JP2022512817A - オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介植物形質転換のための組成物及び方法 - Google Patents

オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介植物形質転換のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本出願では、改変オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株、そのような改変オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株を作製する方法、並びに形質転換植物を生産するためにそのような改変オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株を使用する方法が開示されている。

Description

本開示は、全体として、植物の遺伝子操作等の植物分子生物学の分野に関する。より具体的には、本開示は、改変オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株、そのような改変オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株を作製する方法、並びに形質転換植物を生産するためにそのようなオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株を使用する方法、及びそのようにして生産された形質転換植物に関連する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／７５３５９４号明細書の利益を主張するものであり、この明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１９年９月２６日に作成された、２０１９０９２６＿７８３６ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇＴＸＴと命名され且つ８０，６０３バイトのサイズを有するファイルのＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、且つ本明細書と同時に出願されている。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１ ＮＲＲＬ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｂ－６７０７８（オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１）は、植物細胞のゲノム内にＴ－ＤＮＡを組み込むために使用される。オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１は、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、カルベニシリン、バンコマイシン、チメンチン、及びセフォタキシム等の一部の抗生物質に対して耐性を示す。環境中への抗生物質耐性遺伝子の拡散は、非常に望ましくない。加えて、これらの抗生物質の多くは、組織培養で一般に使用されている。この抵抗性により、一部の組織培養プロセス中にオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１が過剰に増殖し、このことは形質転換効率に悪影響を及ぼし、結果として、形質転換された外植片が失われる。
そのため、組織培養プロセスで使用される抗生物質に対して感受性を示し、栄養要求性も示し、且つ温室プロセス及び他の環境下での生物学的封じ込めを容易にして環境中への抗生物質耐性遺伝子の拡散を抑制する、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１の改善株が必要とされている。
ある態様では、改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌であって、β－ラクタマーゼ遺伝子が欠失している、改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌が提供される。ある態様では、改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌であって、セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が欠失している、改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌が提供される。ある態様では、この改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０である。ある態様では、このセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、アレル置換により、この改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌から欠失している。ある態様では、この改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－２、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－３、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－４、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－５、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－６、及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－７からなる群から選択される。ある態様では、システイン要求性株をさらに含む改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。ある態様では、この改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８である。ある態様では、ロイシン要求性株をさらに含む改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。ある態様では、この改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－９である。ある態様では、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、アレル置換により、この改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌から欠失している。ある態様では、β－ラクタマーゼ遺伝子は、ＳＦＯ－１遺伝子、ＯＸＡ－１遺伝子、クラスＢ Ｚｎ金属酵素遺伝子（Ｃｌａｓｓ Ｂ Ｚｎ－ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ ｇｅｎｅ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。ある態様では、このβ－ラクタマーゼ遺伝子は、アレル置換により、この改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌から欠失している。ある態様では、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌が提供される。ある態様では、配列番号２４を含まない改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌が提供される。ある態様では、植物に有利な形質を付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを有するバイナリープラスミドＴ－ＤＮＡをさらに含む、本明細書で提供される改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。ある態様では、この有利な形質は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせである。ある態様では、ヘルパープラスミドをさらに含む改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌が提供される。ある態様では、植物に有利な形質を付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを有するバイナリープラスミドＴ－ＤＮＡと、ヘルパープラスミドをさらに含む改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌が提供される。
ある態様では、植物を形質転換する方法であって、植物細胞と、改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌とを接触させることであり、この改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌のこの植物細胞への感染を許容する条件下で接触させ、それによりこの植物細胞を形質転換すること；この形質転換された植物細胞を選択し且つスクリーニングすること；及びこの選択され且つスクリーニングされた植物細胞からトランスジェニック植物全体を再生することを含む方法が提供される。ある態様では、このトランスジェニック植物は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせを付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含む。ある態様では、この植物細胞は、オオムギ細胞、トウモロコシ細胞、キビ細胞、オートムギ細胞、イネ細胞、ライムギ細胞、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種細胞、ソルガム細胞、サトウキビ細胞、スイッチグラス細胞、ライコムギ細胞、芝草細胞、コムギ細胞、ケール細胞、カリフラワー細胞、ブロッコリー細胞、カラシナ細胞、キャベツ細胞、エンドウ細胞、クローバー細胞、アルファルファ細胞、ソラマメ細胞、トマト細胞、キャッサバ細胞、ダイズ細胞、キャノーラ細胞、ヒマワリ細胞、ベニバナ細胞、タバコ細胞、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞、又はワタ細胞である。
ある態様では、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８である改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌が提供される。ある態様では、植物に有利な形質を付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを有するバイナリープラスミドＴ－ＤＮＡをさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌が提供される。ある態様では、この有利な形質は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせである。ある態様では、ヘルパープラスミドをさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌が提供される。ある態様では、植物に有利な形質を付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを有するバイナリープラスミドＴ－ＤＮＡと、ヘルパープラスミドをさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌が提供される。
ある態様では、植物を形質転換する方法であって、植物細胞と、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌とを接触させることであり、このオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌のこの植物細胞への感染を許容する条件下で接触させ、それによりこの植物細胞を形質転換すること；この形質転換された植物細胞を選択し且つスクリーニングすること；及びこの選択され且つスクリーニングされた植物細胞からトランスジェニック植物全体を再生することを含む方法が提供される。ある態様では、このトランスジェニック植物は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせを付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含む。ある態様では、この植物細胞は、オオムギ細胞、トウモロコシ細胞、キビ細胞、オートムギ細胞、イネ細胞、ライムギ細胞、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種細胞、ソルガム細胞、サトウキビ細胞、スイッチグラス細胞、ライコムギ細胞、芝草細胞、コムギ細胞、ケール細胞、カリフラワー細胞、ブロッコリー細胞、カラシナ細胞、キャベツ細胞、エンドウ細胞、クローバー細胞、アルファルファ細胞、ソラマメ細胞、トマト細胞、キャッサバ細胞、ダイズ細胞、キャノーラ細胞、ヒマワリ細胞、ベニバナ細胞、タバコ細胞、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞、又はワタ細胞である。
ある態様では、植物を形質転換する方法であって、植物細胞と、植物に有利な形質を付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを有するバイナリープラスミドＴ－ＤＮＡを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌とを接触させることであり、このオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌のこの植物細胞への感染を許容する条件下で接触させ、それによりこの植物細胞を形質転換すること；この形質転換された植物細胞を選択し且つスクリーニングすること；及びこの選択され且つスクリーニングされた植物細胞からトランスジェニック植物全体を再生することを含む方法が提供される。ある態様では、このトランスジェニック植物は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせを付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含む。ある態様では、この植物細胞は、オオムギ細胞、トウモロコシ細胞、キビ細胞、オートムギ細胞、イネ細胞、ライムギ細胞、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種細胞、ソルガム細胞、サトウキビ細胞、スイッチグラス細胞、ライコムギ細胞、芝草細胞、コムギ細胞、ケール細胞、カリフラワー細胞、ブロッコリー細胞、カラシナ細胞、キャベツ細胞、エンドウ細胞、クローバー細胞、アルファルファ細胞、ソラマメ細胞、トマト細胞、キャッサバ細胞、ダイズ細胞、キャノーラ細胞、ヒマワリ細胞、ベニバナ細胞、タバコ細胞、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞、又はワタ細胞である。
ある態様では、植物を形質転換する方法であって、植物細胞と、ヘルパープラスミド、及び植物に有利な形質を付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを有するバイナリープラスミドＴ－ＤＮＡ、及びヘルパープラスミドを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌とを接触させることであり、このオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌のこの植物細胞への感染を許容する条件下で接触させ、それによりこの植物細胞を形質転換すること；この形質転換された植物細胞を選択し且つスクリーニングすること；並びにこの選択され且つスクリーニングされた植物細胞からトランスジェニック植物全体を再生することを含む方法が提供される。ある態様では、このトランスジェニック植物は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせを付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含む。ある態様では、この植物細胞は、オオムギ細胞、トウモロコシ細胞、キビ細胞、オートムギ細胞、イネ細胞、ライムギ細胞、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種細胞、ソルガム細胞、サトウキビ細胞、スイッチグラス細胞、ライコムギ細胞、芝草細胞、コムギ細胞、ケール細胞、カリフラワー細胞、ブロッコリー細胞、カラシナ細胞、キャベツ細胞、エンドウ細胞、クローバー細胞、アルファルファ細胞、ソラマメ細胞、トマト細胞、キャッサバ細胞、ダイズ細胞、キャノーラ細胞、ヒマワリ細胞、ベニバナ細胞、タバコ細胞、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞、又はワタ細胞である。
アレル置換ベクターを使用するオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株の生成の概略図を示す。
下記で、添付の図面を参照しながら本明細書中の開示をより詳しく説明するが、図面は可能な態様のいくつかを示すものであって全部ではない。実際、開示は、多くの異なる形態で具体化可能であり得、本明細書中で記載された態様に限定されると解釈すべきではなく、むしろ、これらの態様は、本開示が適用法的要件を満たすために提供されるものである。
本明細書で開示されている多くの変更及び他の態様は、本開示の方法が関連する技術分野の当業者であって、以下の説明及び添付の図面に提示された教示を利用できる者であれば、思い付くであろう。従って、本開示が、開示された特定の態様に限定されるべきではないこと、並びに変更及び他の態様が添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されていることを理解しなければならない。本明細書中では特定の用語が使用されるが、それらは、一般的な且つ記述的な意味でのみ使用されるものであって、限定を目的として使用されるものではない。
本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明するという目的のためのものであるにすぎず、限定的であることは意図されていない。本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語には、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の態様が含まれ得る。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示の方法が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。この後に続く本明細書及び特許請求の範囲においては、本明細書で定義される多くの用語について言及するであろう。
ある態様では、本開示は、トランスジェニック植物を生産するための方法及び組成物を含む。「植物」という用語は、全植物、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、植物組織、植物細胞、植物部分、種子、栄養繁殖体、胚、及びこれらの子孫を指す。植物細胞は、分化又は未分化であり得る（例えば、カルス、未分化カルス、未熟胚及び成熟胚、未熟接合胚、未熟子葉、胚軸、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉、葉細胞、根細胞、師管細胞、及び花粉）。植物細胞として、限定されないが、下記からの細胞が挙げられる：種子、懸濁培養物、外植片、未熟胚、胚、接合胚、体細胞胚、胚発生カルス、分裂組織、体細胞分裂組織、器官形成カルス、プロトプラスト、成熟穂生成種子由来胚、葉基、成熟植物由来葉、葉頂、未熟花序、房、未熟穂、シルク、子葉、未熟子葉、胚軸、分裂組織領域、カルス組織、葉由来細胞、葉由来細胞、茎由来細胞、根由来細胞、シュート由来細胞、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子由来。植物部として下記が挙げられる：分化組織及び未分化組織、例えば、限定されないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、及び様々な形態の培養物中の細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、及びカルス組織）。植物組織は、植物中に存在してもよいし、植物の器官、組織、又は細胞培養物に存在してもよい。穀粒は、種の栽培又は繁殖以外の目的で栽培業者が作製する成熟種子を意味することが意図されている。再生植物の子孫、改変体、及び変異体もまた、これらの子孫、改変体、及び変異体が導入ポリヌクレオチドを含むならば、本開示の範囲に含まれる。
本開示は、任意の植物種（例えば、限定されないが、単子葉植物及び双子葉植物）の形質転換に使用され得る。単子葉植物として下記が挙げられるが、これらに限定されない：オオムギ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）（トウモロコシ（ｃｏｒｎ））、キビ（ｍｉｌｌｅｔ）（例えば、トウジンビエ（ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（ｐｒｏｓｏ ｍｉｌｌｅｔ）（パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、テフ（エラグロスティス・テフ（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ ｔｅｆ））、オートムギ、イネ、ライムギ、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、ライコムギ、若しくはコムギ、又は葉及び茎作物、例えば、限定されないが、竹、マーラム、牧草、アシ、ライグラス、サトウキビ；芝、観賞用草本、並びにスイッチグラス及び芝草等の他の草。或いは、本開示で使用される双子葉植物として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、エンドウ、クローバー、アルファルファ、ソラマメ、トマト、ラッカセイ、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、又はワタ。
目的の植物種の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：トウモロコシ（ズィー・メイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ））、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（例えば、Ｂ．ナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、Ｂ．ジュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））、特に、種子油源として有用なブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、キビ（ｍｉｌｌｅｔ）（例えば、トウジンビエ（ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（ｐｒｏｓｏ ｍｉｌｌｅｔ）（パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））、コムギ（トリーティクム・アエスティウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））、ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ラッカセイ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、ワタ（ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、サツマイモ（イポモエア・バタツス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ））、キャッサバ（マニホト・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コフィア属（Ｃｏｆｆｅａ）種）、ココナツ（ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、カンキツ樹（シトラス属（Ｃｉｔｒｕｓ）種）、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ））、チャノキ（カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（ムサ属（Ｍｕｓａ）種）、アボカド（ペルセア・アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））、イチジク（フィクス・カシカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ））、グアバ（プシディウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オレア・エウロパエア（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイア（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ））、カシュー（アナカルジウム・オクシデンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））、マカダミア（マカダミア・インテグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、アーモンド（プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ））、テンサイ（ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、サトウキビ（サッカルム属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種）、カラスムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、及び球果植物。
高等植物を本開示に使用し得、例えば、被子植物類（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）及び裸子植物類（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）の綱を本開示に使用し得る。本開示に有用で好適な植物種は、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）、ユリズイセン科（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、ベニノキ科（Ｂｉｘａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、イヌガヤ科（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、イヌサフラン科（Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、マオウ科（Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ）、ユカノキ科（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、ヒカゲノカズラ科（Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、メランチウム科（Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、ヌマミズキ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、マツ科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、及びブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）由来であり得る。トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、パイナップル属（Ａｎａｎａｓ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）、アトローパ属（Ａｔｒｏｐａ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンレンボク属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、キナ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、コヒア属（Ｃｏｆｆｅａ）、イヌサフラン属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、エリスロキシルム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ガランサス属（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ナンヨウアブラギリ属（Ｊａｔｒｏｐｈａ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ヤマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヨモギキク属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ポア属（Ｐｏａ）、ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、サングイナリア属（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ウニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）、シュロソウ属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ビンカ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、及びトウモロコシ属（Ｚｅａ）のメンバーからの植物が、本開示の方法で使用され得る。
農業、園芸、（液体燃料分子及び他の化学物質の作製のための）バイオマス作製、並びに／又は林業にとって重要な又は興味深い植物は、本開示の方法で使用され得る。非限定的な例として、例えば下記が挙げられる：パニクム・ウィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、ミスカンツス・ギガンテウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ、エネルギーケーン（ｅｎｅｒｇｙｃａｎｅ））、ポプルス・バルサミフェラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ワタ（ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、ソルガム（ソルガム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、アンドロポゴン・ゲラルディー（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ペニセタム・プルプレウム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、ファラリスアルンディナケア（Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（クサヨシ）、シノドン・ダクチロン（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ）（ギョウギシバ）、フェスツカ・アルンディナケア（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（トールフェスキュ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、アルンド・ドナックス（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ、例えば、Ｅ．グランディス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）（及び、「ウログランディス」として知られるそのハイブリッド）、Ｅ．グロブルス（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、Ｅ．カマルドレンシス（Ｅ．ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）、Ｅ．テレティコルニス（Ｅ．ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉ）、Ｅ．ビミナリス（Ｅ．ｖｉｍｉｎａｌｉｓ）、Ｅ．ニテンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、Ｅ．サリグナ（Ｅ．ｓａｌｉｇｎａ）、及びＥ．ウロフィラ（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ））、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（コムギ属（ｔｒｉｔｉｃｕｍ）－コムギ×ライムギ）、テフ（エラグロスティス・テフ（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ ｔｅｆ））、竹、カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ヤトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）（ヤトロファ属（ｊａｔｒｏｐｈａ））、リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、エラエイス・グネーンシス（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、リヌム・ウシタティスシムム（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（亜麻）、マニホト・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、リコペルシコン・エクスレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、ラクチュカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）（レタス）、ファセオルス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（サヤインゲン）、ファセオルス・リメンシス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）（ライマメ）、レンリソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）種（エンドウマメ）、ムサ・パラディシアカ（Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（Ｂ．ナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、Ｂ．ジュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ）、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（チャノキ）、フラガリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ）（イチゴ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）（ココア）、コフェア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）（コーヒーノキ）、ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、カプシカム・アンヌム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ）（トウガラシ及びピーマン）、アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）（ラッカセイ）、イポモエア・バタツス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）（サツマイモ）、ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）（ココナツ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）種（カンキツ類の木）、ペルセア・アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（アボカド）、イチジク（フィクス・カシカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ））、グアバ（シジウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オレア・エウロパエ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））、カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）（パパイア）、アナカルジウム・オクシデンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）（カシュー）、マカダミア・インテグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）（マカダミアの木）、プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）（アーモンド）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）（タマネギ）、ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）（マスクメロン）、ククミス・サチブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、ククミス・カンタルペンシス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）（カンタロープ）、ククルビタ・マクシマ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）（スクワシュ）、ククルビタ・モスカータ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）（スクワシュ）、スピナケア・オレラケア（Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、キトルッルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、アベルモスクス・エスクレンツス（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、シアムプシス・テトラゴノロバ（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ）（グアーマメ）、ケラトニア・シリクア（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ）（イナゴマメ）、トリゴネラ・フォエヌム－グラエクム（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ ｆｏｅｎｕｍ－ｇｒａｅｃｕｍ）（フェヌグリーク）、ビグナ・ラディアタ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）（リョクトウ）、ビグナ・ウンギィクラタ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）（ササゲ）、ビシア・ファバ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）（ソラマメ）、キセル・アリエチヌム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）（ヒヨコマメ）、レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）（レンズマメ）、パパフェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ケシ）、パパフェル・オリエンターレ（Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、タクスス・バッカータ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、タクスス・ブレウィフォリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、アルテミシア・アヌア（（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、カムプトテカ・アクミナーテ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、カタランツス・ロセウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、ビンカ・ロセア（Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ）、キンコナ・オッフィキナリス（Ｃｉｎｃｈｏｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、カリフォルニアバイケイソウ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ．）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ）、ジギタリス・プルプレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）種、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）種、シナマオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａｓｉｎｉｃａ）種、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）種、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）種、ホソバノトウゲシバ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ ｓｅｒｒａｔｕｍ）（トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ ｓｅｒｒａｔａ））、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）種、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）種、サンギナリア・カナデンシス（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）種、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、コシロギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）種（ゴムノキ）、オランダハッカ（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、コショウハッカ（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ ｏｒｅｌｌａｎａ）（ベニノキ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）種、バラ属（Ｒｏｓａ）種（バラ）、ツツジ属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）種（アザレア）、アザレア（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）（アザレア）、ブッソウゲ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）（ハイビスカス）、チューリップ属（Ｔｕｌｉｐａ）種（チューリップ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）種（ラッパズイセン）、ペチュニア・ハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）（ペチュニア）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、キク、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、シロバナルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）（ルピナス）、ユニオラ・パニクラタ（Ｕｎｉｏｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（カラスムギ）、ベントグラス（コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）種）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（ヤマナラシ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種（マツ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）種（モミ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）種（メープル）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）（オオムギ）、ナガハグサ（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ブルーグラス）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）種（ライグラス）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）（オオアワガエリ）、及び球果植物。
本開示では球果植物を使用し得、球果植物として、例えば下記が挙げられる：マツ、例えば、テーダマツ（テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ））、スラッシュパイン（スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ））、ポンデローサマツ（ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ））、ロッジポールパイン（コントルタマツ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ））、及びモントレーパイン（ラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ））；ダグラスファー（ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））；カナダツガ（カナダツガ（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））；アメリカツガ（アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ））；マウンテンヘムロック（マウンテンヘムロック（Ｔｓｕｇａ ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ））；アメリカカラマツ又はカラマツ（ラリックス・オキシデンタリス（Ｌａｒｉｘ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））；ベイトウヒ（カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ））；セコイア（セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））；トゥルーモミ、例えば、ヨーロッパモミ（アビエス・アマビリス（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ））、及びバルサムモミ（バルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ））；並びにシーダー、例えば、ベイスギ（ベイスギ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ））、及びアラスカイエローシーダー（イエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））。
本開示では芝草を使用し得、芝草として下記が挙げられるが、これらに限定されない：スズメノカタビラ（スズメノカタビラ（Ｐｏａ ａｎｎｕａ））；ネズミムギ（ネズミムギ（Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；カナダブルーグラス（コイチゴツナギ（Ｐｏａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））；コロニアルベントグラス（イトコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓｔｅｎｕｉｓ））；クリーピングベントグラス（コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））；クレステッドホイートグラス（アグロピロン・デセルトルム（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ））；フェアウェイホイートグラス（アグロピロン・クリスタツム（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｃｒｉｓｔａｔｕｍ））；ハードフェスク（フェストゥカ・ロンギホリア（Ｆｅｓｔｕｃａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ））；ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ））；オーチャードグラス（カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ））；ペレニアルライグラス（ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ））；レッドフェスク（オオウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ｒｕｂｒａ））；レッドトップ（コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ａｌｂａ））；ラフブルーグラス（オオスズメノカタビラ（Ｐｏａ ｔｒｉｖｉａｌｉｓ））；ウシノケグサ（ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ｏｖｉｎａ））；スムーズブロムグラス（コスズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ ｉｎｅｒｍｉｓ））；オオアワガエリ（オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ））；ベルベットベントグラス（ヒメヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｃａｎｉｎａ））；ウィーピングアルカリグラス（アレチタチドジョウツナギ（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ ｄｉｓｔａｎｓ））；ヒメカモジグサ（アグロピロン・スミチイ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｓｍｉｔｈｉｉ））；セントオーガスチングラス（イヌシバ（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ））；ノシバ（シバ属（Ｚｏｙｓｉａ）種）；バヒアグラス（アメリカスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ））；カーペットグラス（ホソバツルメヒシバ（Ａｘｏｎｏｐｕｓ ａｆｆｉｎｉｓ））；センチビードグラス（チャボウシノシッペイ（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ））；キクユグラス（キクユグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｃｌａｎｄｅｓｉｎｕｍ））；シーショアパスパラム（サワスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ ｖａｇｉｎａｔｕｍ））；ブルーグラマ（ブルーグラマ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ ｇｒａｃｉｌｉｓ））；バッファローグラス（バッファローグラス（Ｂｕｃｈｌｏｅ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｓ））；アゼガヤモドキ（アゼガヤモドキ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ））。
特定の態様では、本明細書で開示されている組成物及び方法を使用して形質転換される植物は、作物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、イネ、ソルガム、コムギ、キビ、タバコ等）である。特に目的の植物として、目的の種子を提供する穀物植物、油糧種子植物、及びマメ科植物が挙げられる。目的の種子として、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライムギ等の穀物の種子が挙げられる。油糧種子植物として、ワタ、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナツ等が挙げられ、マメ科植物として、マメ及びエンドウマメが挙げられるが、これらに限定されない。マメとして、グアー、イナゴマメ、フェヌグリーク、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、及びヒヨコマメが挙げられるが、これらに限定されない。
ある態様では、本開示はまた、本明細書で開示されている組成物及び方法を使用して得られた植物も含む。ある態様では、本開示はまた、本明細書で開示されている組成物及び方法を使用することにより得られた植物からの種子も含む。トランスジェニック植物は、導入遺伝子を含む成熟した稔性植物と定義される。
本開示の方法では、未熟胚、１～５ｍｍの接合胚、３～５ｍｍの胚、並びに、成熟した雌穂由来の種子、葉基、十分に成長した植物体の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟雌穂、及びシルクに由来する胚等の様々な植物由来の外植片を使用し得る。ある態様では、本開示の方法で使用される外植片は、成熟した雌穂由来の種子、葉基、十分に成長した植物体の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟雌穂、及びシルクに由来し得る。本開示の方法で使用される外植片は、本明細書で説明されている植物のいずれかに由来し得る。
本開示は、単離されたか又は実質的に精製された核酸組成物を包含する。「単離された」か又は「精製された」核酸分子若しくはタンパク質又はそれらの生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境において見出されるような核酸分子若しくはタンパク質に通常付随するか若しくは相互作用する他の細胞物質若しくは成分を実質的に含まないか、又は組み換え技術により生成される場合には培養培地を実質的に含まず、若しくは化学的に合成される場合には化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然ではこの核酸に隣接している配列（例えばタンパク質コード配列）（即ち、この核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を実質的に含まない。例えば、様々な態様では、単離された核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然ではこの核酸分子に隣接しているヌクレオチド配列を、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満含み得る。細胞物質を実質的に含んでいないタンパク質として、夾雑タンパク質が約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満（乾燥重量で）であるタンパク質調製物が挙げられる。本開示の方法に有用なタンパク質、又はその生物学的に活性な部分が組み換え技術によって作られた場合には、最適には、培養培地中の化学的前駆体又は非目的タンパク質の化学物質は、約３０％、２０％、１０％、５％又は１％未満（乾燥重量で）である。本開示の方法に有用な配列を、それぞれの転写開始部位に隣接している５’非翻訳領域から単離し得る。本開示は、本開示の方法に有用な単離されたか又は実質的に精製された核酸又はタンパク質組成物を包含する。
本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、核酸配列の一部を指す。本開示の方法に有用な配列の断片は、核酸配列の生物学的活性を保持する。或いは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、必ずしも生物学的活性を保持し得ない。本明細書で開示されているヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０、１９７５、２０００、２０２５、２０５０、２０７５、２１００、２１２５、２１５０、２１７５、２２００、２２２５、２２５０、２２７５、２３００、２３２５、２３５０、２３７５、２４００、２４２５、２４５０、２４７５、２５００、２５２５、２５５０、２５７５、２６００、２６２５、２６５０、２６７５、２７００、２７２５、２７５０、２７７５、２８００、２８２５、２８５０、２８７５、２９００、２９２５、２９５０、２９７５、３０００、３０２５、３０５０、３０７５、３１００、３１２５、３１５０、３１７５、３２００、３２２５、３２５０、３２７５、３３００、３３２５、３３５０、３３７５、３４００、３４２５、３４５０、３４７５、３５００、３５２５、３５５０、３５７５、３６００、３６２５、３６５０、３６７５、３７００、３７２５、３７５０、３７７５、３８００、３８２５、３８５０、３８７５、３９００、３９２５、３９５０、３９７５、４０００、４０２５、４０５０、４０７５、４１００、４１２５、４１５０、４１７５、４２００、４２２５、４２５０、４２７５、４３００、４３２５、４３５０、４３７５、４４００、４４２５、４４５０、４４７５、４５００、４５２５、４５５０、４５７５、４６００、４６２５、４６５０、４６７５、４７００、４７２５、４７５０、４７７５、４８００、４８２５、４８５０、４８７５、４９００、４９２５、４９５０、４９７５、５０００、５０２５、５０５０、５０７５、５１００、５１２５、５１５０、５１７５、５２００、５２２５、５２５０、５２７５、５３００、５３２５、５３５０、５３７５、５４００、５４２５、５４５０、５４７５、５５００、５５２５、５５５０、５５７５、５６００、５６２５、５６５０、５６７５、５７００、５７２５、５７５０、５７７５、５８００、５８２５、５８５０、５８７５、５９００、５９２５、５９５０、５９７５、６０００、６０２５、６０５０、６０７５、６１００、６１２５、６１５０、６１７５、６２００、又は６２２５個のヌクレオチドから対象配列の完全長までの範囲であり得る。ヌクレオチド配列の生物学的に活性な部分を、この配列の一部を単離し、その部分の活性を評価することにより調製し得る。
本開示の方法に有用なヌクレオチド配列の断片及び改変体、並びにそれらによりコードされるタンパク質もまた、包含される。本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、ヌクレオチド配列の一部を指し、従って、この一部によりコードされるタンパク質、又はアミノ酸配列の一部を指す。ヌクレオチド配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持しているタンパク質断片をコードし得る。或いは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、生物学的活性を保持している断片タンパク質を一般にコードしない。従って、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約２０個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチドから、本開示の方法で有用なタンパク質をコードする完全長のヌクレオチド配列までの範囲であり得る。
本明細書で使用される場合、「改変体」という用語は、本明細書で開示されている配列と実質的類似性を有する配列を意味する。改変体は、天然のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの１つ若しくは複数の内部部位における１つ若しくは複数のヌクレオチド若しくはペプチドの欠失及び／若しくは付加、並びに／又は天然のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの１つ若しくは複数の部位における１つ若しくは複数のヌクレオチド若しくはペプチドの置換を含む。本明細書で使用される場合、「天然の」ヌクレオチド配列又はペプチド配列は、それぞれ、天然に存在するヌクレオチド配列又はペプチド配列を含む。ヌクレオチド配列では、天然に存在する改変体を、公知の分子生物学的手法（例えば、ポリヌクレアーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び本明細書で概説されているようなハイブリダイゼーション手法）を使用して同定し得る。本開示の方法に有用なタンパク質の生物学的活性を有する改変体は、その天然のタンパク質と、僅かに１～１５個のアミノ酸残基、僅かに１～１０個、例えば６～１０個、僅かに５個、僅かに４個、３個、２個、又はたった１個のアミノ酸残基が異なり得る。
改変体ヌクレオチド配列はまた、合成的に誘導されたヌクレオチド配列（例えば、部位特異的変異誘発を使用して生成されたもの等）も含む。一般に、本明細書で開示されているヌクレオチド配列の改変体は、本明細書の他の箇所で説明されている配列アラインメントプログラム（デフォルトパラメーターを使用）で測定した場合に、そのヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％～９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はより高い配列同一性を有するであろう。本明細書で開示されているヌクレオチド配列の生物学的に活性な改変体も包含される。生物学的活性を、ノーザンブロット解析、転写融合体で行うレポーター活性測定等の手法を使用して測定し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。或いは、ヌクレオチド断片又は改変体に作動可能に連結されたプロモーターの制御下で生成される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は同類のもの等のレポーター遺伝子のレベルを測定し得る。例えば、Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：９６９－９７３；米国特許第６，０７２，０５０号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）；Ｎａｇａｉ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（１）：８７－９０を参照されたい。改変体ヌクレオチド配列にはまた、ＤＮＡシャフリング等の変異組み換え手順により生成される配列も包含される。そのような手順により、１つ又は複数の異なるヌクレオチド配列を操作して、新たなヌクレオチド配列を作製し得る。このようにして、実質的な配列同一性を有し且つインビトロ又はインビボで相同的に組み換えられ得る配列領域を含む関連配列のポリヌクレオチドの集団から、組み換えポリヌクレオチドのライブラリが作られる。そのようなＤＮＡシャフリングのための戦略は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９ ３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６－４３８；Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６－３４７；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４５０４－４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８－２９１、並びに米国特許第５，６０５，７９３号明細書及び同第５，８３７，４５８号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
変異誘発及びヌクレオチド配列改変の方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－４９２、Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２、米国特許第４，８７３，１９２号明細書、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びこれらに引用されている参考文献（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（参照により本明細書に組み込まれる）のモデルにおいて見出され得る。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のものと交換する等の保存置換が最適であり得る。
本開示のヌクレオチド配列を使用して、他の生物（具体的には他の植物、より具体的には他の単子葉植物又は双子葉植物）から対応する配列を単離し得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、及び同類のもの等の方法を使用して、本明細書に記載されている配列に対する配列相同性に基づいて、そのような配列を同定し得る。本明細書に記載されている全配列又はその断片に対する配列同一性に基づいて単離された配列は、本開示に包含される。
ＰＣＲ法では、任意の目的の植物から抽出されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡからの対応するＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲ反応に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計し得る。ＰＣＲプライマーを設計する方法及びＰＣＲクローニングの方法は当該技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）で開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＩｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。既知のＰＣＲ方法として下記が挙げられるが、これらに限定されない：対合プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチのプライマー、及び同類のものを使用する方法。
ハイブリダイゼーション手法では、既知のヌクレオチド配列の全て又は一部を、選択された生物からのクローン化ゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ断片の集団（即ち、ゲノムライブラリ又はｃＤＮＡライブラリ）に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用する。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、又は他のオリゴヌクレオチドであり得、且つ３２Ｐ又は任意の他の検出マーカー等の検出可能な基で標識され得る。そのため、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブを、本開示の配列をベースとする合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製し得る。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製方法、及びゲノムライブラリの構築方法は、当該技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）で開示されている。
例えば、本明細書で開示されている全配列、又はその１つ若しくは複数の部分を、対応する配列及びメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用し得る。様々な条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブとして、配列の中でも独特であり且つ一般に少なくとも約１０個のヌクレオチドの長さ又は少なくとも約２０個のヌクレオチドの長さである配列が挙げられる。そのようなプローブを使用して、ＰＣＲにより、選択された植物からの対応する配列を増幅し得る。この手法を使用して、所望の生物からさらなるコード配列を単離し得るか、又はこの手法を、生物中におけるコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして使用し得る。ハイブリダイゼーション手法として、プレーティングされたＤＮＡライブラリ（プラーク又はコロニー、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照されたい）のハイブリダイゼーションスクリーニングが挙げられる。
そのような配列のハイブリダイゼーションを、ストリンジェントな条件下で行ない得る。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブが他の配列と比べて検出可能に高い（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）程度で標的配列にハイブリダイズする条件を意味することが意図されている。ストリンジェントな条件は、配列依存性があり、環境によって異なるであろう。ハイブリダイゼーション条件及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定し得る（相同プロービング）。或いは、ストリンジェンシー条件を、より低い程度の類似性が検出されるように配列内での一部のミスマッチを許容するように調整し得る（非相同プロービング）。一般に、プローブは、約１０００個未満のヌクレオチドの長さであり、最適には５００個未満のヌクレオチドの長さである。
典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０～８．３で塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン（典型的には約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度）（又は、他の塩）であり、且つ温度が、短いプローブ（例えば、１０～５０個のヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０個超のヌクレオチド）の場合には少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化物質の添加によっても達成され得る。低ストリンジェントな条件の例として、３７℃での３０～３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液によるハイブリダイゼーション、及び５０～５５℃での１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）における洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェントな条件の例として、３７℃での４０～４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び５５～６０℃での０．５×～１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。高ストリンジェントな条件の例として、３７℃での５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び少なくとも３０分の持続時間にわたる６０～６５℃での０．１×ＳＳＣにおける最終洗浄が挙げられる。ハイブリダイゼーションの持続時間は、概ね約２４時間未満であり、通常は約４～約１２時間である。洗浄の持続時間は、少なくとも平衡に達するのに十分な長さの時間であるだろう。
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドでは、熱融点（Ｔｍ）を、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ，（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３８：２６７ ２８４の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ｆｏｒｍ）－５００／Ｌ（式中、Ｍは、一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、塩基対中のハイブリッドの長さである）から概算し得る。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度及びｐＨでの）温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃低下し、そのため、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄の条件を、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整し得る。例えば、９０％の同一性を有する配列を得たい場合には、Ｔｍを１０℃低下させ得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列及びその相補配列についてのＴｍと比べて約５℃低くなるように選択される。しかしながら、厳しいストリンジェントな条件は、Ｔｍと比べて１、２、３、又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用し得、中程度のストリンジェントな条件は、Ｔｍと比べて６、７、８、９、又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用し得、低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍと比べて１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄の組成物、並びに所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本質的に説明されていることを理解するであろう。所望のミスマッチの程度が、４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）と比べて低いＴｍを生じる場合には、より高い温度を使用し得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）もまた参照されたい。そのため、活性を有し、且つ本明細書で開示されている配列又はその断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離配列は、本開示に包含される。
一般に、活性を有し、且つ本明細書中で開示されている配列にハイブリダイズする配列は、この開示されている配列と、少なくとも４０％～５０％相同であり、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％～９８％以上相同である。換言すると、配列の配列類似性は、少なくとも約４０％～５０％、約６０％～７０％、及び約８０％、８５％、９０％、９５％～９８％の配列類似性を共有する範囲であり得る。
参照配列（対象）に関する「パーセント（％）の配列同一性」は、配列をアラインさせ、配列同一性の最大パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入し、任意のアミノ酸の保存的置換を配列同一性の一部と見なさない後の、この参照配列中の各アミノ酸残基又はヌクレオチドと同一である候補配列（クエリ）中のアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージとして決定される。パーセントの配列同一性を決定することを目的とするアラインメントを、当該技術分野のスキル内である様々な方法で達成し得、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ－２等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成し得る。当業者は、配列をアラインさせるのに適切なパラメータ（例えば、比較する配列の完全長にわたり最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズム）を決定し得る。２つの配列の間のパーセントの同一性は、これらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（例えば、クエリ配列のパーセントの同一性＝クエリ配列と対象配列との間の同一の位置の数／クエリ配列の位置の総数×１００）。
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするか否かである。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列のＴｍと比べて約５℃低く選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、Ｔｍと比べて約１℃～約２０℃低い範囲の温度を含み、別途本明細書中で限定されるように、所望するストリンジェンシーの程度により変わる。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーが、遺伝コードにより許容される最大のコドン縮重を使用して作製される場合に起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの指標は、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である場合である。
「改変体」は、実質的に類似の配列を意味することが意図されている。ポリヌクレオチドでは、保存的改変体は、遺伝コードの縮重のために、本明細書で開示されている形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドの内の１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。改変体ポリヌクレオチドにはまた、合成的に誘導されたポリヌクレオチド（例えば、部位特異的変異誘発を使用して生成されるが、それでもなお本明細書で開示されている形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドのタンパク質をコードするポリヌクレオチド）も含まれる。一般に、本明細書で開示されている特定の形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドの改変体は、本明細書の他の箇所で記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータにより決定した場合に、その特定の形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はより高い配列同一性を有するであろう。
「改変体」タンパク質は、天然タンパク質の１つ若しくは複数の内部部位での１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失若しくは付加により、及び／又は天然タンパク質の１つ若しくは複数の部位での１つ若しくは複数のアミノ酸の置換により天然タンパク質から誘導されたタンパク質を意味することが意図されている。本開示に包含される改変体タンパク質は、生物学的活性を有し、即ち、この改変体タンパク質は、天然タンパク質の所望の生物学的活性を保持し続けており、即ち、このポリペプチドは、形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドの活性を有する。そのような改変体は、例えば、遺伝的多型から生じ得るか、又は人工的操作により生じ得る。本明細書で開示されている天然の形態形成遺伝子及び／又は目的の遺伝子／ポリヌクレオチドのタンパク質の生物活性を有する改変体は、本明細書の他の箇所で説明されている配列アラインメントプログラム及びパラメータにより決定した場合に、この天然のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はより高い配列同一性を有するであろう。本開示のタンパク質の生物活性を有する改変体は、このタンパク質と、僅かに１～１５個のアミノ酸残基、僅かに１～１０個、例えば６～１０個、僅かに５個、僅かに４個、３個、２個、又はたった１個のアミノ酸残基が異なり得る。
本明細書で開示されている配列及び遺伝子、並びにその改変体及び断片は、植物の遺伝子操作に有用であり、例えば、形質転換植物又はトランスジェニック植物を作製するのに有用であり、目的の表現型を発現させるのに有用である。本明細書で使用される場合、「形質転換植物」及び「トランスジェニック植物」という用語は、ゲノム内に異種ポリヌクレオチドを含む植物を指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドが何世代にもわたって伝えられるように、トランスジェニック植物又は形質転換植物のゲノムに安定して組み込まれる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムに単独で組み込まれてもよいし、組み換えＤＮＡコンストラクトの一部として組み込まれてもよい。本明細書で使用される場合、「トランスジェニック」という用語には、異種核酸の存在によって表現型が改変されているあらゆる細胞、細胞系、カルス、組織、植物部又は、植物体（例えば、これらの最初にそのように改変されたトランスジェニック体、及びこの最初のトランスジェニック体から有性交配又は無性繁殖により作られたもの）が含まれることを理解しなければならない。
トランスジェニック「イベント」は、目的の遺伝子を含む核酸発現カセット等の異種ＤＮＡコンストラクトで植物細胞を形質転換し、植物体のゲノムへ導入遺伝子を挿入することにより植物体の集団を再生し、特定のゲノム位置への挿入により特徴付けられた植物体を選択することによって作製される。イベントは、挿入遺伝子の発現により、表現型で特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは、植物体の遺伝子構造の一部である。「イベント」という用語はまた、形質転換体と別の植物との間の有性交配により作製された子孫を指し、この子孫は、異種ＤＮＡを含む。
形質転換プロトコル、及びヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的の植物又は植物細胞の種類により変わり得、即ち、単子葉植物であるか又は双子葉植物であるかにより変わり得る。全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３号明細書で開示されているオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換の使用により双子葉植物を形質転換する方法、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）媒介形質転換の使用により双子葉植物を形質転換する方法（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，３６５，８５９号明細書を参照されたい）、及びアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換の使用により双子葉植物を形質転換する方法、並びにトランスジェニック植物を得る方法が公開されている。
本開示の方法は、植物にポリペプチド又はポリヌクレオチドを導入することを含む。本明細書で使用される場合、「導入する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを、植物に、その配列がこの植物の細胞内部に侵入する方法で提示することを意味する。本開示の方法は、植物に配列を導入する特定の方法に依存することはなく、この植物の少なくとも１つの細胞の内部にポリヌクレオチド又はポリペプチドを単に侵入させるだけである。ポリヌクレオチド又はポリペプチドを植物に導入する方法は、当該技術分野で既知であり、安定した形質転換方法、一過性の形質転換方法、及びウイルス媒介方法が挙げられるが、これらに限定されない。
「安定した形質転換」とは、植物に導入されたヌクレオチドコンストラクトがこの植物のゲノムに組み込まれ、その子孫により受け継がれ得る形質転換のことである。「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが植物に導入されるがこの植物のゲノムに組み込まれないか又はポリペプチドが植物に導入されることを意味する。
レポーター遺伝子又は選択マーカー遺伝子もまた、発現カセットに含まれ得、且つ本開示の方法で使用され得る。当該技術分野で既知の好適なレポーター遺伝子の例は、例えば、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｅｌｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ｐｐ．１－３３；ＤｅＷｅｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５－７３７；Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：２５１７－２５２２；Ｋａｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：６５０－６５５；及びＣｈｉｕ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：３２５－３３０（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
選択マーカーは、多くの場合には特定の条件下で、ある分子若しくはこの分子を含む細胞を同定するか、又はこの分子若しくは細胞に関して選択するか、又はこの分子若しくは細胞に対して選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。このマーカーは、活性（例えば、限定されないが、ＲＮＡ、ペプチド、若しくはタンパク質の産生）をコードし得るか、又はＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物及び有機化合物、若しくは組成物、及び同類のものに関する結合部位を提供し得る。選択マーカーの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；他の毒性化合物に耐性を示す産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば抗生物質、例えば、スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、Ｂａｓｔａ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ））；受容細胞において他の方法で欠失している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；容易に同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、表現型マーカー、例えば、β－ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ；蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）；及び細胞表面タンパク質）；新しいＰＣＲ用プライマー部位の世代（例えば、前に並置されていない２つのＤＮＡ配列の並列）；制限エンドヌクレアーゼ又は他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質等の作用を受けていないか又は作用を受けたＤＮＡ配列の含有物、並びに、同定を可能にする特異的修飾（例えばメチル化）に必要とされるＤＮＡ配列の含有物。
形質転換された細胞又は組織を選択するための選択マーカー遺伝子として、抗生物質耐性又は除草剤抵抗性を付与する遺伝子が挙げられ得る。好適な選択マーカー遺伝子の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：クロラムフェニコールに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｅｒｒｅｒａ Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ．２：９８７－９９２）；メトトレキサートに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｅｒｒｅｒａ Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９－２１３；Ｍｅｉｊｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７－８２０）；ヒグロマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｗａｌｄｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３－１０８；及びＺｈｉｊｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ１０８：２１９－２２７）；ストレプトマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６－９１）；スペクチノマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｂｒｅｔａｇｎｅ－Ｓａｇｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：１３１－１３７）；ブレオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子（Ｈｉｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１－１７６）；スルホンアミドに対する耐性をコードする遺伝子（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７－３６）；ブロモキシニルに対する耐性をコードする遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４１９－４２３）；グリホサートに対する耐性をコードする遺伝子（Ｓｈａｗ，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８－４８１；並びに米国特許出願第１０／００４，３５７号明細書及び同第１０／４２７，６９２号明細書）；ホスフィノトリシンに対する耐性をコードする遺伝子（ＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３－２５１８）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
除草化合物に対する耐性を付与する選択マーカーとして、除草化合物（例えば、グリホサート、スルホニル尿素、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、及び２，４－ジクロロフェノキシアセテート（２，４－Ｄ））に対する抵抗性及び／又は耐性をコードする遺伝子が挙げられる。一般的に、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６－５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４－６３１８；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ７１：６３－７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９－２４２２；Ｂａｒｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）ｉｎ Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ，ｐｐ．１７７－２２０；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５－５６６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３－６１２；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３－７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００－５４０４；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９－２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０－４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７－１９２１；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３－３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２－３９５６；Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２－５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７－４６５３；Ｈｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３－１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１－１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４－１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７－５５５１；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３－９１９；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：７２１－７２４）を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本方法に有用な特定の選択マーカーとして下記が挙げられるが、これらに限定されず：スルホニル尿素及びイミダゾリノンに対する耐性を付与するトウモロコシＨＲＡ遺伝子（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ ７：１２４１－１２４８）、グリホサートに対する耐性を付与するＧＡＴ遺伝子（Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０４：１１５１－１１５４）、ａａｄＡ遺伝子等のスペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４：１９７－２０５）、並びにグルホシネートアンモニウムに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：１０６２）、ＰＡＴ（又はトウモロコシのｍｏＰＡＴ、Ｒａｓｃｏ－Ｇａｕｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２１：５６９－７６を参照されたい）、及びマンノース含有培地での成長を許容するＰＭＩ遺伝子（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２：６８４－６９０）は、本方法の体細胞胚形成及び胚成熟に含まれる短い経過時間中の急速な選択に非常に有用である。しかしながら、使用される選択マーカー、及び形質転換される作物、近交系、又は種に応じて、野生型エスケープ（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｅｓｃａｐｅ）の割合は変わり得る。トウモロコシ及びソルガムでは、ＨＲＡ遺伝子は、野生型エスケープの頻度の低減に有効である。
トランスジェニックイベントの回収において有用性を有し得る他の遺伝子として下記が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、ＧＵＳ（ベータ－グルクロニダーゼ；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質；Ｃｈａｌｆｉｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２）、ルシフェラーゼ（Ｒｉｇｇｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（１９）：８１１５；及びＬｕｅｈｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３９７－４１４）、遠赤色、赤色、橙色、黄色、グリーンシアン、及び青色にわたる代替発光最適条件のスペクトルを有する様々な蛍光タンパク質（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：９０５－９０９）、並びにアントシアニン産生をコードするトウモロコシ遺伝子（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：４４９）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
上に掲げた選択マーカーは、それらに限定することを意図するものではない。任意の選択マーカーが、本開示の方法で使用され得る。
ある態様では、本開示の方法は、ポジティブな成長選択を可能にする形質転換方法を提供する。従来の植物形質転換法は、抗生物質又は除草剤（ネガティブ選択剤）を使用して、形質転換されていない細胞又は組織を阻害するか又は死滅させ、トランスジェニック細胞又は組織は、耐性遺伝子の発現に起因して成長し続けるという、上記で説明されているようなネガティブ選択スキームに主に依存していることを、当業者は認識し得る。対照的に、本開示の方法を、ネガティブ選択剤を適用することなく使用し得る。そのため、野生型細胞は阻害されずに成長し得るが、比較すると、形態形成遺伝子発現の制御の影響を受けた細胞は、周囲の野生型組織と比較して成長速度が速いため、容易に識別され得る。成長の速さを容易に観察できることに加えて、本開示の方法は、形質転換されていない細胞と比べて急速な形態形成を示すトランスジェニック細胞を提供する。従って、そのような成長及び形態発生の差を使用して、トランスジェニック植物構造体を、周囲の非形質転換組織から容易に識別し得、このプロセスを、本明細書では「ポジティブ成長選択」と称する。
本開示は、効率良く且つ高速でトランスジェニック植物を生産する方法、及び一連の遺伝的多様性を示し且つ顕著な商業的有用性を有する形質転換近交系を含む様々な出発組織型を用いて、多数の近交系において、形質転換率が有意により高く且つ品質が有意により良好なイベント（ベクター（プラスミド）バックボーンを持たない形質遺伝子発現カセットの１コピーを含むイベント）を生じる方法を提供する。本開示の方法は、良好な形質及び特性を与えるポリヌクレオチドをさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、「形質」は、植物、又は特定の植物材料若しくは植物細胞の生理学的特性、形態学的特性、生化学的特性、又は物理的特性を指す。いくつかの例において、この特性は、種子若しくは植物体の大きさ等のヒトの目で視ることができるか、又は種子若しくは葉に含まれるタンパク質、デンプン、若しくは油の量を検出する等の生化学的手法により、又は代謝プロセス若しくは生理学的プロセスの観察により、例えば、二酸化炭素の取り込み量を測定することにより、又は遺伝子若しくは遺伝子群の発現レベルの観察により、例えば、ノーザン解析、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ遺伝子発現アッセイ、若しくはレポーター遺伝子発現システムを用いることにより、又はストレス耐性、収穫量、病原体耐性等の農学的観察により、測定され得る。油、デンプン、及びタンパク質の含有量等の農業的に重要な形質を、伝統的な育種法を使用することに加えて、遺伝的に改変し得る。改変には、オレイン酸、飽和油、及び不飽和油の含有量の増加、リシン及び硫黄のレベルの上昇、必須アミノ酸の提供、並びにデンプンの改変が含まれる。ホルドチオニンタンパク質改変は、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第５，８８５，８０２号明細書、及び同第５，９９０，３８９号明細書で説明されており、これらの明細書は、参照により本明細書に組み込まれる。別の例は、米国特許第５，８５０，０１６号明細書で説明されているダイズ２Ｓアルブミンによりコードされるリシン及び／又は硫黄リッチ種子タンパク質、並びにＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９－１０６で説明されているオオムギ由来のキモトリプシン阻害剤である（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
コード配列の誘導体を、予め選択したアミノ酸の、コードされたポリペプチドにおけるレベルを上昇させるための部位特異的変異誘発法により作製し得る。例えば、ヒマワリの種子（Ｌｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，ｅｄ．Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ．），ｐｐ．４９７－５０２；この文献は参照により本明細書に組み込まれる）；トウモロコシ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７１：３５９；これらの両文献は、参照により本明細書に組み込まれる）；及びイネ（Ｍｕｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）等からのメチオニンリッチ植物タンパク質を使用する可能性がある。他の農学的に重要な遺伝子は、ラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ ２、成長因子、種子貯蔵因子、及び転写因子をコードする。
多くの農業形質（例えば、限定はされないが、植物の高さ、莢の数、植物体における莢の位置、節間部の数、莢の破損の発生率、穀粒サイズ、根粒形成効率及び窒素固定効率、栄養の消化効率、生物的ストレス及び非生物的ストレスに対する耐性、炭素同化、植物構造、耐倒伏性、種子の発芽率、苗の成長力、並びに幼植物の形質）が、「収穫量」に影響を及ぼし得る。収穫量に影響を及ぼし得る他の形質として、発芽効率（例えば、ストレス条件下での発芽効率）、成長速度（例えば、ストレス条件下での成長速度）、穂の数、１本の穂当たりの種子数、種子の大きさ、種子の組成（デンプン、油、タンパク質）、並びに登熟特性が挙げられる。全植物の収穫量を増大させ得るか否かは分からないが、所望の表現型特性を示すトランスジェニック植物の世代もまた目的とされる。そのような特性として、植物形態学的増強、植物生理学的増強、又はトランスジェニック植物から得られる成熟種子の成分の改善が挙げられる。
本開示のトランスジェニック植物の「収穫量の増大」を、多くの方法（例えば、試験重量、１つの植物体当たりの種子数、種子重量、単位面積当たりの種子数（即ち、１エーカー当たりの種子、若しくは種子重量）、１エーカー当たりのブッシェル数、１エーカー当たりのトン数、及び１へクタール当たりのキロ数）で評価して測定し得る。例えば、トウモロコシの収穫量を、例えば、１エーカー当たりのブッシェル数又は１へクタール当たりのメートルトン数を単位とした、生産面積１単位当たりの、皮を剥いたトウモロコシ粒の産生量として測定し得、多くの場合には、水分調節ベース（例えば水分１５．５％）で報告される。収穫量の増大は、キーとなる生化学化合物（例えば、窒素、リン、及び炭水化物）の利用の改善によりもたらされ得るか、又は環境ストレス（例えば、寒さ、熱、乾燥、塩分、及び害虫若しくは病原体による攻撃）に対する耐性の向上によりもたらされ得る。形質強化組み換えＤＮＡを使用して、植物成長調節物質の発現の改変の結果としてか、又は細胞周期若しくは光合成経路の変更の結果として、成長及び発達が改善されており、ひいては収穫量が増大しているトランスジェニック植物も提供し得る。
「形質の強化」は、本開示の態様の説明中で使用される場合、水使用効率若しくは乾燥耐性の改善若しくは強化、浸透圧ストレス耐性、高塩分ストレス耐性、熱ストレス耐性、低温発芽耐性等の耐寒性の強化、収穫量の増大、種子品質の改善、窒素利用効率の強化、植物の早い成長及び発達、植物の遅い成長及び発達、種子タンパク質の強化、並びに種子油の生産性の強化を含む。
本開示の方法では、任意の目的のポリヌクレオチドを使用し得る。目的の遺伝子により付与される表現型の様々な変化として、植物中の脂肪酸組成の変更、植物のアミノ酸含有量、デンプン含有量又は炭水化物含有量の改変、植物の病原体防御機構の改変、実サイズの改変、スクロース付加の改変、及び同類のものが挙げられる。目的の遺伝子はまた、栄養の取り込みの調節、及びフィチン酸塩遺伝子の発現の調節、特に、種子中のフィチン酸塩レベルの低下させる調節にも関与し得る。これらの結果を、植物において異種産物を発現させることにより得ることができるか、又は内因性産物の発現を増大させることにより得ることができる。或いは、これらの結果を、１種又は複数種の内因性産物（特に、植物中の酵素又は補因子）の発現を低減させることにより得ることができる。これらの変化は、形質転換植物の表現型の変化をもたらす。
目的の遺伝子は、商業市場、及び作物の開発に従事している者の関心を反映している。目的の作物及び市場が変わり、国の発展が世界市場を切り開くにつれ、新しい作物及び技術も出現してくるであろう。加えて、収穫量及び雑種強勢等の農学上の形質及び特性に対する理解が深まるにつれ、形質転換のための遺伝子の選択もそれに応じて変化するであろう。本開示の方法に有用な目的のヌクレオチド配列若しくは遺伝子の一般的な種類として、例えば、ジンクフィンガー等の情報に関与する遺伝子、キナーゼ等の伝達に関与する遺伝子、及び熱ショックタンパク質等のハウスキーピングに関与する遺伝子が挙げられる。導入遺伝子のより具体的な種類として、例えば、農学上の重要な形質、昆虫耐性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、不稔性、環境ストレス耐性（寒冷、塩、乾燥等に対する耐性の変化）、穀粒特性、及び市場の生産物をコードする遺伝子が挙げられる。
本明細書で開示されている方法により形質転換されたプロモーター配列により発現される異種コード配列、異種ポリヌクレオチド、及び目的のポリヌクレオチドを使用して、植物の表現型を変化させ得る。目的の表現型の様々な変化として、植物における遺伝子発現の改変、植物の病原体又は昆虫に対する防御機構の改変、植物の除草剤に対する耐性の増大、環境ストレスに応答する植物の成長の改変、塩、温度（高温及び低温）、乾燥に対する植物の応答の調節、並びに同類のものが挙げられる。これらの結果は、適切な遺伝子産物を含む目的の異種ヌクレオチド配列の発現により達成され得る。特定の態様では、目的の異種ヌクレオチド配列は、その発現レベルが植物体又は植物部で上昇する内因性の植物配列である。結果を、１種若しくは複数種の内因性遺伝子産物（特に、ホルモン、レセプター、シグナル伝達分子、酵素、トランスポーター、若しくは補因子）の発現を改変することにより得ることができるか、又は植物の栄養摂取に影響を及ぼすことにより得ることができる。これらの変化は、形質転換植物の表現型の変化をもたらす。導入遺伝子のさらに他の種類として、植物及び他の真核生物、並びに原核生物からの酵素、補因子及びホルモン等の外因性産物の発現を誘発する遺伝子が挙げられる。
目的の任意の遺伝子、目的のポリヌクレオチド、又は目的の複数の遺伝子／ポリヌクレオチド（例えば、１つ又は複数のさらなるインプット形質（例えば、除草剤抵抗性、真菌耐性、ウイルス耐性、ストレス耐性、病害抵抗性、疾患耐性、雄性不稔性、茎強度、及び同類のもの）又はアウトプット形質（例えば、収穫量の増大、デンプンの改変、油プロファイルの改善、バランスのとれたアミノ酸、高リシン若しくは高メチオニン、消化性の増大、繊維品質の改善、乾燥耐性、及び同類のもの）が積み重ねられ得る昆虫耐性形質）が、プロモーターに作動可能に連結され得、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現され得ることが認識されている。
プロモーターを、穀粒の品質、例えば、油のレベル（オレイン酸の含有量の増加）及び種類、飽和及び不飽和、必須アミノ酸の品質及び量、リシン及び硫黄のレベルの上昇、セルロースのレベル、並びにデンプン及びタンパク質の含有量に影響を及ぼす、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるための農学的に重要な形質に作動可能に連結することができる。プロモーターを、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためのホルドチオニンタンパク質改変を提供する遺伝子に作動可能に連結させ得、そのような遺伝子は、米国特許第５，９９０，３８９号明細書；同第５，８８５，８０１号明細書；同第５，８８５，８０２号明細書；及び同第５，７０３，０４９号明細書で説明されており、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターを作動可能に連結し得る遺伝子の別の例は、米国特許第５，８５０，０１６号明細書で説明されているダイズ２Ｓアルブミンによりコードされるリシン及び／又は硫黄リッチ種子タンパク質、並びにオオムギ由来のキモトリプシン阻害剤（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １６５：９９－１０６）であり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
プロモーターを、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるために、収穫量の低下（ｙｉｅｌｄ ｄｒａｇ）をもたらす害虫（例えば、根切り虫、ヨトウムシ、ヨーロッパアワノメイガ、及び同類もの）に対する耐性をコードする昆虫耐性遺伝子に作動可能に連結させ得る。そのような遺伝子として、例えば、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号明細書；同第５，７４７，４５０号明細書；同第５，７３６，５１４号明細書；同第５，７２３，７５６号明細書；同第５，５９３，８８１号明細書；及びＧｅｉｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））が挙げられる。本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結され得る、病害抵抗性形質をコードする遺伝子として、例えば、フモニシンを解毒する遺伝子等の解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号明細書）；非病原性（ａｖｒ）及び病害抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２；及びＭｉｎｄｒｉｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１０８９）が挙げられ、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結され得る除草剤抵抗性形質として、下記が挙げられる：アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）の働きを阻害するように作用する除草剤、特に、スルホニル尿素系除草剤に対する耐性をコードする遺伝子（例えば、そのような耐性に導く変異、特にＳ４及び／又はＨｒａ変異を含むアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子）、グルタミン合成酵素の働きを阻害するように作用する除草剤、例えば、ホスフィノトリシン若しくはバスタに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）、グリホサートに対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子及びＧＡＴ遺伝子；例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書、国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット、及び国際公開第０５／０１２５１５号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、又は当該技術分野で既知の他のそのような遺伝子。ｂａｒ遺伝子は除草剤のバスタに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は抗生物質のカナマイシン及びジェネティシンに対する耐性をコードし、ＡＬＳ－遺伝子変異体は除草剤のクロルスルフロンに対する耐性をコードしており、そのいずれもが、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得る。
グリホサート耐性は、変異５－エノールピルビル－３－ホスフィキメート合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子及びａｒｏＡ遺伝子により付与され、これらの遺伝子は、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、Ｓｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照されたい。この明細書では、グリホサート耐性を付与し得るＥＰＳＰＳの形態のヌクレオチド配列が開示されている。Ｂａｒｒｙらの米国特許第５，６２７，０６１号明細書ではまた、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得るＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子も説明されている。米国特許第６，２４８，８７６Ｂ１号明細書；同第６，０４０，４９７号明細書；同第５，８０４，４２５号明細書；同第５，６３３，４３５号明細書；同第５，１４５，７８３号明細書；同第４，９７１，９０８号明細書；同第５，３１２，９１０号明細書；同第５，１８８，６４２号明細書；同第４，９４０，８３５号明細書；同第５，８６６，７７５号明細書；同第６，２２５，１１４Ｂ１号明細書；同第６，１３０，３６６号明細書；同第５，３１０，６６７号明細書；同第４，５３５，０６０号明細書；同第４，７６９，０６１号明細書；同第５，６３３，４４８号明細書；同第５，５１０，４７１号明細書；米国再発行特許第３６，４４９号明細書、同第３７，２８７Ｅ号明細書、及び米国特許第５，４９１，２８８号明細書、並びに国際公開第９７／０４１０３号パンフレット；同第９７／０４１１４号パンフレット；同第００／６６７４６号パンフレット；同第０１／６６７０４号パンフレット；同第００／６６７４７号パンフレット、及び同第００／６６７４８号パンフレット（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。グリホサート耐性はまた、米国特許第５，７７６，７６０号明細書、及び同第５，４６３，１７５号明細書（これらの明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により詳しく説明されているように、グリホサート酸化還元酵素をコードする、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得る遺伝子を発現する植物に付与される。グリホサート耐性を、グリホサートＮ－アセチルトランスフェラーゼをコードする、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得る遺伝子の過剰発現によっても、植物に付与し得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書、国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット、及び同第０５／０１２５１５号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結された不稔遺伝子もまた、ＤＮＡコンストラクトにおいてコードされ得、物理的雄穂除去の代替法を提供し得る。そのような方法に使用される遺伝子の例として、雄性組織優先的遺伝子、及び米国特許第５，５８３，２１０号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているＱＭ等の雄性不稔性表現型を有する遺伝子が挙げられる。本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得る他の遺伝子として、キナーゼ、及び雄性又は雌性の配偶体の成長に有害な化合物をコードするものが挙げられる。
商業的形質もまた、例えばエタノール産生用デンプンを増加させる可能性があるか又はタンパク質の発現を提供する可能性がある、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結された遺伝子又は遺伝子群でコードされ得る。形質転換植物の別の重要な商業利用は、米国特許第５，６０２，３２１号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）で記載されているようなポリマー及びバイオプラスチックの生成である。ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進するβ－ケトチオラーゼ、ＰＨＢアーゼ（ポリヒドロキシ酪酸合成酵素）、及びアセトアセチル－ＣｏＡ還元酵素等の遺伝子は、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得る（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７－５８４７（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得る、他の適用可能な形質遺伝子及びその関連する表現型の例として、下記が挙げられる：ウイルス外皮タンパク質及び／若しくはＲＮＡをコードする遺伝子、又はウイルス耐性を付与する他のウイルス若しくは植物遺伝子、真菌耐性を付与する遺伝子、収穫量増大を促進する遺伝子、並びに寒冷、乾燥によって生じる脱水、熱、及び塩分等のストレス、有毒な金属、若しくは微量元素等に対する耐性を与える遺伝子、又は同類のもの。
下記は、本明細書で開示されている方法により形質転換された植物で発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され得る遺伝子の種類の他の例のリストであるが、例示として示すものであって、限定することは意図されていない。
１．昆虫又は病害に対する抵抗性を付与し、且つ下記をコードする導入遺伝子：
（Ａ）植物の病害抵抗性遺伝子。植物防御は、植物中の病害抵抗性遺伝子（Ｒ）産物と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子産物との間の特異的相互作用によってしばしば活性化される。特定の病原体株に耐性を示す植物を設計するために、クローン化された耐性遺伝子で植物種を形質転換し得る。例えば、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９（ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ Ｃｆ－９ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍ）；Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２（ｔｏｍａｔｏ Ｐｔｏ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１０８９（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＳＰ２ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）；ＭｃＤｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｗｏｆｆｅｎｄｅｎ，（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（４）：１７８－８３及びＴｏｙｏｄａ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１１（６）：５６７－８２（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。病害抵抗性植物は、野生型植物と比較して病原体に対する耐性がより大きいものである。
（Ｂ）バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質、その誘導体、又はそれをモデルとした合成ポリペプチド。例えば、Ｇｅｉｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９を参照されたい。これには、Ｂｔデルタ－エンドトキシン遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列が開示されている。さらに、デルタ－エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子を、例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号４００９８、６７１３６、３１９９５、及び３１９９８で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し得る。遺伝子操作されるバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）導入遺伝子の他の例は、下記の特許及び特許出願に記載されており、この目的のために参照により本明細書に組み込まれる：米国特許第５，１８８，９６０号明細書；同第５，６８９，０５２号明細書；同第５，８８０，２７５号明細書；国際公開第９１／１４７７８号パンフレット；国際公開第９９／３１２４８号パンフレット；国際公開第０１／１２７３１号パンフレット；国際公開第９９／２４５８１号パンフレット；国際公開第９７／４０１６２号パンフレット；並びに米国特許出願第１０／０３２，７１７号明細書；同第１０／４１４，６３７号明細書；及び同第１０／６０６，３２０号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
（Ｃ）エクジステロイド及び幼若ホルモン等の昆虫特異的ホルモン若しくはフェロモン、その改変体、それに基づく模倣体、又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニスト。例えば、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼ、即ち幼若ホルモンの不活性化剤のバキュロウイルス発現に関するＨａｍｍｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４４：４５８（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）による開示を参照されたい。
（Ｄ）発現すると、その作用を受けた害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（発現クローニングは昆虫利尿ホルモン受容体をコードするＤＮＡを得る）；Ｐｒａｔｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（アロスタチンがディプロプテラ・プンクタータ（Ｄｉｐｌｏｐｔｅｒａ ｐｕｎｔａｔａ）で特定されている）；Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３０（１）：３３－５４；Ｚｊａｗｉｏｎｙ，（２００４）Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ ６７（２）：３００－３１０；Ｃａｒｌｉｎｉ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｉ－ｄｅ－Ｓａ，（２００２）Ｔｏｘｉｃｏｎ ４０（１１）：１５１５－１５３９；Ｕｓｓｕｆ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ Ｓｃｉ．８０（７）：８４７－８５３；及びＶａｓｃｏｎｃｅｌｏｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｉｒａ，（２００４）Ｔｏｘｉｃｏｎ ４４（４）：３８５－４０３（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）の開示を参照されたい。また、昆虫特異的毒素をコードする遺伝子が開示されているＴｏｍａｌｓｋｉらの米国特許第５，２６６，３１７号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
（Ｅ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体、又は殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の超集積に関与する酵素。
（Ｆ）生物活性分子の改変（例えば翻訳後の改変）に関与する酵素、例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、及びグルカナーゼ（天然であるか合成であるかを問わない）。例えば、カラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている、Ｓｃｏｔｔらの名前によるＰＣＴ出願の国際公開第９３／０２１９７号パンフレット、この全体が参照により本明細書に組み込まれる、を参照されたい。キチナーゼをコードする配列を含むＤＮＡ分子を、例えば、アクセッション番号３９６３７及び６７１５２でＡＴＣＣから入手し得る。Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（これには、タバコ鉤虫キチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列が教示されている）、及びＫａｗａｌｌｅｃｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（これには、パセリのｕｂｉ４－２ポリウビキチン遺伝子のヌクレオチド配列が提示されている）、米国特許出願第１０／３８９，４３２号明細書、同第１０／６９２，３６７号明細書、及び米国特許第６，５６３，０２０号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
（Ｇ）シグナル伝達を刺激する分子。例えば、リョクトウのカルモジュリンのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に関するＢｏｔｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７による開示、及びトウモロコシのカルモジュリンのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を提示しているＧｒｉｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７（この全体が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｈ）疎水性モーメントペプチド。ＰＣＴ出願の国際公開第９５／１６７７６号パンフレット及び米国特許第５，５８０，８５２号明細書（真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体の開示）、並びにＰＣＴ出願の国際公開第９５／１８８５５号パンフレット及び米国特許第５，６０７，９１４号明細書（病害抵抗性を付与する合成抗微生物ペプチドを教示する）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｉ）膜透過酵素、チャネルフォーマー、又はチャネルブロッカー。例えば、トランスジェニックタバコ植物にシュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に対する耐性を付与するセクロピン－ベータ溶解ペプチド類似体の異種発現に関するＪａｙｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８９：４３（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）による開示を参照されたい。
（Ｊ）ウイルス侵入性タンパク質又はそれから誘導される複合毒素。例えば、形質転換植物細胞中のウイルス外皮タンパク質の蓄積は、外皮タンパク質遺伝子が由来するウイルス及び関連ウイルスにより引き起こされるウイルスの感染及び／又は疾患の進行に対する耐性を付与する。Ｂｅａｃｈｙ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。外皮タンパク質が介在する、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコ・エッチ・ウイルス、タバコ茎壊疽ウイルス、及びタバコモザイクウイルスに対する耐性が、形質転換植物に付与されている（同文献）。
（Ｋ）昆虫特異的抗体又はそれから誘導される免疫毒素。そのため、昆虫の消化管での重要な代謝機能を標的とした抗体は、その作用を受けた酵素を不活性化し、昆虫を死滅させるであろう。Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ ♯４９７，ＳＥＶＥＮＴＨ ＩＮＴ’Ｌ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ ＯＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＬＡＮＴ－ＭＩＣＲＯＢＥ ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮＳ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，１９９４）（一本鎖抗体断片の生成による、トランスジェニックタバコの酵素不活性化）（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｌ）ウイルス特異的抗体。例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４６９を参照されたい。この文献には、組み換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物がウイルスの攻撃から保護されることが示されており、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（Ｍ）病原体又は寄生生物により天然に産生される発達阻害タンパク質。そのため、真菌エンド－アルファ－１，４－Ｄ－ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ－アルファ－１，４－Ｄ－ガラクツロナーゼを可溶化することにより、真菌のコロニー形成及び植物の養分放出を促進する。Ｌａｍｂ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４３６（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び特徴付けは、Ｔｏｕｂａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：３６７（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されている。
（Ｎ）植物により天然に産生される発達阻害タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：３０５（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、真菌性の疾患に対し高い耐性を有することを示している。
（Ｏ）全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）応答に関与する遺伝子、及び／又は病因関連遺伝子。Ｂｒｉｇｇｓ，（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（２）：１２８－１３１，Ｐｉｅｔｅｒｓｅ ａｎｄ Ｖａｎ Ｌｏｏｎ，（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ．７（４）：４５６－６４、及びＳｏｍｓｓｉｃｈ，（２００３）Ｃｅｌｌ １１３（７）：８１５－６（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
（Ｐ）抗真菌遺伝子（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ ａｎｄ Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，（１９９３）Ｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０１：７０９－７１２、及びＰａｒｉｊｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔａ １８３：２５８－２６４、及びＢｕｓｈｎｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈ．２０（２）：１３７－１４９）。また、米国特許出願第０９／９５０，９３３号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｑ）フモニシン、ビューベリシン、モニリホルミン、及びゼアラレノン、並びにそれらの構造的に関連する誘導体等に対する解毒遺伝子。例えば、米国特許第５，７９２，９３１号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｒ）シスタチン、及びシステインプロテイナーゼ阻害剤。米国特許出願第１０／９４７，９７９号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｓ）デフェンシン遺伝子。国際公開第０３／０００８６３号パンフレット及び米国特許出願第１０／１７８，２１３号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｔ）線虫に対する耐性を付与する遺伝子。国際公開第０３／０３３６５１号パンフレット、及びＵｒｗｉｎ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）Ｐｌａｎｔａ ２０４：４７２－４７９，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ．２（４）：３２７－３１（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｕ）真菌コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｏｌａ）により引き起こされる炭疽病による茎腐病に対する耐性を付与する、ｒｃｇ１等の遺伝子。Ｊｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ－ｍｅａｎｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ Ｓｔａｌｋ Ｒｏｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｉｚｅ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）８９：４１３－４１８、及び米国仮特許出願第６０／６７５，６６４号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
２．除草剤に対する抵抗性を付与する導入遺伝子、例えば：
（Ａ）イミダゾリノン又はスルホニル尿素等の、成長点又は分裂組織を阻害する除草剤。このカテゴリーの遺伝子の例は、例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：１２４１及びＭｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９でそれぞれ説明されているような変異ＡＬＳ及びＡＨＡＳ酵素をコードする。また、米国特許第５，６０５，０１１号明細書；同第５，０１３，６５９号明細書、同第５，１４１，８７０号明細書、同第５，７６７，３６１号明細書、同第５，７３１，１８０号明細書、同第５，３０４，７３２号明細書、同第４，７６１，３７３号明細書、同第５，３３１，１０７号明細書、同第５，９２８，９３７号明細書、及び同第５，３７８，８２４号明細書、並びに国際公開第９６／３３２７０号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
（Ｂ）グリホサート（それぞれ変異５－エノールピルビル－３－ホスフィキメート合成酵素（ＥＰＳＰ）遺伝子及びａｒｏＡ遺伝子により耐性が付与される）、及びグルホシネート等の他のホスホノ化合物（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子及びストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子）、並びにピリジノキシプロピオン酸又はフェノキシプロピオン酸、及びシクロスヘキソン（ｃｙｃｌｏｓｈｅｘｏｎｅ）（ＡＣＣ酵素阻害剤をコードする遺伝子）。例えば、Ｓｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照されたい。これには、グリホサート耐性を付与し得るＥＰＳＰＳの形態のヌクレオチド配列が開示されている。Ｂａｒｒｙらの米国特許第５，６２７，０６１号明細書でも、ＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子が説明されている。米国特許第６，５６６，５８７号明細書；同第６，３３８，９６１号明細書；同第６，２４８，８７６Ｂ１号明細書；同第６，０４０，４９７号明細書；同第５，８０４，４２５号明細書；同第５，６３３，４３５号明細書；同第５，１４５，７８３号明細書；同第４，９７１，９０８号明細書；同第５，３１２，９１０号明細書；同第５，１８８，６４２号明細書；同第４，９４０，８３５号明細書；同第５，８６６，７７５号明細書；同第６，２２５，１１４Ｂ１号明細書；同第６，１３０，３６６号明細書；同第５，３１０，６６７号明細書；同第４，５３５，０６０号明細書；同第４，７６９，０６１号明細書；同第５，６３３，４４８号明細書；同第５，５１０，４７１号明細書；米国再発行特許第３６，４４９号明細書；同第３７，２８７Ｅ号明細書；及び米国特許第５，４９１，２８８号明細書、並びに国際公開の欧州特許第１１７３５８０号明細書；国際公開第０１／６６７０４号パンフレット；欧州特許第１１７３５８１号明細書；及び欧州特許第１１７３５８２号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。グリホサート耐性はまた、米国特許第５，７７６，７６０号明細書及び同第５，４６３，１７５号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）でより詳しく説明されているグリホサート酸化還元酵素をコードする遺伝子を発現する植物にも付与される。加えて、グリホサート耐性は、グリホサートＮアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現により植物に付与され得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書、国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット、及び同第０５／０１２５１５号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子を、ＡＴＣＣアクセッション番号３９２５６で得ることができ、この変異遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉの米国特許第４，７６９，０６１号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている。Ｋｕｍａｄａらの欧州特許出願第０ ３３３ ０３３号明細書、及びＧｏｏｄｍａｎらの米国特許第４，９７５，３７４号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）では、Ｌ－ホスフィノトリシン等の除草剤に対する耐性を付与するグルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらの欧州特許第０ ２４２ ２４６号明細書及び同第０ ２４２ ２３６号明細書、Ｄｅ Ｇｒｅｅｆ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６１（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に示されており、これらでは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製が説明されている。また、米国特許第５，９６９，２１３号明細書；同第５，４８９，５２０号明細書；同第５，５５０，３１８号明細書；同第５，８７４，２６５号明細書；同第５，９１９，６７５号明細書；同第５，５６１，２３６号明細書；同第５，６４８，４７７号明細書；同第５，６４６，０２４号明細書；同第６，１７７，６１６Ｂ１号明細書；及び同第５，８７９，９０３号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。フェノキシプロピオン酸及びシクロスヘキソン（例えば、セトキシジム及びハロキシホップ）に対する耐性を付与する遺伝子の例は、Ｍａｒｓｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）により説明されているＡｃｃ１－Ｓ１、Ａｃｃ１－Ｓ２、及びＡｃｃ１－Ｓ３遺伝子である。
（Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡ遺伝子及びｇｓ＋遺伝子）並びにベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）等の、光合成を阻害する除草剤。Ｐｒｚｉｂｉｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１６９（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）では、変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）の形質転換が説明されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒの米国特許第４，８１０，６４８号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示されており、この遺伝子を含むＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣアクセッション番号５３４３５、６７４４１及び６７４４２で入手可能である。グルタチオンＳ－トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び発現は、Ｈａｙｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）により説明されている。
（Ｄ）アセトヒドロキシ酸合成酵素は、この酵素を発現する植物を複数の種類の除草剤に対して耐性を有する植物とすることが見出され、様々な植物に導入されている（例えば、Ｈａｔｔｏｒｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４６：４１９（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。除草剤に対する耐性を付与する他の遺伝子として、下記が挙げられる：ラットシトクロムＰ４５０７Ａ１及び酵母ＮＡＤＰＨ－シトクロムＰ４５０酸化還元酵素のキメラ蛋白質をコードする遺伝子（Ｓｈｉｏｔａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６（１）：１７－２３）、グルタチオン還元酵素及びスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子（Ａｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３６：１６８７）、並びに様々なホスホトランスフェラーゼの遺伝子（Ｄａｔｔａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：６１９）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
（Ｅ）プロトポルフィリノーゲン酸化酵素（ｐｒｏｔｏｘ）は、葉緑素の生成に必要であり、葉緑素はあらゆる植物の生存に必要である。ｐｒｏｔｏｘ酵素は、様々な除草化合物の標的として働く。これらの除草剤はまた、存在する異なる種類の植物全ての成長を阻害し、それら全体を破壊する。これらの除草剤に対し耐性を有する改変ｐｒｏｔｏｘ活性を含む植物の開発は、米国特許第６，２８８，３０６Ｂ１号明細書；同第６，２８２，８３７Ｂ１号明細書；及び同第５，７６７，３７３号明細書；並びに国際公開第０１／１２８２５号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されている。
３．下記等の改変穀粒特性を付与するか又はそれに寄与する導入遺伝子：
（Ａ）例えば、下記による脂肪酸の改変：
（１）植物のステアリン酸含有量を増加させるステアロイル－ＡＣＰ不飽和化酵素の下方制御。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６２４、及び国際公開第９９／６４５７９号パンフレット（トウモロコシでの脂質プロファイルを変更する不飽和化酵素の遺伝子）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（２）ＦＡＤ－２遺伝子の改変によるオレイン酸の増大、及び／又はＦＡＤ－３遺伝子の改変によるリノレン酸の減少（米国特許第６，０６３，９４７号明細書；同第６，３２３，３９２号明細書；同第６，３７２，９６５号明細書；及び国際公開第９３／１１２４５号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、
（３）国際公開第０１／１２８００号パンフレット（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）等での共役リノレン酸含有量又はリノール酸含有量の改変、
（４）ＬＥＣ１、ＡＧＰ、Ｄｅｋ１、Ｓｕｐｅｒａｌ１、ｍｉ１ｐｓ、様々なｌｐａ遺伝子、例えば、ｌｐａ１、ｌｐａ３、ｈｐｔ、又はｈｇｇｔの改変。例えば、国際公開第０２／４２４２４号パンフレット、同第９８／２２６０４号パンフレット、同第０３／０１１０１５号パンフレット、米国特許第６，４２３，８８６号明細書、同第６，１９７，５６１号明細書、同第６，８２５，３９７号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、同第２００３／０２０４８７０号明細書、国際公開第０２／０５７４３９号パンフレット、同第０３／０１１０１５号パンフレット、及びＲｉｖｅｒａ－Ｍａｄｒｉｄ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：５６２０－５６２４（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｂ）例えば、下記によるリン含有量の変更：
（１）フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィチン酸の分解を増強し、形質転換植物により多くの遊離リン酸を加えるだろう。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示については、Ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅ １２７：８７（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（２）フィターゼ含有量を減少させる遺伝子の上方制御。トウモロコシでは、このことを、例えば、Ｒａｂｏｙ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍａｙｄｉｃａ ３５：３８３等での低濃度のフィチン酸で特徴付けられるトウモロコシ変異体で同定されるＬＰＡアレル等の１つ若しくは複数のアレルと関連するＤＮＡをクローニングし、その後、再導入することにより、及び／又は国際公開第０２／０５９３２４号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／０００９０１１号明細書、国際公開第０３／０２７２４３号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、国際公開第９９／０５２９８号パンフレット、米国特許第６，１９７，５６１号明細書、同第６，２９１，２２４号明細書、同第６，３９１，３４８号明細書、国際公開第２００２／０５９３２４号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、国際公開第９８／４５４４８号パンフレット、同第９９／５５８８２号パンフレット、同第０１／０４１４７号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）のようにイノシトールキナーゼ活性を変更することにより、達成し得るだろう。
（Ｃ）例えば、デンプンの分枝パターンに作用する酵素の遺伝子、又はＮＴＲ及び／若しくはＴＲＸ等のチオレドキシンを改変する遺伝子を変えること（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３１，６４８号明細書を参照されたい）、並びに／又はｃｓ２７若しくはＴＵＳＣ２７若しくはｅｎ２７等のガンマゼインノックアウト若しくは変異体（米国特許第６，８５８，７７８号明細書、及び米国特許出願公開第２００５／０１６０４８８号明細書、及び同第２００５／０２０４４１８号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）により得られる炭水化物の改変。Ｓｈｉｒｏｚａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：８１０（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）のフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２００：２２０（バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｐｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９２（バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ－アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の作製）、Ｅｌｌｉｏｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：５１５（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓφｇａａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（オオムギアルファ－アミラーゼ遺伝子の部位特異的変異誘発）、及びＦｉｓｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）、国際公開第９９／１０４９８号パンフレット（ＵＤＰ－Ｄ－キシロース４－エピメラーゼ、Ｆｒａｇｉｌｅ１及び２、Ｒｅｆ１、ＨＣＨＬ、Ｃ４Ｈの修飾による消化性及び／又はデンプン抽出の改善）、米国特許第６，２３２，５２９号明細書（デンプンレベル（ＡＧＰ）の改変による高油料種子の作製方法）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。上記の脂肪酸修飾遺伝子を使用して、デンプン及び油の経路の相互関係によりデンプンの含有量及び／又は組成に影響を及ぼすこともできる。
（Ｄ）トコフェロール又はトコトリエノールの改変等の、抗酸化物質の含有量又は組成の改変。例えば、米国特許第６，７８７，６８３号明細書、米国特許出願公開第２００４／００３４８８６号明細書、及び国際公開第００／６８３９３号パンフレット（フィチルプレニルトランスフェラーゼ（ｐｐｔ）の改変による抗酸化物質レベルの操作を含む）、国際公開第０３／０８２８９９号パンフレット（ホモゲンチシン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｈｇｇｔ）の改変による）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
（Ｅ）種子の必須アミノ酸の改変。例えば、米国特許第６，１２７，６００号明細書（種子中の必須アミノ酸の蓄積を増加させる方法）、米国特許第６，０８０，９１３号明細書（種子中の必須アミノ酸の蓄積を増加させるバイナリ方法）、米国特許第５，９９０，３８９号明細書（高リシン）、国際公開第９９／４０２０９号パンフレット（種子中のアミノ酸組成の改変）、国際公開第９９／２９８８２号パンフレット（タンパク質のアミノ酸含有量の改変方法）、米国特許第５，８５０，０１６号明細書（種子中のアミノ酸組成の改変）、国際公開第９８／２０１３３号パンフレット（必須アミノ酸レベルが高いタンパク質）、米国特許第５，８８５，８０２号明細書（高メチオニン）、米国特許第５，８８５，８０１号明細書（高トレオニン）、米国特許第６，６６４，４４５号明細書（植物アミノ酸生合成酵素）、米国特許第６，４５９，０１９号明細書（リシン及びトレオニンの増加）、米国特許第６，４４１，２７４号明細書（植物トリプトファン合成酵素ベータサブユニット）、米国特許第６，３４６，４０３号明細書（メチオニン代謝酵素）、米国特許第５，９３９，５９９号明細書（高硫黄）、米国特許第５，９１２，４１４号明細書（メチオニンの増加）、国際公開第９８／５６９３５号パンフレット（植物アミノ酸生合成酵素）、国際公開第９８／４５４５８号パンフレット（より高い割合で必須アミノ酸を含む改変種子タンパク質）、国際公開第９８／４２８３１号パンフレット（リシンの増加）、米国特許第５，６３３，４３６号明細書（含硫アミノ酸含有量の増加）、米国特許第５，５５９，２２３号明細書（植物の栄養価を改善するためにプログラム可能なレベルの必須アミノ酸を含有する、所定の構造を有する合成貯蔵タンパク質）、国際公開第９６／０１９０５号パンフレット（トレオニンの増加）、国際公開第９５／１５３９２号パンフレット（リシンの増加）、米国特許出願公開第２００３／０１６３８３８号明細書、同第２００３／０１５００１４号明細書、同第２００４／００６８７６７号明細書、米国特許第６，８０３，４９８号明細書、国際公開第０１／７９５１６号パンフレット、及び同第００／０９７０６号パンフレット（ＣｅｓＡ：セルロース合成酵素）、米国特許第６，１９４，６３８号明細書（ヘミセルロース）、米国特許第６，３９９，８５９号明細書及び米国特許出願公開第２００４／００２５２０３号明細書（ＵＤＰＧｄＨ）、米国特許第６，１９４，６３８号明細書（ＲＧＰ）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
４．部位特異的ＤＮＡ組み込みのための部位を作製する遺伝子
これには、ＦＬＰ／ＦＲＴ系に使用可能なＦＲＴ部位、及び／又はＣｒｅ／Ｌｏｘｐ系に使用可能なＬｏｘ部位の導入が含まれる。例えば、Ｌｙｚｎｉｋ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２１：９２５－９３２、及び国際公開第９９／２５８２１号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。使用可能な他の系として、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ（Ｍａｅｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｖｉｃｋｉ Ｃｈａｎｄｌｅｒ，Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｃｈ．１１８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ １９９４）、大腸菌のＰｉｎリコンビナーゼ（Ｅｎｏｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８３）、及びｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系（Ａｒａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９２）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
５．非生物的ストレス耐性（例えば、限定はされないが、開花、雄穂及び種子の発達、窒素利用効率の増強、窒素反応性の改変、乾燥抵抗性又は乾燥耐性、寒冷耐性又は耐寒性、並びに塩抵抗性又は耐塩性）に影響を及ぼし、且つストレス下で収穫量を増加させる遺伝子。例えば、国際公開第００／７３４７５号パンフレット（リンゴ酸塩の改変によって水使用効率が改変される）；米国特許第５，８９２，００９号明細書、同第５，９６５，７０５号明細書、同第５，９２９，３０５号明細書、同第５，８９１，８５９号明細書、同第６，４１７，４２８号明細書、同第６，６６４，４４６号明細書、同第６，７０６，８６６号明細書、同第６，７１７，０３４号明細書、国際公開第２０００／０６００８９号パンフレット、同第２００１／０２６４５９号パンフレット、同第２００１／０３５７２５号パンフレット、同第２００１／０３４７２６号パンフレット、同第２００１／０３５７２７号パンフレット、同第２００１／０３６４４４号パンフレット、同第２００１／０３６５９７号パンフレット、同第２００１／０３６５９８号パンフレット、同第２００２／０１５６７５号パンフレット、同第２００２／０１７４３０号パンフレット、同第２００２／０７７１８５号パンフレット、同第２００２／０７９４０３号パンフレット、同第２００３／０１３２２７号パンフレット、同第２００３／０１３２２８号パンフレット、同第２００３／０１４３２７号パンフレット、同第２００４／０３１３４９号パンフレット、同第２００４／０７６６３８号パンフレット、同第９８／０９５２１号パンフレット、及び同第９９／３８９７７号パンフレット（凍結、高塩分及び乾燥という植物に対する負の効果を緩和し、植物表現型に他の正の効果を付与するのに有効な、ＣＢＦ遺伝子及び転写因子等の遺伝子を説明している）；米国特許出願公開第２００４／０１４８６５４号明細書、及び国際公開第０１／３６５９６号パンフレット（植物中のアブシジン酸が改変され、それにより、収穫量の増加及び／又は非生物的ストレスに対する耐性の増大等の植物の表現型が改善される）；国際公開第２０００／００６３４１号パンフレット、同第０４／０９０１４３号パンフレット、米国特許出願第１０／８１７４８３号明細書、及び米国特許第６，９９２，２３７号明細書（サイトカイニン発現が改変され、それにより、乾燥耐性等のストレス耐性が増大し、及び／又は収穫量が増加した植物が得られる）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。また、国際公開第０２／０２７７６号パンフレット、同第２００３／０５２０６３号パンフレット、特開２００２２８１９７５号公報、米国特許第６，０８４，１５３号明細書、国際公開第０１／６４８９８号パンフレット、米国特許第６，１７７，２７５号明細書、及び同第６，１０７，５４７号明細書（窒素利用の増強及び窒素反応性の改変）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。エチレンの改変については、米国特許出願公開第２００４／０１２８７１９号明細書、同第２００３／０１６６１９７号明細書、及び国際公開第２０００／３２７６１号パンフレット（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。非生物的ストレスの植物転写因子又は転写調節因子については、例えば、米国特許出願公開第２００４／００９８７６４号明細書、又は同第２００４／００７８８５２号明細書（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
６．収穫量、開花、植物成長、及び／又は植物構造等の植物の成長及び農業形質に影響を及ぼす他の遺伝子及び転写因子を、植物に導入し得るか又は移入し得、例えば、国際公開第９７／４９８１１号パンフレット（ＬＨＹ）、同第９８／５６９１８号パンフレット（ＥＳＤ４）、同第９７／１０３３９号パンフレット、及び米国特許第６，５７３，４３０号明細書（ＴＦＬ）、同第６，７１３，６６３号明細書（ＦＴ）、国際公開第９６／１４４１４号パンフレット（ＣＯＮ）、同第９６／３８５６０号パンフレット、同第０１／２１８２２号パンフレット（ＶＲＮ１）、同第００／４４９１８号パンフレット（ＶＲＮ２）、同第９９／４９０６４号パンフレット（ＧＩ）、同第００／４６３５８号パンフレット（ＦＲＩ）、同第９７／２９１２３号パンフレット、米国特許第６，７９４，５６０号明細書、同第６，３０７，１２６号明細書（ＧＡＩ）、国際公開第９９／０９１７４号パンフレット（Ｄ８及びＲｈｔ）、並びに同第２００４／０７６６３８号パンフレット及び同第２００４／０３１３４９号パンフレット（転写因子）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「アンチセンス配向」は、アンチセンス鎖が転写される方向でプロモーターに作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列を指す。アンチセンス鎖は、内因性転写産物に十分に相補的であり、そのため内因性転写産物の翻訳は阻害されることが多い。「作動可能に連結されている」は、単一の核酸断片上の２つ以上の核酸断片が、１つの断片の機能が他の断片の影響を受けるような関係にあることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼし得る（即ち、このコード配列がこのプロモーターの転写制御下にある）場合には、このプロモーターは、このコード配列に作動可能に連結されている。コード配列は、センス配向又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
本明細書で開示されている方法に有用な、プロモーターに作動可能に連結されている異種ヌクレオチド配列、及びそれに関連する生物学的活性を有する断片又は改変体は、標的遺伝子のアンチセンス配列であり得る。「アンチセンスＤＮＡヌクレオチド配列」という専門用語は、このヌクレオチド配列の５’から３’という通常の方向に対して逆方向である配列を意味することが意図されている。植物細胞に送達されると、アンチセンスＤＮＡ配列の発現は、標的遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の正常な発現を妨げる。アンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の転写により生じた内因性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的であり且つハイブリダイズし得るＲＮＡ転写産物をコードする。この場合には、標的遺伝子によりコードされる天然タンパク質の産生が阻害されて、所望の表現型応答が得られる。アンチセンス配列は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズしてその発現を妨げる限りにおいて改変され得る。このように、対応するアンチセンス配列に対して７０％、８０％、８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築物を使用し得る。さらに、アンチセンスヌクレオチドの部分は、標的遺伝子の発現を妨げるために使用され得る。一般に、少なくとも５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、又はより多くの配列を使用し得る。そのため、プロモーターは、アンチセンスＤＮＡ配列に作動可能に連結されて、本明細書で開示されている方法により形質転換された場合に、植物における天然タンパク質の発現を低減させ得るか又は阻害し得る。
「ＲＮＡｉ」は、遺伝子発現を減少させる一連の関連手法を指す（例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。他の名称で呼ばれる旧手法は、今日、同じメカニズムに依っていると考えられるが、文献では異なる名称が付されている。これには、「アンチセンス阻害」、即ち、標的タンパク質の発現を抑制し得るアンチセンスＲＮＡ転写産物の産生、及び、同一の又は実質的に類似の外来性又は内因性の遺伝子の発現を抑制し得るセンスＲＮＡ転写産物の産生を指す「コサプレッション」又は「センスサプレッション」が含まれる（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。そのような手法は、サイレンシングする標的遺伝子に１本の鎖が相補的な二本鎖ＲＮＡの蓄積を生じるコンストラクトの使用に依存している。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」又は「転写開始領域」という用語は、ＴＡＴＡボックス、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導して特定のコード配列に適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始させ得るＤＮＡ配列を通常は含むＤＮＡの調節領域を意味する。プロモーターは、ＴＡＴＡボックスの上流若しくは５’に一般的に位置する他の認識配列、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導してＲＮＡ合成を開始させ得るＤＮＡ配列（転写開始速度に影響を及ぼす上流プロモーターエレメントと呼ばれる）をさらに含み得る。
転写開始領域（即ちプロモーター）は、宿主に対してネイティブ（即ち同種）であってもよいし、外来（即ち異種）であってもよいか、又は天然配列若しくは合成配列の可能性がある。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主では、この転写開始領域が見出されことが意図されている。目的のコード配列に関して、ネイティブプロモーター又は異種プロモーターを使用し得る。
転写カセットは、転写の５’－３’方向において、植物内で機能する、転写及び翻訳の開始領域、目的のＤＮＡ配列、並びに転写及び翻訳の終止領域を含む。終止領域は、転写開始領域と共にネイティブであってもよいし、目的のＤＮＡ配列と共にネイティブであってもよいし、他のソース由来であってもよい。使いやすい終止領域を、ジャガイモプロテイナーゼ阻害剤（ＰｉｎＩＩ）遺伝子から得ることができるか、又はノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、及びオパリンシンターゼ終止領域等の、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ－プラスミドの配列から得ることができる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１－１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１－６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１－１４９；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１－１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１－１５８；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１－７９０３；Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７－９６３９もまた参照されたい。
発現カセットは、発現カセットコンストラクト中に５’リーダー配列をさらに含み得る。そのようなリーダー配列は、翻訳を促進するよう作用し得る。翻訳リーダーは当技術分野で既知であり、下記が挙げられる：ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ－Ｓｔｅｉｎ、Ｏ．，Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８６：６１２６－６１３０）；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（（タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ））（Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）；（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５４：９－２０）、及びヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、（Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｐ．Ｓａｒｎｏｗ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０－９４）；アルファルファモザイクウイルスの外皮タンパク質ＭＡＲＮＡの非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）、（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ Ｇｅｈｒｋｅ，Ｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：６２２－６２５；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）、（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，ｐａｇｅｓ ２３７－２５６、Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３２５７－３２７３；トウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｒｎｍｅｌ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２－３８５）。Ｄｅｌｌａ－Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，８４：９６５－９６８；及び内因性トウモロコシ５’非翻訳配列も参照されたい。翻訳を促進することで知られている他の方法（例えば、イントロン及び同類のもの）も利用し得る。
発現カセットは、形質転換植物に導入されて発現される１つ又は複数の遺伝子又は核酸配列を含み得る。そのため、各核酸配列は、５’及び３’の調節配列に作動可能に連結されるだろう。或いは、複数の発現カセットが提供され得る。
「植物プロモーター」は、植物細胞由来であるか否かに関わりなく、植物細胞において転写を開始し得るプロモーターである。植物プロモーターの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：植物、植物ウイルス、及びアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）等からの植物細胞で発現される遺伝子を含む細菌から得られるもの。発生制御下のプロモーターの例として、葉、根、又は種子等の特定の組織で優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、「組織優先的」を呼ばれる。特定の組織でのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型」特異的プロモーターは、１種又は複数種の器官の特定の細胞型（例えば、根又は葉の維管束細胞）における発現を主に駆動する。組織特異的プロモーター、組織優先的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーター類を構成する。
「誘導性」プロモーター又は「抑制性」プロモーターは、環境制御下又は外的制御下にあるプロモーターであり得る。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例として、嫌気的条件、又は特定の化学物質、又は光の存在が挙げられる。或いは、誘導性プロモーター又は抑制性プロモーターの外的制御は、標的ポリペプチドとの相互作用によりプロモーターを誘導するか又は抑制する好適な化学物質又は他の薬剤を与えることにより影響され得る。誘導性プロモーターとしては、熱誘導性プロモーター、エストラジオール応答性プロモーター、化学誘導性プロモーター、及び同類のものが挙げられる。病原体誘導性プロモーターとして、病原体の感染後に誘導される病原性関連タンパク質（ＰＲタンパク質）（例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼ等）からのものが挙げられる。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．８９：２４５－２５４；Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：６４５－６５６；及びＶａｎ Ｌｏｏｎ（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．４：１１１－１１６を参照されたい。本方法に有用な誘導性プロモーターとして、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、及びＸＶＥプロモーターが挙げられる。
化学誘導性プロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）、エタメツルフロンリプレッサー（ＥＳＲ）、又はクロルスルフロンリプレッサー（ＣＲ）により抑制され得、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンド又はスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。リプレッサーはＴＥＴＲであり得、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリン又はアンヒドロテトラサイクリンである（Ｇａｔｚ、Ｃ．，Ｆｒｏｈｂｅｒｇ、Ｃ．ａｎｄ Ｗｅｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．（１９９２）Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｄｅ－ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｏｆ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣａＭＶ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２，３９７－４０４）。或いは、リプレッサーはＥＳＲであり得、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、又はハロスルフロンである（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１０２８７９３６号明細書）。リプレッサーがＣＲである場合には、ＣＲリガンドはクロルスルフロンである。全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８０，５５６号明細書を参照されたい。
「構成的」プロモーターは、ほとんどの条件下で活性を有するプロモーターである。本開示に有用なプロモーターとして、国際公開第２０１７／１１２００６号パンフレットで開示されているもの、及び米国仮特許出願第６２／５６２，６６３号明細書で開示されているものが挙げられる。植物の遺伝子発現で使用される構成的プロモーターは、当該技術分野で既知である。そうしたプロモーターとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１－５７３、Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０－８１２）、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５－６８９）、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８：７８－９８）、アクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：１６３－１７１）、ヒストン、ＤｎａＪ（Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ４２：１８９－２０１）等の遺伝子からのプロモーター、及び同類のもの。
本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語はまた、通常、常にではないが、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は特定の部位で転写を開始するのに必要な他の因子を認識することにより、コード領域の発現を制御する配列を含む、構造遺伝子のコード配列の上流（５’）側のＤＮＡ配列も指す。ＲＮＡポリメラーゼ又は特定の部位で確実に開始させる他の転写因子を認識する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与しているコアプロモーターエレメント、及び遺伝子発現を変化させる他の調節エレメントを含む。イントロン内に又はコード領域配列の３’側に位置しているヌクレオチド配列も目的のコード領域の発現の調節に寄与し得ることを理解しなければならない。好適なイントロンの例としては、トウモロコシＩＶＳ６イントロン、又はトウモロコシアクチンイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。調節エレメントはまた、転写開始部位の下流（３’）側に、転写領域内で、又はそれらの両方に位置するエレメントも含み得る。本開示の方法との関連では、転写後の調節エレメントとして、転写開始の後に活性なエレメント、例えば、翻訳エンハンサー及び転写エンハンサー、翻訳リプレッサー及び転写リプレッサー、並びにｍＲＮＡ安定性決定因子が挙げられ得る。
「異種ヌクレオチド配列」、「目的の異種ポリヌクレオチド」、又は「異種ポリヌクレオチド」は、本開示全体を通して使用される場合、天然にはプロモーターと共に存在していないか又はプロモーターに作動可能に連結されていない配列である。このヌクレオチド配列は、プロモーター配列に対し異種であるが、宿主植物に対しては、同種の、又は天然の、又は異種の、又は外来のものであり得る。同様に、プロモーター配列は、宿主植物及び／又は目的のポリヌクレオチドに対して、同種の、又は天然の、又は異種の、又は外来のものであり得る。
本開示の方法に有用なＤＮＡコンストラクト及び発現カセットはまた、必要な場合には、エンハンサー（翻訳エンハンサー又は転写エンハンサー）をさらに含み得る。このエンハンサー領域は当業者に公知であり、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含み得る。開始コドンは、全配列の翻訳を確かにするため、コード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源に由来し得る。翻訳開始領域は、転写開始領域の供給源から提供され得るか、又は構造遺伝子から提供され得る。この配列はまた、遺伝子発現のために選択された調節エレメントに由来し得、特に、ｍＲＮＡの翻訳を増大させるように改変され得る。転写レベルを高めるために、エンハンサーをプロモーター領域と組み合わせて使用し得ることが認識されている。転写レベルを高めるために、エンハンサーをプロモーター領域と組み合わせて使用し得ることが認識されている。エンハンサーは、プロモーター領域の発現を増加させるように作用するヌクレオチド配列である。エンハンサーは当該技術分野で既知であり、ＳＶ４０エンハンサー領域、３５Ｓエンハンサーエレメント、及び同類のものが挙げられる。いくつかのエンハンサーはまた、通常のプロモーター発現パターンを、例えば、プロモーターを構成的に発現させることにより変更することが知られている（エンハンサーがない場合には、同一のプロモーターが１つ又は少数の特定の組織でのみ発現する）。
一般に、「弱プロモーター」は、コード配列の発現を低レベルで駆動するプロモーターを意味する。「低レベル」の発現とは、約１／１０，０００転写産物～約１／１００，０００転写産物～約１／５００，０００転写産物のレベルでの発現を意味することが意図されている。逆に、強プロモーターは、高レベルで、即ち約１／１０転写産物～約１／１００転写産物～約１／１，０００転写産物でコード配列の発現を駆動する。
本開示の方法に有用な配列は、その天然のコード配列と共に使用され得、それによって形質転換植物の表現型の変化を生じることが認識されている。本明細書で開示される形態形成遺伝子及び目的の遺伝子、並びにそれらの改変体及び断片は、任意の植物の遺伝子操作のための本開示の方法において有用である。「作動可能に連結されている」という用語は、異種ヌクレオチド配列の転写又は翻訳が、プロモーター配列の影響下にあることを意味する。
本開示の一態様では、発現カセットは、形態形成遺伝子及び／又は異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたている転写開始領域又はその改変体若しくは断片を含む。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下にヌクレオチド配列を挿入するための複数の制限酵素認識部位を備え得る。この発現カセットは、選択マーカー遺伝子及び３’終止領域をさらに含み得る。
発現カセットは、転写の５’－３’方向で、宿主生物において機能する、転写開始領域（即ち、プロモーター又はその改変体若しくは断片）、翻訳開始領域、目的の異種ヌクレオチド配列、翻訳終止領域、及び、任意選択的な転写終止領域を含み得る。本開示の方法に有用な調節領域（即ち、プロモーター、転写調節領域、及び翻訳終止領域）、目的のポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して又は互いにネイティブ／類似であり得る。或いは、調節領域、目的のポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して又は互いに異種であり得る。本明細書で使用される場合、配列に関連した「異種」は、外来種を起源とする配列であるか、又は同種からのものであれば、組成及び／又はゲノム遺伝子座が意図的な人的介入により天然の形態から実質的に改変されている配列である。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、このポリヌクレオチドが由来した種と異なる種からのものであるか、又は同一／類似種からのものであれば、一方若しくは両方が元の形態及び／若しくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されているか、又はこのプロモーターが、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの天然プロモーターではない。
終止領域は、転写開始領域と同じ由来であってもよいし、作動可能に連結された目的のＤＮＡ配列と同じ由来であってもよいし、植物宿主と同じ由来であってもよいし、別の供給源由来（即ち、プロモーター、発現される形態形成遺伝子及び／又はＤＮＡ配列、植物宿主、又はこれらの任意の組み合わせに対して外来又は異種）であってもよい。適切な終止領域は、オクトピン合成酵素終止領域及びノパリン合成酵素終止領域等のＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから入手可能である。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１－１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１－６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１－１４９；Ｍｏｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１－１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１－１５８；Ｂａｌｌａｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１－７９０３；及びＪｏｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７－９６３９（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター、目的の異種ポリヌクレオチド、異種ポリヌクレオチドヌクレオチド、又は目的の配列を含む発現カセットを使用して、任意の植物を形質転換し得る。或いは、プロモーターに作動可能に連結された目的の異種ポリヌクレオチド、異種ポリヌクレオチドヌクレオチド、又は目的の配列は、トランスファーＤＮＡの外に配置された別個の発現カセット上にあり得る。このようにして、遺伝子組み換えが行われた植物体、植物細胞、植物組織、種子、根、及び同類のものを得ることができる。本開示の配列を含む発現カセットはまた、生物に同時形質転換される遺伝子、異種ヌクレオチド配列、目的の異種ポリヌクレオチド、又は異種ポリヌクレオチドの少なくとも１つの追加のヌクレオチド配列も含み得る。或いは、この追加のヌクレオチド配列を、別の発現カセットで供してもよい。
適切な場合には、プロモーター配列の制御下で発現されるヌクレオチド配列、及び任意の追加のヌクレオチド配列を、形質転換植物における発現を増加させるために最適化し得る。即ち、発現を改善するために、これらのヌクレオチド配列を、植物に好適なコドンを使用して合成し得る。例えば、宿主優先コドンの利用についての考察には、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１－１１（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書、同第５，４３６，３９１号明細書、及びＭｕｒｒａｙ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７－４９８（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
細胞宿主中での遺伝子発現を増強するために、追加的に配列を改変することが知られている。この改変には、遺伝子発現に有害であり得る、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン－イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様リピートをコードする配列、及び他のそのようなよく特徴付けられた配列の除去が含まれる。異種ヌクレオチド配列のＧ－Ｃ含量を、宿主細胞において発現された既知の遺伝子を参照することにより算出される、所与の細胞宿主の平均レベルに調節し得る。可能であれば、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるように配列を改変する。
本開示の方法に有用な発現カセットは、５’リーダー配列をさらに含み得る。そのようなリーダー配列は、翻訳を増強するよう作用し得る。翻訳リーダーは、当該技術分野で既知であり、下記が挙げられるが、これらに限定されない：ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ－Ｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６１２６－６１３０）；ポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）リーダー、例えばＴＥＶリーダー（タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ））（Ａｌｌｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９－２０）；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（Ｍａｉｚｅ Ｄｗａｒｆ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ））；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０－９４）；アルファルファモザイクウイルス（ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）の外皮タンパク質ｍＲＮＡ（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）由来の非翻訳リーダー（Ｊｏｂｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２－６２５）；タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）リーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ， ｐａｇｅｓ ２３７－２５６）；及びトウモロコシクロロティックモトルウイルス（ｍａｉｚｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）リーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２－３８５）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｄｅｌｌａ－Ｃｉｏｐｐａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８４：９６５－９６８（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。ｍＲＮＡの安定性を高めることが知られている方法では、イントロン（例えば、トウモロコシユビキチンイントロン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ，（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：２１３－２１８；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８：６７５－６８９）又はトウモロコシＡｄｈＩイントロン（Ｋｙｏｚｕｋａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４０－４８；Ｋｙｏｚｕｋａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍａｙｄｉｃａ ３５：３５３－３５７）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及び同類のもの）も使用され得る。
本開示の方法に有用な発現カセットの調製では、各種ＤＮＡ断片が、適当な配向で、必要ならば適当なリーディングフレームにおいて、ＤＮＡ配列を提供するように操作され得る。この目標に向かって、アダプター又はリンカーがＤＮＡ断片の結合に使用され得るか、又は適当な制限酵素認識部位、不要なＤＮＡの除去、制限酵素認識部位、又は同類のものを提供するための他の操作が行われ得る。この目的のために、インビトロでの変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えばトランジション及びトランスバージョンが行われ得る。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ヌクレオチドコンストラクト（例えば発現カセット）を宿主細胞に導入するためのＤＮＡ分子（例えば、プラスミド、コスミド、又はバクテリオファージ）を指す。クローニングベクターは、典型的には、外来ＤＮＡ配列を特定可能な方法で、ベクターの必須の生物学的機能を失わずに挿入し得る１つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、クローニングベクターで形質転換された細胞の識別及び選択に使用するのに好適なマーカー遺伝子とを含む。マーカー遺伝子として、典型的には、テトラサイクリン耐性、ハイグロマイシン耐性、又はアンピシリン耐性を与える遺伝子が挙げられる。
形質転換されている細胞を、従来の方法に従って植物体に成長させ得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１－８４（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。その後、この植物を成長させ、同じ形質転換株又は異なる株と授粉させ、それにより得られた、所望の表現型の特性を発現した子孫が確認され得る。所望の表現型特性の発現が安定して維持されて受け継がれるのを確実にするため、２世代以上生育させ、その後、所望の表現型特質の発現が達成されていることを確実にするため、種子を収穫し得る。このように、本開示は、ゲノムに安定に組み込まれた、本開示の方法に有用なヌクレオチドコンストラクト（例えば本開示の方法に有用な発現カセット）を有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。
植物組織から植物を再生する様々な方法がある。再生の特定の方法は、出発植物組織と再生する特定の植物種に依存するだろう。
植物ゲノムの特定の位置でポリヌクレオチドをターゲティングにより挿入する方法は、当該技術分野で既知である。ゲノムの所望の位置でのポリヌクレオチドの挿入は、部位特異的組み換えシステムを使用して行われる。例えば、国際公開第９９／２５８２１号パンフレット、同第９９／２５８５４号パンフレット、同第９９／２５８４０号パンフレット、同第９９／２５８５５号パンフレット、及び同第９９／２５８５３号パンフレット（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。簡潔に説明すると、目的のポリヌクレオチドは、２つの非同一性組換え部位で挟まれている導入カセットに含まれ得る。導入カセットは、この導入カセットの部位に対応する２つの非同一性組換え部位で挟まれている標的部位がそのゲノムに安定に組み込まれた植物に導入される。適切なリコンビナーゼが提供され、トランスファーカセットが標的部位に組み込まれる。それにより、目的のポリヌクレオチドが、植物ゲノムの特定の染色体上の位置に組み込まれる。
本開示の方法を使用して、外植片由来の植物のゲノムにおける改変のための特定の部位を標的とするのに有用なポリヌクレオチドを外植片に導入し得る。本開示の方法により導入され得る部位特異的改変として、部位特異的改変を導入する任意の方法によるものが挙げられ、例えば、限定されないが、遺伝子修復オリゴヌクレオチドの使用（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１９３４９号明細書）、又は二本鎖切断技術（ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、及び同類のもの）の使用によるものが挙げられる。例えば、植物体又は植物細胞のゲノム中の標的配列のゲノム改変のために、植物体を選択するために、塩基又は配列を欠失させるために、遺伝子編集のために、そして目的ポリヌクレオチドを植物体又は植物細胞のゲノムに挿入するために、本開示の方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを植物細胞又は植物体に導入し得る。そのため、本開示の方法を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと共に使用して、植物体、植物細胞、又は種子のゲノム中の標的部位及び目的のヌクレオチドを変更するか又は改変するのに有効なシステムを提供し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、この植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、植物ゲノムに結合し、ゲノム標的配列に二本鎖切断を引き起こし得る。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドによりガイドされて、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、植物体、植物細胞、又は種子のゲノム中の標的部位の改変に有効なシステムを提供する。さらに、細胞のゲノム中の標的部位の改変、及び細胞のゲノム中のヌクレオチド配列の編集に有効なシステムを提供するために、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法が提供される。ゲノム標的部位が特定されると、様々な方法を用いて、様々な目的ポリヌクレオチドを含むように標的部位をさらに改変し得る。本開示の方法を使用して、細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を編集するためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを導入し得る。編集されるヌクレオチド配列（目的のヌクレオチド配列）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより認識される標的部位中に又は標的部位外に位置し得る。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）（ＳＰＩＤＲ－スペーサー散在型ダイレクトリピートとしても既知である）は、最近説明されたＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短く且つ高度に保存されたＤＮＡリピート（典型的には２４～４０ｂｐ、１～１４０回の繰り返し－ＣＲＩＳＰＲリピートとも呼ばれる）から構成され、部分的に回文を形成している。反復配列（通常、種に固有である）は、一定の長さの可変配列（典型的には、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に依存して２０～５８）がスペーサーとして存在している（２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は最初に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において見出された（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１６９：５４２９－５４３３；Ｎａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：３５５３－３５５６）。同様の間隔短配列リピートが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、及びマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で特定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７－１０６５、Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４－２６３；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３０７：２６－３０；Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５－９３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、リピートの構造が他のＳＳＲと異なり、短等間隔リピート（ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔ）（ＳＲＳＲ）と呼ばれている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．６：２３－３３；Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４－２４６）。リピートは、クラスターの形態で生じる短いエレメントであり、常に一定の長さの可変配列により等しい間隔をおいて存在している（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４－２４６）。
Ｃａｓ遺伝子として、一般にフランキングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合して、関連して、又は近接若しくは隣接して存在する遺伝子が挙げられる。「Ｃａｓ遺伝子」及び「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的レビューは、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０に示されている。
４種の当初説明された遺伝子ファミリーに加え、さらに４１種のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ファミリーが、米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）で説明されている。この文献には、ＣＲＩＳＰＲシステムが、異なるリピート配列パターン、遺伝子群、及び種の範囲を有する異なる分類に属することが示されている。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣａｓ遺伝子の数は、種によって変わり得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣａｓタンパク質と関連しており、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ標的配列へ二本鎖切断を導入し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドによりガイドされ、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。本明細書で使用される場合、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」という用語には、ＤＮＡ標的配列に二本鎖切断を導入し得る、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチドとの複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的部位に近接したＤＮＡ二本鎖をほどき、標的配列を認識すると同時に、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端にほぼ配向されている限り、両方のＤＮＡ鎖を切断する（米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０号明細書の図２Ａ及び図２Ｂを参照されたい）。
ある態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、例えば、限定されないが、２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の配列番号４６２、４７４、４８９、４９４、４９９、５０５、及び５１８に挙げられているＣａｓ９遺伝子である。別の態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物、トウモロコシ、又はダイズに最適化されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、例えば、限定されないが、米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０号明細書の図１Ａに示されているものである。
別の態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓコドン領域上流のＳＶ４０核標的シグナル、及びＣａｓコドン領域下流の二分ＶｉｒＤ２核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７４４２－６）に作動可能に連結されている。
ある態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０号明細書の、配列番号１、１２４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、１９３、若しくは配列番号５のヌクレオチド２０３７～６３２９、又はこれらの任意の機能的断片若しくは改変体からなるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子である。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して、「機能的断片」、「機能的に等価である断片」、及び「機能的に等価な断片」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ配列の一部又は部分配列を指す。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して、「機能的改変体」、「機能的に等価である改変体」、及び「機能的に等価な改変体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの改変体を指す。断片及び改変体を、部位特異的変異誘発法及び合成構築法（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）等により得ることができる。
ある態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｎ（１２－３０）ＮＧＧ型の任意のゲノム配列を認識し得る植物コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子であり、原則として標的とされ得る。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び二本鎖切断誘発物質ドメインからなる人工の二本鎖切断誘発物質である。
「デッドＣＡＳ９」（ｄＣＡＳ９）は、本明細書で使用される場合、転写リプレッサードメインを供給するために使用される。ｄＣＡＳ９は、もはやＤＮＡを切断できないように変異されている。ｄＣＡＳ０は、ｇＲＮＡにより配列にガイドされると、なお結合し得、また、リプレッサーエレメントに融合され得る（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１３Ｊｕｌｙ １８；１５４（２）：４４２－４５１、Ｋｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．１２ Ｎｏ．１１：１０５１－１０５４を参照されたい）。リプレッサーエレメントに融合したｄＣＡＳ９は、本明細書で説明されているように、ｄＣＡＳ９～ＲＥＰと略され、ここで、リプレッサーエレメント（ＲＥＰ）は、植物において特徴付けられている既知のリプレッサーモチーフのいずれかであり得る（レビューには、Ｋａｇａｌｅ ａｎｄ Ｒｏｚｘａｄｏｗｓｋｉ，２００１０ ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇ＆Ｂｅｈａｖｉｏｒ５：６、６９１－６９４を参照されたい）。発現ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ｄＣＡＳ９～ＲＥＰタンパク質に結合し、ｄＣＡＳ９－ＲＥＰ融合タンパク質のプロモーター（Ｔ－ＤＮＡ内のプロモーター）内の特定の所定のヌクレオチド配列への結合を標的とする。（ＴＥＴＲ又はＥＳＲとは対照的に）リプレッサーに融合したｄＣＡＳ９タンパク質を用いる利点は、Ｔ－ＤＮＡ内の任意のプロモーターに対しこれらのリプレッサーを標的とする能力である。ＴＥＴＲ及びＥＳＲは、同種のオペレーター結合配列に限定される。或いは、リプレッサードメインに融合した合成ジンクフィンガーヌクレアーゼを、上記のように、ｇＲＮＡ及びｄＣＡＳ９～ＲＥＰに代えて使用し得る（Ｕｒｒｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．４：２３１）。
細菌及び古細菌は、外来核酸の分解に短鎖ＲＮＡを使用する、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を発展させている（２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的へガイドするのにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に相補的な領域と、ＣａｓエンドヌクレアーゼにＤＮＡ標的を切断させるＲＮＡ二本鎖を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を有する塩基対とを含む。
本明細書で使用される場合、「ガイドヌクレオチド」という用語は、２つのＲＮＡ分子、可変標的領域を含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）、及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成的融合に関する。ある態様では、ガイドヌクレオチドは、１２～３０個のヌクレオチド配列からなる可変標的ドメインと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用し得るＲＮＡ断片とを含む。
本明細書で使用される場合、「ガイドポリヌクレオチド」という用語は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関連している。ガイドポリヌクレオチドは、単分子又は二重分子であり得る。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はこれらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。任意選択的に、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合、又は連結修飾を含み得、この連結修飾として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣ、２，６－ジアミノプリン、２’－フルオロＡ、２’－フルオロＵ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、又は環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結が挙げられるが、これらに限定されない。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドもまた、「ガイドヌクレオチド」と称される。
ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインとも呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン又はＣＥＲドメインとも呼ばれる）とを含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。この二重分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の個別の分子を含む。これら２個の個別の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る。ある態様では、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、「ｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「ｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「ｃｒＤＮＡ－ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌及び古細菌中で天然に存在するｃＲＮＡの断片を含み得る。ある態様では、本明細書で開示されているｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中及び古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はより多いヌクレオチドから変動し得るが、これらに限定されない。
ある態様では、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「ｔｒａｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合）、又は「ｔｒａｃｒＤＮＡ－ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。ある態様では、ＲＮＡ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン又はＣＥＲドメインと呼ばれる）とを含む単分子であり得る。ガイドポリヌクレオチドの「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」又は「ＣＥＲドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、本明細書で説明されている改変を参照されたい）、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。ある態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００個のヌクレオチドの長さであり得る。別の態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定はされないがＧＡＡＡテトラループ配列等のテトラループ配列を含み得る。
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメイン、及び／又はＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変は、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変若しくは配列、トラッキングが生じる改変若しくは配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変若しくは配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣヌクレオチド、２，６－ジアミノプリンヌクレオチド、２’－フルオロＡヌクレオチド、２’－フルオロＵヌクレオチド；２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得るが、これらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらし得、この追加の有利な特徴は、安定性の変更又は調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用又はタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更、及び細胞透過性の増大の群から選択される。
ある態様では、ガイドヌクレオチドとＣａｓエンドヌクレアーゼとは、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位で二本鎖切断を導入するのを可能にする複合体を形成し得る。
本開示のある態様では、可変標的ドメインは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドの長さである。
本開示のある態様では、ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し得るＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡ（又はｃＲＮＡ断片）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（又はｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導し得、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。ガイドヌクレオチドを、当該技術分野で既知の任意の方法（例えば、限定されないが、粒子衝撃法又は局所的適用法）により、植物体又は植物細胞に直接導入し得る。
ある態様では、ガイドヌクレオチドを、植物細胞中でガイドヌクレオチドを転写し得る植物特異的プロモーターに作動可能に連結された、対応するガイドＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡ分子を導入することにより、間接的に導入し得る。「対応するガイドＤＮＡ」という用語は、ＲＮＡ分子の各「Ｕ」が「Ｔ」に置き替えられている以外はＲＮＡ分子と同じＤＮＡ分子を含む。
ある態様では、ガイドヌクレオチドは、粒子衝撃法により、又は植物Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結された、対応するガイドＤＮＡを含む組み換えＤＮＡコンストラクトをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により形質転換するための本開示の方法を使用して導入される。
ある態様では、ＲＮＡ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。二本鎖ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡに対してガイドヌクレオチドを使用する利点の１つは、融合ガイドヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
「標的部位」、「標的配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、及び「ゲノム標的遺伝子座」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより植物細胞ゲノムで二本鎖切断が導入される植物細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列（葉緑体ＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡを含む）を指す。標的部位は、植物ゲノム中の内在性部位であり得るか、或いは、標的部位は、植物体に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していないか、或いは標的部位は、天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出され得る。
本明細書で使用される場合、用語「内在性標的配列」及び「天然標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物ゲノムに対して内在性であるか又は天然であり、且つ植物ゲノム中の標的配列の内在性又は天然の位置に存在する標的配列を指す。ある態様では、標的部位は、ＬＩＧ３－４エンドヌクレアーゼ（米国特許出願公開第２００９／０１３３１５２号明細書）又はＭＳ２６＋＋メガヌクレアーゼ（米国特許出願公開第２０１４／００２０１３１号明細書）等の二本鎖切断誘発物質により特異的に認識され及び／又は結合されるＤＮＡ認識部位又は標的部位に類似する部位であり得る。
「人工標的部位」又は「人工標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物のゲノム中に導入された標的配列を指す。そのような人工標的配列は、植物ゲノム中の内在性標的配列又は天然標的配列と配列が同じであり得るが、植物ゲノム中の異なる場所（即ち、非内在性又は非天然の場所）に存在し得る。
「改変標的部位」、「改変標的配列」、「変更標的部位」、及び「変更標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、非改変標的配列を比較した場合に少なくとも１つの改変を含む、本明細書で開示されている標的部位を指す。そのような「改変」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
ある態様では、本開示の方法を使用して、植物における標的遺伝子の遺伝子抑制に有用なポリヌクレオチドを植物に導入し得る。植物における遺伝子操作のいくつかの態様では、特定の遺伝子の活性低下（遺伝子サイレンシング又は遺伝子抑制としても既知である）が望まれる。多くの遺伝子サイレンシング技術が当業者に公知であり、下記が挙げられるが、これらに限定されない：アンチセンス技術（例えば、Ｓｈｅｅｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８８０５－８８０９；並びに米国特許第５，１０７，０６５号明細書；同第５，４５３，５６６号明細書；及び同第５，７５９，８２９号明細書を参照）；コサプレッション（例えば、Ｔａｙｌｏｒ（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９：１２４５；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．８（１２）：３４０－３４４；Ｆｌａｖｅｌｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３４９０－３４９６；Ｆｉｎｎｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８８３－８８８；及びＮｅｕｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：２３０－２４１）；ＲＮＡ干渉（Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９－２８９、米国特許第５，０３４，３２３号明細書；Ｓｈａｒｐ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３：１３９－１４１；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：２５－３３；Ｊａｖｉｅｒ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２５：２５７－２６３；及びＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１５５０２－１５５０７）；ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １２：６９１－７０５；及びＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ．２：１０９－１１３）；標的ＲＮＡ特異的リボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５－５９１）；ヘアピン構造（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０７：３１９－３２０；国際公開第９９／５３０５０号パンフレット；同第０２／００９０４号パンフレット；及び同第９８／５３０８３号パンフレット）；リボザイム（Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１５２５、米国特許第４，９８７，０７１号明細書；及びＰｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：２５３）；オリゴヌクレオチド媒介標的改変（例えば、国際公開第０３／０７６５７４号パンフレット及び同第９９／２５８５３号パンフレット）；Ｚｎフィンガー標的分子（例えば、国際公開第０１／５２６２０号パンフレット；同第０３／０４８３４５号パンフレット；及び同第００／４２２１９号パンフレット）；人工マイクロＲＮＡ（ＵＳ８１０６１８０；Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １８：１１２１－１１３３）；並びに当業者に既知の他の方法又は上記方法の組み合わせ。
ある態様では、本開示の方法を使用して、植物へのヌクレオチド配列の標的組み込みに有用なポリヌクレオチドを植物に導入し得る。例えば、本開示の方法を使用して、標的部位を含む植物体を形質転換するために、非同一組み換え部位が隣接する目的のヌクレオチド配列を含むトランスファーカセットを導入し得る。ある態様では、標的部位は、トランスファーカセット上のものに対応する、非同一組み換え部位を少なくとも１セット含む。組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列の置換は、リコンビナーゼの影響を受ける。そのため、本開示の方法を、ヌクレオチド配列の標的組み込みのためのトランスファーカセットの導入に使用し得、非同一組み換え部位が隣接するトランスファーカセットは、非同一組み換え部位を認識してこの非同一組み換え部位で組み換えを行うリコンビナーゼにより認識される。従って、本開示の方法及び組成物を使用して、非同一組み換え部位を含む植物の成長の効率及び速度を改善し得る。
そのため、本開示の方法は、外因性ヌクレオチドの形質転換植物への、方向性を有する標的組み込みを行うための方法をさらに含み得る。ある態様では、本開示の方法は、所望の遺伝子及びヌクレオチド配列の、既に標的植物ゲノムに導入された対応する組み換え部位への方向性を有するターゲティングを促進する遺伝子ターゲティングシステムにおいて、新規の組み換え部位を使用する。
ある態様では、２つの非同一組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列が、目的のヌクレオチド配列の挿入のために標的部位が設けられた、標的生物のゲノム由来の外植片の１つ又は複数の細胞に導入される。安定した植物体又は培養組織が確立されると、標的部位に隣接している組み換え部位に対応する部位が隣接した第２のコンストラクト（即ち、目的のヌクレオチド配列）が、リコンビナーゼタンパク質の存在下で、安定して形質転換された植物体又は組織に導入される。このプロセスにより、標的部位の非同一組み換え部位とトランスファーカセットとの間で、ヌクレオチド配列の置換が起こる。
この方法で調製された形質転換植物体は複数の標的部位（即ち、非同一組み換え部位のセット）を含み得ることが認識されている。この方法では、形質転換植物体の標的部位に対して複数の操作を行い得る。形質転換植物体の標的部位は、形質転換植物体のゲノムに挿入されており且つ非同一組み換え部位を含むＤＮＡ配列が意図されている。
本開示の方法で使用される組み換え部位の例は、当該技術分野で既知であり、下記が挙げられる：ＦＲＴ部位（例えば、Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１２７４６－１２７５１；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：４４３－４４８；Ｐａｕｌ Ｄ．Ｓａｄｏｗｓｋｉ（１９９５）Ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．５１，ｐｐ．５３－９１；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍ．Ｃｏｘ（１９８９）Ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ，Ｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｏｗｅ（ｅｄｓ）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．１１６－６７０；Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）１８：４４９－４５８；Ｕｍｌａｕｆ ａｎｄ Ｃｏｘ（１９８８）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：１８４５－１８５２；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３１１８－３１１９；Ｋｉｌｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．９：４１３－４２１：Ｒｏｓｓａｎｔ ａｎｄ Ｇｅａｇｙ（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：５９２－５９４；Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：６４９－６５９；Ｂａｙｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３５３－３６１；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：３６９－３７８；及びＤａｌｅ ａｎｄ Ｏｗ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５５８－１０５６２０（これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）；Ｌｏｘ（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：６４９－６５９；Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１７０６－１７１０；Ｓｔｕｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：９０１－９１３；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｖｅｔ．２２３：３６９－３７８；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：７９－８５；及びＢａｙｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３５３－３６１）。大部分の天然に存在するサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株で見出される２ミクロンのプラスミドは、２つの反転リピート間のＤＮＡの反転を促進する部位特異的リコンビナーゼをコードする。この反転は、プラスミドのコピー数増幅で中心的な役割を果たす。
タンパク質、指定されたＦＬＰタンパク質は、部位特異的組み換えイベントを触媒する。最小の組み換え部位（ＦＲＴ）が定義されており、且つ非対称８ｂｐスペーサーを挟んだ２つの反転１３塩基対（ｂｐ）のリピートを含む。ＦＬＰタンパク質は、リピートとスペーサーとの接合部で部位を切断し、３’末端リン酸エステルによりＤＮＡに共有結合する。ＦＬＰのような部位特異的リコンビナーゼは、特定の標的配列でＤＮＡを切断して再ライゲートして、２つの同一部位間で正確に定義された組み換えをもたらす。機能させるには、システムは組み換え部位とリコンビナーゼとを必要とする。補助的因子は必要でない。このようにして、システム全体を植物細胞に挿入して機能させ得る。酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組み換えシステムが植物で機能することが示されている。今日では、このシステムは、不要なＤＮＡの切除に利用されている。Ｌｙｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１：９６９－９７５を参照されたい。対照的に、本開示は、植物ゲノムにおけるヌクレオチド配列の置換、ターゲティング、配置、挿入、及び発現の制御に、非同一ＦＲＴを使用する。
ある態様では、ゲノムに組み込まれる標的部位を含む目的の形質転換生物（例えば、植物体からの外植片）が必要とされる。この標的部位は、非同一組み換え部位が隣接するという特徴を有する。形質転換生物の標的部位に含まれる部位に対応する非同一組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列を含むターゲティングカセットが、さらに要求される。非同一組み換え部位を認識し且つ部位特異的組み換えを触媒するリコンビナーゼが要求される。
リコンビナーゼは、当該技術分野で既知の任意の手段で提供され得ると認識されている。即ち、リコンビナーゼは、生物中でリコンビナーゼを発現し得る発現カセットで生物を形質転換することにより、一過性発現により、又はリコンビナーゼ若しくはリコンビナーゼタンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を提供することにより、生物又は植物細胞中に提供され得る。
「非同一組み換え部位」は、隣接する組み換え部位の配列が同一でなく、組み換えが生じないか、又は部位間の組み換えが最少になるであろうことが意図されている。即ち、１つの隣接する組み換え部位は、ＦＲＴ部位であり得、第２の組み換え部位は、変異したＦＲＴ部位であり得る。本開示の方法で使用される非同一組み換え部位は、２つの隣接する組み換え部位間の組み換え、及びそこに含まれるヌクレオチド配列の切除を妨げるか、又は大きく抑制する。従って、本開示では、ＦＲＴ及び変異ＦＲＴ部位、ＦＲＴ及びｌｏｘ部位、ｌｏｘ及び変異ｌｏｘ部位、並びに当該技術分野で既知の他の組み換え部位を含む、任意の好適な非同一組み換え部位を使用し得ることが認識されている。
好適な非同一組み換え部位とは、活性なリコンビナーゼの存在下で、２つの非同一組み換え部位間の配列の削除がなされるとしても、植物ゲノムへのヌクレオチド配列の組み換えによる標的配置の置換よりもかなり低い効率で生じることを意味する。そのため、本開示で使用される好適な非同一部位には、部位間の組み換え効率が低い部位、例えば、効率が約３０～約５０％未満、好ましくは約１０～約３０％未満、より好ましくは約５～約１０％未満の部位が含まれる。
上述のように、ターゲティングカセットの組み換え部位は、形質転換された植物体の標的サイトでの組み換え部位に対応する。即ち、形質転換植物体の標的部位が、ＦＲＴ及び変異ＦＲＴという隣接する非同一組み換え部位を含む場合には、ターゲティングカセットは、同じＦＲＴ及び変異ＦＲＴの非同一組み換え部位を含むだろう。
さらに、本開示の方法で使用されるリコンビナーゼは、形質転換植物体及びターゲティングカセットの標的部位の組み換え部位に依存するであろうことが認識されている。即ち、ＦＲＴ部位が使用される場合、ＦＬＰリコンビナーゼが必要になるであろう。同様に、ｌｏｘ部位が使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼが必要になる。非同一組み換え部位がＦＲＴ及びｌｏｘ部位の両方を含む場合、植物細胞中にＦＬＰ及びＣｒｅの両リコンビナーゼが必要になるだろう。
ＦＬＰリコンビナーゼは、ＤＮＡ複製時に、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２ミクロンプラスミドのコピー数の増幅に関与する部位特異的反応を触媒するタンパク質である。ＦＬＰタンパク質はクローン化されて発現されている。例えば、Ｃｏｘ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：４２２３－４２２７を参照されたい。本開示で使用されるＦＬＰリコンビナーゼを、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から得ることができる。目的の植物体での最適な発現のために、植物体に望ましいコドンを使用してリコンビナーゼを合成することが好ましい場合がある。例えば、１９９７年１１月１８日出願の、発明の名称が「Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＦＬＰ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ」である米国特許出願第０８／９７２，２５８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
バクテリオファージリコンビナーゼＣｒｅは、２つのｌｏｘ部位間の部位特異的組み換えを触媒する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：４０－４６；Ａｂｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９－１５１４；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４７７－４８８；及びＳｈａｉｋｈ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５６９５－５７０２を参照されたい。これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。そのようなＣｒｅ配列はまた、植物体に望ましいコドンを使用しても合成され得る。
適切な場合には、植物ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列は、形質転換植物における発現を増加させるために最適化され得る。本開示において哺乳動物、酵母、又は細菌の遺伝子が使用される場合、これらを、発現改善のために、植物体に望ましいコドンを使用して合成し得る。単子葉植物における発現では、単子葉植物に望ましいコドンを使用して双子葉植物の遺伝子も合成し得ると認識されている。当該技術分野では、植物に望ましい遺伝子を合成する方法が利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書、同第５，４３６，３９１号明細書，及びＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７－４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物に望ましいコドンは、目的の植物で発現されるタンパク質において、より頻繁に使用されるコドンから決定され得る。単子葉植物又は双子葉植物に望ましい配列は、特定の植物種にとってその植物に望ましい配列と同様に構築され得ると認識されている。例えば、欧州特許出願公開第Ａ０３５９４７２号明細書；欧州特許出願公開第Ａ０３８５９６２号明細書；国際公開第９１／１６４３２号パンフレット；Ｐｅｒｌａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３３２４－３３２８；及びＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：４７７－４９８．米国特許第５，３８０，８３１号明細書；同第５，４３６，３９１号明細書；並びに同類のもの（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、遺伝子配列の全て又は任意の部分が、最適化されてもよいし合成されてもよいことが認識されている。即ち、完全に最適化されたか又は部分的に最適化された配列も使用し得る。
配列のさらなる改変が、細胞宿主中での遺伝子発現を促進することが知られており、且つ本開示で使用され得る。このような改変には、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン－イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様リピートをコードする配列、及び遺伝子の発現に有害であり得る他のそのようなよく特徴付けられた配列の除去が含まれる。配列のＧ－Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現される既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均的なレベルに調節され得る。可能であれば、配列を、予想されるヘアピン二次ＲＮＡ構造を避けるように改変する。
本開示はまた、新規のＦＬＰ組み換え標的部位（ＦＲＴ）も包含する。ＦＲＴは、８塩基スペーサーで分けられた２つの１３塩基対リピートを含む最小配列として特定されている。２つの１３塩基リピートが８個のヌクレオチドで分離されている限り、スペーサー領域のヌクレオチドを、ヌクレオチドの組み合わせで置換し得る。スペーサーの実際のヌクレオチド配列は重要ではないが、しかしながら、本開示の実施のためには、スペース領域のヌクレオチドのいくつかの置換は、他の領域の置換より良く機能し得る。８塩基対のスペーサーは、鎖置換時のＤＮＡ－ＤＮＡの対合に関与する。この領域の非対称性は、組み換えイベントの部位アラインメントの方向を決定し、これは、その後、逆方向になるか又は切除されるかに繋がる。上述のように、スペーサーの大部分は、機能を失うことなく変異され得る。例えば、Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１２７４６－１２７５１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
新規のＦＲＴ変異部位は、本開示の方法の実施で使用され得る。そのような変異部位は、ＰＣＲをベースとした変異誘発により構築され得る。変異ＦＲＴ部位は既知である（国際公開第１９９９／０２５８２１号パンフレットの配列番号２、３、４、及び５を参照されたい）が、本開示の実施に別の変異ＦＲＴ部位が使用され得ることが認識されている。本開示は、特定のＦＲＴ又は組み換え部位の使用ではなく、むしろ、非同一組み換え部位又はＦＲＴ部位が、植物ゲノム中のヌクレオチド配列のターゲティング挿入及び発現に使用され得る。そのため、本開示に基づいて、他の変異ＦＲＴ部位が構築されて使用され得る。
上で論じたように、リコンビナーゼの存在下で、非同一組み換え部位を有する標的部位を含むゲノムＤＮＡを、対応する非同一組み換え部位を有するトランスファーカセットを含むベクターと一緒にすると、組み換えが起こる。隣接する組み換え部位の間に位置するトランスファーカセットのヌクレオチド配列は、隣接する組み換え部位の間に位置する標的部位のヌクレオチド配列と置換される。このようにして、目的のヌクレオチド配列を、宿主のゲノムに正確に組み込み得る。
本開示の多くの変形を実施し得ることが認識されている。例えば、複数の非同一組み換え部位を有する標的部位を構築し得る。このように、複数の遺伝子又はヌクレオチド配列を、植物ゲノムの正確な位置に積み重ね得るか又はオーダーし得る。同様に、ゲノム内で標的部位が確立されると、トランスファーカセットのヌクレオチド配列内に追加の組み換え部位を組み込み、その部位を標的配列に移入することにより、追加の組み換え部位を導入し得る。このように、標的部位が確立されると、その後、組み換えにより部位を追加するか又は部位を変更することが可能である。
別の変形として、生物の標的部位に作動可能に連結されたプロモーター又は転写開始領域を提供することが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、最初の組み換え部位の５’末端側にあるだろう。コード領域を含むトランスファーカセットで生物を形質転換することにより、コード領域の発現は、トランスファーカセットが標的部位に組み込まれたときに起こるであろう。この態様は、コード配列として選択マーカー配列を提供することにより、形質転換された細胞（特に植物細胞）を選択する方法を提供する。
本システムの別の利点として、上で論じたトランスファーカセットを使用することによる、導入遺伝子又は導入ＤＮＡを生物に組み込むことの複雑さを軽減する能力、及び単純な組み込みパターンによる生物の選択が挙げられる。同様に、数種の形質転換イベントを比較することにより、ゲノム内の好ましい部位を特定し得る。ゲノム内の好ましい部位として、必須配列の発現を妨害せず且つ導入遺伝子配列を十分に発現させるものが挙げられる。
本開示の方法はまた、ゲノム内の１ヵ所で複数のカセットを結合させる手段も提供する。ゲノム内の標的部位で、組み換え部位を追加してもよいし欠失させてもよい。
本開示においては、本システムの３つの成分を一緒にする、当該技術分野で既知の任意の手段を使用し得る。例えば、植物を安定して形質転換し、このゲノム内に標的部位を宿させ得る。リコンビナーゼを、一時的に発現させてもよいし、提供してもよい。或いは、リコンビナーゼを発現し得るヌクレオチド配列を、植物ゲノムに安定的に組み込み得る。対応する非同一組み換え部位が隣接するトランスファーカセットは、対応する標的部位及びリコンビナーゼの存在下で、形質転換植物のゲノムに挿入される。
或いは、形質転換植物を有性交雑させることにより、本システムの成分を一緒にし得る。この態様では、ゲノムに組み込まれた標的部位を含む形質転換植物（即ち第１の親）を、第２の植物（即ち第１の親に対応する隣接する非同一組み換え部位を含むトランスファーカセットで遺伝子的に形質転換されている第２の親）と有性交雑し得る。第１の植物又は第２の植物は、そのゲノム内にリコンビナーゼを発現するヌクレオチド配列を含む。リコンビナーゼを、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。このようにして、リコンビナーゼの発現及びその後の組み換え部位での活性を制御し得る。
本開示の方法は、導入されるヌクレオチド配列を特定の染色体部位へ組み込むターゲティングに有用である。このヌクレオチド配列は、任意の目的のヌクレオチド配列をコードし得る。目的の特定の遺伝子としては、宿主細胞及び／又は生物に容易に分析可能な機能的特徴を提供するもの（例えばマーカー遺伝子）、並びに受容細胞の表現型を変える他の遺伝子、並びに同類のものが挙げられる。そのため、本開示では、植物の成長、高さ、病気に対する感受性、昆虫、栄養価、及び同類のものに影響する遺伝子を使用し得る。このヌクレオチド配列はまた、遺伝子の発現を停止するか又は改変させる「アンチセンス」配列もコードし得る。
このヌクレオチド配列は、機能性発現ユニット又はカセットで使用され得ると認識されている。機能性発現ユニット又はカセットは、機能性プロモーター及び殆どの場合に終止領域を有する目的のヌクレオチド配列が意図されている。本開示の実施の中で機能性発現ユニットを実現させるには、各種の方法がある。本開示の一態様では、目的の核酸は、機能性発現ユニットとしてゲノムに導入されるか又は挿入される。
或いは、このヌクレオチド配列を、ゲノム内のプロモーター領域の３’端側の部位へ挿入し得る。この後者の場合、プロモーター領域の３’末端側へのコード配列の挿入は、組み込み時に機能性発現ユニットを実現させるものである。植物における発現では、便宜のために、標的部位をコードする核酸、及び目的のヌクレオチド配列を含むトランスファーカセットを、発現カセットに含ませ得る。発現カセットは、目的のペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された転写開始領域（即ちプロモーター）を含むであろう。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下での目的の遺伝子又は遺伝子群を挿入するための複数の制限部位を備えている。
実施例１：配列及びプラスミド
本開示の方法及び組成物で有用な配列を、表１に列挙する。
Figure 2022512817000002
Figure 2022512817000003
実施例２：オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株の生成
オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株を、植物形質転換に使用する（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３号明細書）。チメンチンに対する感受性を示し、及び／又はシステイン若しくはロイシンに関する栄養要求性を示す株を作製した。表２を参照されたい。
オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株Ｈ１－１～Ｈ１－７の場合には、βラクタマーゼ遺伝子（ＳＦＯ－１（ΔｂｌａＡ）、ＯＸＡ－１（ΔｂｌａＤ）、及びクラスＢ Ｚｎ金属酵素（ΔｂｌａＢ）を、下記で説明するように及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株の生成の概略を示す図１に示すようにアレル置換ベクターを使用して、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）から個々に及び／又は順次欠失させた。作製するオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株に応じて、下記で説明し且つ図１に示すプロセスを１回実行するか又は複数回連続して実行する。例えば、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を、下記で説明し且つ図１に示すプロセスに供し、ＳＦＯ－１遺伝子、クラスＢ Ｚｎ金属酵素遺伝子、又はＯＸＡ－１遺伝子をそれぞれ欠失させて、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－２、及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－３をそれぞれ作製した。同様に、ＳＦＯ－１遺伝子が欠失しているオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１を、下記で説明し且つ図１に示すプロセスに再び供し、ＯＸＡ－１遺伝子及びクラスＢ Ｚｎ金属酵素遺伝子をそれぞれ欠失させて、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－４，及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－５をそれぞれ作製した。同様に、クラスＢ Ｚｎ金属酵素遺伝子が欠失しているオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－２を、下記で説明し且つ図１に示すプロセスに再び供し、ＯＸＡ－１遺伝子を欠失させて、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－６を作製した。ＳＦＯ－１遺伝子及びクラスＢ Ｚｎ金属酵素遺伝子が既に欠失しているオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－５を、下記で説明し且つ図１に示すプロセスに再び供し、ＯＸＡ－１遺伝子を欠失させて、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－７を作製した。その後、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－７を、下記で説明し且つ図１に示すプロセスに供し、セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失させてオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８を生成し、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失させてオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－９を生成した。下記で説明し且つ図１に示すように、野生型オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株からセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失させることにより、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０を生成した。
Figure 2022512817000004
アレル置換カセットベクターの構築
β－ラクタマーゼ遺伝子（ＳＦＯ－１、ＯＸＡ－１、及びクラスＢ Ｚｎ金属酵素）、セリンアセチルトランスフェラーゼ、並びに３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失の場合には、アレル置換カセットベクター＋を、オーバーラップベースのＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，２４０ Ｃｏｕｎｔｙ Ｒｄ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ ０１９３８から入手可能なＤＮＡアセンブリ法）で構築した。各ベクターは、それぞれβ－ラクタマーゼ遺伝子に隣接する２ｋｂのＤＮＡを含む。３０～４０ｂｐの長いオーバーラップ領域を含むＤＮＡ断片の全てを、ＰＣＲ又は制限酵素消化により生成した。ＰＣＲ増幅を、製造業者の推奨に従って、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により行ない、増幅したＤＮＡ部分を、アガロースゲル電気泳動で分析し、カラム精製又はゲル精製の後に、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ反応で使用した（データは示さない）。市販のＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（商標）ＥＰＩ３００（商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２９０５ Ｐａｒｍｅｎｔｅｒ Ｓｔ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ ５３５６２）を、このアセンブリ反応 ２μＬで形質転換した。アセンブリを、配列決定により検証した（データは示さない）。
本明細書で構築されて使用されるアレル置換ベクターを、表３に列挙する。
Figure 2022512817000005
アレル置換実験
β－ラクタマーゼ遺伝子（ＳＦＯ－１、ＯＸＡ－１、及びクラスＢ Ｚｎ金属酵素）を、下記のように、個々に及び／又は順次欠失させた。アレル置換の第１の工程では、適切なアレル置換ベクター（ｐＬＦ４０７、ｐＬＦ４０８、又はｐＬＦ４０９）を、個々に、及び複数の欠失の場合には順次に、エレクトロポレーションによりオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１に形質転換させた。このベクターは、ｐＵＣ複製基点を有し、そのため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で複製し得るがオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１中では複製し得ない。カナマイシン耐性の形質転換体の選択により、このベクターが、優先的には欠失する特定のβ－ラクタマーゼ遺伝子に隣接するクローン化された相同部位で、染色体に組み込まれているというイベントが得られる。形質転換体をカナマイシン上で画線して純度を高めた。アレル置換の第２の工程では、次いで、独立した単離体を、選択することなくブロスで継代させ、ダイレクトリピートの間でベクターをループさせて、第２の組み換えイベントを経験している細胞が増殖することを可能にした。これらのイベントは、もはやｓａｃＢ遺伝子を含んでおらず、５％のスクロースが入ったプレートで選択した。
セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子及び３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子も、同様に欠失させた。具体的には、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－９の生成の場合には、アレル置換の第１の工程において、ＧＰ７０４ＣｙｓＥＫＯアレル置換ベクター又はＧＰ７０４Ｌｅｕ２ＫＯアレル置換ベクターを、エレクトロポレーションにより、それぞれオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－７に形質転換させた。これらのベクターはＲ６Ｋ複製起点を有しており、そのため、Ｒ６Ｋ ｐｉｒ遺伝子を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で複製し得るが、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－７中では複製し得ない。カナマイシン耐性の形質転換体の選択により、このベクターが、優先的にはセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子又は３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に隣接するクローン化された相同部位で、染色体に組み込まれているというイベントが得られる。形質転換体をカナマイシン上で画線して純度を高めた。アレル置換の第２の工程では、次いで、独立した単離体を、選択することなくブロスで継代させ、ダイレクトリピートの間でベクターをループさせて、第２の組み換えイベントを経験している細胞が増殖することを可能にした。これらのイベントは、もはやｓａｃＢ遺伝子を含んでおらず、５％のスクロースが入ったプレートで選択した。
オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０の生成の場合には、アレル置換の第１の工程において、ｐＨ５５５７ＣｙｓＥＫＯアレル置換ベクターを、エレクトロポレーションにより、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１に形質転換させた。このベクターはｐＵＣ複製起点を有しており、そのため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で複製し得るが、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１中では複製し得ない。カナマイシン耐性の形質転換体の選択により、このベクターが、優先的にはセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に隣接するクローン化された相同部位で、染色体に組み込まれているというイベントが得られる。形質転換体をカナマイシン上で画線して純度を高めた。アレル置換の第２の工程では、次いで、独立した単離体を、選択することなくブロスで継代させ、ダイレクトリピートの間でベクターをループさせて、第２の組み換えイベントを経験している細胞が増殖することを可能にした。このイベントは、もはやｓａｃＢ遺伝子を含んでおらず、５％のスクロースが入ったプレートで選択した。
アレル置換用のコロニーＰＣＲスクリーニング
各アレル置換反応からのスクロース耐性候補コロニーの一部を、各遺伝子に隣接する、表４に列挙されたプライマーによるＰＣＲに供して、各遺伝子が欠失しているかどうかを決定した。
プライマーＢＬＡ ＯＸＡ－１ ３－３（配列番号１）及びＢＬＡ ＯＸＡ－１ ３－５（配列番号２）を使用して、β－ラクタマーゼＯＸＡ－１遺伝子が残存しているか、又は表５に列挙された合成欠失接合部（配列番号１９）に置換されているかを決定した。
プライマーＢｌａ ＳＦＯ－１ ３－３（配列番号３）及びＢｌａ ＳＦＯ－１ ３－５（配列番号４）を使用して、β－ラクタマーゼＳＦＯ－１遺伝子が残存しているか、又は表５に列挙された合成欠失接合部（配列番号２０）に置換されているかを決定した。
プライマーＢｌａ ＺｎクラスＢ ３－３（配列番号５）及びＢｌａ ＺｎクラスＢ ３－５（配列番号６）を使用して、β－ラクタマーゼ クラスＢ Ｚｎ金属酵素遺伝子が残存しているか、又は表５に列挙された合成欠失接合部（配列番号２１）に置換されているかを決定した。
プライマーＣｙｓＥＫＯ－Ｆ（配列番号７）及びＣｙｓＥＫＯ－Ｒ（配列番号８）を使用して、セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が残存しているか、又は表５に列挙された合成欠失接合部（配列番号２２）に置換されているかを決定した。
プライマーＬｅｕ２ＫＯ－Ｆ（配列番号９）及びＬｅｕ２ＫＯ－Ｒ（配列番号１０）を使用して、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が残存しているか、又は表５に列挙された合成欠失接合部（配列番号２３）に置換されているかを決定した。
Figure 2022512817000006
Figure 2022512817000007
新規のオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株Ｈ１－１～Ｈ１－７は、β－ラクタマーゼ遺伝子（ＯＸＡ－１、ＳＦＯ－１、及びクラスＢ Ｚｎ金属酵素）の内の１つ又は複数の欠失を裏付ける、チメンチンに対する様々な程度の感受性を有することが示された。加えて、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－９も、それぞれシステイン及びロイシンに関する栄養要求性も示した。オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０は、システインに関する栄養要求性を示した。
独立した単離体のゲノム配列を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．５２００ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｗａｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２２）を使用して決定し、既に配列決定されているオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株と別の点で同質遺伝子的であることが分かった。次いで、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０を、実施例３で説明されるダイズを形質転換する能力に関して、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１と比較した。
実施例３：オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株によるダイズの形質転換
オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８、及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０を使用して、ダイズ胚軸（ＥＡ）形質転換の２回の形質転換実験での並列比較を実行した。オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）により媒介されるダイズ胚軸形質転換を、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０２１６１２３号明細書で本質的に説明されているように行なった。ダイズ栽培品種Ｐ２９Ｔ５０の成熟乾燥種子を、塩素ガスを使用して消毒し、暗所において室温で、５ｇ／ｌのスクロース及び６ｇ／ｌの寒天を含む半固体培地上で浸した。終夜のインキュベーション後、この種子を、暗所において室温で、さらなる３～４時間にわたり蒸留水に浸漬させた。蒸留した滅菌水中において、メスの刃を使用して、子葉から無傷の胚軸を単離した。胚軸外植片を、２００μＭのアセトシリンゴンを含む感染培地にＯＤ６００＝０．５で懸濁されたヘルパーベクターＰＨＰ８５６３４（ＲＶ００５３９３（配列番号２５））及びバイナリーベクターＰＨＰ８２３１４（配列番号２６）をそれぞれ含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８、又はオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０ １５ｍＬが入った深皿に移した。この皿を、パラフィルム（「Ｐａｒａｆｉｌｍ Ｍ」ＶＷＲ Ｃａｔ＃５２８５８）で密閉し、次いで３０秒にわたり超音波処理した（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ－ＶＷＲ ｍｏｄｅｌ ５０Ｔ）。超音波処理後、胚軸外植片を、オートクレーブされた滅菌ろ紙（ＶＷＲ＃４１５／カタログ番号２８３２０－０２０）の単層に移した。この皿を、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅテープ（カタログ番号１５３０－０、３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ））で密閉し、３日にわたり２１℃で、１６時間にわたる弱い光（５～１０μＥ／ｍ２／ｓ、冷白色蛍光ランプ）下でインキュベートした。
共培養後、胚軸外植片を、選択することなく、０．７％の寒天で固化したシュート誘導培地上で培養した。この外植片の基部（即ち、胚軸の根）を、この培地に埋め込んだ。１８時間にわたる光周期及び４０～７０μＥ／ｍ２／ｓの光強度にて、２６℃でＰｅｒｃｉｖａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ中において、シュートの誘導を実行した。形質転換の６～７週間後、伸びたシュート（＞１～２ｃｍ）を単離し、選択剤を含む発根培地に移した。トランスジェニック小植物を土壌ポットに移し、温室中で成長させた。
表６Ａに示すように、野生型オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１で形質転換されたＥＡを含む９個の皿の内の８個は、形質転換実験＃１で細菌の過剰増殖を示しており、形質転換実験＃２では、全ての皿（７／７）が、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１の過剰増殖で汚染されていた（表６Ｂ）。オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８又はオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０のいずれかで形質転換された皿はいずれも、形質転換実験＃１及び＃２で細菌の加増増殖を示さなかった（表６Ａ及び６Ｂ）。これらの結果は、栄養要求性株オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０が、形質転換実験＃１及び＃２の両方で、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１と比較して同様の形質転換効率を示した（表６Ａ及び６Ｂ）ことを示す。
Figure 2022512817000008
Figure 2022512817000009
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。そのため、例えば、「細胞」への言及は、そのような細胞を複数含み、「タンパク質」への言及は、１つ又は複数のタンパク質及び当業者に既知のその等価物等への言及を含む。別途明確な指示がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。
本明細書で言及された全ての特許、刊行物、及び特許出願は、本開示が属する技術分野の当業者の水準を示すものである。全ての特許、刊行物、及び特許出願は、あたかも個々の特許、刊行物、又は特許出願が、明確に且つ個々に参照により全体が組み込まれるよう指示されているのと同程度に、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以上の開示は、理解を明確にする目的で、図面及び実施例によりある程度の詳しく説明してきたが、添付の請求項の範囲内で一定の変更及び修正を行ない得る。

Claims (30)

  1. 改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌であって、β－ラクタマーゼ遺伝子が欠失している、改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  2. 改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌であって、セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が欠失している、改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  3. 前記改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１０である、請求項２に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  4. 前記セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、アレル置換により欠失している、請求項２に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  5. 前記改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－１、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－２、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－３、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－４、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－５、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－６、及びオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－７からなる群から選択される、請求項１に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  6. システイン要求性株をさらに含む請求項１に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  7. 前記改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８である、請求項６に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  8. ロイシン要求性株をさらに含む請求項１に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  9. 前記改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－９である、請求項８に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  10. ３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がアレル置換により欠失している、請求項８に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  11. 前記β－ラクタマーゼ遺伝子は、ＳＦＯ－１遺伝子、ＯＸＡ－１遺伝子、クラスＢ Ｚｎ金属酵素遺伝子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  12. 前記β－ラクタマーゼ遺伝子は、アレル置換により欠失している、請求項１１に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  13. 配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  14. 配列番号２４を含まない改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  15. 植物に有利な形質を付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを有するバイナリープラスミドＴ－ＤＮＡをさらに含む請求項１、２、又は６のいずれか一項に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  16. 前記有利な形質は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項１５に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  17. ヘルパープラスミドをさらに含む請求項１、２、６、又は１５のいずれか一項に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  18. 植物を形質転換する方法であって、
    植物細胞と、請求項１に記載の改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌とを、前記改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌の前記植物細胞への感染を許容する条件下で接触させることであり、それにより前記植物細胞を形質転換すること；
    前記形質転換された植物細胞を選択し且つスクリーニングすること；
    及び
    前記選択され且つスクリーニングされた植物細胞からトランスジェニック植物全体を再生すること
    を含む方法。
  19. 前記トランスジェニック植物は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせを付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記植物細胞は、オオムギ細胞、トウモロコシ細胞、キビ細胞、オートムギ細胞、イネ細胞、ライムギ細胞、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種細胞、ソルガム細胞、サトウキビ細胞、スイッチグラス細胞、ライコムギ細胞、芝草細胞、コムギ細胞、ケール細胞、カリフラワー細胞、ブロッコリー細胞、カラシナ細胞、キャベツ細胞、エンドウ細胞、クローバー細胞、アルファルファ細胞、ソラマメ細胞、トマト細胞、キャッサバ細胞、ダイズ細胞、キャノーラ細胞、ヒマワリ細胞、ベニバナ細胞、タバコ細胞、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞、又はワタ細胞である、請求項１８に記載の方法。
  21. オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８である改変オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１細菌。
  22. 植物に有利な形質を付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを有するバイナリープラスミドＴ－ＤＮＡをさらに含む請求項２１に記載のオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌。
  23. 前記有利な形質は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項２２に記載のオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌。
  24. ヘルパープラスミドをさらに含む請求項２２に記載のオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌。
  25. 植物を形質転換する方法であって、
    植物細胞と、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌とを、前記オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌の前記植物細胞への感染を許容する条件下で接触させることであり、それにより前記植物細胞を形質転換すること；
    前記形質転換された植物細胞を選択し且つスクリーニングすること；
    及び
    前記選択され且つスクリーニングされた植物細胞からトランスジェニック植物全体を再生すること
    を含む方法。
  26. 前記トランスジェニック植物は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせを付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記植物細胞は、オオムギ細胞、トウモロコシ細胞、キビ細胞、オートムギ細胞、イネ細胞、ライムギ細胞、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種細胞、ソルガム細胞、サトウキビ細胞、スイッチグラス細胞、ライコムギ細胞、芝草細胞、コムギ細胞、ケール細胞、カリフラワー細胞、ブロッコリー細胞、カラシナ細胞、キャベツ細胞、エンドウ細胞、クローバー細胞、アルファルファ細胞、ソラマメ細胞、トマト細胞、キャッサバ細胞、ダイズ細胞、キャノーラ細胞、ヒマワリ細胞、ベニバナ細胞、タバコ細胞、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞、又はワタ細胞である、請求項２６に記載の方法。
  28. 植物を形質転換する方法であって、
    植物細胞と、請求項２２又は２４に記載のオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌とを、前記オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８細菌の前記植物細胞への感染を許容する条件下で接触させることであり、それにより前記植物細胞を形質転換すること；
    前記形質転換された植物細胞を選択し且つスクリーニングすること；
    及び
    前記選択され且つスクリーニングされた植物細胞からトランスジェニック植物全体を再生すること
    を含む方法。
  29. 前記トランスジェニック植物は、ストレス耐性、栄養強化、収穫量の増大、非生物的ストレス耐性、乾燥抵抗性、寒冷耐性、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、病原体抵抗性、昆虫抵抗性、窒素利用効率（ＮＵＥ）、病害抵抗性、若しくは代謝経路を変更する能力、又はこれらの任意の組み合わせを付与するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記植物細胞は、オオムギ細胞、トウモロコシ細胞、キビ細胞、オートムギ細胞、イネ細胞、ライムギ細胞、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種細胞、ソルガム細胞、サトウキビ細胞、スイッチグラス細胞、ライコムギ細胞、芝草細胞、コムギ細胞、ケール細胞、カリフラワー細胞、ブロッコリー細胞、カラシナ細胞、キャベツ細胞、エンドウ細胞、クローバー細胞、アルファルファ細胞、ソラマメ細胞、トマト細胞、キャッサバ細胞、ダイズ細胞、キャノーラ細胞、ヒマワリ細胞、ベニバナ細胞、タバコ細胞、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）細胞、又はワタ細胞である、請求項２９に記載の方法。
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