações em cry3Bb para reflectir a sequência de aminoácidos em cry3A no extremo de 1α3,4 e no começo da hélice 4. Estas alterações resultaram na proteína projectada, Cry3Bb.11035, que ao contrário de Cry3Bb selvagem, forma canais espontâneos com condutâncias maiores. Cry3Bb.11035 é aproximadamente três vezes mais activo contra as larvas SCRW do que Cry3Bb selvagem. Cry3Bb.11035 e as suas alterações de aminoácidos estão apresentadas na tabela 10. 5.14.4 Cry3Bb.11032

Cry3Bb.11032 foi alterado no resíduo 165 na hélice a4, alterando um aspartato para glicina, como encontrado em Cry3A. Cry3Bb.11032 é três vezes mais activo do que Cry3Bb selvagem. A actividade de canal de Cry3Bb.11032 é muito semelhante à de cry3Bb excepto quando a proteína projectada é artificialmente incorporada na membrana. Um aumento de 16 vezes nas condutâncias do canal inicial é observado comparativamente a Cry3Bb selvagem (ver secção 5.12.2). Este aumento na condutância inicial presumivelmente é devido a um aumento da estrutura quaternária, estabilidade ou estrutura de ordem superior. 220 ΡΕ1040192 5.14.5 EG11224

Na estrutura do dímero Cry3Bb selvagem, histi-dina, na posição 231 no domínio 1, faz contactos de ligações de hidrogénio com D288(domínio 1), Y230 (domínio 1) e através de uma rede de moléculas de água, também faz contacto com D610 (domínio 3), todos do monómero oposto. D610 e K235 (domínio 1) também faz contacto. Substituindo a histidina com uma arginina, H231R resulta, numa orientação, na formação de uma ponte de sal com D610 do monómero vizinho. Numa segunda orientação, os contactos com D288 do monómero vizinho, como surge na estrutura selvagem, são mantidos. Em qualquer uma das orientações, R231 não faz ligações de hidrogénio com Y230 do monómero oposto mas faz contacto com K235 que retém o seu contacto com K610 (V.

Cody, comunicação pessoal). A alteração das ligações de hidrogénio modificou as interacções entre os diferentes domínios da proteína na estrutura quaternária. Globalmente, existem menos ligações de hidrogénio entre os domínios 1 dos monómeros vizinhos e uma ligação muito mais forte forma-se entre os domínios 1 e 3. Encontrou-se que a actividade de canal estava alterada. Cry3Bb.11224 produz pequenos canais de abertura/fecho rápido como Cry3Bb. No entanto, ao contrário de Cry3Bb selvagem, Cry3Bb.11224 não apresenta activação dependente de β-mercaptoetanol. A substituição de H231 com arginina resultou numa proteína Cry3Bb redesenhada, Cry3Bb.11224, apresentando um aumento de 5 vezes da bioactividade. 221 ΡΕ1040192 5.14.6 Cry3Bb.1126

Cry3Bb.11226 é semelhante a Cry3Bb.11224 discutido na Secção 4.8.5, pelo facto de a histidina na posição 231 ter sido substituída. A alteração de aminoácido, H231T, resulta na perda de activação dependente de β-mercapto-etanol observada com Cry3Bb selvagem (ver Secção 5.12.1). a substituição de H231, um local putativo de ligação a metais, altera a interacção de regiões na estrutura quaternária resultando num tipo diferente de actividade de canal. Cry3Bb.ll26 é três vezes mais activo do que Cry3Bb selvagem. 5.14.7 Cry3Bb.11221

Cry3Bb.11221 foi redesenhada na região 1α3,4 de Cry3Bb. Os canais formados por Cry3Bb.11221 são muito melhor resolvidos do que as condutâncias formadas por Cry3Bb selvagem (ver Secção 5.12.6). Cry3Bb.11221 apresenta um aumento de 6,4 vezes na bioactividade relativamente a Cry3Bb selvagem. As alterações de aminoácidos encontradas em Cry3Bb.11221 estão apresentadas na Tabela 2. 5.14.8 Cry3Bb.11242 A proteína redesenhada, Cry3Bb.11242, portadora da alteração R290V, forma pequenas condutâncias imediatamente, que crescem rapidamente e de forma estável para condutâncias maiores em cerca de 3 min (ver secção 5.12.7). 222 ΡΕ1040192

Isto contrasta com os canais de Cry3Bb selvagem que levam 30-45 min a surgirem e crescem lentamente ao longo de horas para condutâncias grandes. Cry3Bb.11242 também apresenta um aumento de 2,5 vezes na bioactividade comparativamente com Cry3Bb selvagem. 5.14.9 Cry3Bb.11230

Cry3Bb.11230, ao contrário de Cry3Bb selvagem, forma canais bem resolvidos com estados abertos longos. Estes canais atingem uma condutância máxima de 3000 pS mas não continuam a crescer com o tempo. Cry3Bb.11230 foi redesenhada na região Ιβί,αθ de Cry3Bb e apresenta um aumento de quase 5 vezes na actividade contra larvas SCRW (Tabela 9) e um aumento de 5,4 vezes contra larvas WCRW (Tabela 10) comparado com Cry3Bb selvagem. As alterações de aminoácidos encontradas em Cry3bb.11230 estão apresentadas na Tabela 2. 5.15 Exemplo 15 - Método de Projecção 9: Projecção de Resíduos

Estruturais. A estrutura tridimensional especifica de uma proteína é mantida no lugar por aminoácidos que podem estar escondidos ou de outra removidos da superfície da proteína. Estes determinantes estruturais podem ser identificados através da análise das forças responsáveis pelo posicionamento da estrutura da superfície. O impacto destes resíduos estruturais pode ser então aumentado para restringir o movimento molecular ou diminuído para aumentar a flexibilidade molecular. 223 ΡΕ1040192 5.15.1 Cry3Bb. 11095

As ansas β2,3, β6,7 e βΙΟ,ΙΙ, situadas no domínio 2 de Cry3Bb, foram identificadas como importantes para a bioactividade. O aminoácido Q348 na estrutura selvagem, situado na cadeia β2 imediatamente antes de 1β2,3 não forma quaisquer contactos intramoleculares. No entanto, a substituição de Q348 com arginina (Q348R) resulta na formação de 2 novas ligações de hidrogénio entre R348 e o esqueleto de carbonilos de R487 e R488, ambos situados em ΙβΙΟ,ΙΙ. As novas ligações de hidrogénio podem actuar de forma a estabilizar a estrutura formada pelas três ansas. Certamente, a estrutura à volta de R348 está mais intimamente empacotada conforme determinado por cristalografia de raios X. A proteína projectada portadora desta alteração Cry3Bb.11095, é 4,6 mais activa do que Cry3Bb selvagem. 5.16 Exemplo 16 - Método de Projecção 10: Análise Combinatória e Mutagénese

Locais individuais na molécula Cry3Bb alterada podem ser usados conjuntamente para criar uma molécula Cry3Bb com actividade ainda maior do que a actividade de qualquer lugar individual. Este método não foi aplicado com precisão a qualquer δ-endotoxina. Igualmente também não é óbvio que melhorias em dois locais possam conjuntamente melhorar a actividade biológica da proteína. De facto, os 224 ΡΕ1040192 dados demonstram que melhorias em 2 locais, quando reunidos numa única construção, não melhoram mais necessariamente a actividade biológica de Cry3Bb. Nalguns casos, a combinação resultou no decréscimo da estabilidade e/ou actividade da proteína. Exemplos de proteínas com combinações de locais que resultaram num melhoramento de actividade comparativamente com Cry3Bb selvagem mas com menos actividade comparativamente com 1 ou mais das proteínas "parentais" são Cry3Bb.11235, 11046, 11057 e 11058. Cry3Bb.11082, que contem as regiões redesenhadas das 4 proteínas parentais, retém o nível de actividade da estirpe parental mais activa (Cry3Bb.11230) mas não apresenta um aumento de actividade. Estas proteínas estão apresentadas na Tabela 7. Seguem-se exemplos de casos em que mutações combinadas possuem actividade biológica significativamente melhorada. 5.16.1 Cry3Bb.11231 A proteína redesenhada Cry3Bb.11231 contem as alterações encontradas em Cry3Bb.11224 (H231R) e cry3Bb.11228 (alterações em Ιβί,αδ). A combinação de alterações de aminoácidos encontrada em Cry3Bb.11231 resulta num aumento de bioactividade contra larvas de SCRW e aproximadamente 8 vezes relativamente a Cry3Bb selvagem (Tabela 2). Este aumento é maior do que o apresentado por Cry3Bb.11224 (5,0x) ou Cry3Bb.11228 (4,lx) sozinho. Cry3Bb.11231 também apresenta um aumento de 12,9 vezes na actividade comparativamente com Cry3Bb selvagem contra larvas WCRW (Tabela 10). 225 ΡΕ1040192 5.16.2 Cry3Bb.11081 A proteína Cry3Bb redesenhada Cry3bb.11081 foi construída combinando as alterações encontradas em Cry3Bb.11032 e Cry3Bb.11229 (com excepção de Y318C). Cry3Bb.11081 demonstrou um aumento de actividade de 6,1 vezes na actividade relativamente a Cry3Bb selvagem; um maior aumento na actividade do que qualquer uma das proteínas parentais individuais, Cry3Bb.11032 (3,1 vezes) e

Cry3Bb.11229 (2,5 vezes). 5.16.3 Cry3Bb.11083 A proteína Cry3Bb redesenhada Cry3bb.11083 foi construída combinando as alterações encontradas em Cry3Bb.11036 e Cry3Bb.11095. Cry3Bb.11083 demonstrou um aumento de actividade de 7,4 vezes na actividade contra larvas SCRW comparativamente com Cry3Bb selvagem; um aumento maior do que Cry3Bb.11036 (4,3x) ou Cry3Bb.11095 (4,6x). Cry3Bb.11083 também apresenta um aumento de 5,4 vezes na actividade contra larvas WCRW comparativamente com Cry3Bb selvagem (Tabela 10). 5.16.4 Cry3Bb. 11084 A proteína Cry3Bb redesenhada Cry3bb.11084 foi construída combinando as alterações encontradas em Cry3Bb.11032 e a alteraçao S311L encontrada em Cry3Bb.11228 . Cry3Bb. 11084 apresenta um aumento de 7,2 226 ΡΕ1040192 vezes na actividade relativamente a Cry3Bb selvagem; um aumento superior a Cry3Bb.11032 (3,lx) ou cry3Bb.11228 (4,lx) · 5.16.5 Cry3bb11098

A proteína Cry3Bb redesenhada Cry3Bb.11098 foi construída de forma a conter as seguintes alterações de aminoácidos: D165G, H231R, S311L, N313T e E317K. A sequência de ácidos nucleicos está apresentada em SEQ ID NO:107 e a sequência de aminoácidos codificada está apresentada em SEQ ID NO: 107 e a sequência de aminoácidos codificada está apresentada em SEQ ID NO:108. 5.17 Exemplo 17 - Estratégia de Projecção 11: Alteração da Ligação de WCRW a Glicoproteínas e a Membranas em Escova

Se bem que a identidade dos receptores de Cry3Bb seja desconhecida, é no entanto importante para aumentar a interacção da toxina com o seu receptor. Uma forma de aumentar a interacção toxina-receptor sabendo a identidade do receptor é reduzir ou eliminar a ligação não produtiva a outras moléculas. Os inventores observaram que Cry3Bb se liga não especificamente a albumina sérica bovina (BSA) que foi glicosilada com uma variedade de grupos de açúcar, mas não a BSA não glicosilada. Cry3A, que não é activa em espécies de Diabrotica, apresenta ligação semelhante mas ainda maior a BSA glicosilada. De forma semelhante, Cry3A apresenta ainda maior ligação a membranas em escova (BBM) 227 ΡΕ1040192 de WCRW imobilizadas do que Cry3Bb selvagem, sugerindo que muita da ligação observada não é produtiva. Deduziu-se que a ligação não específica a BBM de WCRW ocorre via proteínas glicosiladas e que a ligação a BSA glicosilada e a BBM de WCRW é não produtiva na via de reacções para toxicidade. Assim, a redução ou eliminação daquela ligação conduzirá a um aumento da ligação ao receptor produtivo e a um aumento da toxicidade. Os potenciais locais de ligação a grupos de açúcar foram alvo do redesenhamento de forma a reduzir a ligação não específica de Cry3Bb a glicoproteínas e a BBM de WCRW imobilizadas. 5.17.1 Cry3Bb . 60

Cry3Bb-60, em que Cry3Bb foi clivada em R159 em 1α3,4, mostra decréscimo da ligação a BSA glicosilada e diminui a ligação a BBM de WCRW imobilizadas. Cry3Bb-60 apresenta um aumento de 3,6 vezes na bioactividade relativamente a Cry3Bb selvagem. 5.17.2 Alterações a 1α3,4 (Cry3Bb. 11221)

Cry3Bb.11221 foi redesenhada na região 1α3,4 do domínio 1, que é a rgeião em que Cry3Bb é clivada para produzir Cry3Bb-60. Cry3Bb.11221 também apresenta um decréscimo da ligação a BSA glicosilada e a BBM de WCRW imobilizadas e apresenta um aumento de 6,4 vezes na bioactividade relativamente a Cry3Bb selvagem. Conjuntamente com os dados de Cry3Bb.60 (secção 5.17.1) estes dados sugerem que esta 228 ΡΕ1040192 região da ansa contribui substancialmente para a ligação não produtiva da toxina. 5.17.3 Alteração de 1β1,α8 (Cry3Bb. 11228, 11230, 11237 e 11231) A região Ιβί,αδ de Cry3BB foi redesenhada para aumentar a hidratação (secção 4.2.4) e aumentar a flexibilidade (secção 4.4.3). Várias proteínas alteradas nesta região, Cry3Bb.ll28, 11230 e 1237, demonstram niveis substancialmente mais baixos de ligação a BSA glicosilada e a BBM de WCRW imobilizada e também apresenta aumentos entre 4,1 e 4,5 vezes da bioactividade relativamente a Cry3Bb selvagem. 5.17.4 Actividade de Ligação

As tendências de Cry3Bb e de alguns dos seus derivados para se ligarem a BSA glicosilada e a BBM de WCRW foram determinadas usando um biosensor de ressonância dos plasmões de superfície BIAcore™. Para a ligação a BSA glicosilada, a proteína glicosilada foi imobilizada, usando química de NHS convencional, a uma chip CM5 (BIAcore) e a toxina solubilizada foi injectada na superfície de BSA glicosilada. Para medir a ligação a BBM de WCRW, as vesículas das membranas em escova (BBMV) purificadas a partir de tubos digestivos de WCRW (English et ai., 1991) foram imobilizadas num chip HPA (BIAcore) depois lavadas com KOH 10 mM ou com β-octilglucósido 40 mM. A toxina solubilizada foi então injectada sobre a superfície da bi-camada híbrida resultante para detectar a ligação. A con- 229 ΡΕ1040192 centração proteica foi determinada pelo ensaio de Protein Dye Reagent (BioRad) ou ensaio de BCA Portein (Pierce).

Podem ser igualmente usados outros métodos para determinar a mesma informação de ligação. Estes incluem, mas não estão limitados a experiências de transferência de ligandos usando toxina marcada, proteína glicosilada marcada ou anticorpos anti-toxina, cromatografia de afinidade e ligação in vitro de toxina a BBMV intacta. 5.18 Exemplo 18 - Construção de Plasmídeos com Sequências cry3Bb Selvagem

Procedimentos de DNA recombinante convencionais foram efectuados essencialmente como descrito por Sambrook et al., (1989) . 5.18.1 PEG1701 pEGl701 (Fig. 11), contido em EG11204 e EG11037, foi construído através da inserção do fragmento Sphl-PstI contendo o gene cry3Bb e o terminador crylF derivado de pEG911 (Baum, 1994) no local Sphl-PstI de pEG854.9 (Baum et al., 1996), um número elevado de cópias do vector vai-vem B. thuringiensis - E. coli. 5.18.2 PEG1028 pEG1028 contem o fragmento HindiII de cry3Bb 230 ΡΕ1040192 derivado de pEG1701 clonado no local de clonagem múltiplo de pTZ18U em HindIII. 5.19 Exemplo 19 - Construcção de Plasmídeos com Genes cry3Bb Alterados O DNA de plasmideo derivado de E. coli foi preparado pelo método de lise alcalina (Maniatis et al., 1982) ou pelos kits de preparação de plasmideo comerciais (exemplos: kit PERFECTprep™, 5 Prime - 3 Prime, Inc.,

Boulder CO; QIAGEN plasmid prep kit, QIAGEN Inc.) . Os plasmídeos de B. thuringiensis foram preparados a partir de culturas, crescidas em infusão de cérebro coração mais 0,5% de glicerol (BHIG) até meio da fase logarítmica, pelo método de lise alcalina. Quando necessário para purificação, fragmentos de DNA foram removidos do gel de agarose após electroforese e recuperados com pó de vidro usando um kit Geneclean II® (BIO 101 Inc., La Jolla, CA) . A alteração do gene cry3Bb foi conseguida usando várias técnicas incluindo mutagénese dirigida, PCR™ triplex, mutagénese por PCR™ quase ao acaso, arrastamento de DNA e técnicas recombinantes convencionais. Estas técnicas estão descritas nas Secções 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 e 6.5, respectivamente. As sequências de DNA das sequências iniciadoras usadas estão apresentadas na Secção 7. 5.20 Exemplo 20 - Mutagénese Dirigida

Mutagénese dirigida foi efectuada pelos protocolos estabelecidos por Kunkle (1985) e Kunkle et al. (1987) 231 ΡΕ1040192 usando o kit de mutagénese in vitro Muta-Gene™ M13 (Bio-Rad, Richmond, CA) . Combinações de alterações de cry3Bb foram conseguidas usando o kit Muta-Gene™ e múltiplas sequências iniciadoras oligonucleotídicas mutagénicas. 5.20.1 PEG1041

pEG1041, contido em EG11032, foi construído usando o kit Muta-Gene™, a sequência iniciadora C e pEG1028 de cadeia simples como matriz de DNA. A sequência de DNA

cry3Bb alterada resultante foi excisada como um fragmento de DNA PflMI e usada para substituir o fragmento de DNA correspondente em pEG1701. 5.20.2 PEG1046

pEG1046, contido em EG11035, foi construído usando o kit Muta-Gene™, a sequência iniciadora D e pEG1028 de cadeia simples como matriz de DNA. A sequência de DNA

cry3Bb alterada resultante foi excisada como um fragmento de DNA PflMI e usada para substituir o fragmento de DNA correspondente em pEG1701. 5.20.3 PEG1047 pEGl0 4 7, contido em EG11036, foi construído usando o kit Muta-Gene™, a sequência iniciadora E e pEG1028 de cadeia simples como matriz de DNA. A sequência 232 ΡΕ1040192 de DNA cry3Bb alterada resultante foi excisada como um fragmento de DNA PflMI e usada para substituir o fragmento de DNA correspondente em pEG1701. 5.20.4 PEG1052 pEGl0 52, contido em EG11046, foi construído usando o kit Muta-Gene™, as sequências iniciadoras D e E e pEG1028 de cadeia simples como matriz de DNA. A sequência de DNA cry3Bb alterada resultante foi excisada como um fragmento de DNA PflMI e usada para substituir o fragmento de DNA correspondente em pEG1701. 5.20.5 PEG1054 pEG1054, contido em EG11048, foi construído usando o kit Muta-Gene™, a sequência iniciadora F e pEG1028 de cadeia simples como matriz de DNA. A sequência de DNA cry3Bb alterada resultante foi excisada como um fragmento de DNA PflMI e usada para substituir o fragmento de DNA correspondente em pEG1701. 5.20.6 PEG1057 pEG1057, contido em EG11051, foi construído usando o kit Muta-Gene™, a sequência iniciadora G e pEG1028 de cadeia simples como matriz de DNA. A sequência de DNA cry3Bb alterada resultante foi excisada como um 233 ΡΕ1040192 fragmento de DNA PflMI e usada para substituir o fragmento de DNA correspondente em pEG1701. 5.21 Exemplo 21 - PCR™ Triplex PCR™ triplex está descrito por Michael (1994). Este método utiliza uma ligase termostável para incorporar uma sequência iniciadora mutagénica fosforilada num fragmento de DNA amplificado durante PCR™. PCR™ foi realizado num termociclador Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) usando um kit de DNA polimerase AmpliTaq™ (Perkin-Elmer) e pEG1701 linearizado com Sphl como DNA matriz. Os produtos de PCR™ foram limpos usando kits comerciais tais como Wizard™ PCR™ Preps (Promega, Madison, WI) e QIAquick PCR™ Purification kit (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA). 5.21.1 PEG1708 e PEG1709

pEGl708 e pEG1709, contidos em EG11222 e EG11223, respectivamente, foram construídos por substitução do fragmento PflMI-PflMI de cry3Bb em pEG1701 com o fragmento de PCR™ digerido com PflMI e purificado em gel, alterado nas posições nucleotídicas 688-690 de cry3Bb, codificadora do aminoácido Y230. As mutações ao acaso foram introduzidas no codão Y230 por PCR™ triplex. A sequência iniciadora mutagénica MVT095 foi fosforilada e usada em conjunto com o par de sequências iniciadoras externas FW001 e FW006. A 234 ΡΕ1040192 sequência iniciadora MVT095 também contem uma mutação silenciosa na posição 687, mudando T para C, o que, quando da incorporação, introduz uma local FcoRI adicional em pEGl701. 5.21.2 PEG1710, PEG1711 E PEG1712

Os plasmideos pEG1710, pEG1711 e pEG1712, contidos em EG11224, EG11225 e EG11226, respectivamente, foram construídos por substitução do fragmento PflMI-PflMI de cry3Bb em pEG1701 com o fragmento de PCR™ digerido com PflMI e purificado em gel, alterado nas posições nucleotí-dicas 690-692 de cry3Bb, codificadora de H231. As mutações ao acaso foram introduzidas no codão H231 por PCR™ triplex. A sequência iniciadora mutagénica MVT097 foi fosforilada e usada em conjunto com o par de sequências iniciadoras externas FW001 e FW006. A sequência iniciadora MVT095 também contem uma alteração da sequência de um T para C na posição 687, o que, quando da incorporação, resulta num local FcoRI adicional por mutação silenciosa. 5.21.3 PEG1713 e PEG1727 pEG1713 e pEG1727, contidos em EG11227 e EG11242, respectivamente, foram construídos por substitução do fragmento PflMI-PflMI de cry3Bb em pEG1701 com o fragmento de PCR™ digerido com PflMI e purificado em gel, alterado nas posições nucleotídicas 868-870 em cry3Bb, codificadora 235 ΡΕ1040192 do aminoácido R290. As mutações ao acaso foram introduzidas no codão Y230 por PCR™ triplex. A sequência iniciadora mutagénica MVT091 foi projectada de forma a que as substituições de nucleótidos resultassem em aproximadamente 36% das sequências codificadoras dos aminoácidos D ou E. MTV091 foi fosforilada e usada em conjunto com o par de sequências iniciadoras externas FW001 e FW006. 5.22 Exemplo 22 - Mutagénese Quase ao Acaso por PCR™ A mutagénese quase ao acaso combina as técnicas mutagénicas por PCR™ descritas por Vallette et al. (1989), Tomic et ai. (1990) e LaBean and Kauffman (1993). As sequências iniciadoras mutagénicas, por vezes mais de 70 nucleótidos de comprimento, foram redesenhadas para introduzir alterações ao longo das posições nucleotidicas codificadoras de uma região estrutural completa, como seja uma ansa. Codões degenerados tipicamente consistem numa proporção de 82% dos nucleótidos selvagens mais 6% de cada um dos outros 3 nucleótidos por posição para introduzir semi ao acaso alterações ao longo da região alvo (LaBean and Kauffman, 1993). Quando possível, os locais de restrição naturais foram utilizados; usaram-se enzimas da classe 2 quando os locais naturais não eram convenientes (Stemmer and Morris, 1992, descreve a lista adicional de enzimas de restrição úteis para esta técnica) . PCR™ foi efectuado num termociclador Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) usando um kit de Ampli- 236 ΡΕ1040192

Taq™ DNA polimerase (Perkin-Elmer) e pEG1701 linearizado com Sphl como DNA matriz. A amplificação quase ao acaso por PCR™ foi realizada usando as seguintes condições: desnaturação a 94°C durante 1,5 min.; emparelhamento a 50°C durante 2 min. e extensão a 72°C durante 3 min., durante 30 ciclos. Os 14 ciclos finais de extensão foram prolongados mais 25 s por ciclo. A concentração das sequências iniciadoras foi 20 μΜ por reacção ou 40 μΜ para sequências iniciadoras mutagénicas mais longas. Os produtos de PCR™ foram limpos usando kits comerciais tais como Wizard™ PCR™ Preps (Promega, Madison, WI) e o kit QIAquick PCR™ Purification kit (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA). Nalguns casos os produtos de PCR™ foram tratados com o fragmento Klenow (Promega) seguindo as instruções do fabricante para preencher quaisquer extremidades soltas de cadeia simples antes da digestão de restrição. 5.22.1 PEG1707 pEG1707, contido em EG11221, foi construído por substitução do fragmento PflMI-PflMI de cry3Bb em pEG1701 com o fragmento de PCR™ digerido com PflMI e purificado em gel, alterado nas posições nucleotídicas 460-480 de cry3Bb, codificadora dos aminoácidos de 1α3,4 154-160. A sequência iniciadora MVT075, que inclui um local de reconhecimento para a enzima de restrição da classe 2 Bsal, e a sequência iniciadora FW006 foram usados para introduzir alterações nesta região por mutagénese quase ao acaso. A sequência 237 ΡΕ1040192 iniciadora MVT076, também contendo um local Bsal, e a sequência iniciadora FW001 foram usadas para amplificar por PCR™ um fragmento "adaptador". Após amplificação por PCR™, ambos os produtos foram limpos, preenchidos os extremos, digeridos com Bsal e ligados um ao outro. 0 fragmento ligado foi purificado em gel e usado como matriz para a amplificação por PCR™ usando o par de sequências iniciadoras FW001 e FW006. 0 produto de PCR™ foi limpo, digerido com PflMI, purificado em gel e ligado ao DNA do vector pEG1701 digerido com PflMI e purificado 5.22.2 PEG1720 e PEG1726 pEGl720 e pEG1726, contido em EG11234 e EG11241, respectivamente, foram construídos por substitução do fragmento PflMI-PflMI de cry3Bb em pEG1701 com o fragmento de PCR™ digerido com Pfim e purificado em gel, alterado nas posições nucleotídicas 859-885 de cry3Bb, codificador dos aminoácidos de 1α7,β1 287-295. A mutagénese quase ao acaso através de PCR™ foi usada para introduzir alterações nesta região. A sequência iniciadora MVT111, desenhada com um local Bsal, e a sequência iniciadora FW006 foram usadas para introduzir as alterações. A sequência iniciadora MVT094, também contendo um local Bsal, e a sequência iniciadora FW001 foram usadas para amplificar por PCR™ um fragmento adaptador. Os produtos de PCR™ foram digeridos com Bsal, purificados em gel e depois ligados uns aos outros. O produto ligado foi amplificado por PCR™ usando 238 ΡΕ1040192 o par de sequências iniciadoras FW001 e FW006, digerido com PflMI. 5.22.3 PEG1714, PEG1715, PEG1716, PEG1718, PEG1719, PEG1722, PEG1723, PEG1724 e PEG1725 pEGl714, pEGl715, pEG1716, pEG1718, pEG1719, pEG1722, pEG1723, pEG1724 e pEG1725, contidos em EG11228, EG11229, EG11230, EG11232, EG11233, EG11236, EG11237, EG11238 e EG11239, respectivamente, foram construídos por substitução do fragmento PflMI-PflMI do gene cry3Bb em pEG1701 com o fragmento de PCR™ digerido com PflMI e purificado em gel, alterado nas posições nucleotídicas 931-954 de cry3Bb, codificadoras dos aminoácidos de Ιβί,αδ 311-318. A mutagénese quase ao acaso através de PCR™ foi usada para introduzir alterações nesta região usando a sequência iniciadora MVT103 e a sequência iniciadora FW006. As sequências iniciadoras FW001 e FW006 foram usadas para amplificar um fragmento adaptador. Os produtos de PCR™ foram preenchidos usando Klenow e digeridos com BamH.1. 0 fragmento maior da digestão e FW001-FW006 foi purificado em gel, depois ligado ao fragmento MVT103-FW006 digerido. 0 produto ligado foi purificado em gel e amplificado por PCR™ usando o par de sequências iniciadoras FW001 e FW006. 0 produto amplificado foi digerido com PflMI e purificado em gel antes da ligação ao DNA vector pEG1701 digerido com PflMI e purificado. 239 ΡΕ1040192 5.22.4 PEG1701. Ιιβ2.3

Plasmídeos portadores de alterações da sequência selvagem de cry3Bb nos nucleótidos 1051-1065, codificadores da região estrutural Ιβ2,3 de Cry3Bb, foram construídos por substituição do fragmento Mlul-Spel de pEG1701 com o

produto de PCR™ isolado e digerido com MluI e Spel. O produto de PCR™ foi gerado por mutagénese quase ao acaso por PCR™, em que que a sequência iniciadora mutagénica MVT081 foi emparelhada com FW006. Estes plasmídeos como grupo foram designados pEG1701.1β2,3. 5.22.5 PEG1701.Ιιβ6, 7

Os plasmideos contendo mutações na sequência selvagem de cry3Bb nos nucleótidos 1234-1248, codificadores da região estrutural Ιββ, 7 de Cry3Bb, foram construídos por substituição do fragmento Mlul-Spel de pEG1701 com o

produto de PCR™ isolado e digerido com Mlu I e Spel. O produto de PCR™ foi gerado por mutagénese quase ao acaso através de PCR™ em que a sequência iniciadora mutagénica MVT085 foi emparelhada com WD115. O par de sequências iniciadoras MVT089 e WD112 foi usado para amplificar um fragmento adaptador. Ambos os produtos de PCR™ foram digeridos com Taql e ligados um ao outro. O produto de ligação foi purificado em gel e amplificado por PCR™ usando o par de sequências iniciadoras MVT089 e FW006. O produto amplificado foi digerido com MluI e Spel e ligado 240 ΡΕ1040192 ao DNA do vector digerido com MluI e SpeI e purificado. Estes plasmideos como grupo foram designados pEG1701.Ιββ, 7. 5.22.6 PEG1701, ΙιβΙΟ, 11

Plasmideos contendo sequências cry3Bb mutadas nos nucleótidos 1450-1467, codificadores da região estrutural ΙβΙΟ,ΙΙ de Cry3Bb, foram construídos por substituição do fragmento Mlul-Spel de pEG1701 com o produto de PCR™ isolado e digeridos com MluI e Spel. O produto de PCR™ foi gerado por mutagénese quase ao acaso através de PCR™ em que a sequência iniciadora mutagénica MVT105 foi emparelhada com MVT070. O par de sequências iniciadoras MVT092 e MVT083 foram usadas para amplificar um fragmento adaptador. (MVT083 é um oligonucleótido mutagénico desenhado para uma outra região. As alterações da sequência introduzidas por MVT083 foram removidas após digestão com enzimas de restrição e não têm impacto na alteração de cry3Bb na região ΙβΙΟ,11). Ambos os produtos de PCR™ foram digeridos com Bsal, ligados um ao outro e o produto de ligação amplificado por PCR™ usando o par de sequências iniciadoras MVT083 e MVT070. O produto de PCR™ resultante foi digerido com Spel e PstI e purificado em gel. Estes plasmideos como grupo foram designados pEG1701.ΙβΙΟ,11.

5.23 Exemplo 23 - Arrastamento de DNA

Arrastamento de DNA, como descrito por Stemmer (1994), foi usado para combinar alterações individuais no gene cry3Bb. 241 ΡΕ1040192 5.23.1 PEG1084, PEG1085, PEG1086 e PEG1087 pEGlΟ84, PEG1085, pEG1086 e pEG1087, contidos em EG11081, EG11082, EG11083 e EG11084, respectivamente, foram recuperados a partir de arrastamento de DNA. Resumidamente, os fragmentos de DNA PflMI foram gerados usando a série de sequências iniciadoras A e B e cada um dos plasmídeos pEGl707, pEGl714, pEG1715, pEG1716, pEG1041, pEG1046, pEG1047 e pEG1054 como matrizes de DNA. Os fragmentos de DNA resultantes foram reunidos em quantidades equimolares e digeridos com DNasel e fragmentos de DNA de 50-100 pb foram recuperados a partir de um gel de agarose através de três ciclos de congelação-descongelação: três min num banho de neve carbónica-etanol, seguido de descongelação completa a 50 °C. Os fragmentos de DNA recuperados foram montados por PCR™ sem sequências iniciadoras e amplificados por PCR™ usando a série de sequências iniciadoras A e B como descrito por Stemmer (1994). Os fragmentos de DNA finais amplificados foram cortados com PflMI e usados para substituir o fragmento de DNA PfIMI de cry3Bb correspondente em pEG1701. 5.24 Exemplo 24 - Técnicas de DNA Recombinante

Os procedimentos de DNA recombinante convencionais foram realizados essencialmente como descrito por Sambrook et ai. (1989). 242 ΡΕ1040192 5.24.1 PEG1717 pEG1717, contido em EG11231, foi construído por substituição do fragmento Bgl I pequeno de pEG1710 com o fragmento Bgll pequeno de pEG1714. 5.24.2 PEG1721 pEG1721, contido em EG11235, foi construído por substituição do fragmento Bgll pequeno de pEG1710 com o fragmento Bgll pequeno de pEG1087. 5.24.3 PEG1063 pEG1062, contido em EG11057, foi construído por substituição do fragmento de DNA NcoI contendo ori43 derivada de pEG1054 com o fragmento de DNA NcoI isolado contendo ori43 e as alterações em cry3Bb derivado de pEGl046 . 5.24.4 PEG1063 pEG1063, contido em EG11058, foi construído por substituição do fragmento de DNA iVcol contendo ori43 derivada de pEG1054 com o fragmento de DNA iVcol isolado contendo ori43 e as alterações em cry3Bb derivado de pEGl707. 243 ΡΕ1040192 5.24.5 PEG1095 PEG1095, contido em EG11095, foi construído por substituição do fragmento de DNA Mlul-Spel em pE1701 com o fragmento de DNA correspondente Mlul-Spel derivado de PEG1086. 5.25 Exemplo 25 - Sequências Iniciadoras Utilizadas na Construção de Variantes de Cry3Bb*

Estão apresentadas abaixo as sequências iniciadoras usadas para mutagénese dirigida por PCR™ triplex e PCR™ quase ao acaso para preparar as variantes cy3Bb* como descrito atrás. As sequências iniciadoras foram obtidas da Ranson Hill Bioscience, Inc. (Ramona, CA) e Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). A composição específica das sequências iniciadoras contendo degenerescências particulares num ou mais resíduos está apresentado na Secção 5.30, Exemplo 30. 5.25.1 Sequência Iniciadora FW001 (SEQ ID NO: 71) : 5'-AGACAACTCTACAGTAAAAGATG-3' 5.25.2 Sequência Iniciadora FW006 (SEQ ID NO: 72) : 5'-GGTAATTGGTCAATAGAATC-3' 244 ΡΕ1040192 5.25.3 Sequência Iniciadora MVT095 (SEQ ID NO: 73) : 5'-CAGAAGATGTTGCTGAATTCNNNCATAGACAATTAAAAC-3' 5.25.4 Sequência Iniciadora MVT097 (SEQ ID NO: 74) : 5'-GATGTTGCTGAATTCTATNNNAGACAATTAAAAC-3' 5.25.5 Sequência Iniciadora MVT091 (SEQ ID NO:75) : 5'-CCCATTTTATGATATTBDNTTATACTCAAAAGG-3' 5.25.6 Sequência Iniciadora MVT075 (SEQ ID NO: 76) :

5'-AGCTATGCTGGTCTCGGAAGAAAEFNFFNFJNJFJFJNFINJFJA AAAGAAGCCAAGATCGAAT-3' 5.25.7 Sequência Iniciadora MVT076 (SEQ ID NO: 77) : 5'-GGTCACCTAGGTCTCTCTTCCAGGAATTTAACGCATTAAC-3' 5.25.8 Sequência Iniciadora MVTlll (SEQ ID NO: 78) :

5'-AGCTATGCTGGTCTCCCATTTJEHIEJEJJEIIKRRJEHEIJEEN 111GT TAAAACAGAAC TAAC-3' 5.25.9 Sequência iniciadora MVT094 (SEQ ID NO: 79) : 5'-ATCCAGTGGGGTCTCAAATGGGAAAAGTACAATTAG-3' 245 ΡΕ1040192 5.25.10 Sequência Iniciadora MVT103 (SEQ ID NO: 80) : 5'-CATTTTTACGGATCCAATTTTTJFFFJNEEJEFNF JNFEILEIJE-OGGACCAACTTTTTTGAG-3' 5.25.11 Sequência Iniciadora MVT081 (SEQ ID NO: 81) : 5'-GAATTTCATACGCGTCTTCAACCTGGTJEHJJJIINMEEIEJTCT-TTCAATTATTGGTCTGG-3' 5.25.12 Sequência Iniciadora MVT085 (SEQ ID NO: 82) : 5'-AAAAGTTTATCGAACTATAGCTAATACAGACGTAGCGGCTJQQFF-NEEJIIJEEIGTATATTTAGGTGTTACG-3' 5.25.13 Sequência Iniciadora A (SEQ ID NO:83) 3B2PFLM1: 5'-GGAGTTCCATTTGCTGGGGC-3' 5.25.14 Sequência Iniciadora B (SEQ ID NO: 84) 3B2PFLM2: 5'-ATCTCCATAAAATGGGG-3' 5.25.15 Sequência Iniciadora C (SEQ ID NO: 85) 3B2165DG: 5'-GCGAAGTAAAAGAAGCCAAGGTCGAATAAGGG-3' 246 ΡΕ1040192 5.25.16 Sequência Iniciadora D (SEQ ID NO: 86 ) 3B216 0SKRD: 5'-CCTTTAAGTTTGCGAAATCCACACAGCCAAGGTCGAATAAGGG-3 5.25.17 Sequência Iniciadora E (SEQ ID NO: 87) 3B2290VP : 5'-CCCATTTTATGATGTTCGGTTATACCCAAAAGGGG-3' 5.25.18 Sequência Iniciadora F (SEQ ID NO: 88) 3B2EDA104 : 5'-GGCCAAGTGAAGACCCATGGAAGGC-3' 5.25.19 Sequência Iniciadora G (SEQ ID NO: 89) 3B2KG189: 5'-GCAGTTTCCGGATTCGAAGTGC-3' 5.25.20 Sequência Iniciadora WD112 (SEQ ID NO: 90) : 5'-CCGCTACGTCTGTATTA-3' 5.25.21 Sequência Iniciadora WD115 (SEQ ID NO: 91) : 5'-ATAATGGAAGCACCTGA-3' 5.25.22 Sequência Iniciadora MVT105 (SEQ ID NO: 92) :

5'-AGCTATGCTGGTCTCTTCTTAEJIFEIIEFFIJFIJIINACAATT CCATTTTTTACTTGG-3' 247 ΡΕ1040192 5.25.23 Sequência Iniciadora MVT092 (SEQ ID NO: 93) : 5'-ATCCAGTTGGGTCTCTAAGAAACAAACCGCGTAATTAAGC-3' 5.25.24 Sequência Iniciadora MVT070 (SEQ ID NO: 94) : 5'-CCTCAAGGGTTATAACATCC-3' 5.25.25 Sequência Iniciadora MVT083 (SEQ ID NO: 95) : 5'-GTACAAAAGCTAAGCTTTIEJIINPEEMEEIJNJESCGAACTATA-GCTAATACAG-3' 5.26 Exemplo 26 - Análise da Sequência dos Genes cry3Bb Alterados Células E. coli DH5a™ (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), JM110 e Sure™ (Stratagene, La Jolla, CA) foram por vezes usadas para amplificar DNA de plasmideo para sequenciação. Os plasmídeos foram usados para transformar estas células usando os procedimentos do fabricante. O DNA foi sequenciado usando o kit de sequenciação de DNA Sequenase® 2.0 adquirido a U.S. Biochemical Corporation (Cleveland, Ohio). Os plasmídeos descritos na secção 6, a sua respectiva divergência da sequência cry3Bb selvagem, as alterações de aminoácidos resultantes e o local das alterações da estrutura proteica estão apresentados na

Tabela 11. - 248 - ΡΕ1040192

Tabela 11

Alterações na Sequência de DNA dos Genes cry3Bb e Substituições de Ahinoácidos Resultantes das Proteínas Cry3Bb*

Plasraídeo Sequência de DNA cry3Bb* Sequência de aminoácidos Cry3Bb* Local da alteração estrutural pEG1707 A460T,C461T,A462T,C464A,T465C,T466C, T467A,A468T,A469T,G470C,T472C, T473G, G474T,A477T,A478T,G479C T154F,P155H,L156H,L158R lo3,4 pEG1708 T687C, T688C, A689T,C691A,A692G Y230L,H231S a6 pPEG1709 T667C,T687C,T688A,A689G,C591A,A692G S223P,Y230S a6 pEG1710 T687C,A692G H231R a6 PEG1711 T687C,C691A H231N,T241S aõ pEG1712 T687C,C691A,A692C,T693C H231T a6 pEG1713 C868A,G869A,G870T R290N Ια,βΐ pEG1714 C932T,A938C,T942G,G949A,T954C S311L,N313T,E317K Ιβί,αδ pEG1715 T931A, A933C,T942A,T945A,G949A,A953G, T954C S311T,E317K,Y318C Ιβί,αδ pEG1716 T931G,A933C,C934G,T945G,C946T,A947G, G951A,T954C S311A,L312,Q316W Ιβί,αδ - 249 - ΡΕ1040192

Tabela 11 (Continuação)

Plasnídeo Sequência de DNA cry3Bb* Sequência de aminoácidos Cry3Bb* Local da alteração estrutural pEG1717 T687C,A692G,C932T,A938C,T942G,G949A H231R, S311L,N313T,E317K αδ,Ιβί,αδ pEG1718 T931A,A933G,T935C,T936C,A938C,T939C S311T,L312P,N313T,E317N Ιβί,αδ PEG1719 T931G, A933C, T936G, T942C, C943T,T945A, C946G,G948C,T954C S311A,Q316D Ιβί,αδ pEG1720 T861C,T866C,C868A,T871CrT872G,A875T, T877A,C878G,A882G I289T,L291R,Y292F,S293R 1α7,β1 pEG1721 T687C,A692G,C932T H231R,S311L αδ,Ιβί,αδ pEG1722 T931A,C932T,A933C,T936C,T942G, T945A, T954C S311I Ιβί,αδ pEG1723 T931A,C932T,A933C,T936C,A937G,A938T, C941A,T942C,T945A,C946A,A947T, A950T, T954C S311I,N313H Ιβί,αδ pEG1724 A933C,T936C,A937G,A938T,C941A,T942C, T945A,C946A,A947T,A950T,T954C N313V,T314N,Q316M,E317V Ιβί,αδ - 250 - ΡΕ1040192

Tabela 11 (Continuação)

Plasiídeo Sequência de DNA cry3Hb* Sequência de aminoácidos Cry3Bb* Local da alteração estrutural pEG1725 A933T,A938G,T939G,T942A,T944C,T945A, N313R,L315P,Q316L,E317A Ιβί,αβ A947T,G948T,A950C,T954C pEG1726 A860T,T861C,G862A,C868T,G869T,T871C, Y287F,D288N,R290L 1α7,β1 A873T,T877A,C878G,A879T pEG1727 C868G,G869T R290V 1α7,β1 pEG1041 A494G D165G α4 pEG1046 G479A,A481C,A482C,A484C,G485A,A486C, S160N,K161P,P162H,D165G α4 A494G pEG1047 A865G,T877C I289V,S293P 1ο7,β1 PEG1052 G479A,A481C,A482C,A484C,G485A,A486C, S160NrK161P,P162H,D165G, α4,1α7,β1 A494G,A865G,T877C I289V,S293P PEG1054 Τ309Α,Δ310,Δ311,Δ312 D103E,AA104 la2a,2b pEG1057 A565G,A566G K189G 1α4,5 pEG1062 T309A,Δ310,Δ311,Δ312,G479A,A481C, D103E,AA104,S160N,K161P, Ia2a,2ba4 A482C,A484C,G485A,A486C,A494G P162H,D165G - 251 - ΡΕ1040192

Tabela 11 (Continuação)

Plasraídeo Sequência de DNA cry3Bb* Sequência de aminoácidos Cry3Bb* Local da alteração estrutural pEG1063 T309A,A310,A311,A312,A460T,C461T, A462T,C464A,T465C,T466C,T467A,A468T, A469T,G470C,T472C,T473G,G474T, A477T, A478T,G479C D103E,AA104,T154F,P155H, L156HrL158R Ia2a,2bla3,4 pEG1084 A494G,T931A,A933C,T942A,T945A,G949A, T954C D165G,S311T,E317K a4,lpl,o8 PEG1085 A494G,A865GrT877C,T914C,T931G,A933C, C934G,T945G,C946T,A947G,G951ArT954C, A1043G,T1094C S311A,L312V,Q316W,Q348R, V365A p203b pEG1086 A865G,T877C,A1043G I289V,S293P,Q348R 1ο7,ρΐ,β2 pEG1087 A494G,C932T D165G,S311L a4,lpl,a8 PEG1095 A1043G Q348R P2 252 ΡΕ1040192 5.27 Exemplo 27 - Expressão de Proteínas Cry3Bb* 5.27.1 Condições de Cultura

Preparou-se agar LB usando uma fórmula convencional (Maniatis et al., 1982). 0 agar de amido foi adquirido à Difco Laboratories (Detroit, MI) e suplementado com mais 5 g/1 de agar. 0 meio líquido C2 foi descrito por Donovan et al. (1988). 0 meio C2 foi por vezes preparado sem tampão fosfato (C2-P). Todas as culturas foram incubadas entre 25°C e 30°C; as culturas líquidas foram também agitadas a 250 rpm, até ter ocorrido esporulação e lise. 5.27.2 Condições de Transformação pEG1701 e seus derivados foram introduzidos em B. thuringiensis var. kurstaki EG7566 (Baum, 1994) ou EG10368 (Patente U.S. 5322687) acristalífera pelo método de electroporação de Macaluso e Mettus (1991). Nalguns casos, o método foi modificado como se segue para maximizar o número de transformantes. A estirpe recipiente de B. thuringiensis foi inoculada em infusão de cérebro coração mais 0,5% de glicerol a partir de um inoculo crescido durante a noite a 30°C em agar LB, crescida até uma densidade óptica de aproximadamente 0,5 a 600 nm, arrefecida em gelo durante 10 min, lavada 2x com EB e ressuspensa em 1/50 volumes de EB. As células transformadas foram seleccionadas em agar LB ou em agar de milho mais 5 253 ΡΕ1040192 μg/ml de cloranfenicol. 0 rastreio visual de colónias foi usado para identificar transformantes produtores de proteína do cristal; as colónias recombinantes foram geralmente mais opacas do que as colónias que não produziram proteína do cristal. 5.27.3 Designações de Estirpes e Proteínas

Um transformante contendo um gene cry3Bb* alterado codificador de uma proteína Cry3Bb* alterada foi designado por um número "EG", e.g., EG11231. A proteína

Cry3Bb* alterada foi designada Cry3Bb seguido do número da estirpe, e.g., Cry3Bb.11231. As colecções de proteínas com alterações num local estrutural foram designadas Cry3Bb seguido do local estrutural, e.g., Cry3Bb.1β2,3. A Tabela 12 apresenta os plasmídeos pertinentes para este invento, as novas estirpes de B. thuringiensis contendo os plasmídeos, a estirpe recipiente acristalífera de B. thuringiensis usada e as proteínas produzidas pelas novas estirpes. 5.28 Exemplo 28 - Geração e Caracterização de Cry3Bb-60 5.28.1 Geração de Cry3Bb-60 A estirpe EG7231 produtora de Cry3Bb (Patente U.S. 5187091) foi crescida em meio C2 mais 3 mg/ml de cloranfenicol. Após esporulação e lise, a cultura foi lavada com água e a proteína Cry3Bb purificada pelo método de 254 ΡΕ1040192 solubilização com NaBr e recristalização de Cody et al. (1992). A concentração proteica foi determinada pelo ensaio BCA Protein Assay (pierce, Rockford, IL). A proteina recristalizada foi solubilizada em 10 ml de KOH 50 mM por 100 mg de proteina Cry3Bb e tamponado para pH 9,0 com CAPS (ácido 3-[ciclo-hexilamino]-1-propanossulfónico) 100 mM, pH 9,0. A toxina solúvel foi tratada com tripsina numa proporção de peso de 50 mg de toxina para 1 mg de tripsina, entre 10 min e durante a noite, à temperatura ambiente. A tripsina cliva proteínas no lado carboxilo de resíduos de arginina e lisina disponíveis. Para o bioensaio de 8 doses, as condições de solubilização foram alteradas ligeiramente para aumentar a concentração proteica: KOH 50 mM foi adicionado gota a gota para 2,7 ml de uma suspensão a 12,77 mg/ml de Cry3Bb* purificada até ter ocorrido a solubilização do cristal. O volume foi então ajustado a 7 ml com CAPS 100 mM, pH 9,0.

Tabela 12

Plasmídeos Portadores de Genes Cry3Bb* Alterados Transformados em B.

THURINGIENSIS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS CRY3BB* ALTERADAS

Designação do plasmídeo Nova estirpe BT Proteina expressa pEGl701 EG11204 WT Cry3Bb pEGl701 EG11037 WT Cry3Bb pEGl707 EG11221 Cry3Bb.11221 pEGl708 EG11222 Cry3Bb.11222 pEGl709 EG11223 Cry3Bb.11223 255 ΡΕ1040192

Tabela 12 (Continuação)

Designação do plasmídeo Nova estirpe BT Proteína expressa pEGl710 EG11224 Cry3Bb.11224 pEGl711 EG11225 Cry3Bb.11225 pEGl712 EG11226 Cry3Bb.11226 pEGl713 EG11227 Cry3Bb.11227 pEGl714 EG11228 Cry3Bb.11228 pEGl715 EG11229 Cry3Bb.11229 pEGl716 EG11230 Cry3Bb.11230 pEGl717 EG11231 Cry3Bb.11231 pEGl718 EG11232 Cry3Bb.11232 pEGl719 EG11233 Cry3Bb.11233 pEGl720 EG11234 Cry3Bb.11234 pEGl721 EG11235 Cry3Bb.11235 pEGl722 EG11236 Cry3Bb.11236 pEGl723 EG11237 Cry3Bb.11237 pEGl724 EG11238 Cry3Bb.11238 pEGl725 EG11239 Cry3Bb.11239 pEGl726 EG11241 Cry3Bb.11241 pEGl727 EG11242 Cry3Bb.11242 pEGl0 41 EG11032 Cry3Bb.11032 pEGl0 46 EG11035 Cry3Bb.11035 pEGl0 4 7 EG11036 Cry3Bb.11036 pEG1052 EG11046 Cry3Bb.11046 pEGl0 5 4 EG11048 Cry3Bb.11048 pEGl0 5 7 EG11051 Cry3Bb.11051 pEG1062 EG11057 Cry3Bb.11057 256 ΡΕ1040192

Tabela 12 (Continuação)

Designação do plasmídeo Nova estirpe BT Proteina expressa PEG1063 EG11058 Cry3Bb.11058 pEGl0 8 4 EG11081 Cry3Bb.11081 pEGl0 8 5 EG11082 Cry3Bb.11082 pEG1086 EG11083 Cry3Bb.11083 pEGl087 EG11084 Cry3Bb.11084 PEG1095 EG11095 Cry3Bb.11095 PEG1098 EG11098 Cry3Bb.11098 pEGl701.1β2,3 Colecção de estirpes sem designação Cry3Bb.1β2,3 pEGl7 01.1β 6,7 Colecção de estirpes sem designação Cry3Bb.1β6,7 pEGl701.1β10,11 Colecção de estirpes sem designação Cry3Bb.1β10,11 5.28.2 Determinação do Peso Molecular de Cry3Bb-60 0 peso molecular do fragmento predominante da digestão com tripsina de Cry3Bb foi determinado como sendo 60 KDa por análise de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) usando marcadores de pesos moleculares comerciais. Este fragmento de digestão foi designado Cry3Bb-60. Não se observou qualquer outro produtos de clivagem de 60 KDa. 257 ΡΕ1040192 5.28.3 Determinação do Extremo NH2 de Cry3Bb-60

Para determinar a sequência terminal NH2 de Cry3Bb-60, o produto de digestão com tripsina foi frac-cionado por SDS-PAGE e transferido para membrana Immobilon™-P (Millipore Corporation, Bedford, MA) seguindo procedimentos de transferência Western convencionais. Após transferência, a membrana foi lavada duas vezes com água, depois corada com 0,025% de Coomassie Brilliant Blue R-250 mais 40% metanol durante 5 min, descorada com 50% de metanol e lavado em água. A banda Cry3Bb.60 foi removida com uma lâmina de barbear. A sequenciação terminal NH2 foi realizada em Tufts Medicai School, Department of Physiology (Boston, MA) usando processo de degradação de Edman automatizados convencionais. A sequência de aminoácidos terminal NH2 foi determinada como sendo SKRAQDR (SEQ ID NO:96), correspondendo aos aminoácidos 160-166 de Cry3Bb. A digestão com tripsina ocorreu no lado carboxilo do aminoácido R159 resultando na remoção de hélices 1-3. 5.29 Exemplo 29 - Bioactividade de Proteínas Cry3Bb* 5.29.1 Condições de Cultura e Determinação da Concentração Proteica

As culturas para os bioensaios de 1 dose foram crescidas em C2-P mais 5 μρ/ιηΐ de cloranfenicol (C2-P/cm5) depois diluído com 3 volumes de 0,005% de triton X-100®. As concentrações proteicas destas culturas não foram determinadas. As culturas para bioensaios de 8 doses foram 258 ΡΕ1040192 crescidas em C2/cm5, lavadas 1-2 vezes com 1-2 volumes de água estéril e ressuspensas em 1/10 volume de Triton X-100® a 0,005%. A concentração proteica da toxina de cada concentrado foi determinada como descrito por Brussock e Currier (1990), omitindo o tratamento com HEPES 3M. A concentração proteica foi ajustada a 3,2 mg/ml em 0,005% de Triton X-100® para a dose máxima do ensaio. Cry3Bb.60 foi produzida e guantificada através do ensaio de 8 doses como descrito na Secção 9.1. 5.29.2 Bioensaios de Insectos

Larvas de Diabrotica undecimpunctata Barber (lagarta da raiz do milho do sul ou SCWR) e Diabrotica virgifera virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho do oeste ou WCRW) foram criadas como descrito por Slaney et ai. (1992). Ensaios de oito doses e análises "probit" foram realizados como descrito por Slaney et al. (1992). Trinta e duas larvas foram testadas por dose a 50 μΐ de amostra por alvéolo de dieta (área de superfície de 175 mm2) . Os controlos positivos foram estirpes produtoras de Cry3Bb EG11037 ou EG11204. Todos os bioensaios foram realizados usando placas de 128 alvéolos contendo aproximadamente 1 ml de dieta por alvéolo com coberturas de filme poliéster Mylar perfurada (C-D International Inc., Pitman, NJ). Realizaram-se ensaios de uma dose essencialmente como anteriormente, excepto ter-se testado apenas 1 dose por estirpe. Todos os ensaios foram repetidos pelo menos duas vezes. 259 ΡΕ1040192

5.29.3 Resultados de Bioensaios com Insectos : Ensaios de 1 Dose Contra SCRW

Os resultados dos ensaios de 1 dose são expressos como a mortalidade relativa (RM) da estirpe experimental comparada com a selvagem (% de mortalidade da cultura experimental dividida pela % de mortalidade da cultura WT). As proteínas Cry3Bb alteradas e melhoradas derivadas dos plasmideos construídos usando os métodos de PCR™ introduzindo alterações ao acaso ou semi ao acaso na sequência do gene cry3Bb foram distinguidas de outras proteínas Cry3Bb alteradas mas não melhoradas repetindo o ensaio de 1 dose contra larvas SCRW. As proteínas apresentando aumento de actividade (definido como RM > 1,5) comparativamente com WT Cry3Bb ou, no caso de proteínas com combinações de locais alterados, comparativamente com uma proteína Cry3BB alterada "parental", foram ainda caracterizados pelo ensaio de 8 doses. 0 "padrão" de RM global, produzido pelo ensaio de 1 dose resulta de uma colecção de proteínas portadoras de alterações ao acaso ou semi ao acaso dentro de uma única região estrutural, e.g., em 1β2,3, pode ser usado para determinar se aquela região estrutural é importante para a bioactividade. A retenção dos níveis de actividade WT (RM « 1) indica que são toleradas alterações naquela região. A perda global de actividade (RM < 19) distingue as regiões como importantes para a bioactividade. ΡΕ1040192

5.29.4 Cry3Bb. 1β2,3: Resultados de Bioensaios de 1 Dose Contra SCRW A proteína Cry3Bb.ip2,3 é uma colecção de proteínas na região 1β2,3 de Cry3Bb (ver secção 5.3.4). Resultados típicos dos ensaios de 1-dose destas proteínas alteradas estão apresentados na Fig. 12. Os valores de RM para Cry3Bb.^2,3 são inferiores a 1, com poucas excepções dos valores perto de 1, indicando que esta região é importante para a toxicidade.

5.29.5 Cry3Bb.1β6,7: Resultados de Bioensaios de 1 Dose Contra SCRW A proteína Cry3Bb.^6,7 é uma colecção de proteínas na região 1β6,7 de Cry3Bb (ver secção 5.3.5). Resultados típicos dos ensaios de 1-dose destas proteínas alteradas estão apresentados na Fig. 13. Os valores de RM para Cry3Bb.^6,7 são inferiores a 1, com poucas excepções dos valores perto de 1, indicando que esta região é importante para a toxicidade.

5.29.6 Cry3Bb.ΙβΙΟ,11: Resultados de Bioensaios de 1 Dose Contra SCRW A proteína Cry3Bb.ΙβΙΟ, 11 é uma colecção de proteínas na região ΙβΙΟ,11 de Cry3Bb (ver secção 5.3.6). Resultados típicos dos ensaios de 1-dose destas proteínas alteradas estão apresnetados na Fig. 14. Os valores de RM para Cry3Bb.Ιβί0,11 são inferiores a 1, com poucas excepções dos valores perto de 1, indicando que esta região é importante para a toxicidade. 261 ΡΕ1040192

5.29.7 Resultados de Bioensaios com Insectos : Resultados de Ensaios de 8 Doses Contra SCRW

Os resultados dos ensaios de 8 doses são expressos como um valor de LC50 (concentração proteica dando 50% de mortalidade) com intervalos de confiança de 95%. Os valores de LC50 com intervalos de confiança de 95% das proteínas Cry3Bb alteradas mostrando actividades aumentadas contra larvas SCRW e os valores de LC50 do controlo WT Cry3Bb determinado na mesma altura estão apresentados na Tabela 13, juntamente com o número de vezes de aumento relativamente à actividade WT para cada uma das proteínas melhoradas.

Tabela 13

Proteínas Cry3Bb Alteradas Foram Testadas Contra Larvas SCRW em Duplicados de Ensaios de 8 Doses para Determinar os Valores de LC50 LC50 μ9/3ΐνέο1ο (95% C.I.) Proteína Proteína WT Cry3Bb Numero de ve- melhorada melhorada controlo zes do aumento relativamente à Actividade de WT WT Cry3Bb.6 0 6,7(5,3-8,4) 24,1(15-39) 3,6x Cry3Bb.11221 3,2(2,5-4) 20,5(14,529) 6,4x Cry3Bb.11222 7,3(6-9) 29,4(23-37) 4, Ox Cry3Bb.11223 10,5(9-12) 29,4(23-37) 2,8x 262 ΡΕ1040192

Tabela 13 (Continuação)

Proteína melhorada LC50 μg/alvéolo (95% C.I.) Proteína melhorada WT Cry3Bb controlo Numero de vezes do aumento relativamente à Actividade de WT Cry3Bb.11224 6,5(5,1-8,2) 32,5(25-43) 5, Ox Cry3Bb.11225 13,7(11-16,8) 49,5 (39-65) 3,6x Cry3Bb.11226 16,7(10,62-4,2) 49,5 (39-65) 3, Ox Cry3Bb.11227 11,1(9,1-13,5) 21,3(16-28) 1,9x Cry3Bb.11228 00 1 kD O 00 32,9(25-45) 4, lx Cry3Bb.11229 7,2(5, 8-8,8) 18,2(15-22) 2,5x Cry3Bb.11230 7,0(5,8-8,6) 32,9(25-45) 4, 7x Cry3Bb.11231 3,3(3,0-3,7) 26,1(22-31) 7, 9x Cry3Bb.11232 6,4(5, 4-7, 7) 32,9(25-45) 5, lx Cry3Bb.11233 15,7(12-20) 32,9(25-45) 2,2x Cry3Bb.11234 7(6-9) 29(22-39) 4, lx Cry3Bb.11235 4,2 (3,6-4,9) 13,3 (10-17) 3,2x Cry3Bb.11236 11,6(9-15) 36,4(27-49) 3, lx Cry3Bb.11237 6,8(4-11) 36,4(27-49) 5, 4x Cry3Bb.11238 13,9 (11-17) 36,4(27-49) 2,6x Cry3Bb.11239 13,0(10-16) 36,4(27-49) 2, 8x Cry3Bb.11241 11(7-16) 29(22-39) 2,6x Cry3Bb.11242 11,9(9,2-16) 30(23-38) 2,5x Cry3Bb.11032 4,2 (3,6-4,9) 13,3 (10-17) 3, lx Cry3Bb.11035 10,3(8-13) 27, 9 (23-34) 2, 7x Cry3Bb.11036 6,5(5, 1-7,9) 27, 9 (23-34) 4,3x 263 ΡΕ1040192

Tabela 13 (Continuação) LC50 μg/alvéolo (95% C.I.) Proteína melhorada Proteína melhorada WT Cry3Bb controlo Numero de vezes do aumento relatívamente à Actividade de WT Cry3Bb.11046 12,1(8-19) 31,2(25-39) 2,6x Cry3Bb.11048 8,3 (6-11) 35,4(24-53) 4, 3x Cry3Bb.11051 11,8(8-16) 35,4(24-53) 3, Ox Cry3Bb.11057 8,8(7-11) 29,5(24-36) 3,4x Cry3Bb.11058 9,6(6-14) 33,4(27-43) 3,5x Cry3Bb.11081 8,5(7-11) 51,5(37-79) 6, lx Cry3Bb.11082 10,6(8-13) 51,5(37-79) 4, 9x Cry3Bb.11083 7,0(5-10) 51,5(37-79) 7, 4x Cry3Bb.11084 7,2 (4-12) 51,5(37-79) 7,2x Cry3Bb.11095 11,1(9-14) 51,5(37-79) 4,6x Cry3Bb.11098

5.29.8 Resultados de Bioensaios com Insectos : Ensaios de 8 Doses Contra WCRW

As larvas de WCRW são delicadas e difíceis de trabalhar. Assim, apenas algumas das Cry3Bb alteradas apresentando actividade melhorada contra larvas de SCWT foram igualmente testadas contra larvas de WCRW em ensaios de 8 doses. As determinações de LC50 para as proteínas Cry3Bb alteradas estão apresentadas na Tabela 14 juntamente 264 ΡΕ1040192 com os valores de LC50 do controlo WT Cry3Bb determinado na mesma altura.

Tabela 14

Proteínas Cry3Bb* Apresentando Actividade Melhorada Contra Larvas de SCRW Também Apresentam Actividade Melhorada Contra Larvas de WCRW LC50 μρ/alvéolo (95% C.I.) Proteína Proteína WT Cry3Bb Número de melhorada melhorada controlo vezes do aumento relativamente a WT EG11083 6,3(4,7-8,2) 63,5(46-91) 10, lx EG11230 24,2(13-40) 4,5(2,1-7,4) 5, 4x EG11231 32,2 (14-67) 2,5(1,7-3,6) 12, 9x 5.30 Exemplo 30 - Actividade de Canal

Os canais iónicos produzidos por Cry3Bb e alguns dos seus derivados foram medidos pelos métodos descritos por Slatin et al., (1990). Nalguns casos, as bicamadas lipidicas foram preparadas a partir de uma mistura de 4:1 de fosfatidiletanolamina (PE):fosfatidilcolina (PC). A proteína toxina foi solubilizada a partir de culturas de B. thuringiensis em meio C2 lavadas com KOH 12 mM. Após centrifugação para remover esporos e outros detritos, 10 μρ de proteína toxina solúvel foi adicionado ao compartimento cis (4,5 volumes) da câmara da membrana. A concentração protei- 265 ΡΕ1040192 ca foi determinada usando o ensaio BCA Protein Assay (Pierce). 5.30.1 Actividade de Canal Iónico de WT Cry3Bb

Quando da exposição a membranas de lipidos negras, Cry3Bb forma canais iónicos com vários estados de condutância. Os canais formados por Cry3Bb são raramente canais discretos com estados de abertura e fecho bem resolvidos e geralmente requerem incubação da toxina com a membrana durante 30-45 min antes de serem observados quaisquer eventos tipo canal. Após formação das condutân-cias iniciais, o tamanho aumenta entre aproximadamente 200 pS e mais de 10 000 pS durante 2-3 h. Apenas as pequenas condutâncias (< 200 pS) são dependentes de voltagem. Acima de 200 pS, as condutâncias são completamente simétricas. Os canais de Cry3Bb também apresentam activação dependente de β-mercaptoetanol, crescendo de condutâncias de pequenos canais de « 200 pS até vários milhares de pS dentro de 2 min após a adição de β-mercatoetanol ao compartimento cis da câmara de membranas. 5.30.2 Cry3Bb.11032 A actividade de canal de Cry3Bb.11032 é muito semlhante a WT Cry3Bb quando a proteína toxina solubilizada é adicionada ao compartimento cis da câmara de membranas. No entanto, quando esta proteína é artificialmente incorporada na membrana através da formação ou "pintura" da 266 ΡΕ1040192 membrana na presença da proteína Cry3Bb.11032, foi observado um aumento de 16 vezes nas condutâncias de canal iniciais (¾ 4000 pS) . Este fenómeno não foi observado com WT Cry3Bb. 5.30.3 Cry3Bb.11035

Quando da exposição a membranas artificiais, a proteína Cry3Bb.11035 forma espontaneamente canais que crescem para condutâncias maiores dentro de um tempo relativamente curto (~ 5 min) . Os valores de condutância variam entre 3000 e 6000 pS e, tal como WT Cry3Bb, são dependentes de voltagem em valores de condutância baixos. 5.30.4 Cry3Bb.11048 A proteína Cry3Bb.11048 é muito diferente de WT Cry3Bb pelo facto de parecer não formar canais mas, antes, forma poros simétricos relativamente à voltagem. Uma vez formado o poro, ele permanece aberto e permite uma condutância estável variando entre 25 e 130 pS. 5.30.5 Cry3Bb. 11224 e Cry3Bb. 11226 O local de ligação a metais de WT Cry3Bb, formado por H231 na estrutura dimérica, foi removido nas proteínas Cry3Bb.11224 e Cry3Bb.11226. As condutâncias formadas por proteínas alteradas são idênticas às de WT Cry3Bb com a 267 ΡΕ1040192 excepção de nenhuma das proteínas alteradas apresentar activação dependente de β-mercaptoetanol. 5.30.6 Cry3Bb.11221 A proteína Cry3Bb.11221 foi observada como formando imediatamente pequenos canais de 100-200 pS com dependência limitada da voltagem. Algumas condutâncias mais elevadas foram observadas no potencial negativo. Noutros estudos, o estabelecimento de actividade foi retardado em 27 min, que é mais típico para WT Cry3Bb. Ao contrário de WT Cry3Bb, no entanto, Cry3Bb.11221 forma canais de 600 pS bem resolvidos com longos estados de abertura. A proteína eventualmente atinge condutâncias de 700 pS. 5.30.7 Cry3Bb.11242 A proteína Cry3Bb.11242 forma pequenas condutâncias imediatamente quando da exposição a uma membrana artificial. A condutância cresce estavelmente e rapidamente até 6000 pS em aproximadamente 3 min. Alguma dependência da voltagem foi observada, com uma preferência para uma voltagem negativa imposta. 5.30.8 Cry3Bb.11230

Ao contrário de WT Cry3Bb, Cry3Bb.11230 forma canais bem resolvidos com longos estados de abertura que não continuam a crescer em condutância com o tempo. As 268 ΡΕ1040192 condutâncias máximas de canal observadas atingiram 3000 pS. FIG. 15 ilustra a diferença entre os canais formados por Cry3Bb e Cry3Bb.11230. 5.30.9 Cry3Bb.60

Cry3Bb.60 forma canais iónicos bem resolvidos dentro de 20 min de exposição a uma membrana artificial. Estes canais crescem em condutância e frequência com o tempo. O comportamento de Cry3Bb.60 numa bicamada lipídica planar difere de Cry3Bb em duas formas significativas. As condutâncias criadas por Cry3Bb.60 formam-se mais rapidamente do que Cry3Bb e, ao contrário de cry3Bb, as condutâncias são estáveis, tendo estados de abertura e fecho bem resolvidos de canais iónicos estáveis (FIG. 16). 5.31 Exemplo 31 - Composições de sequências iniciadoras

Tabela 15 SEQ ID NO:83 % de nucleótidos na mistura Código A T G C N 25 25 25 25

Tabela 16 SEQ ID NO:84 % de nucleótidos na mistura Código A T G C N 25 25 25 25 269 ΡΕ1040192

Tabela 17 SEQ ID NO:85 % de nucleótidos na mistura Código A T G C B 16 16 52 16 D 70 10 10 10 N 25 25 25 25 Tabela 18 SEQ ID NO:86 % de nucleótidos na mistura Código A T G C E 82 6 6 6 F 6 6 6 82 J 6 82 6 6 I 6 6 82 6 N 25 25 25 25 Tabela 19 SEQ ID NO:88 % de nucleótidos na mistura Código A T G C J 6 82 6 6 E 82 6 6 6 H 1 1 1 97 I 6 6 82 6 K 15 15 15 55 R 15 55 15 15 270 ΡΕ1040192

Tabela 20 SEQ ID NO:83 % de nucleótidos na mistura Código A T G C J 6 82 6 6 F 6 6 6 82 N 25 25 25 25 E 82 6 6 6 I 6 6 82 6 L 8 1 83 8 0 1 1 1 97 Tabela 21 SEQ ID NO:91 % de nucleótidos na mistura Código A T G C J 6 82 6 6 E 82 6 6 6 H 1 1 1 97 I 6 6 82 6 N 25 25 25 25 M 82 2 8 8 Tabela 22 SEQ ID NO:92 % de nucleótidos na mistura Código A T G C J 6 82 6 6 Q 0 9 82 9 F 6 6 6 82 N 25 25 25 25 E 82 6 6 6 I 6 6 82 6 271 ΡΕ1040192

Tabela 23 SEQ ID NO:92 Código % de nucleótidos na mistura A T G c J 6 82 6 6 F 6 6 6 82 N 25 25 25 25 E 82 6 6 6 I 6 6 82 6

Tabela 24 SEQ ID NO:95 % de nucleótidos na mistura Código A T G C J 6 82 6 6 N 25 25 25 25 E 82 6 6 6 I 6 6 82 6 M 82 2 8 8 P 8 2 8 82 S 1 97 1 1 5.32 Exemplo 32 - Coordenadas Atómicas Para Cry3Bb As coordenadas atómicas para a proteína Cry3Bb estão apresentadas no Apêndice incluído na Secção 9.1. 272 ΡΕ1040192

5.33 Exemplo 32 - Coordenadas Atómicas Para Cry3A

As coordenadas atómicas para a proteína Cry3A estão apresentadas no Apêndice incluído na Secção 9.2. 5.34 Exemplo 34 - Modificação de Genes cry para Expressão em Plantas.

Sabe-se que os genes cry selvagens são fracamente expressos em plantas como um gene de tamanho completo ou como um gene truncado. Tipicamente, o teor G+C de um gene cry é baixo (37%) e muitas vezes possui muitas regiões ricas em A+T, potenciais locais de poliadenilação e numerosas sequências ATTTA. A Tabela 25 mostra uma lista de potenciais sequências de poliadenilação que deverão ser evitadas quando da preparação da construção do gene "plantizado".

Tabela 25

Lista de sequências dos potenciais locais de poliadenilação

AATAAA1 AATAAT1 AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA1 2 AATTAA1 1 AATACA1 1 CATAAA1 1 indica um potencial local de poliadenilação maior vegetal. 2 indica um potencial local de poliadenilação menor animal. 273 ΡΕ1040192

Todos os outros são potenciais locais de poliadenilaçao menor de plantas.

As regiões para mutagénese podem ser seleccio-nadas como se segue. Foram identificadas todas as regiões da sequência de DNA do gene cry contendo cinco ou mais pares de bases consecutivas que eram A ou T. Estes foram ordenados em termos de comprimento e percentagem mais elevada de A+T na sequência envolvente ao longo de uma região de 20-30 pares de bases. O DNA foi analisado relativamente às regiões que devem conter locais de poliadenilação ou sequências ATTTA. Foram então projectados oligonucleótidos que maximizam a eliminação de regiões consecutivas de A+T que continham um ou mais locais de poliadenilação ou sequências ATTTA. Demonstrou-se, com base em trabalhos publicados, que dois potenciais locais de poliadenilação são mais críticos. Foram seleccionados codões com G+C aumentado, mas que não geram locais para enzimas de restrição úteis para clonagem e montagem do gene modificado (e.g., BamHI, BglII, Seal, Ncol, EcoRI, etc.) Igualmente foram evitados codões que possuem os pares TA ou GC, os quais são descritos como sendo raros em plantas.

Se bem que o promotor CaMV35S seja geralmente um promotor constitutivo de elevado nível na maior parte dos tecidos vegetais, o nível de expressão dos genes dirigidos pelo promotor CaMV35S é baixo em tecido floral relativamente aos níveis observados em tecido foliar. Devido aos alvos economicamente importantes danificados por alguns 274 ΡΕ1040192 insectos serem as partes florais ou derivadas das partes florais (e.g., quartos e bolas de algodão, rebentos de tabaco, rebentos e frutos de tomateiro), é muitas vezes vantajoso aumentar a expressão de proteínas do cristal nestes tecidos relativamente à obtida com o promotor CaMV35S. 0 promotor 35S do vírus do mosaico da escrofu-lária (FMV) é análogo ao promotor de CaMV35S. Este promotor foi isolado e inserido num vector de transformação de plantas. Relativamente ao promotor CaMV, o promotor FMV 35S é altamente expresso no tecido floral, enquanto proporciona simultaneamente níveis elevados de expressão génica noutros tecidos tais como a folha. Pode ser construído um vector de transformação de plantas em que o gene cry sintético de tamamnho completo é dirigido pelo promotor 35S de FMV. As plantas do tabaco podem ser transformadas com o vector e comparadas relativamente à expressão da proteína do cristal por transferência Western ou imunoensaio de ELISA no tecido foliar e floral. 0 promotor FMV foi usado para produzir níveis relativamente elevados da proteína do cristal em tecido floral comparativamente com o promotor CaMV. 5.35 Exemplo 35 - Expressão de Genes cry Sintéticos com Promotores ssRUBISCO e Peptídeos de Trânsito para o Cloroplasto.

Os genes em plantas codificadores da subunidade pequena de RUBISCO (SSU) são muitas vezes altamente expressos, regulados pela luz e por vezes mostram especificidade 275 ΡΕ1040192 de tecido. Estas propriedades de expressão são largamente devidas às sequências do promotor destes genes. Foi possível usar os promotores SSU para expressar genes heterólo-gos em plantas transformadas. Tipicamente uma planta possuirá múltiplos genes SSU e os níveis de expressão e especificidade de tecido de diferentes genes SSU serão diferentes. As proteínas SSU são codificadas no núcleo e sintetizadas no citoplasma como precursores que possuem uma extensão N-terminal conhecida como peptídeo de trânsito para o cloroplasto (CTP) . CTP dirige o precursor para o cloroplasto e promove a internalização da proteína SSU para o cloroplasto. Neste processo, o CTP é clivado da proteína SSU. Estas sequências CTP foram usadas para dirigir as proteínas heterólogas para os cloroplastos das plantas transformadas.

Os promotores SSU deverão ter várias vantagens para a expressão de genes de proteínas heterólogas em plantas. Alguns promotores SSU são altamente expressos e podem originar níveis tão elevados como os observados com o promotor CaMV35S. A distribuição nos tecidos da expressão a partir de promotores SSU é diferente da do promotor CaMV35S, assim para o controlo de algumas pragas de insec-tos, poderá ser vantajoso dirigir a expressão de proteínas do cristal naquelas células em que SSU é mais altamente expresso. Por exemplo, se bem que relativamente constitutivo, na folha o promotor CaMV35S é mais altamente expresso em tecido vascular do que nalgumas partes da folha, enquanto que os promotores SSU são mais altamente expressos 276 ΡΕ1040192 nas células do mesófilo da folha. Alguns promotores SSU são igualmente mais específicos de tecido, assim será possível utilizar um promotor SSU específico para expressar a proteína do presente invento em apenas uma subsérie de tecidos vegetais se, por exemplo, a expressão de tal proteína em determinadas células for mais prejudicial para essas células. Por exemplo, para o controlo do escaravelho da batateira do Colorado, pode ser vantajoso usar os promotores SSU para dirigir a expressão da proteína do cristal nas folhas mas não no tubérculo comestível. A utilização de sequências CTP SSU para localizar proteínas do cristal no cloroplasto deverá ser igualmente vantajoso. A localização das proteínas do cristal de B. thuringiensis no cloroplasto poderá proteger estes de proteases encontradas no citoplasma. Isto poderá estabilizar as proteínas e conduzir a níveis mais elevados de acumulação da toxina activa. Os genes cry contendo o CTP poderão ser usados em combinação com o promotor SSU ou com outros promotores tais como CaMV35S. 5.36 Exemplo 36 - Direccionamento de Proteínas Cry* para o Espaço Extracelular ou Vacúolo através da Utilização de Peptídeos Sinal.

As proteínas de B. thuringiensis produzidas a partir dos genes sintéticos aqui descritos estão localizados no citoplasma da célula vegetal e esta localização citoplasmática resulta em plantas que são eficazes como insecticidas. Pode ser vantajoso para alguns fins dirigir 277 ΡΕ1040192 as proteínas de B. thuringiensis para outros compartimentos da célula vegetal. A localização das proteínas de B. thuringiensis em compartimentos diferentes do citoplasma pode resultar em menor exposição das proteínas de B. thuringiensis às proteases citoplasmáticas conduzindo a uma maior acumulação da proteína originando maior actividade insecticida. A localização extracelular poderá conduzir a exposição mais eficiente de certos insectos às proteínas de B. thuringiensis conduzindo a uma maior eficácia. Se uma proteína de B. thuringiensis for prejudicial para uma função da célula vegetal, então a localização num compartimento não citoplasmático poderá proteger estas células da proteína.

Em plantas, assim como noutros eucariotas, as proteínas que se destinam a ser localizadas extracelular-mente ou em vários compartimentos específicos são tipicamente sintetizadas com uma extensão N-terminal conhecida como o peptídeo sinal. Este peptídeo sinal dirige a proteína para a via de compatimentalização e é tipicamente clivado da proteína madura como um passo precoce da compartimentalização. Para uma proteína extracelular, a via secretória tipicamente envolve, durante a tradução, a inserção no retículo endoplasmático com clivagem do peptídeo sinal nesta fase. A proteína madura passa então através do Golgi para vesículas que se fundem com a membrana plasmática, resultando assim na libertação da proteína para o espaço extracelular. As proteínas destinadas a outros compartimentos seguem uma via semlhante. Por exemplo, 278 ΡΕ1040192 proteínas destinadas ao retículo endoplasmático ou ao Golgi seguem este esquema, mas são especificamente retidas no compartimento adequado. Nas plantas algumas proteínas são igualmente dirigidas para o vacúolo, um outro compartimento membranar no citoplasma de muitas células vegetais. As proteínas dirigidas para o vacúolo divergem da via atrás referida no Golgi onde entram em vesículas que se fundem com o vacúolo.

Uma característica comum deste direcionamento de proteínas é o peptídeo sinal que inicia o processo de compartimentalização. A fusão de um peptídeo sinal com uma proteína conduzirá, em muitos casos, ao direcionamento da proteína para o retículo endoplasmático. A eficiência deste passo pode depender igualmente da sequência da própria proteína madura. Os sinais que dirigem uma proteína para um compartimento específico em vez do espaço extracelular não está claramente definido. Parece que muitos dos sinais que dirigem a proteína para compartimentos específicos estão contidos dentro da sequência de aminoácidos da proteína madura. Isto foi demonstrado para algumas proteínas direccionadas para os vacúolos, mas não é ainda possível definir com precisão estas sequências. Parece que a secreção para o espaço extracelular é a via de "defeito" para uma proteína que contem uma sequência sinal mas sem outros sinais de compartimentalização. Assim, uma estratégia para dirigir as proteínas de B. thuringiensis para fora do citoplasma é fundir os genes de B. thu- 279 ΡΕ1040192 ringiensis sintéticos com sequências de DNA codificadoras de peptideos sinais vegetais conhecidos. Estes genes de fusão darão origem a proteínas de B. thuringiensis que entram na via secretória e conduzem à secreção extracelular ou direccionamento para o vacúolo ou para outros compartimentos. Têm sido descritas sequências sinal para vários genes vegetais. Uma dessas sequências é da proteína PRlb relacionada com a patogénese do tabaco que foi anterior-mente descrita (Cornelissen et al., 1986). A proteína PRlb está normalmente localizada no espaço extracelular. Um outro tipo de peptídeo sinal está contido nas proteínas de armazenamento de sementes dos legumes. Estas proteínas estão localizadas no corpo proteico das sementes, que é um compartimento do tipo vacúolo encontrado em sementes. Uma sequência de DNA de peptídeo sinal para a subunidade β da proteína de armazenamento 7S do feijão comum (Phaseolus vulgaris) , PvuB foi descrita (Doyle et al., 1986). Baseado nestas sequências publicadas, os genes podem ser sin-tetisados quimicamente usando oligonucleótidos que codificam os peptideos sinal de PRlb e PvuB. Nalguns casos para se conseguir secreção ou compartimentalização de proteínas heterólogas, pode ser necessário incluir uma sequência de aminoácidos para além do local de clivagem normal do peptídeo sinal. Isto pode ser necessário para assegurar a clivagem correcta do peptídeo sinal. 280 ΡΕ1040192 5.37 Exemplo 37 - Isolamento de Milho Transgénico Resistente a

Diabrotica spp. Usando Variantes de Cry3Bb. 5.37.1 Construção de Genes Vegetais A expressão de um gene vegetal, que existe na forma de DNA de cadeia dupla, envolve a transcrição de RNA mensageiro (mRNA) a partir de uma cadeia do DNA pela enzima RNA polimerase e subsequente processamento do transcrito primário de mRNA dentro do núcleo. Este processamento envolve uma região 3' não traduzida que adiciona nucleó-tidos poliadenilados ao extremo 3' do RNA. A transcrição do DNA em mRNA é regulada por uma região de DNA geralmente referida como o "promotor". A região do promotor contem uma sequência de bases que sinaliza a RNA polimerase para se associar ao DNA e iniciar a transcrição de mRNA usando uma das cadeias de DNA como uma matriz para preparar a cadeia de RNA correspondente.

Uma série de promotores que são activos em células vegetais foram descritos na literatura. Tais promotores podem ser obtidos a partir de plantas ou de virus de plantas e incluem, mas não estão limitados aos promotores da nopalina sintetase (NOS) e ocotpina sintetase (OCS) (os quais existem em plasmideo indutores de tumores de Agrobacterium tumefaciens) , os promotores 19S e 35S virus do mosaico da couve flor (CaMV), o promotor induzivel pela luz da subunidade pequena de ribulose 1,5-bifosfato carboxilase (ssRUBISCO, um polipeptídeo vegetal muito 281 ΡΕ1040192 abundante) e o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (FMV). Todos estes promotores foram usados para criar vários tipos de construções de DNA que foram expressos em plantas (ver e.g., Patente U.S. N° 5463175). 0 promotor particular seleccionado deverá ser capaz de causar suficiente expressão da sequência codificadora da enzima para resultar na produção de uma quantidade eficaz da proteína. Uma série de promotores preferidos são promotores constitutivos tais como os promotores CaMV35S ou FMV35S que dão níveis elevados de expressão na maior parte dos órgãos vegetais (Patente U.S. N° 5378619). Uma outra série de promotores preferidos são promotores estimulados na raiz ou promotores específicos tais como o promotor 4 as-1 derivado de CaMV ou o promotor P0X1 de trigo (Patente U.S. N°5023179; Hertig et ai., 1991). Os promotores estimulados ou específicos da raiz serão particularmente preferidos para o controlo da lagarta do milho (Diabroticus spp.) em plantas de milho transgénicas.

Os promotores usados nas construções de DNA (i.e. genes vegetais quiméricos) do presente invento podem ser modificados, caso se pretenda, para afectar as suas carac-terísticas de controlo. Por exemplo, o promotor CaMV35S pode ser ligado à porção do gene ssRUBISCO que reprime a expressão de ssRUBISCO na ausência de luz, para criar promotor que é activo em folhas mas não nas raízes. promotor quimérico resultante pode ser usado como aqui descrito. Para fins desta descrição, a frase promotor 282 ΡΕ1040192 "CaMV35" inclui assim variações do promotor CaMV35S, e.g., promotores derivados por meio de ligação a regiões de operador, mutagénese ao acaso ou controlada, etc. Ainda, os promotores podem ser alterados de forma a conterem múltiplas "sequências estimuladoras" para contribuir para o aumento da expressão génica. 0 RNA produzido por uma construção de DNA do presente invento também contem uma sequência líder 5' não traduzida. Esta sequência pode ser derivada do promotor seleccionado para expressar o gene e pode ser especifi-camente modificada de forma a aumentar a tradução do mRNA. As regiões 5' não traduzidas podem ser igualmente obtidas a partir do RNA virai, a partir de genes eucarióticos adequados ou a partir de uma sequência génica sintética. 0 presente invento não está limitado a construções em que a região não traduzida deriva da sequência 5' não traduzida que acompanha a sequência do promotor.

Para a expressão optimizada em plantas monoco-tiledóneas, tais como milho, deverá ser incluído um intrão na construção de expressão de DNA. Este intrão será tipicamente substituído perto do extremo 5' do mRNA na sequência não traduzida. Este intrão poderá ser obtido, mas não está limitado a uma série de intrões consistindo no intrão hsp70 de milho (Patente U.S. N° 5424412; especificamente aqui incorporado por referência) ou no intrão Actl de arroz (McElroy et al., 1990). Como se mostra abaixo, o intrão hsp70 do milho é útil no presente invento. 283 ΡΕ1040192

Conforme referido atrás, a região 3' não traduzida dos genes vegetais quiméricos do presente invento possuem um sinal de poliadenilação que funciona em plantas de forma a causar a adição dos nucleótidos adenilato ao extremo 3' do RNA. São exemplos de regiões 3' preferidas (1) as regiões 3' transcritas não traduzidas contendo o sinal de poliadenilação de genes do plasmídeo indutor de tumores em Agrobacterium (Ti), tais como o gene da nopalina sintetase (NOS) e (2) os genes de plantas tais como o gene ssRUBISCO E9 da ervilheira (Fischhoff et al., 1987). 5.37.2 Transformação e Expressão em Plantas

Um gene vegetal quimérico contendo uma sequência codificadora estrutural do presente invento pode ser inserido no genoma de uma planta por qualquer método adequado. Os vectores de transformação vegetais adequados incluem os derivados de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, assim como os descritos, e.g., por Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) e Publicação do Pedido de Patente Europeia N° EP0120516. Para além dos vectores de transformação de plantas derivados dos plasmídeos Ti ou indutores de raízes (Ri) de Agrobacterium, podem ser usados métodos alternativos para inserir as construções de DNA deste invento em células vegetais. Tais métodos podem envolver, por exemplo, a utilização de lipossomas, electroporação, agentes químicos que aumentam a internalização de DNA livre, introdução de DNA livre via 284 ΡΕ1040192 bombardeamento com microprojécteis e transformação usando vírus ou pólen (Fromm et al., 1986; Armstrong et al., 1990; Frommet al., 1990). 5.37.3 Construção de Vectores de Expressão de Plantas Monocotiledóneas para Variantes de cry3Bb 5.37.3.1 Projecção de Genes Variantes de cry3Bb para a Expressão em Plantas

Para a expressão eficiente das variantes cry3Bb em plantas transgénicas, o gene codificador das variantes deve ter uma composição de sequências adequada (Diehn et al., 1996). Um exemplo de tal sequência está apresentado para o gene vll231 (SEQ ID NO: 99) que codifica a proteína variante Cry3Bbll231 (SEQ ID NO:100) com actividade Diabrotica. Este gene foi obtido por mutagénese (Kunkel, 1985) de um gene cry3Bb sintético (SEQ ID NO: 101) codificador de uma proteína essencialmente homóloga da proteína codificada pelo gene cry3Bb nativo (Número de acesso do GenBank m89794, SEQ ID NO: 102). Os oligonucleótidos que se seguem foram usados na mutagénese do gene sintético original cry3Bb (SEQ ID NO:101) para criar o gene vll231 (SEQ ID NO:99):

Oligo#l: 5'-TAGGCCTCCATCCATGGCAAACCCTAACAATC-3' (SEQ ID NO:103) ΡΕ1040192 285 01igo#2: 5'-TCCCATCTTCCTACTTACGACCCTGCAGAAATACGGTCCAAC-3' (SEQ ID NO:104)

Oligo#3: 5'-GACCTCACCTACCAAACATTCGATCTTG-3' (SEQ ID NO:105)

Oligo#4: 5'-CGAGTTCTACCGTAGGCAGCTCAAG-3' (SEQ ID NO:106) 5.37.3.2 Construção do Vector de Expressão de Cry3Bb em Plantas Monocotiledóneas

Para colocar o gene variante de cry3Bb vll232 num vector adequado para a expressão em plantas monocotiledóneas (i.e. sob o controlo do promotor com estimulador 35S do vírus do mosaico da couve flor e ligado ao intrão hsp70 seguido de um local de poliadenilação da nopalina sintetase como na Patente U.S. N° 5424412, aqui incorporada especificamente como referência), o vector pMONl9469 foi digerido com NcoI e EcoRI. A banda maior do vector de apro-ximadamente 4,6 Kb foi sujeita a electroforese, purificada e ligada com DNA ligase de T4 ao fragmento NcoI-EcoRI de aproximadamente 2 Kb contendo o gene vll231 (SEQ ID NO:99). A mistura de ligação foi usada para transformada E. coli, recuperadas as colónias resistentes a carbenicilina e o DNA de plasmídeo recuperado pelo processo de minipreparação de 286 ΡΕ1040192 DNA. Este DNA foi sujeito a análise com enzimas de restrição, com enzimas tais como NcoI e EcoRI (em conjunto), NotI e PstI para identificar clones contendo pMON33708 (a sequência codificadora de vll231 fundida com o intrão hsp70 sob o controlo do promotor CaMV35S com estimulador).

Para colocar o gene vll231 num vector adequado para a recuperação de plantas estavelmente transformadas e resistentes a insectos, o fragmento de restrição iVotl de 3,75 Kb derivado de pMON33708, contendo a sequência codificadora da lisina oxidase fundida com o intrão hsp70 sob o controlo do promotor CaMV35S com estimulador, foi isolado por electroforese em gel e purificação. Este fragmento foi ligado a pMON30460 tratado com NotI e fosfa-tase alcalina intestinal de vitela (pMON30460 contem a sequência codificadora da neomicina fosfotransferase sob o controlo do promotor CaMV35S). As colónias resistentes à canamicina foram obtidas por transformação desta mistura de ligação em E. coli e as colónias contendo pMON33710 identificadas por digestão com endonucleases de restrição dos DNAs das minipreparações de plasmideo. Enzimas de restrição tais como NotI, EcoRV, HindIII, NcoI, EcoRI e f3g_Z.il podem ser usadas para identificar os clones adequados contendo o fragmento iVotl de pMON33708 no local Not I de pMON30460 (i.e. pMON3710) numa orientação tal que ambos os genes ficam em tandem (i.e. o extremo 3' da cassete de expressão vll231 fica ligado ao extremo 5' da cassete de expressão nptll). A expressão da proteína vll231 por pMON33710, em cloroplastos de milho, foi confirmada por electroporação de DNA de pMON33710 em protoplastos seguido de transferência 287 ΡΕ1040192 das proteínas e análise por ELISA. Este vector pode ser introduzido no DNA genómico de embriões de milho por bombardeamento com pistola de partículas, seguido de selecção com paromomicina para se obter plantas expressando o gene vll232 essencialmente como descrito na Patente U.S. N° 5424412, especificamente aqui incluído como referência.

Neste exemplo, o vector foi introduzido via cobombardeamento com um plasmídeo que confere resistência a higromicina em escutelos de embriões imaturos (IES) de milho, seguido de selecção com higromicina e regeneração. Linhas de milho transgénicas expressando a proteína vll231 foram identificadas por análise de ELISA. As sementes da progénie destes eventos foram subsequentemente testadas relativamente à protecção da alimentação por Diabrotica. 5.37.3.3 Desempenho in planta de Cry3Bb . 11231

As plantas de milho transformadas expressando Cry3Bb.11231 foram testadas com larvas da lagarta da raiz do milho ocidental (WCR) num ensaio de plantação de plântulas em vasos de 25,4 cm. 0 genótipo transformado foi A634, enquanto que a progénie do cruzamento RO com A634 foi avaliada. As observações incluíram o efeito no desenvolvimento larvar (peso), velocidade de destruição das raízes (RDR) e expressão proteica. 0 vector de transformação contendo o gene cry3Bb foi pMON33710. Os tratamentos incluíram isopopulações positivas e negativas para cada evento e um teste A634. 288 ΡΕ1040192 0 ensaio das plântulas consistiu nos seguintes passos: (i) sementes isoladas foram colocadas em copos de 1 onça contendo terra de envasamento; (ii) quando do rebentamento, cada plântula foi infestada com 4 larvas recém eclodidas; e (iii) após infestação, as plântulas foram incubadas durante 7 dias a 25°C, 50% RH e 14:10 (L:D) de fotoperiodo. A humidade adequada foi aplicada ao solo dos vasos durante o periodo de incubação para manter o vigor da plântula. O ensaio dos vasos de 10 polegadas consistiu nos seguintes passos: (i) sementes isoladas foram colocadas em vasos de 10 polegadas contendo terra de envasamento; (ii) aos 14 dias após sementeira, cada vaso foi infestado com 800 ovos, os quais tinham sido pré-incubados de forma a que a eclosão ocorresse 5-7 dias após infestação; e (iii) após infestação, as plantas foram incubadas durante 4 semanas nas mesmas condições ambientais do ensaio das plântulas. Os vasos foram irrigados por baixo e por cima diariamente.

Para o ensaio das plântulas, no dia 7 as plantas foram classificadas de acordo com a destruição da raiz e as larvas sobreviventes foram pesadas. Igualmente nesta altura, as concentrações da proteína Cry3Bb nas raízes foram determinadas por ELISA. A escala usada para o ensaio das plântulas para avaliar a destruição das raízes é como se segue: RDR (taxa de destruição da raiz) 0 = sem alimentação visível; RDR 1 = alimentação muito ligeira; RDR 2 = alimentação ligeira; RDR 3 = alimentação moderada; RDR 4= alimentação abundante; e RDR 5 = alimentação muito abundante. 289 ΡΕ1040192

Os resultados do ensaio das plântulas estão apresentados na Tabela 26. As plantas expressando a proteína Cry3Bb foram completamente protegidas da alimentação por WCR, enquanto que as larvas que sobreviveram a este tratamento não tinham crescido. Os pesos médios das larvas variaram entre 2,03 e 2,73 mg para os tratamentos sem expressão, enquanto que as larvas sobreviventes pesavam em média 0,11 g no tratamento com expressão de cry3Bb. As taxas de destruição de raízes foram 3,86 e 0,33 para as isopopulações sem expressão e com expressão, respectivamen-te. A sobrevivência larvar variou entre 75 e 85% para os tratamentos negativos e a testar, em que apenas 25% das larvas sobreviveram ao tratamento com Cy3Bb.

Tabela 26

Efeito de Plantas que Expressam Cry3Bb nas Larvas WCR num Ensaio com

Plântulas

Plantas Larvas Evento Tratamento N Raiz RDR+DP N % Média+DP (ppm) Sob peso (mg) 16 Negativo 7 O O 3,86+0,65 21 75 2,73+1,67 16 Positivo 3 29,01 0,33+0,45 3 25 0,11+0,07 A634 Teste 4 O O - 13 81 2,03+0,83

Para o ensaio dos vasos (25,4 cm), às 4 semanas após infestação o peso das plantas foi registado e foi 290 ΡΕ1040192 atribuída uma classificaçao de destruição das raízes (Escala 1-6 de Iowa; Hills e Peters, 1971) .

Os resultados do ensaio com os vasos de 25,4 cm estão apresentados na Tabela 27. As plantas que expressavam a proteína Cry3Bb tinham significativamente menos alimentação e estavam mais altas do que as plantas que não expressavam a proteína. O evento 16, o mais elevado dos dois eventos de expressão proporcionou quase controlo completo. Os tratamentos negativos tiveram taxas de destruição de raízes muito elevadas indicando uma pressão muito grande pelos insectos. As avaliações de destruição média de raízes positivas foram de 3,4 e 2,2 para o evento 6 e 16, respectivamente. RDR média para o tratamento negativo foi de 5,0 e 5,6.

Tabela 27

Efeito do Milho que Expressa Cry3Bb no Controlo da Alimentação das Larvas WCR num Ensaio com Vasos de 10 Polegadas

Evento Tratamento N Raiz (ppm) RDR±DP Altura da planta (cm) 6 Negativo 7 O O 5,0+1,41 49,7+18,72 6 Positivo 5 7,0 3,4+1,14 73,9+8,67 16 Negativo 5 O o 5,6+0,89 61,2+7,75 16 Positivp 5 55, 0 2,2+0,84 83,8+7,15

Resumindo, as plantas de milho expressando proteína Cry3Bb possuem um efeito biológico significativo no desenvolvimento de larvas WCR, conforme ilustrado no ensaio com vasos de 10 polegadas. 291 ΡΕ1040192 6.0 Breve descrição dos identificadores de sequências SEQ ID NO:l Sequência de DNA do gene cry3Bb.11221. SEQ ID NO: 2 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo Cry3Bb.11221. SEQ ID NO:3 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11222. SEQ ID NO: 4 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo Cry3Bb.11222. SEQ ID NO:5 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11223. SEQ ID NO: 6 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo Cry3Bb.11223. SEQ ID NO:7 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11224. SEQ ID NO: 8 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo Cry3Bb.11224. SEQ ID NO: SEQ ID NO: Cry3Bb.11225. SEQ ID NO: SEQ ID NO: Cry3Bb.11226. SEQ ID NO: SEQ ID NO: Cry3Bb.11227. SEQ ID NO: SEQ ID NO: Cry3Bb.11228. SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11225. 10 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo 11 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11226. 12 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo 13 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11227. 14 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo 15 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11228. 16 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo 17 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11229. 18 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo

Cry3Bb.11229. ΡΕ1040192 292 SEQ ID NO:19 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:20 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11230. SEQ ID NO:21 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:22 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11231. SEQ ID NO:23 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:24 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11232. SEQ ID NO:25 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:26 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11233. SEQ ID NO:2 7 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:28 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11234. SEQ ID NO:29 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:30 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11235. SEQ ID NO:31 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:32 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11236. SEQ ID NO:33 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:34 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11237. SEQ ID NO:35 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:36 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11238. SEQ ID NO:3 7 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:38 Sequência de aminoácidos cry3Bb.11230 . do polipeptídeo cry3Bb.11231. do polipeptídeo cry3Bb.11232. do polipeptídeo cry3Bb.11233. do polipeptídeo cry3Bb.11234. do polipeptídeo cry3Bb.11235. do polipeptídeo cry3Bb.11236. do polipeptídeo cry3Bb.11237. do polipeptídeo cry3Bb.11238. do polipeptídeo cry3Bb.11239. do polipeptídeo

Cry3Bb.11239. ΡΕ1040192 293 SEQ ID NO:39 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:40 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11241. SEQ ID NO:41 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:42 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11243. SEQ ID NO:43 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:44 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11032. SEQ ID NO:45 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:46 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11035. SEQ ID NO:47 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:48 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11036. SEQ ID NO:49 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:50 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11046. SEQ ID NO:51 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:52 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11048 . SEQ ID NO:53 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:54 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11051. SEQ ID NO:55 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:56 Sequência de aminoácidos Cry3Bb.11057. SEQ ID NO:57 Sequência de DNA do gene SEQ ID NO:58 Sequência de aminoácidos cry3Bb.11241. do polipeptídeo cry3Bb.11242. do polipeptídeo cry3Bb.11032. do polipeptídeo cry3Bb.11035. do polipeptídeo cry3Bb.11036. do polipeptídeo cry3Bb.11046. do polipeptídeo cry3Bb.11048. do polipeptídeo cry3Bb.11051. do polipeptídeo cry3Bb.11057. do polipeptídeo cry3Bb.11058. do polipeptídeo

Cry3Bb.11058. 294 ΡΕ1040192 SEQ ID NO:59 Sequência SEQ ID NO:60 Sequência Cry3Bb.11081. SEQ ID NO:61 Sequência SEQ ID NO:62 Sequência Cry3Bb.11082. SEQ ID NO:63 Sequência SEQ ID NO:64 Sequência Cry3Bb.11083. SEQ ID NO:65 Sequência SEQ ID NO:66 Sequência Cry3Bb.11084. SEQ ID NO:6 7 Sequência SEQ ID NO:68 Sequência Cry3Bb.11095. SEQ ID NO:69 Sequência SEQ ID NO:70 Sequência Cry3Bb.60. SEQ ID NO:71 Sequência SEQ ID NO:72 Sequência SEQ ID NO:73 Sequência SEQ ID NO:74 Sequência SEQ ID NO:75 Sequência SEQ ID NO:76 Sequência SEQ ID NO:77 Sequência SEQ ID NO:78 Sequência SEQ ID NO:79 Sequência SEQ ID NO:80 Sequência SEQ ID NO:81 Sequência SEQ ID NO:82 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11081. de aminoácidos do polipeptídeo de DNA do gene cry3Bb.11082. de aminoácidos do polipeptídeo de DNA do gene cry3Bb.11083. de aminoácidos do polipeptídeo de DNA do gene cry3Bb.11084. de aminoácidos do polipeptídeo de DNA do gene cry3Bb.11095. de aminoácidos do polipeptídeo de DNA do gene cry3Bb.60. de aminoácidos do polipeptídeo iniciadora FW001. iniciadora FW006. iniciadora MVT095. iniciadora MVT097. iniciadora MVT091. iniciadora MVT075. iniciadora MVT076. iniciadora MVT111. iniciadora MVT094. iniciadora MVT103. iniciadora MVT081. iniciadora MVT085. PE1040192 — 295 - SEQ ID NO: 83 Sequência iniciadora A. SEQ ID NO: 84 Sequência iniciadora B. SEQ ID NO: 85 Sequência iniciadora C. SEQ ID NO: 86 Sequência iniciadora D. SEQ ID NO: 87 Sequência iniciadora E . SEQ ID NO: 88 Sequência iniciadora F . SEQ ID NO: 89 Sequência iniciadora G. SEQ ID NO: 90 Sequência iniciadora WD112. SEQ ID NO: 91 Sequência iniciadora WD115. SEQ ID NO: 92 Sequência iniciadora MVT105. SEQ ID NO: 93 Sequência iniciadora MVT092. SEQ ID NO: 94 Sequência iniciadora MVT 0 7 0. SEQ ID NO: 95 Sequência iniciadora MVT 0 83. SEQ ID NO:96 Aminoácido N-terminal do polipeptídeo Cry3Bb. SEQ ID NO:97 Sequência de DNA do gene cry3Bb selvagem. SEQ ID NO:98 Sequênca de aminoácidos do plipeptídeo Cry3Bb selvagem. SEQ ID NO: 99 Sequência de DNAplantizada para o gene cry3Bb.11231. SEQ ID NO:100 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo plantizado Cry3Bb.11231. SEQ ID NO: 101 Sequência de DNA do gene cry3Bb usado para preparar SEQ ID NO:99. SEQ ID NO:102 Sequência de DNA do gene cry3Bb selvagem, Genbank #M89794. SEQ ID NO:103 Sequência de DNA de Oligo #1. SEQ ID NO:104 Sequência de DNA de Oligo #2. SEQ ID NO:105 Sequência de DNA de Oligo #3. 296 ΡΕ1040192 SEQ ID NO:106 Sequência de DNA de Oligo #4. SEQ ID NO:107 Sequência de DNA do gene cry3Bb.11089. SEQ ID NO:108 Sequência de aminoácidos do polipeptídeo Cry3Bb.11098. 7.0 Referências

As referências que se seguem, proporcionam exemplos de processos ou outros detalhes suplementares aos aqui descritos.

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Todas as composições e métodos aqui descritos e reivindicados podem ser preparados e executados sem experimentação adicional face à presente descrição. ΡΕ1040192 309

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: ECOGEN, INC./MONSANTO COMPANY

(B) RUA: 2005 CABOT BLVD W/700 CHESTERFIELD VILLAGE PKY N

(C) CIDADE: LANGHORNE/ST. LOUIS

(D) ESTADO: PA/MO

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 819047/63198

(A) NOME: LEIGH H. ENGLISH

(B) RUA: 120 CHAPEL DR

(C) CIDADE: CHRUCHVILLE

(D) ESTADO: PA

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 18966

(A) NOME: SUSAN M. BRUSSOCK

(B) RUA: 7 HILLSIDE LN

(C) CIDADE: NEW HOPE

(D) ESTADO: PA

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 18938

(A) NOME: THOMASM. MALVAR

(B) RUA: 12046 CHÁRTER HOUSE LN

(C) CIDADE: ST. LOUIS

(D) ESTADO: MO

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 63146

(A) NOME: JAMES W. BRYSON

(B) RUA: 87 WOOD STREAM DR

(C) CIDADE: LANGHORNE

(D) ESTADO: PA

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 19053

(A) NOME: CAROLINE A. KULESZA

(B) RUA: 301 OLD LYNCHBURG RD

(C) CIDADE: CHARLOTTESVILLE

(D) ESTADO: VA

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 22903

(A) NOME: FREDERICK S. WALTERS

(B) RUA: 3413 6TH AVE

(C) CIDADE: BEAVER FALLS

(D) ESTADO: PA

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 15010 - 310 - ΡΕ1040192

(A) NOME: STEPHEN L. SLATIN

(B) RUA:3823 LESLIE PL

(C) CIDADE: FAIR LAWN

(D) ESTADO: NJ

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 07410

(A) NOME: MICAHAEL A. VON TERSCH

(B) RUA: 14 RUTLEDGE AVE

(C) CIDADE: TRENTON

(D) ESTADO: NJ

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 08618

(A) NOME: CHARLES ROMANO

(B) RUA: 2402 MAPLE CROSSING DR

(C) CIDADE: WILDWOOD

(D) ESTADO: MO

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 63011

(ii) TÍTULO DO INVENTO: PLANTAS TRANSGÉNICAS RESISTENTES A INSECTOS E MÉTODOS PARA MELHORAMENTO DA ACTIVIDADE DE δ-ENDOTOXINA CONTRA INSECTOS ALVO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 113 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: PatentInRelease #1.0, Versão #1.30 (EPO) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO:

NÚMERO DO PEDIDO: DESCONHECIDO (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/993170 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 18-DEC-1997 (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/993722 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 18-DEC-1997 (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/993775 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 18-DEC-1997 (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/996441 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 18-DEC-1997 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases 311 ΡΕ1040192 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

ΛΤδ MT CCA MC MT ÇÇÃ AGT CM CM AC0 MA MC SM Mlk CCT ii Nafc ASA Pro Asn Asn Arg Ser (31 u Mia Asp Thr He Lys vai Thr Pxtí 1 5 ΪΟ is AAC ACT mh TT© CAA ACT AAC CAT AAT CAA TAT CCT TTA gct SAC AAT 9S Ajs» S®r Gin Leu Gin Thr Asn Kis ãsíi Gin Tyt Pró Leu Alâ Asp As» ^0: 25 10 ccã. AAT TG& RC& CTA Ç5&Ã GAA TTA AAT TAT MA GAA TTT TTA AOA ATC 144 Fr® As» Ser Thr Glu Glu L®u Asm Tyr Lys Fh® LS» Arg Met 35 40 45 ACT GAÂ ©&c &©T TCT &C« «&& «TG CTA ©AC AAC TCT ACA STA AM «AT 192 rhx ©lu Astp Ssr Ser Thr SIu Vai Aap Asn Ser Thr Vai Lys Asp so 55 so ac.k GTT QSQ ACA ©GA ATT TCT STT GTA COO CA© ATT TTA ©ST Gr? ®T& 249 Ala Vai <aly Thr oiy n« ser vai. V «fc % Gly Gin XI® £|l.y Val val 65 00 75 m ©GA ©Tf Tfl: OCT SCA etc ACT TCA TTT TAT CAA TCA CTT 2 88: ©ly mt s*r® Fh® .Ala Oly Ala l®u Tíu· Sêr Phe tyr Ser Phe Leu 85 90 SB &AC ACT ATA TG© CCA AGT «AT gct ©AC CCA τα© AAG gct TTT' ÃTG «CA 3 36 AS» Thr IlS: Trp Pr® bd' Asp Ala .ftsp pro Trp Lyã Ala Phe Met Ala 100 10 s 110 CAA mt G&& cm CTO ATA a&T m® MA ATA GA3 ÇAS TAT «CT AftA AGT ΪΜ SIn vai Glu vai Leu 11® Asp Liy& Lya Ilè Glu Glu ty* Lys Sar LIS 12.0 12S MA GCT crr OCA sás TT<\ fiAS CGT CTT CAA AAT AAT TTC CAA OAT tat: 432 Lya Ala hSU Ala Glu Leu Gla ®ly Leu Gin As» Mn Fhe Glu ftsp Tyr 130 H3 140 GTT MT GCQ TTÃ ÃÃT TCC T®3 AAC AAR. TTT CAC CAT CGT CGT TCT 4S0 vai Asn AX& Leu As» ser Trp Lys Lys Phe H.ÍS Hia ser Arg Arg Ser 145 ISO 15ã ISO MA m& AflC ÇÃA ÍS&T CGA ATI Afífí CAA CTT ppípp CM 8©A (PÃ mr S2Ê: Lya Arg Ser ASp Arg 11 a Arg Glu Leu Phe Ser 01» .|ί1ά Glu Ser iCô 170 17S 312 ΡΕ1040192 ÇftT •m CGT A&T TCC AT® ccg TCA TTT cca gtt TCC AAÃ TTC GAA STG 576 HÍ8 Phe Arg Íiíin S&r físt Pr» Ser Phe Ala Vai Ser Lys Phe: Glu Vai MO 1,85 190 çrq TTT CTA CCA ACA TAT GCA CAA GCT «CA AAT ACA CAT TTA TTG CTA 824 .Leu Phe Léa Pró Thr Tyr Ale Gin Ala Ale Ληη Thr Kr 5 Leu .Leu Leu l&S SOO 208 rm AAA GAT GCT CAA STT TTT OCA GAA <3AA TOG GSA TAT TCT.TCA GAA 672 Leu Lys &hp Ale Glrs vai Phe siy Glu Giu. Trp Gly- Tyr Ser Ser Glu £10 215 220 GAT GTT «cr GM. TTT mt CAT mh CAA TTA AM OT ACA CM CAA mc 7M Asp Vai Ais. Giu Phe Tyr Sis Arg Gin L®« hys Leu Thr Si» Gin Tyr ass 230 23$ 240 ACT fâ&C CAT TGT GTT MT TGGt TAT AAT STT GGA TTA AAT COT TTA AGA 768 Thr kfsp Bi a cy« Vai As» Trp Tyr Ãsn Vai Gly Leu As» Gly Less Arg a«s 250 2$$ GOT TCA ACT TAT GAT GCA TGG ore AM TTT AAC CGT TTT CGC ASA CAA SIS Gly Ssr Thr Tyr A»p Ala l^rp vai Lys Phe Asn Arg Ph« Arg Ary Glu 2£S MS 270 AT® ACT TTA, ACT CTA ΤΓΑ GAT CTA ATT SfA CTT TTC CCA TTT TAT CAT 884 mt Thr LêU Thr Vai T.<Í?"U Aosp L«n n« Vai Phe TfXS Fbe Tyr Asp 275 280: 285 ATS ms ra. tac TCA MA úm qtt MA ΜΆ SM CTA A.CA AGÂ G»e ATT SI.2 llB Arg Leu. Tyr Ser Lys Gly V&l Lys Thr Gi» Leu Thr Aorg Asp ile ata 2 95 300 TTT ACG GAT CCA ATT TTT TCA CTT AAT ÁèT CTT CAS3 QftG TAT GSA CCA 860 phe Thr Ãsp Por® IU ser Leu Ma Thr Leu Ql.fi Giu Tyr Gly Prp 3ÕS 3X0 315 320 ACT TTT T7G ÂGT ATA 0,¾^¾. AAC TCT ATT CGA AM CCT CAT TTA TTT GAT 1008 Thr Phe Lgu Ssr Ile Glu Asa Ser Ile Arn Lys Fro lis Leu Phe Asp 325 330 33,5 ®r TO CM OvtG ATT TTT CA1? acg CGT CTT CAA CCT GGT TAC TTT X05S Tyr &KU Gin Gly Πβ Glu Phe lia Thr Ar>g Leu Gin Pr» Gly Tyr Phe ;í4ô 343 330 GGG MA gat" TCT TO MT TAT TSG TCT GGT AAT TAT GT.A GAA ACT AGA 1X04 Gly Lyas Asp Ser Ph» Mn Tyr TTp Ser Gly As-n Tyr Vai Siu Tkr Arg 355 M9 3SS eef MT ATA GSA ΤΓΤ AST AAiía ACA ATT ACT TCC CCA TTT TAT GGA GAT 1152 Pra Sfer ile Gly ser ser Lys Thr ile Thr ssr P:ro Phe Tyr Gly Asp 370 3"?S 380 MA TCT AC? SM. CCT ©TA CM AAO CTA AGC TTT CAT Θ3Α CM AAA. STT 1200 Lys Ser Thr 01. ti Pr» vai Gin Lys Leu Ser Phe Asp Gly «in hys vai 38'S 390 335 400 ΡΕ1040192 313

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(xi ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: «tet Ass Pro Aars As® Arg S«r Glu His A*p Tbr Xiè Lys Vai TSsr % 5 10 IS h&tl Sar Qltt Leis Gin TAr Asa His &3ΪΪ Gltt -ryr 5>ro léu Ala Assp AUn 20 20 Pres Aàs. Sé£ Thr ILew G.iu Glu Leu Asn tyr Ly« Glu Ph* Leu Arg 8tet 25 40 4S Tte SíLti ASp ser ser Tto Qlu vai Leu &Sp AS£È Ser Thx Vai lya Asp so ss €0 Ala Vai Gly Tta Gly Ile Ser vai vai Giy Gin li* L*U <ny v*i Vai 70 75 00 Sly Vai Sr-à Shè AÍ ài ©iy Alá Leu Thr Piie *2yr Gin Ssr Ph* Leu ss 30 85 Assa TM' 11« Tsp PE» Ser Aap Ala ASp Pro Trp Lys Ai a Pfee Ala xos 10 5 110 Gla Vai Glu vai Leu xie A«P Lys Lya :T..5.e Glu Glu Tyr Ala Lys S®r 115 123 12 S Lys Ala IfSU Ala Gin LSU ©Ift Gly Leu Gin Asn Aaxs Pbé Cplis. Asp Tyr 13 θ 135 140 Val ASO Ala L-eg ASP Ser Trp Lys Ly';s Phe Mia Mis Ser Arg Arg Ser 14S .100 188 18 Ô iys Arg Ser Qixs ÃSp Arg lie Arg Glu Léu. Phe Set Gin Ala Glu S»r 105 120 175 Sis Shs Arg A-OB Ser «et Prp Ser Pb* j&XiSi Vai Ser Lys Phe Glti Vai 100 185 ISO 315 ΡΕ1040192 í.ati Phs Leu LM Fk» Thr Tyr Alâ íàs-Xj^ 2QQ Ala AI® Ase . fhr Mi» Leu L$u Leu aos Leu Lys ΪΧΟ Asp Mâ Cal« Vai Fbe eivais siu Glu Trp Qiy Tyr Ser Ser Slu 220 Asp Vai 22$ Ιίΐά <5!u Tyr 23 0 Mis Arg Glrt Leu Lys 235 Lsu Thr Slh Gle Tyr 240 Thr Asp His Cys V»X 24 S &s« Trp Tyr .teíi Vai 250 £ly Leu Ase âly Leu Arg 255 Sly Sér Thr Tyr 2655 Aap AXs. Trp Vai Lys 26S Phe Aen Arg Phe Arg Arg slu 270 Met Thr v$ $7$ Thr Vai L.#U Asp L*« 2:5 O lie vai Leu. Fhe Aro Fhs Tyr Asp 2§s '11® Asrg 290 Leu Tyr Ser Lyss Oly Vai 295 Lys Thr G Xaí Le® Thr Asg Asp lie 3 O# F&e Thr 305 As;p Fr® ii® Ç'h«? 11Θ Ser Leu Âsn 'Thr Leu 315 Sln 0lu Tyr Sly Pr» 320 Thr Pbs tóa §er 11« 125 0ÍiU As» S®r 11® Arg &yg 330 Pr® Ui» &©« Fhe Asp 335 Tyr Leu <51 u Giy 340 π<?: 531 u Fhe Hig Thr Arg 349 L.ÉU CJl.® vro my Tyr Fhe 350 Sly Lys Asp 353 ser Pbe ASA Tyr Trp 360 Ser Gly Aam Tyr Vai. Slu Thr Arg 266 Pr® Ler 370 n« Siy Ser Ser Lys Thr 3TS XMe Thr Ser F*0 Pb» Tyr GTy A&p 3S0 Lysi S»sr 3 85 Thr mu Pfó Vâl 3:90 Sla. Ly.S íâií ssr Pfee 395 Aiip Oiy Cia Lys Val 490 Tyr &rg Thr 11¾ Ala 405 Asm Thr Λεφ vai A.2 si 410 AJL& Trp Pru Ausi Siy Lya 415 V&l Tyr Less ©Xy· 420 Vai Thr Lys Vai Asp 435 Fhe Ser 01® Tyx Aap Asp <3la 430 Lys Á.sn hiu' «S Thr Ser Thr 53I.S1 Thr •540 Tyr Asp Ssr Lys teg Asr» Asn Oly 455 hIs v&X 450 Ser Al^ '3.1 n Asp Ser lie 4 55 Asp ΦΐϊΧ Leu Fro frv slu Thr Thr 400 Asp 465 Pr® Leu SiU L^âi 470 Alâ. Tyr .ser Mlh SI» 475' Lé.ii asm. Tyr Ala 3lu 450 Cys Phe LíÈtS Mefc Sln 485 &sp &rg Arg δίγ Thr 430 iie Pr® Ffee Fhe Thr Trp 4S5 316 ΡΕ1040192 rhr Hls Arf Sfir vai Asp Rhe Phe Asa tM~ Ik Asp Ma »1« ty$ XX* SCO 505 S-l0

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Tyr 11« Asp- ty»· 11« 01 u Vh* 11* Pr» Vai «31» teu $4$ $50 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

ATS AAT CCA AAC ΑΑΤ ÇGA AGT GA& Ç*T GAT AOS ATA SAS «TP *CA CCT 4S «te* &»» Pr* Asa Asm AJPS Ser <Slu Eis Aep Tfer lie y*i fcc® 1 s ίο X5 AAC âST GAA TTQ CAA ACT AAC CAT AAT CAA TAT CCT TTA SÇT @AC AAT 0$

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: ATS A&T OCA MC MT CGA MT SM CAT «AT ATA ΑΑΩ ΟΙ’Τ’ ACÃ COT 40 Asn S?rp Asa As» Arg sar His Msp TíVf XI® Vai Ifeor S?re 1 § 3.0 IS AAC AGT ÓAA TTG OAA ACT AAC CAT AAT ÇA& mf OCT tta OCT GftC AAT 36 Assoa. s&r >31« úew GÍM Thr As« Hia Aãíi Glíi Tyr PrO L*u Ala As p Asn 20 25 lô em aat TCA AC& CTA CAA GAA TTA AAT TAT AAA G&A TTT TTA Asm ATS 144 Tro A&ii Saa Thr Jàau Sla Sl» Ae» Asm Tyr L'/s Gla Pile Ifãa Aí-g ÍSSE :3S 40 45 ACT Cp&Âí ΑΟΓ TCT AOS GTS CTA mc &M: TCT AÇA OTA AAA GAT 1.42 ΤΐιΓ CJlw. Α*φ SSF Set Thff GlU vai Xieu Asp Asii Sar Thír ¥S.I s Asp so 55 go SCA GTT ©GG AiCA c«s& ATT TCT STT GTA cm ATT rm SST GTT ST®. 34 i> A!í.is val sly ¥h:t Ôly Uss Ser vai Vai Sly GI» lie Isea >jly VAI Vai ss 70 75 eo sm <stt OCA GCT GGG GÚ.A CTO ACT TCA TTT TAT OAA TOA TTT CTT 288 Giy vsl Ero pise Ala Gly Ala I*»U THr Pb® Tyr Gla Ssr Ffe® tau 8S so MC ACT Am TGG CC& AGT «ST GCT SAC OCA. TSG AAG iírOX1 TTT ATG •SCA 338 As» Th* 11® Ttp PXQ $ar ,&sp Ala Asp Pm Ttp tys Eha ííteo Ala. CAA «r

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I95S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: Met Asn Pr© As© A/rSt Arg S©r Glu Sis Th.K' XX® L-ys Vai TAr F.ra % s 1& IS Msn s®:r 81» &»U 8lnt Tfcr ASft BiS Aon GXis Tyy teo Lou Alo As» ASA ao 35 5Ô te© As© Ser Thr li^u Glu Glu LéU Asr! Tyr l>ys Giu PAe Leu Arg Met. 3S $<3 4S Thr Glv Asp Ssr sor Tbr Glu Vai L&w Asp As© Ser Thr Vai Lyís Asp 5S SS éo Ala Vai <31y Thr <»iy II·® Ser Vai Vai Gly Gin n« Leu Gly Vai vai S5 ve 75 SÓ ííly vai Pr© VA* MS uiy Ala LAU Thr Ser Ph® Tyr Gin Ser Phe Leu ss so 55 Ãsn Tfej* :tie Trp teo Ser Asp Ala Assp te© *ixp Lys Ala Pise Met AX& 1&Q 1<ÍS iia G'ÍIS. val <3.1 u vai II® Afíp lvs Lys lie o.in Gia Tyr Ala L-ys Ser 326 ΡΕ1040192

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Tyr H« Astp &ya lie Gl« Ph® Xle Pr© Vai 01» í»eu 545 656 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: ATO AAT CCA me &AT C8A AGT 0AA CAT GAT AC® ATA AA® STT ACA CCT 46 mt Aan Pro Asn Asn Arg ííer Glu His Afjp Thr He Lys v®.l Thr pr© 1 5 10 15 aac XGV m'' rm CAA A0T AAC CAT AAT CAA ΤΆΤ CCT TTA GCT GAC AAT 86 A®» ãér 0181 Léu 0lfi Thr Mn Hi.S Asn 0.· ft Tyr Frct Lsu Ala A&p Assss 20 25 .3® •CCA AAT TÇA ACA CTA S&A 0AA TT& AAT TAT AAA 0&à TYT TTA A0A A1G 144 Pro AStl Ser Thr LSU GÍU aiu Leu Ass Tyr Lys SlB Phs Lew Arf 34ar 35 40 45 ACT GAA GAC AST tct AOS GAA CTA GAC me TCT ACA 0TA ASA GAT 182 Thr Gl« aer âer Thr <S1» val Leu Asp &SD, Ser Thr ¥âi Lys Mp se $$ 60 240ΡΕ1040192 334

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(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: .ATS AM? «SC* AAC AftT COA A®¥ «A& CAT «AT AC6 m A&S3 CTT ACA CCT M8fe Asa Pifo Asa Asa Aygr Sssr Qlu Sis Asp Thr 11« E.ys. V«1 Thr Pro 1 S :ifâ i$ AAC JMSf CJAA TTS CAA ACT AAG C3WP AAT CAA «AT CCT TTA C€T CAC AAT As» Ser ciii fceu <2l» Thr A$u His Ass «X» Tyr Pr» Isôo. Ais Asp Asn 20 35 30 CCA AAT TCA ÁCà CTA SAA CAA TTA AAT TAT ARA CAA TTT TTA ACA. ATC Pr® Asa Ser Thr iew &lu Glu Leu Asn Tyr hys «1« ph« Lev Sr$ M*£ 35 ^0 4S ACT G.AA «AC AST TCT ACÇ GAR CTC CTA (IRC AA€ TCT ACA QTA ΛΑΑ GAT Thr íllu Ãsp ser ser Thr Ôlu vsl Leu Attp Asb Ser Thr V«.X Ly» Atsp s® ss se QCA OTT GSG ACA GOA. ATT TCT GTT STA CCS CAOS ATT TTA «OT GTT CTA Ai*. Vai Gly Thr sly .11« Ser vai va.1 «ly Gla Xle hsri Sly Vai Vai iS 7 V 75 80 GOA mt CCA TTT CCT GQO «CA CTC ACT TCA TTT mtt CAA TCA TTT CST Gly Vsl Pro phs .Ala ®iy Ais Lau Thr Ser Fhe>: Tyr Gin Ser Phe Leu 8S a*0 SS &&C ACT ATA TSG CCA ACT S&T CCT GAC CCA TSG AAC CCT TTT ATS OCA As® Thr Xis Trp Fr© Ser Asp Ala Asp sre T*p tya Ala Pha Set Ala 100 AOS li® CAA GTT QhA OTA CTQ ATà GAT AAG AAA ATA GAG GAO TAT CCT AAA A«T Gla vai Glu Vai Loo lie Aep Ly» Lys lia alo 81« ‘Py* Ais Lys Sàr 115 130 12.» AAA GCT crr CCA GAG TT& CAG «G3? CTT CAA AAT AAT fTC SAA «AT TAT Xsya Ala .te» Ala «1» IA» 81a Gly Aasi <Sla Asn Asa Sfes «la Asp Tyr 130 135 l^SO 144 102 340 2 as 33« 3S4 432 ΡΕ1040192 340 err awt oce m &at tcc tos aas ma aca otp toa mr ttc csa Vai Asa M® :Leu Aen Ser Trp Lys Lys TM- Fro Leu Ser Lew ftrg Ser 145 Ϊ·5Ρ ISS ISO. MA AGA mc CAA QAT 0(3». Am ΜΙ SAA CTT TW TCT KM «CA «Aà AST :Lvs Ara Ser Qla Asp Ara llô Ara 01« teu JFh« Ser SI» Ala elu Ser 2SS 170 175 c»x ttt esr »at tcc ato css toa ttt «ca stt κε aa* ttc ou gto His si*e &rg Ama Ser Met: Vra ser Phe Ale V«X Ser Ly» Pia®· «la VAX 1*0 l*f 150 CTQ TCf C*A ÇÇà ACA TÃt «CA. CAA ®CT «Cà AAT ACA CAT Tth tTO CT» Jeew Fhé i*u Fro Thr *Hyz Ala «In Ala Ala As» Ttur Eis Le» S-eu L»u 295 200 205 TTA AAA GA7 ®S CAA OTT TTT «GA «AA «M TOS m& TAT TCT TOA. -(SAA Leu Lys? Asp Ala «Xe V®X Pfce «ly ôlta <SX« Trp Sly Tyr Séx Ser «Xu 510 215 230 ÓM «TO «Cf G6A TTO «At AOC ASA CAA TF» AAA CTT ACA CAA CAA. TAC Aap Vel tti «ia Ffcé Tyr Thr Arg «Xn. Leu Lys Leu t&r «In Gin Tyr 225 230 23S 240 ACT «AC CAT TOT GTO MT TGG TAT AAT «TO «GA TOA AAT «KST TFA. ASA Thr A$$ Eia eye Vai Asn Trp Tyx Aan Va.l «ly Leu Mn «ly Leu. Arg 24S 2S0 255 4 SÓ: 520 576 S24 672

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845 «SC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: .Mefc Ãsn &»o Ibn Aen Ârgr 8ex Slu Sia Mp íhr ile Ly» v«.l Thr jpxo 1 £ 10 15 asm Se» Glu Leu âlt* Wnx Ma Ei» Mn Ôlnt Tyr fxo Leu Ala Asj> asm 20 2.S 30

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Pr© Vai ela L*u OSÔ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13: 48

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Tyr He Aep Lya Xle ©iu & 11« Pr® vai ala Leu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos 348 ΡΕ1040192 (B) TIPO: aminoacido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14:

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Tyr 11« Asp Lys 11« ΘΧ» FSrb Ik Fr© V*1 Sln L&u 645 650 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15: ATO SAT CCA AAC AAT SGA AGT OAA G&T GA.T AAG GTT ACA CCT 4S mt X Aa» Pr» As» Am S Arg Ser Qlu ííis Asp 10 Thr lie: Lys Vai Tfcr 15 pre AAC AÍÍT GAA cm ACT AAC CAT .AAT CAA TAT CCT TOA OCT GAC AAT M Aa» Ser Qlu I;®« 20 Gin TAr Aso Hlg A:SA 25 oin Tyr Fr© Leu Ala 30 Aap ASM CCA AAT TCA ACA em QftA OAA TTA AAT TAT AAA SAA TXT TTA ATS 144 Fm As® Ser 35 ThF Léu ÇIu Qlu liSU 40 Aísri Tyr Lya Qlu Fíié 45 Leu Arg Mer ACX OAA GAC AQT TCT ÃCS QAA GTG CTA GAC AAC TCT ACA QTA AAA «AT isa Thr Ciu Asp 50 Ser Ser TAr Glxl OS vai Lau Asp Asa Ser 60 Thr Vai Lys ΆΜΡ OCA çtt osq ACA ATT TCT OTT OTA GGO CAQ ATT TTA QQT GTO GTA 240 Ala Vai 01y Tbr ss sly DLe 70 S&r V&l Vai Çly 01» IX e 75 Leu OXy Vai Vai SO mh STT CCA TXT GCT (sm CCA CTC ACT TCA m tat CAA TCA TTT CTT S®5 &ly Vai Pr» PA® Ala <3ly &X« Leu Tfcur Ses Phsa Tyr SI» Ser Phe Léu 351 ΡΕ1040192 AAC ACf Am TOS ©CA AS? GAT ©CT SAC CCA T&3 AAS QCt ΤΓΓ ATS ©CA 335

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Asn Pro As» Asa i\rg Ser ©la Hia Aso- Thr Xle Lys vai Thr pro 1 S 10 15 Asa S-er 01« Leu ©in •fhx Asa ais ASh ©Irs Tysr Fro LS!« .Ala Asp Asn S» .35 10 Pro Asa. Ser Tht LãU Slu Glu Leu ASP Tyr Lys Clu Ph& Leu Arg Kefc 33 40 45 Thz Giti Asp Ser ser Thr Giu Vai Leu Afip Asú s&r Thr vai Lys Asp 50 ss fio Ais Vai Gly Thr fôly XXe- ser VAI Vai Sly «In .11 e Leu ©ly vai Vai s$ 7© 75 80 ΡΕ1040192 354

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17: ATO ART ©CA. *AC AA.T ©3R. AGf ©ΑΛ CAT Qm AOS ATA AAS QTP ACA COT Met Asm Pr© Asn As» Asg Ser Slu His Asp Tíir 11® Lye Vai Shr »ro X S 10 15 AAC ACT «M, TTO ©RR. &CT AAC CAT AAT CAA. SA* OCT ΤΤΛ ©CT ©AC ΑΑ3Γ Am ter ©ta tm* ©X» Tfcr .As» Mis A&n Gin fyr Pre teu Ala Aap Asn «0 :S5 3a CÇA ΑΑΪ TC* ACA CSR. ©RA G&& TTA .ΑΛΤ TAT AAA ©AR TST TTA ASA ATS Fto ah» Ser Thr Leu Cílsi clu {«» Asn fyr t,ys Slu Phe te» Arg Mae 3 5 40' 4S ÂCT ©RA «AC AST SOS AfíG «AA ®K? CSA ©AC ARC TOT AÇA ©m AAA OAT Sfer ©J,u A*$* Ss*r Ser Tbr ©I» V*1 Leu tep A*a Ser Thr Vai Lys &sp 53 55 03 3CA STT GGG ACA ©GA ATT TCT QTT GTA. SSG C&Q ATT KA QC5T Í5TT STA Ais Vai 6Iy Thr Sly lia Smt Vai Vai âly ©la lie Leu Gly Vai vai 55 70 75 80 ©©A GTT CCA ITT CCT G©6 ©CA CTC ACT TOA TTT TAT CAA TÇA TTT CTT ©ly Vai Pr» Phe Ala «ly Ala Leu f&r Ser JWsa Ty* Glii Ser Pte te» as ao ss arc act Am to» cm mt «at ©ct «ac cca tos aa© ©ct ttt ato ©ca AS» Thr lie ψτρ Sxo Ser Asp Ala Asp Pr© Trp Ala Pb® Het Ala S.O0 103 110 «8 14.4 192

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19: ATO AAT OCA AAC AAT €©A A©T ©AA CM' ©AT AC© ATA AAS ST? ACA CCT 43

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I52G 1.555 (2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID N0:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20: 365 ΡΕ1040192

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54S esO (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:21: ATS AAT CCA MC MSt CSA AGT SAA CAT GÂT ftCB JKPA AA<3 GTT ACA CCT 46

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23: A.7Í3 AAT : CCA AAC AAT CSA AGT GAA CAT CAT ACG ATA AAG GTT ACA CCT 48 ASO Pro As» A«». Arg Ser mu His Asp Thr Oe Lys Vai Thr Pr» 1 5 10 IS AAC AGT CAA rrc CAA. ACT mc CAT AAT CAA TAT COT TTA CCT CAC AAT 95 A»o Ser Mu Leu Mft Th* AS» UÍM As» Sla Tyr Pro Lê» Ala Aap Aau 20 25 30 CCA AAT TCA ACA CTA Í5AA TTA AAT TAT AAA CAA TTT TTA ACA ATC 144 Fro &br. Ser Vhr te» M» c*iu Leu As» Tyr Lys M u Phe Leu Arg MaL 35 48 4S ACT SAA GAC AST TCT AOS OAA 0TS CTA SAC AAC TCP ACA OTA 192 Tfer 81» AOp ser Ser Thr VáX teu Asp Aso Sér Thr Val Lys Aêp so 55 SQ GCA CTT GGO ACA QG& ATT TCT CTT STA <308: cm ATT TTA CCT CTT GTA 240 Giy Thr Ue ser vai vai GjLy Qln Ile teu Gly vai val S5 TO 75 00 SSA OTT CCA TTT SCT *S?Í2S CCA CTC ACT TCA TTT TAT <5RR TO ITT CTT 3Í& My Vmi Pro Phe Giy Ma teu Thr SOr Phe Tyr Cl» ser Phe teu 85 90 95 a&c ã ct ATA TÇG CCA ACT G&T COT CCA tcc AAC CCT TTT ATC CCA 335 Αβ» Th* xle Trp Pr» «Sã-s? Asp Ala A»p Pr» Trp Lya Ala Pha Hat. AX& 1GS 185 110 CAA <3TT GAA <3TA CTG ATA GAT AAO AAA ATA GAS OAC TAT GCT AAA ACT 384 ®ln v&l Cl» Vai Leu n* Asp Lys Lys tl« Mu Mu Tyr Ala Lys Ser 11S 120 125 ΆΑΑ. CCT CTT GCA GÁG TTA CAG GGT CTT CAA AAT AAT TTC CAA CAT TAT 432 hys Ma Leu Ala Ma Leu M» My Leu Mb As» Asn Hís Mu Asc +yi oo ;os 140 ctt aikp CCS TTA AAT TCC TGG AAG ΆΑΑ ACA CCT TTA AST TTC OííA AÇT 400 Vai Asn Ala Leu Asa Ser Trp Ly» Lys Thr Pro L&u Ser Leu Arg Ser .145 ISO 155 IS© MA ACA j&GCT CAA GAT CGA ATA &GG GA& CTT TTT TCT CAA CCA. SAA AST 32$ Lys Arg ser Gin Asp Arg ile Arg 0ÍU L»U Pite ser cln Ala Olu ser 1S5 270 175 CAT ΤΪΎ CCT AAT TCC ATG CCS tca TTT CCA CTT TCC Α&Λ TTC CAA CTG 5?S Mis Ptss Arg AAft ser H&t Pro Ser Mae Ma Vai Ser Lys Phe Mu Vai ISO SâS 3L»0 cts ttt CT& CCA ACA TAT CCA CAA ÍÍCT GCA AAT ACA CAT TTA TTC CTA 024 leu Phe LSU Pr» fhr Tyr Ala M» Ala Ala Asa Thr His Leu teu Leu 672ΡΕ1040192 375 1SS 286 305 m Mh ssct cm sít τττ ®sa ©&& gm. xs« gga tat tcs- tca. oaaLeu Lys Asp Ala Sln Vai Phe <5Xy Slu slu Trp ely Tyr Sá* S*r Glu210 2X5 220 sjw stt scr gm ttt tat cat aba. caa Tm má ctt acá caã cm tãcasj» vai Ala Glu Phe Tyr Sis Arg fâln l«u kf& hm Thr t$Xtà Slo Tyr 225 230 235 240 ACT SAC CAT TGT ©TT AAT TSÔ TAT M.T «Tf 6GA TTA AAT QQT TTA A8A Th*' Ãsp Sis Cy» vai Asn Trp Tys Asn Vai Gly lueu ASA ely Lè*i Arg 245 250 25S ©GT TCA AÇT TAT «AT GCÁ 7GG GTC ãA& TTT AAC C8T TTT CSC ASA 0A& sly Ser Tlit Tyr Aap Aia Tip v*x x>ys Ptse Asm Axg P.h$ Arg «xfr Glo 260 26'5 270 ATS ACT TTA ACV STA TTÁ SAT CTA ATT STA CTT TTC OCA TTT TAT OAT Mac Thr hm Thr Vai Mu Mp fceu tl« Vai Lau Oh® Pm fte Tyr Asp 27S 280 285 ATT cm tta me tca aaa me otr aaa aca «aã cia aca asa gác ast 11« Arg Mu Tyr S«r hym ely Vai J»y* Thr <a« Leu Thr Arg A&P Σ1» 280 285 388 TTT AC© ©AT CQA ATT TTT AC© CCÁ ÁCC ACC CTA CÃS ©AT TAC OSA OCA Ph* Thr Asp Pr© II» £4ts Tbar Pm Thr Thr Mu 01« Amp Tyr ely Pro 305 3X0 31S 328 ACfT fff WS AGT ATA SM. AAC TCT ATT C©A MA CCT CAT TTA TTT ©AT Tkr Pisa &eu Ser· Xle Qlu Mn Ser lia Mg h¥& Prh His hm The Asp 325 330 335 730 768

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Tyr ila Asp Lys XI» slu pfa® 1.1* Paro vai ©ln Leu €45 S50 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25: ATS AAT CCA AAC AAT CGA AGT GAA CAT SAT AOS ATA AAG GTT ACA CCT Met ÃSSSt Ar© Asn Asn. Arg Ser Glu Eis Asp Thr lie hys Vai Tfex P£S 1 5 10 15 AAC mr SAA TTG CAA ACT AAC «AT AAT CAA TAT CCT TTA GCT GAC AAT Asn SÓS? G1u Leu Gin. Th® Asn Hia Asn Gin Tyr Pr» Leu Alâ Asp Asn 20 2S 3 D CCA AAT TCA ACM CTA <3AA GÃA TTA AAT tãt AA& «AA TTT TTA AGA ATS Px© As« Ser TA® Leu 01 u Leu Ash Tyx PLs Leu Arg Met 15 49 4i* ACT G.ftA 0ÃC AGT TCT ACG «AÃ &m CTA «AS AAC TCT ACA STA AAA «AT T»X Glu Asp Ser &sr Thr Gl« Vai Léu Aíip Asa s&r Thr Vai Lys Asp 50 60 340 340 380 ΡΕ1040192 ©cã ©rr ©©© ãc& s©a ATT tct srr gta ©qs cas αττ tt» s©t stt ©m

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29:

4E

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144 D 1488 1533 15S4 1S32 1680 1738 1776 JJ34 1872 1050 ΡΕ1040192 394 (B) TIPO: aminoacido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteí (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA:

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S45 fSG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:31:

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:35:

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:37: ATS AAT CCA AAC AAT C&A ÃÕT SAA CAT GAT ACS ATA A&S esr ACA ecr 43 Mafc ASO £ΐ» Aara Asn Arg Sor Hi;s ASÍ> Thr Os £j'ys Vâl Thr Fri> 1 S 10 is AftC «T GAA TT® cm ACT MAC Ç»T RAT C&A TAT CCT TTA (5C“T CAC AH.T 5!$ Asa Ser SI li í..fcU C.lfc Thr A&m Aso Si» Tyr Fro kSU Ala Asp Mn 20 35 30 ec&. AA? TCA A£A CTA SAà ORA TTA AAT fÂf AAA SÃA TTT TTA ASA A1S3 144 Pro Asn Thr i-OM ai» sXu Asn TVf iys Cia Ph® Lsw A.v>3 Mrt 35 40 4S AC? OAA SAC A3T TCf ACS «AA STS cm OAÇ AAC TCT ACA CTA AAA SAT 1®2 Thr Glu Asp á«r Ser Thr Glts vai Leu Asp ASR Ser Thr vai. Lys Asp 50 S.5 so GCA GTT dCd AC& SOA AT? tct gvt «TA. CCS CAQ ATT TTA ÇSf ÇTT CTA 240 Ala. Vai Sly Thr Oly i.i® Ser vai V»1 aly Gin lis leu Oly Vai Vai ss ia ?5 00 STT CCA TTT SCT 00$ «CA CTC ACT TCA TTT TAT CA» TCA T^T CTT 200 sly Vai Pj:çí Rha &ÍA Oly Ala keti Thr Ser Fh® Tyr Vin $0? ?T*e Le« SS 90 ss A&C Acr mh mi OCA. AST O&T GCT GAC CCA TCl(:> ÁM5 C5CT m ATS GCA 32S AA« Thr 11® Trp Fro S&r Asp Ala &Sp Fr» Trp hys Ala Fhe t4et Ala. im u»

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S4S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: 48ΡΕ1040192 419 (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39: ATS MT CÇ& MC AAT COA AST GAA C&T SAT AC© ATA AAG ©TT ACA OCT Asa Pro Asa Asa Argr Ser ©iu His Asp T&r lie Ly* Vel Tfcr I S 10 15 AAC AST SM TIS CAA ACT AAC CAT AAT CM TA? CCT TTA SC? OAC M? Aeti Ser slu Leu 31« Tt*r Asu Ifi* Ma 31« fyr Pro Leu Ala Mp A»a 20 2S 30 CCA AAT TCA AÇA C?& «3&Ά SAA TTA AAT TA? AAA OAA TTT TTA ASA ATS p.FO hsii Séí TM Leu >31 u 3? u L«« Aon Tyr Lys Glu Pb® Arg M«C 35 40 45 ACT SAA 3ÃC Ã0f TÇT AC© QAA «T© CTA ©AC AAC TC? ACA ©TA AAA SAT Thr 32s As?p Ser Ser Tfe*' Glu Vai L«« Asp Asa S«Sf TM' Vai Ay» Asp 50 SS <?ÇA ©?? ÇC-3 AÇA QGA ATT TCT STT STA GSG CAS ATT TTA S3T STT GTA Ala VAI Sly T-hr G-Xy Ϊ1* Ser Vai Vai ©ly ©la 1:2« Leu «ly Vil V*1 «5 70 75 80 ©8A ©ST CCA TTT ©CT 333 CCA CTC ACT TCA TTT TAT CAA TCft ITT CTT ©ly Vai Jhw? Bh« Ala ©ly &1« Leu Thr ser KA* Tyr sln ser Phe Leu 8g 90 9â AAC ACT ATA 158© CCA AOT SAT SCT SAC CCA TÚ& AM? ÔCT TTT AT© ©CA Asn Thr Ile T*p J?ro Ser Asp Ala A«p Sr© Trp· Lys Ale Kfce «et .Ala 100 105 210 35 244 102 240 28« 316 CAA ©TT 3AA 0TA ÇTS ATA ©AT AAS AAA ATA ©A© ©AG TAT ©CT AAA AKT Sln Vàl Qlu. Vai Leu 11« Asp Ly» Ly» Ha ©1« ©1» Tyr Alã Lys &&r XIS 130 3.2.5 AAA 3CT CTT 3CA SAS TTA CAG GGT CTT CAA AAT AAT TTC SM GAT TAT Lys Ala Leu Ala Glu Leu 31» ©ly Lau ©la Asn Asa 0h« 31» M& Tyr 130 13Ç saç mr MT GCG TTA AAT TCC T©S MS MA ACA CSCT ia AGT TTG C3A A3T VSl As» Ale Leu Aea Ser Ίτρ Lys Ly» Thr ^r© Leu Sár Leu Arg Ser 14$ ISO' XSS ISO AAA ASA mc CAA 3A? CCA ΑΤΑ A33 3AA CTT TTT TCf CAA CCA <3M A3T Ly* Arg Ser 31» Asp Arg Tle Arg Glu Leu Ph-e Ser Cln Ala ©lu Ser 1«S 270 VtM CAT TTT C3T AAT TCC ATS CCS TCA TTT ©CA GTT TCC AAA -T?C CM ®TS Mss Phe Arg Asm. .Ser «et Pr» Sesr Phe Ala ¥al ser Ly» Phe Slu Vai 180 185 150 CTC TTT CTA CCA ACA TAT CCA CAA ©CT GCÃ AAT ACA CAT TTA ΤΎ3 OCA Lbu 2Ά© Leu Fr© TÀr Tyr Ala ©la Ala âIís Asa :thr His Leu Leu Leu 384 432 480 528 57« S24 720ΡΕ1040192 420 200

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177S 1024 1073 ' 1520 1959 ΡΕ1040192 422 $45 SS& (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:40:

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:41: ATS AAT CC& MG Mf CGA MT GÀÀ CAT S&T AOS ATA A&S ACA CGT Mar 1 Asrs Trõ Asa» Aon S Arg Ser Glu HÍS Asp Thr IS TI® Ly® vai Thr 16 Pr® AAC -A£5T 0AA TOS GAA ACT A&C CAT AAT CAA TAT SCT TTA SGT <3AC AÃT Aau Ser Glu Leu Sla Thr AS® JKis Asm «In Tyr Pr© Leu Alá A.sp ASíl 20- SS 30 CCA AAT TCA ACA CTA 0M GAA TOA AAT TAT GAA TOT ASA AT0 Fro As» í§er Thr Leu Glu Giu Léii ASft Tyr Lys ÊsjLlí Phe Leu Ar§ Mefc 35 40 <s ACT ΘΑΑ 0AÇ AST TCT ACG 0AA 0TS CTA QÃC AAC TCT ACA STA A4A «AT Thr ãla Asp Ser Ser Thr Glu val Léu Aep Ahn Ser Thr Vai Lyss ÃS|> $0 SS 6«

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ISSO 1728 1770 XS24 im-2 19.20 1:9 S9 (2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID N0:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:42:

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Tyr lie A*j» Ly» lie 61a ®t*e Xl« Pr© v*X <3Xn L&u ®4S 65® (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:45:

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6M5 SSO (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:47: ATS AAT CCA AAC AAT COÀ A0T 6&A ÇAT Hat Asa Pro .Asas. Asíí A«g ser 61.» Hl® 5 AftC AST 6AA tts CAA AÇT AA,C ÇAT A&T Asn Ser Gl» Leu 6l.tt Thr A«« HÍS Asa» 20 25 CCA AAT TCA ACA CTA GRR CAA, TTA AAT Oro ASSO Ser Thr Leu 61« 61« Leu Asn 35 40 ÂCT 6AA gac AST TCT AOG GAA 6TQ CTA Thr 8.1« Ser ser Thr ÓIu Vai Leu se SS GCA GTT GSS ac.a cm ATT TCT OTT 6TA Alo Vai 61y Thr Gly Xlê Ser Vai val m 70 ®3ft GTT CCÃ TTT GCT 666 GCA. CTC ACT 62 y Vai prs Rhe Alo eXy La» Thr S&T AÍS3 ATA AMi GTT ACA CCT 48

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04S ISO (2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID NO:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases ΡΕ1040192 448 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:49: M-S **T GCA AAC Mf CG* A©T ©AA OLT SAT ACG ATA AAG STT ACA CCT SSat: Asa Pm Asa Aaa aeg ser ©Isn His A»j» Thr rl« l*ye Vfcl Thr Sr© X § ifâ IS AAC AC-T GAA TTS om ACT AAC C&T ΑΛΤ CAA TAV CCT TTA ÊCT GAC AÂT Asa Ser ©lu Leu sin Thr Assa His ft&s ©is Tyr Fro Ais &sp Asa 20 2S ao CCA AAT TCA &C& OS» GSA SAA TTA ΑΑΓ TAT AAA GAA ITT TSA AGA ATS tro Asa Ser Thr Leu ©lu Glu &su Asa Tyr l*ym ©!**. Fhe Lee Arg 35 4S 4S act mk s&c agt rer aos ísaa me cm sac aac tct aca opta aaa «at ISsr Giu Asp- ser Ser fiar ©Xu Vai Leu Aep Asa Ser Thr Vai Lys Asp SO 55 «o OCA ©TT ©QG ACA -GOA ATT TCT CTT CTÃ OGS CAÍ? ATT TTA ©e% fsTT GTA tie Vai ©ly Ttor ©!y Sle Sor V»1 Vai ©ly da lie Leu ©ly vai vai SS ?® ?S 80 &GA STT CCA TTT SCT GGG GOA CTC ATT TCA TXT TAT CAA TCA TTT CTT ©ly Vai Fr» Pfe& Ala ©iy .Ala unt T&* Ser Ftee Tyr sis Ser Pt» Leu as 90 9S AAC ACT ATA TQÍi CCA AST GAT GCT SAC CCA TOS AAS GCT TXT ATS GCA A*n Tfcr lie Trp Ρτα Ser Aap Ai» Asp Fr© Trp Lye Ala vise Met Ala ao® 105 no CAA STT GAA ©TA. era ATA OAT Á&G AÃA ATA G*G SAS TÀT CCT AAA AST «1» vai «1« Vai Leu Xle h&p Lys Lye lie ©1« ©la syr Ala Lys Ser 115 120 125 AAA ©CT CTT GC» SAÍ? TTA CAS «ST CTT CAA AAT AAT TT© β»Α «KP TAT Aya Ala Leu Ala t2Iu Lesi Gin ©iy Ιίβϋ ©1» Aaa Ass Vfe® Glu ksp Tyr 130 135 140 STT A&r 0CS3 Tffi AAT T0C TSS AAS AAA M» OCX TTA AST TTS C5BA AAT v&l Am Ala Leu as» Ser Trp Lyss Lya Tlsr Fra Le« Ser Leu Arg .Ãsa 145 150 153 1^(5 csa cac asc caa em <m ata *as gaa ctt ttt tct caa sca gaa ast pna His Ser ©ia Gly Arg Xle Aarg· Ôlu Leu Fhe ser sia Ala Slu Ser 155 xm tvs 48 144 íss 240

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1953. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:51:

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:53: ATS AAT CCA AAC AAT coa AQT OAA Q\T GÃX A08 ATA AAC orr ACA COT •43 IM®£ Α»β· íhxs Asa fen Arg Ser Glu KiSí Aífp Thr 11« Lys Val Thr Pr» 1 5 20 15 AAC AGT GSA TTS CAA ACT AAC CAT AAT CAA TAT C.C.T TT& SCT GAC AAT Ao» Ser 3.1 \s Leu £3ln Thr Asa HÍ8 Asm ôlts Tyr Pr» Lau. Ala Asp A#a 20 25 3S CCA ARX TCA ACA OTA SAA SAA TTA. AAT TAT AAA GAA, TTT TTA ASA ATS 1*4 "Asra Ser Thr· LíSU □lu 01« L«U ASfi Cyr hym OXo phe Leu Arg Μ* ε. is 40 45 ACT GAA 0AC AOT tct AOC OAA 0X0 CTA QAC AAC TCT ACA «TA ARA GAT IS2 Thr Glw Ásp Sar Ser Thr Slu Vai Le» Aap Asa Ser Thr Val í-ys Aap ,50 ss SO OCA ®rr ACA SSft ATT TCT GTT ÓTA 003 CÁO ATT' TTA OOT GTT «TA 340 Ala Vesl Sly Thr «ly X.les Ser Vai Vai Gly Oln Ue Láu Gly 'Val Vai m 70 75 00 mh s-tt OCA TTT «CT CS® «CA CTC ACT TCA TTT TAT CM TCA ΊΤ2 CTT 2 ia aiy Vai pTTO Phe Ala (Sly Ala Leu Thr Ser Ph& Tyr mu Ser Ph® Leu 8$ ss AAC ACT ATA TOS 0"νΑ· A0T GAT CCT SAC OCA TOO AAS OCX TTT ATO OCA Asm Thr 11« Trp Pro S«r Aop Ala Asp Pr« Trp iys Ala pha Me-fc Ala 10Ç 10^ 120

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1953. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:55: ATS AAT CC« AAC «AT CG.A ©SA CÃT SAÍ ACG ΜΆ ÂA© ©T£ AÇA GCT 48

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1953. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:57: ΜΊ3- ÃAT CCA AAC AAT CSA AGt «AA CA" G&T AOS ATA AAG GTT Wh OT? 4S Met I Fíú Assrs Asrs S Arg «lu ais Aap xs T&r Π® Lys Vai Thr IS fro AAC ΑΘΤ «A& TT« OM AC? MC CAT ΑΛΤ CSA TA? CCT TTA «CT OAÇ AAT 3S Aiíft Ser Qlu Leu SO Sln Thr Agn His ,fts» S:S •31» Tyr Pr« LSíU Alá ASp 30 Aán CCA AÃT TCà ACA CTA GAA ©AA TTA A&T TAT AAA «Aà T7T TTA .ASA ATO 144 ?r<3 Asxj Thr teu QiU <31 v teú 4S Asa Tyr Lys 0Α-ΐί S»he <iS te» Árg wefc ACT ísAA OAO wt TCT ACC3 3AA OTG «TA SAC AAC 1CT ACA gta aaa «AT xn ~hr ΐ3Ι« &sp se £©r Ser Thr Glu BS Vai teu Asp ASS £β Tte Vai Lys Agp 473 ΡΕ1040192 SGR ©ΪΤ A£A S©& ATT TCT ©TT ©TA 006 CS© ATT TTA GGT ©ΤΤ 8TA 2*0

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:59: ATO AAT OCA AA.C AAT CGA AGT SAA CW GAT ACG ATA Afta «ST ACA CH 48 ííeit Ásw Pra As.« Asa Arg Se*' Glu t&r He Ly» Vai «ar Pr«s

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Pré Vai ©lé L<&« €5© (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:61:

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Tyr 11« Asp &.ys 11« el« Ffe.« xl· ®ex» vai óia xau S4S sso (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos 487 ΡΕ1040192 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear ína SEQ ID NO:62: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: prote (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA:

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:63: ATO AA.T CCA AAC AA7 CSA GAA CAT CAT AOS ATA AAS· <3TT ACA CCT 40 MSt Asa Pró Asa AA® Mg s®r aiu HÍS ASp Thr Ile Lys vai Thr Pro .1 s xo is AAC AG-T GAA 7TO CAÃ ACT AAC CAT AAT CAA TAT CCT TTA CfCT CAC ΑΆΤ 96 As® Se? Slu Leu om Thr ASA M.S mn Gin Tyr i>?a LSU Ala ASg ASE SO XS n» CCA αλτ TCA ÃCA cm GAA OAA TTA AAT TAT ARA <3AA TTT TTA AGA ATG 3.44 PrÓ Ask 3sr Th:t- Leu ôlu Ôitt Leu hm- tyr Lyc Slu fhe Leu Arg Mefe 1$ 40 4S ACT CAA «AC AGC TCT ACG SAA GTG cm «ac ÃAC TCT ACA «TA ABA GAT 102 Thr Glu A&p Ssr Ser Thr Sitt Vai LSU A8p AS® Ser Thr vai Lys Aap SC SS «0 «CA GTT GGG AC A GiSA ATT TCT ΘΤΤ Sa GGG CAS ATT TTA «G? GTT «m 240 Ais vai Sly 7inv Sly Xle Ssr Vai Vai Giy 5! In 1½ Leu Qly VAX vai sSS 7Q 75 8© ©GA OTT CCA TTT CCT ggg GCA CTC ACT TCA TTT TAT CAA TCA TTT CTT SSS illy Vãl Ρϊΰ Phc Ai» sly Ala Leu Thr se*" Pha Tyr 01» Ser Píia Leu ΡΕ1040192 490 as se ss ase act aa tss oca mt om gct sac cca tss ms ser ttt atg gca 33«

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1T7S i.824 1872 xm& (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:64: ase. tro Asa Asa Arp Ser diu 8ís &sp Thr He nys vai T&r Fr» i, s iõ is ASSA .Bar illu L«u Gla Tfil Assa ©Is ASMt. «Xa Ϊ5Τ pro Leu Ala Asp Asn 20 XS 3©

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:65: ATO· MT CCA AAC AAT TOA mt «M CAT GAT AGG ATA. AAS GTT ACA CCT 4» í>fet Asa Fm fen Am S«r Glv ai® &®p Tbr £Xá Ly* Vâl Thr Pr®

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:67: ATO· AAT ©CA AAC AAT CSA ASsT Q&& ©AT OAT ATO ATA AAS ©ff ACA COT 4«

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Xl« Tyr lie Asp· Ly» lie ©1» Pfee 11« Pre ¥al Sln Leu 408 490 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:71: AGACAACTCT ACAGTAAAAG ATG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 512 ΡΕ1040192 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:72: GGTAATTGGT CAATAGAATC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 21...23. (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:73: CAGAAGATGT TGCTGAATTC NNNCATAGAC AATTAAAAC 39 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 19...21. (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:74: GATGTTGCTG AATTCTATNN NAGACAATTA AAAC 34 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 513 ΡΕ1040192 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 17 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C ou G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C ou A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 19 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:75: CCCATTTTAT GATATTNNNT TATACTCAAA AGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 24 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C ou A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (25, 27, 28, 30, 34, 36, (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (31, 33, 35, 37, 42, 44) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C ou T" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 40 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C ou G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (26, 29, 32, 38, 41) 514 ΡΕ1040192 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:76: AGCTATGCTG GTCTCGGAAG AAANNNNNNN NNNNNNNNN NNNNAAAAGA AGCCAAGATC 60 GAAT 64 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:77: GGTCACCTAG GTCTCTCTTC CAGGAATTTA ACGCATTAAC 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 65 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (22, 27, 29, 30, 37, 42) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C ou T" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (23, 26, 28, 31, 38, 40, 43, 44) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C ou A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (24, 39) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (25, 32, 33, 41, 46, 47, 48) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C ou G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada 515 ΡΕ1040192 (B) LOCALIZAÇAO: 34 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 45 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 35...36 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C ou T" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:78:

AGCTATGCTG GTCTCCCATT TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNGT TAAAACAGAA CTAAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:79: ATCCAGTGGG GTCTCAAATG GGAAAAGTAC AATTAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 63 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (23, 27, 31, 36, 44) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C ou T" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (23, 26, 28, 31, 38, 40, 43, 44 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C ou A" 516 ΡΕ1040192 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (24, 25, 26, 33, 35, 38) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (28, 34, 37) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (29, 30, 32, 39, 42, 45) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C ou A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (40, 43) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C ou G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 41 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, C, T ou G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 46 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:80: 60 63

CATTTTTACG GATCCAATTT TTNNNNNNN NNNNNNNNN NNNNNNGGAC CAACTTTTT GAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (28, 31, 32, 33, 42) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C ou T" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (29, 38, 39, 41) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C ou A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 30 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" 517 ΡΕ1040192 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (34, 35, 40) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C ou G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 36 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 37 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:81: GAATTTCATA CGCGTCTTCA ACCTGGTNNN NNNNNNNNN NNTCTTTCAA TTATTGGTCT 60 GG 62 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 73 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (41, 49, 52) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C ou T" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 42..43 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C ou A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 44..45 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 46 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (47, 48, 53, 54) 518 ΡΕ1040192 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C ou A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (50, 51, 55) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C ou G" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:82: AAAAGTTTAT CGAACTATAG CTAATACAGA CGTAGCGGCT NNNNNNNNNN NNNNNGTATA 60 TTTAGGTGTT ACG 73 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:83: GGAGTTCCAT TTGCTGGGGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:84: ATCTCCATAA AATGGGG 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 519 ΡΕ1040192 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:85 GCGAAGTAAA AGAAGCCAAG GTCGAATAAG GG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:86 CCTTTAAGTT TGCGAAATCC ACACAGCCAA GGTCGAATAA GGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:87 CCCATTTTAT GATGTTCGGT TATACCCAAA AGGGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:88 GGCCAAGTGA AGACCCATGG AAGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:89: 520 ΡΕ1040192 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:89 GCAGTTTCCG GATTCGAAGT GC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:90: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:90 CCGCTACGTC TGTATTA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:91 ATAATGGAAG CACCTGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 521 ΡΕ1040192 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (22, 26, 29) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C ou A" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (23, 33, 36) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C ou T" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (24, 27, 28, 32, 35, 37, 38) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C ou G" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (25, 30, 31, 34) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 39 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G ou C" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:92: AGCTATGCTG GTCTCTTCTT ANNNNNNNN NNNNNNNNNA CAATTCCATT TTTTACTTGG 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:93: ATCCAGTTGG GTCTCTAAGA AACAAACCGC GTAATTAAGC 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ΡΕ1040192 522 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:94: CCTCAAGGGT TATAACATCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 55 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (19, 22, 23, 31) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, C (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (20, 26, 27, 29, (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= T, G, C (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (21, 32, 34) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: um de (24, 33) (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 25 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, T (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 28 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, T, G (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: base modificada (B) LOCALIZAÇÃO: 36 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota= "N= A, G, C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:95: ou G" 30, 35) ou A" ou T" ou C" ou C" ou C" ou T"

GTACAAAAGC TAAGCTTTNN NNNNNNNNNN NNNNNNCGAA CTATAGCTAA TACAG 55 523 ΡΕ1040192 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:96:

Ser Lys Arg Ser Gin Asp Arg 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1959 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1956.

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:97: ATO ΑΑ.Ϊ etm AAC AAT COA AOV «AA mt «AT Aee ATA AAC crr ACA CCT 45 Asa Pr» As ri AiSW .Arg 61« HlS ASp Ths· Tla Lys VAX. Thr Aro 1. s IS IS AA£ AST «AA TT« CAA ACT AAC CAT AAT CAA TAT CCT TTA GCT CAC AAT 56 Asr. s«.r >3l:u OlíJ .fisn Kis Asrs Óln Tyr Pro Ala Asp Asss 20 23 30 5777 MT TÇA ÃCft CTA M SM TTA ΜΊ TM AM (M TXT m m ATS 1*4 ASSS SSK' Thr Lew «lu Leu Asn Τ'/i' Lys «lu Pha La» Arg Hat. IS 40 4.5 ACT «AC ÃCT VCT hCQ CAA «TS cm OhC AAC TCT ACA «TA AAA «AT XJS Thr ¢3.1¾ Asjp Ser Ssr Thr <31 li Vai L&U Aap ASft SSií’ Thr VíSl i-y.7 ASp 50 5S ao «£& «TT (X30 ACA ««a ATT TCT «TX «m C&« ATT tta SST CTT GTA MÓ AÍS. 65 «ly Thr G&y Xis Sar Vai Vai «1 V Gis 7S· XI® Lsu «ly Val Vai 80 «ΤΪ CC& GCT 333 «CA crc. ACT TCA. TAT «AA TCA TTT CTT 2SS 524 ΡΕ1040192

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1S2D 1954 (2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID NO:98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:98:

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Tyr ile Asp Lys Ile Glu Phe Ile Fr® Vai Gl« Leu S4S 550 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:111: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: 546 ΡΕ1040192 (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:111:

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Claims (45)

1. ΡΕ1040192 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipeptídeo Cry3Bb modificado de B. thuringiensis compreendendo uma a cinco alterações de aminoácidos na sequência primária do polipeptídeo Cry3Bb de SEQ ID NO:98, em que as referidas alterações de aminoácidos são seleccionadas entre: Aspl03 é substituída por ácido glutâmico; Thrl54 é substituída por glicina ou fenilalanina; Prol55 é substituída por histidina; Leul56 é substituída por histidina; Leul58 é substituída por arginina; SerlôO é substituída por asparagina; Lyslôl é substituída por prolina; Argl62 é substituída por histidina; Aspl65 é substituída por glicina; Lysl89 é substituída por glicina; Ser223 é substituída por prolina; Tyr230 é substituída por leucina ou serina; His231 é substituída por arginina, asparagina, serina ou treonina; Thr241 é substituída por serina; Tyr287 é substituída por fenilalanina; Asp288 é substituída por asparagina; Ile289 é substituída por treonina ou valina; Arg290 é substituída por asparagina, leucina ou valina; Leu291 é substituída por arginina; Tyr292 é substituída por fenilalanina; Ser293 é substituída por arginina ou prolina; Phe305 é substituída por serina; Ser311 é substituída por alanina, isoleucina ou treonina; Leu312 é substituída por prolina ou valina; Asn313 e substituída por arginina, histidina, treonina ou valina; Thr314 é substituída por asparagina; Leu315 é substituída por prolina; Gln316 é substituída por ácido aspártico, leucina, metionina ou 2 ΡΕ1040192 triptofano; Glu317 é substituída por alanina, asparagina, lisina ou valina, Tyr318 é substituída por cisteína; Gln348 é substituída por arginina; Val365 é substituída por alanina; e Alal04 é eliminada. 2. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Thrl54 é substituída por fenilalanina, Prol55 é substituída por histidina, Leul56 é substituída por histidina e Leul58 é substituída por arginina. 3. o polipeptídeo da reivindicação 1, em que Tyr230 é substituída por leucina e His231 é substituída por serina. 4. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Ser223 é substituída por prolina e Tyr230 é substituída por serina. 5. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que His231 é substituída por arginina. 6. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em qe His231 é substituída por asparagina e Thr241 é substituída por serina. 7. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que His231 é substituída por treonina. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que 3 ΡΕ1040192 Arg290 é substituída por asparagina. 9. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Ser311 é substituída por leucina, As313 é substituída por treonina e Glu318 é substituída por lisina. Ser311 é 10. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, e que substituída por treonina, Glu317 é substituída por lisina e Tyr318 é substituída por cisteína. 11. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Ser311 é substituída por alanina, Leu312 é substituída por valina e Gln316 é substituída por triptofano. 12. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que His231 é substituída por arginina, Ser311 é substituída por leucina, Asn313 é substituída por treonina e Glu317 é substituída por lisina. Ser311 é 13. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que substituída por treonina, Leu312 é substituída por prolina, Asn313 é substituída por treonina e Glu317 é substituída por asparagina. 14. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Ser311 é substituída por alanina e Gln316 é substituída por ácido aspártico. 15. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que 4 ΡΕ1040192 Ile289 é substituída por treonina, Leu291 é substituída por arginina, Tyr292 é substituída por fenilalanina e Ser293 é substituída por arginina. 16. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que His231 é substituída por arginina e Ser311 é substituída por leucina. 17. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Ser311 é substituída por isoleucina. 18. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Ser311 é substituída por isoleucina e Asn313 é substituída por histidina. 19. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Asn313 é substituída por valina, Thr314 é substituída por asparagina, Gln316 é substituída por metionina e Glu317 é substituída por valina.
2. 20. O polipeptídeo da reivindicação 1, em que Asn313 é substituída por arginina, Leu315 é substituída por prolina, Gln316 é substituída por leucina e Glu317 é substituída por alanina.
3. 21. O polipeptídeo da reivindicação 1, em que Tyr287 é substituída por fenilalanina, Asp288 é substituída por asparagina e Arg290 é substituída por leucina. 5 ΡΕ1040192 22. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Arg290 é substituída por valina. 23. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Aspl65 é substituída por glicina. 24. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Serl60 é substituída por asparagina, Lyslôl é substituída por prlina, Argl62 é substituída por histidina e Aspl65 é substituída por glicina. 25. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Ile289 é substituída por valina e Ser293 é substituída por prolina.
4. 26. Um polipeptídeo Cry3Bb modificado de B. thuringiensis tendo as seguintes alterações de aminoácidos na sequência primária do polipeptídeo Cry3Bb de SEQ ID NO:98: Serl60 é substituída por asparagina, Lysl61 é substituída por prolina, Argl62 é substituída por histidina, Aspl65 é substituída por glicina, Ile289 é substituída por valina e Ser293 é substituído por prolina. 27. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Aspl03 é substituída por ácido glutâmico e Alal04 é eliminada. 28. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Lysl89 é substituída por glicina. ΡΕ1040192
5. 29. Um polipeptídeo Cry3Bb modificado de B. thuringiensis tendo as seguintes alterações de aminoácidos na sequência primária do polipeptídeo Cry3Bb de SEQ ID NO:98: Aspl03 é substituída por ácido glutâmico, Alal04 é eliminada, Serl60 é substituída por asparagina, Lyslôl é substituída por prolina, Argl62 é substituída por histidina e Aspl65 é substituída por glicina.
6. 30. Um polipeptídeo Cry3Bb modificado de B. thuringiensis tendo as seguintes alterações de aminoácidos na sequência primária do polipeptídeo Cry3Bb de SEQ ID NO:98: Aspl03 é substituída por ácido glutâmico, Alal04 é eliminada, Thrl54 é substituída por fenilalanina, Prol55 é substituído por histidina, Leul56 é substituída por histidina e Leul58 é substituída por arginina.
7. 31. O polipeptídeo da reivindicação 1, em que Aspl65 é substituída por glicina, Ser311 é substituída por treonina e Glu317 é substituída por lisina.
8. 32. Um polipeptídeo Cry3Bb modificado de B. thuringiensis tendo as seguintes alterações de aminoácidos na sequência primária do polipeptídeo Cry3Bb de SEQ ID NO:98: Aspl65 é substituída por glicina, Ile289 é substituída por valina, Ser293 é substituída por prolina, Phe305 é substituída por serina, Ser311 é substituída por alanina, Leu312 é substituída por valina, Gln316 é substituída por triptofano, Gln348 é substituída por arginina e Val365 é substituída por alanina. 7 ΡΕ1040192 33. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Ile289 é substituída por valina, Ser293 é substituída por prolina e Gln348 é substituída por arginina. 34. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Aspl65 é substituída por glicina e Ser311 é substituída por leucina. 35. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Gln348 é substituída por arginina. 36. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, em que Aspl65 é substituída por glicina, His231 é substituída por arginina, Ser311 é substituída por leucina, Asn313 é substituída por treonina e Glu317 é substituída por lisina. 37. 0 polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações anteriores, o qual compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6 , SEQ H u o co SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO:1 02 e SEQ ID NO: 108 . ΡΕ1040192 38. 0 polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido polipeptídeo é codificado por uma sequência de ácido nucleico seleccionada de entre SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:7, SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO : 2 7 , SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 35 , SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 43 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO : 51 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO : 59 , SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO :io: L ou SEQ ID NO:10 7.
9. 39. Uma composição compreendendo uma quantidade eficaz como insecticida do polipeptídeo Cry3Bb modificado da reivindicação 1, 37 ou 38.
10. 40. A composição da reivindicação 39, compreendendo entre 0,5% e 99% por peso do polipeptídeo Cry3Bb modificado.
11. 41. A composição da reivindicação 39 ou 40 que é obtida por um processo compreendendo o passo de: (a) cultura de uma célula de Bacillus thurin-giensis NRRL B-21744, NRRL B-21745, NRRL B-21746, NRRL B-21747, NRRL B-21748, NRRL B-2174, NRRL B-21750, NRRL B- 9 ΡΕ1040192 21751, NRRL B-21752, NRRL B-21753, NRRL B-21754, NRRL B- 21755, NRRL B-21756, NRRL B-21757, NRRL B-21758, NRRL B- 21759, NRRL B-21760, NRRL B-21761, NRRL B-21762, NRRL B- 21763, NRRL B-21764, NRRL B-21765, NRRL B-21766, NRRL B- 21767, NRRL B-21768, NRRL B-21769, NRRL B-21770, NRRL B- 21771, NRRL B-21772, NRRL B-21773, NRRL B-21774, NRRL B- 217775, NRRL B-21776, NRRL B-21777, NRRL B-21778, NRRL B- 21779 ou EG11098 em condições de cultura eficazes para produzir um polipeptídeo insecticida; e b) obtenção de um polipeptídeo insecticida a partir da referida célula.
12. 42. A composição de qualquer uma das reivindicações 39 a 41, compreendendo uma célula de B. thuringiensis NRRL B-21744, NRRL B-21745, NRRL B-21746, NRRL B-21747, NRRL B- 21748 , NRRL B- 2174, NRRL B-21750, : NRRL B-21751, NRRL B-21752 , NRRL B-21753, NRRL B-21754, NRRL B-21755, NRRL B- 21756, NRRL B-21757, NRRL B-21758, NRRL B-21759, NRRL B- 21760, NRRL B-21761, NRRL B-21762, NRRL B-21763, NRRL B- 21764, NRRL B-21765, NRRL B-21766, NRRL B-21767, NRRL B- 21768, NRRL B-21769, NRRL B-21770, NRRL B-21771, NRRL B- 21772, NRRL B-21773, NRRL B-21774, NRRL B-217775, NRRL B- 21776, NRRL B-21777, NRRL B 1-21778 ou NRRL B-21779.
13. 43. A composição de qualquer uma das reivindicações 39 a 42, em que a referida composição compreende um extracto celular, suspensão celular, fracção proteica, fracçao de cristal, cultura celular, homogenato celular 10 ΡΕ1040192 lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular ou sedimento celular de uma célula de Bacillus thuringiensis NRRL B- -21744, NRRL B-21745, NRRL B-21746, NRRL B-21747, NRRL B- 21748 , NRRL B-2174, NRRL B-21750, NRRL B-21751, NRRL B-21752 , NRRL B-21753, NRRL B-21754 , NRRL B-21755, NRRL B- 21756, NRRL B-21757, NRRL B-21758, NRRL B-21759, NRRL B- 21760, NRRL B-21761, NRRL B-21762, NRRL B-21763, NRRL B- 21764, NRRL B-21765, NRRL B-21766, NRRL B-21767, NRRL B- 21768, NRRL B-21769, NRRL B-21770, NRRL B-21771, NRRL B- 21772, NRRL B-21773, NRRL B-21774, NRRL B-217775, NRRL B- 21776, NRRL B-21777, NRRL B-21778, NRRL B -21779 ou EG11098.
14. 44. A composição de qualquer uma das reivindicações 39 a 43, formuladas como um pó, qrânulos, liquido pulverizado, emulsão, colóide ou solução.
15. 45. A composição de qualquer uma das reivindicações 39 a 44, em que a referida composição é preparada por secagem, liofilização, homogenização, emulsionação, evaporação, separação, extracção, filtração, centrifugação, sedimentação, diluição, cristalização ou concentração.
16. 46. Um polinucleótido compreendendo uma região isolada da sequência que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 38.
17. 47. O polinucleótido da reivindicação 46, consistindo em DNA, cDNA, rRNA ou mRNA. 11 ΡΕ1040192 48. 0 polinucleótido da reivindicação 46 ou 47, em que o referido polinucleótido tem 2000 a 10000 nucleótidos de comprimento, de preferência entre 3000 e 8000 nucleótidos de comprimento.
18. 49. O polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 46 a 48, em que a referida região da sequência isolada está operacionalmente ligada a um promotor, o referido promotor expressando a referida região da sequência.
19. 50. O polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 46 a 49, em que a referida região da sequência isolada está operacionalmente ligada a um promotor hete— rólogo.
20. 51. O polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 46 a 50, em que a referida região da sequência isolada está operacionalmente ligada a um promotor que é expresso numa planta.
21. 52. O polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 46 a 51, em que a referida região da sequência isolada está operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, induzivel ou especifico de tecido.
22. 53. Um vector compreendendo o polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 46 a 52, ou um polinucleótido que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 38. 12 ΡΕ1040192 54. 0 vector da reivindicação 53, definido como um plasmideo, cosmideo, fagomideo, fago, virus ou baculo-virus. 55. 0 vector da reivindicação 53 ou 54, trans formado e replicado num hospedeiro procariótico ou euca-riótico.
23. 56. Um virus compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 38, ou o polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 46 ou 52.
24. 57. Uma célula hospedeira transformada compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 38, o polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 46 a 52, o vector de qualquer uma das reivindicações 53 a 55, ou o vírus da reivindicação 56.
25. 58. A célula hospedeira transformada da reivindicação 57, ainda definida como uma célula procariótica ou eucariótica.
26. 59. A célula hospedeira transformada da reivindicação 57 ou 58, em que a referida célula procariótica é uma célula de eubactéria, arqueabactéria ou cianobactéria, ou em que a referida célula eucariótica é uma célua animal, de fungo ou vegetal. 13 ΡΕ1040192
27. 60. A célula hospedeira transformada de qualquer uma das reivindicações 57 a 59, em que a referida célula é uma célula de E. coli, B. thuringiensis, A. tumefaciens, B. subtilis, B. megaterium, B. cereus, Salmonella spp., ou Pseudomonas spp.
28. 61. A célula hospedeira transformada de qualquer uma das reivindicações 57 a 60, em que a referida célula . é seleccionada de entre : B. thuringiensis NRRL B-21744, NRRL B-21745 , NRRL B-21746 , NRRL B-21747 , NRRL B-21748, NRRL B- 217 4, NRRL B-21750, NRRL B-21751, NRRL B-21752, NRRL B- 21753, NRRL B-21754, NRRL B-21755, NRRL B-21756, NRRL B- 21757, NRRL B-21758, NRRL B-21759, NRRL B-21760, NRRL B- 21761, NRRL B-21762, NRRL B-21763, NRRL B-21764, NRRL B- 21765, NRRL B-21766, NRRL B-21767, NRRL B-21768, NRRL B- 21769, NRRL B-21770, NRRL B-21771, NRRL B-21772, NRRL B- 21773, NRRL B-21774, NRRL B-217775, NRRL B-21776, NRRL B- 21777, NRRL B-21778 e NRRL B-21779.
29. 62. A célula hospedeira transformada da reivindicação 59, em que a referida célula vegetal é uma célula de cereal, árvore, legume, fibra, vegetal, furto, baga, noz, citrino, graminea, cacto, suculenta ou planta ornamental .
30. 63. A célula hospedeira transformada da reivindicação 62, em que a referida célula vagetal é uma célula de milho, arroz, tabaco, alfafa, soja, sorgo, batata, tomate, linho, canola, girassol, algodão, paina, trigo, aveia, cevada ou centeio. 14 ΡΕ1040192
31. 64. A célula hospedeira transformada de qualquer uma das reivindicações 57 a 63, em que o referido polinu-cleótido é introduzido na referida célula através de um vector,vírus, cosmídeo, fagomídeo, fago, plasmídeo ou através de electroporação, transformação, conjugação, bombardeamento com microprojécteis, injecção directa de DNA, transferência de DNA nu, transformação ou transfecção.
32. 65. Uma planta transgénica compreendendo o poli-peptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 38, o polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 46 a 52, o vector de qualquer uma das reivindicações 53 a 55, o vírus da reivindicação 56, ou a célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 57 a 64.
33. 66. A planta transgénica da reivindicação 65, tendo incorporado no seu genoma um polinucleótido selec-cionado que codifica o polipeptídeo de qualque ruma das reivindicações 1 a 38.
34. 67. A planta transgénica da reivindicação 65 ou 66, em que a referida planta é cereal, árvore, legume, fibra, vegetal, furto, baga, noz, citrino, gramínea, cacto, suculenta ou planta ornamental. sorgo,
35. 68. A planta transgénica de qualquer uma das reivindicações 65 a 67, em que a referida planta é uma planta de milho, arroz, tabaco, alfafa, soja, 15 ΡΕ1040192 batata, tomate, linho, canola, girassol, algodão, paina, trigo, aveia, cevada ou centeio.
36. 69. Uma progénie de qualquer uma das gerações da planta transgénica de qualquer uma das reivindicações 65 a 68, a referida progénie compreendendo o polipeptideo, o polinucleótido, o vector, o vírus ou a célula hospedeira como definido na reivindicação 65 ou 66.
37. 70. Uma semente de qualquer uma das gerações da planta transgénica de qualquer uma das reivindicações 65 a 68, a referida semente compreendendo o polipeptideo, o polinucleótido, o vector, o vírus ou a célula hospedeira como definido na reivindicação 65 ou 66.
38. 71. Uma semente de qualquer uma das gerações da progénie da reivindicação 69, a referida semente compreendendo o polipeptideo, o polinucleótido, o vector, o vírus ou a célula hospedeira como definido na reivindicação 66 ou 6 7.
39. 72. A planta transgénica da reivindicação 65, que é obtida através do crescimento da semente da reivindicação 70 ou 71.
40. 73. Um método para a morte de um insecto cole-óptero, o referido método compreendendo o passo de contacto do referido insecto com uma quantidade eficaz em termos de insecticida do polipeptideo modificado da reivindicação 1. 16 ΡΕ1040192
41. 74. Um método de controlo de uma população de insectos coleópteros, o referido método compreendendo o passo de colocar no ambiente da referida população de insectos, uma quantidade eficaz como insecticida do poli-peptídeo modificado da reivindicação 1. 75. 0 método da reivindicação 73 ou 74, em que o referido polipeptídeo modificado é obtido a partir de um extracto celular, suspensão de células, fracção proteica, fracção do cristal, cultura celular, homogenato de células, lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular ou sedimento de células de uma célula de B. thuringiensis NRRL B-21744 , NRRL B-21745, NRRL B-21746 , NRRL B-21747, NRRL B- 21748, NRRL B-2174, NRRL B-21750, NRRL B-21751, NRRL B- 21752, NRRL B-21753, NRRL B-21754, NRRL B-21755, NRRL B- 21756, NRRL B-21757, NRRL B-21758, NRRL B-21759, NRRL B- 21760, NRRL B-21761, NRRL B-21762, NRRL B-21763, NRRL B- 21764, NRRL B-21765, NRRL B-21766, NRRL B-21767, NRRL B- 21768, NRRL B-21769, NRRL B-21770, NRRL B-21771, NRRL B- 21772, NRRL B-21773, NRRL B-21774, NRRL B-217775, NRRL B- 21776, NRRL B-21777, NRRL B ,-21778 e NRRL B -21779. 76. 0 método de qualquer uuma das reivindicações 73 a 75, em que o referido polipeptídeo modificado é colocado no referido ambiente através de vaporização, empoei-ramento, aspersão, enxaguamento, arejamento, nebulização, atomização, injecção do solo, cobertura do solo com mosaicos, revestimento de sementes ou revestimento de plântulas. 17 ΡΕ1040192 77. 0 método de qualquer uma das reivindicações 73 a 76, em que o referido polipeptídeo modificado é formulado como um pó, qrânulos, liquido vaporizado, emulsão, colóide ou solução. 78. 0 método de qualquer uma das reivindicações 73 a 77, em que o referido polipeptideo é preparado por secagem, liofilização, homogenização, emulsificação, evaporação, separação, extracção, filtração, centrifugação, sedimentação, diluição, cristalização ou concentração.
42. 79. Um método de preparação de uma planta trans-génica resistente a Coleópteros, compreendendo os passos de: (a) transformação de uma célula vegetal com um polinucleótido compreendendo uma região da sequência selec-cionada que codifica o polipeptideo da reivindicação 1 ou 39, em que a referida região da sequência está operacionalmente ligada a um promotor que expressa a referida região; e (b) geração a partir da referida célula vegetal de uma planta transgénica que compreende a referida região da sequência seleccionada e que expressa o referido polipeptideo .
43. 80. Um método para matar um insecto coleóptero, compreendendo a alimentação do referido insecto com uma 18 ΡΕ1040192 célula vegetal transformada com um polinucleótido que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo como definido na reivindicação 37. 81. 0 método da reivindicação 80, em que o referido insecto é morto pela ingestão de uma porção de uma planta transgénica que compreende a referida célula transformada .
44. 82. Um método de preparação de uma semente vegetal resistente ao ataque por insectos coleópteros, o referido método compreendendo os passos de: (a) transformação de uma célula vegetal com um segmento de ácido nucleico compreendendo um polinucleótido que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo como definido na reivindicação 37 para produzir uma célula vegetal transformada; (b) crescimento da referida célula vegetal transformada em condições eficazes para produzir uma planta transgénica a partir da referida célula; e (c) obtenção a partir da referida planta transgénica, uma semente resistente ao ataque pelo referido insecto Coleóptero.
45. 83. O método da reivindicação 82, em que o passo (a) compreende a transformação da referida célula vegetal 19 ΡΕ1040192 por electroporação, transfecção, introdução de DNA nu, geração de protoplastos, transferência directa do DNA para pólen, embrião ou célula vegetal pluripotente, transformação mediada por Agrobacterium, bombardeamento de partículas ou bombardeamento com microprojécteis. 84. 0 método da reivindicação 82 ou 83, em gue o passo (b) compreende a geração de células vegetais pluri-potentes a partir da referida célula vegetal transformada.