ES2338284T3 - Movilizacion de genomas viricos a partir de t-adn utilizando sistemas de recombinacion especificos de sitio. - Google Patents
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Abstract
Un método para movilizar un replicón vírico de un T-ADN, que comprende: a) proporcionar un replicón Agrobacterium que comprende un T-ADN, que contiene un replicón vírico flanqueado al repetir directamente sitios objetivo para una recombinasa específica de sitio; y b) infectar una célula de una planta con un Agrobacterium que lleva dicho replicón Agrobacterium bajo condiciones que permiten la transferencia de dicho T-ADN y la expresión de dicha recombinasa específica de sitio en dicha célula; en donde dicha célula, dicho T-ADN, o dicho replicón vírico comprende una secuencia de nucleótido que codifica dicha recombinasa o un fragmento activo o una variante activa de la misma, y dicha secuencia de nucleótido se liga operablemente a un promotor que controla la expresión en dicha célula.
Description
Movilización de genomas víricos a partir de
T-ADN utilizando sistemas de recombinación
específicos de sitio.
La presente invención se relaciona con biología
molecular de plantas. Más específicamente, la invención se
relaciona con métodos y composiciones para incrementar la eficiencia
de escisión de replicón vírico de T-ADN que se
transfiere a una planta mediante agroinfección.
El Agrobacterium que cosecha un plásmido Ti o Ri
puede transferir eficientemente una porción de estos plásmidos, del
T-ADN, en células de planta en el sitio de una
herida. La transferencia del T-ADN en la célula de
planta se induce mediante compuestos de señal presentes en el sitio
de una herida de una planta y requiere secuencias de límite de
T-ADN en ambos extremos de T-ADN y
los productos de gen de virulencia que actúan trans (vir)
codificados por el plásmido Ti o Ri. El T-ADN
transferido luego se objetiva en el núcleo y se integra en el
genoma de la planta. Un tumor, agalla de corona, se forma en el
sitio de inoculación en la mayoría de las plantas
dicotiledóneas.
La formación de tumor resulta de la expresión de
Oncogenes T-ADN que codifican los factores de
crecimiento auxina y citoquinina que promueven la proliferación de
células de planta. Con el fin de que se expresen estos oncogenes,
el T-ADN primero se debe integrar en el genoma de la
planta. La formación de tumor se limita a las plantas
dicotiledóneas debido al TDNA, aunque se transfiere en las células
de monocotiledóneas, ya sea que no se integre normalmente en el
genoma de plantas monocotiledóneas o se integre y sea
silencioso.
Al insertar un genoma vírico en el
T-ADN, el Agrobacterium se puede utilizar para
mediar la infección vírica de las plantas. Luego de la
transferencia del T-ADN a las células de planta, se
requiere la escisión del genoma vírico del T-ADN
(movilización) para la infección vírica exitosa. Este método mediado
por Agrobacterium para introducir un virus en un anfitrión de
planta se conoce como agroinfección (para una revisión, ver
Grimsley, "Agroinfection" pp. 325-342, in
Methods in Molecular Biology, vol 44: Agrobacterium Protocols, ed.
Gartland y Davey, Humana Press, Inc., Totowa, NJ; y Grimsley (1990)
Physiol. Plant. 79:147-153). Luego de la entrada en
el núcleo de la célula de planta, un genoma vírico circular de
longitud unitaria que es capaz de iniciar infección sistémica se
moviliza desde el T-ADN. No se requiere la
integración del T-ADN en el genoma de la planta
para este evento. Dos mecanismos no exclusivos, liberación
replicativa y recombinación homóloga intramolecular, se han
propuesto para esta liberación de genomas víricos circulares o
intermedios de replicación de T-ADN. La liberación
replicativa de genomas víricos mediante el mecanismo de replicación
de círculo giratorio se ha demostrado para la movilización de
genomas geminivirus de T-ADN (Stenger et al.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:8029-8033).
También se ha demostrado la liberación de geminivirus por vía de
recombinación homóloga entre genomas repetidos en forma de pares
(Lazarowitz et al. (1989) EMBO J.
8:1023-1032).
La liberación mediante cualquiera de los
mecanismos anteriores requieren la presencia de pares de copias del
replicón vírico directamente repetidos en el T-ADN.
Un replicón vírico circular se puede cortar del
T-ADN mediante recombinación homóloga
intramolecular entre los genomas repetidos. Para liberación
replicativa, dos orígenes de secuencias de replicación pueden estar
presentes para iniciar y completar el proceso de replicación. Ambos
mecanismos de movilización son procesos bioquímicos complejos que se
pueden atenuar mediante un número de factores que a su vez afectan
la eficiencia de escisión vírica. Adicionalmente, los dímeros en
pares del ADN vírico son frecuentemente difíciles de construir y
son inestables en recombinación de células anfitrionas
proeficientes.
Se ha reportado la agroinfección en un número de
publicaciones como un método exitoso para inducir infecciones
víricas sistémicas en células de planta, que incluyen plantas
monocotiledóneas tal como maíz (Heath et al. (1997) Mol.
Plant-Microbe Interact. 10:221-227,
Grimsley et al. (1989) Mol. Gen. Genet.
217:309-316).
En muchos casos, particularmente cuando el ácido
nucleico vírico desnudo no es infeccioso, la agroinfección es solo
la forma de transformar una planta con ADN vírico clonado. Aún
cuando el ácido nucleico vírico desnudo es infeccioso, la
agroinfección se utiliza frecuentemente debido a que este es
relativamente eficiente y no requiere la producción de grandes
cantidades de plásmido o ADN vírico. La agroinfección se ha
utilizado para estudiar la replicación vírica y recombinación, en
la investigación de funciones de gen vírico, para la producción de
vectores víricos que se replican autónomamente, para la expresión
transitoria de genes insertados en el T-ADN, para
la integración de ADN en un genoma de planta, para la producción de
plantas resistentes a virus, para el estudio de elementos
transponibles y para la determinación de susceptibilidad específica
de tejido a la transferencia de T-ADN.
El desarrollo de vectores de gen de virus de
plantas para la expresión de genes externos en las plantas
proporciona un medio para proporcionar altos niveles de la
expresión de gen dentro de un corto tiempo. Los beneficios de ARN
transitorio basado en virus y replicones de ADN incluyen
construcción por ingeniería conveniente y rápida acoplada con
flexibilidad para la aplicación rápida en varias especies de planta.
De esta forma, los virus de replicación autónoma ofrecen numerosas
ventajas para uso como vehículos para la expresión transitoria de
genes externos, que incluyen sus altos niveles de características de
multiplicación y niveles concomitantes de expresión transitoria del
gen. De acuerdo con lo anterior, sería benéfico proporcionar métodos
que faciliten la construcción de vectores para agroinfección,
proporcionar flexibilidad en vectores víricos diseñados para
transformación genética de células de planta e incrementar la
eficiencia de movilización de replicones víricos a partir de
T-ADN y el número de copia de una secuencia de ADN
de interés asociada con el replicón vírico.
La presente invención cumple estos objetivos al
proporcionar métodos y composiciones para la movilización de
replicón vírico de T-ADN por vía de sistemas de
recombinación específicos de sitio. La escisión mediada por
recombinación específica de sitio de fragmentos de ADN de moléculas
de ADN cromosómicas o extracromosómicas se ha descrito para un
número de sistemas de recombinación específicos de sitio y especies
de planta. Ver Russell et al. (1992) Mol. Gen. Genet.
234:49-59; Lyznik et al. (1996) Nucleic Acids
Res. 24: 3784-3789; y Dale et al. (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10558-10562. Sin embargo,
la movilización de vectores víricos a partir de
T-ADN por vía de recombinación específica de sitio
no se ha aplicado previamente para la transformación
agromediada.
La invención se relaciona con métodos y
composiciones para la movilización mediada por recombinasa
específica de sitio de replicones víricos y los ADN asociados de
interés de T-ADN. Los métodos de la invención
comprenden transferencia mediada por Agrobacterium de
T-ADN a una célula de planta, en donde el
T-ADN contiene un replicón vírico flanqueado al
repetir directamente sitios objetivo para una recombinasa específica
de sitio y opcionalmente un ADN de interés ligado al replicón
vírico. El ADN de interés también puede contener un sitio objetivo
no idéntico para la recombinasa. Un casete de expresión para la
recombinasa específica de sitio está presente en el
T-ADN o el genoma de planta, o se introduce
transitoriamente en la célula de planta. La expresión de la
recombinasa específica de sitio en las células de planta resulta en
escisión del replicón vírico y el ADN asociado de interés. El
replicón vírico y el ADN de interés luego se replican para el alto
número de copias en la célula de planta anfitriona.
Los composiciones de la invención comprenden
ácidos nucleicos, tal como T-ADN que contienen un
ADN vírico flanqueado al repetir directamente sitios objetivo para
una recombinasa específica de sitio. Los ácidos nucleicos de la
invención pueden contener adicionalmente los casetes de expresión
que codifican la recombinasa específica de sitio cognato para los
sitios objetivo que flanquean el genoma vírico. Las composiciones de
la invención comprenden adicionalmente Agrobacterium que contiene
los ácidos nucleicos de la invención.
Las composiciones y métodos de la invención
tienen uso en proporcionar altos números de copias de un ADN de
interés para la expresión transitoria o para la integración en un
cromosoma de planta, en simplificar la construcción y mantenimiento
estable de vectores para la transformación agromediada de las
plantas y en incrementar la eficiencia de agroinfección.
La Figura 1 ilustra esquemáticamente un modelo
de movilización de un replicón vírico de T-ADN
mediante recombinación específica de sitio loxP/Cre.
La Figura 2 ilustra esquemáticamente escisión
específica de sitio mediada por Cre de un ADN vírico y ADN de
interés de un T-ADN.
La Figura 3 ilustra esquemáticamente la
integración de ADN en un cromosoma mediante recombinación doble
específica de sitio.
La Figura 4 muestra las secuencias 5' a 3' de
los sitios loxP y FRT.
La Figura 5 ilustra esquemáticamente un
protocolo PCR para la construcción de un ADN vírico flanqueado
mediante sitios objetivo loxP y sitios de restricción XhoI.
La invención se dirige a métodos y composiciones
para la movilización de ADN vírico de T-ADN. En los
métodos de la invención, un replicón vírico flanqueado al repetir
directamente sitios objetivo para una recombinasa específica de
sitio se inserta dentro de un T-ADN llevado por un
replicón Agrobacterium. El T-ADN se transfiere en
la célula de una planta mediante transferencia agromediada. La
expresión de la recombinasa específica de sitio en la célula de
planta infectada resultará en escisión de un replicón vírico
circular del T-ADN transferido (Figura 1). La
replicación de este replicón vírico resultará en un alto número de
copias del replicón. La infección sistémica de la planta puede
tener lugar si el replicón codifica partículas víricas infecciosas.
De acuerdo con lo anterior, los métodos de la invención tienen uso
en la producción de ADN vírico y/o en promover la infección vírica
sistémica de una planta.
Así, la invención se dirige al método para
movilizar un replicón vírico de un T-ADN, que
comprende:
- a)
- proporcionar un replicón Agrobacterium que comprende un T-ADN, que contiene un replicón vírico flanqueado al repetir directamente sitios objetivo para una primera recombinasa específica de sitio; y
\newpage
- b)
- infectar una célula de una planta con un Agrobacterium que lleva dicho replicón Agrobacterium bajo condiciones que permiten la transferencia de dicho T-ADN y la expresión de dicha primera recombinasa en dicha célula;
en donde dicha célula, dicho
T-ADN, o dicho replicón vírico comprende una
secuencia de nucleótido que codifica dicha primera recombinasa o un
fragmento activo o una variante activa de la misma, y dicha
secuencia de nucleótido se liga operablemente a un promotor que
controla la expresión en dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona un
T-ADN que contiene un replicón vírico flanqueado al
repetir directamente sitios objetivo para una primera recombinasa
específica de sitio.
La invención también proporciona un replicón
Agrobacterium que contiene dicho T-ADN.
La invención también proporciona un
Agrobacterium que contiene dicho T-ADN.
La invención también proporciona una célula de
planta que tiene una construcción de ADN que comprende en una
orientación 5' a 3' o a 3' a 5'un primer sitio objetivo para una
recombinasa específica de sitio, un replicón vírico, y un segundo
sitio objetivo para dicha recombinasa específica de sitio, en donde
dicho primer y dicho segundo sitio objetivo se repiten directamente
y son idénticos con respecto uno del otro.
La invención también proporciona una planta que
comprende tal una célula de planta.
La invención también proporciona una semilla
transformada que comprende tal una célula de planta. Si un ADN de
interés se ha insertado en el replicón vírico, o entre el replicón
vírico y un sitio objetivo para una recombinasa específica de sitio,
el ADN de interés también se replicará en alta copia. El alto
número de copias del ADN de interés incrementa la eficiencia de
integración de este ADN en el genoma, o el nivel de expresión
transitoria de un gene codificado por el ADN de interés. Así, en
otro aspecto, la invención proporciona un método para proporcionar a
una célula de planta una pluralidad de copias de una secuencia de
ADN de interés, que comprende:
- a)
- proporcionar un replicón Agrobacterium que tiene un T-ADN, en donde dicho T-ADN contiene en una orientación 5' a 3' o 3' a 5', un primer sitio objetivo para una recombinasa específica de sitio, un replicón vírico, dicha secuencia de ADN de interés, y un segundo sitio objetivo para dicha recombinasa en repetición directa con dicho primer sitio objetivo, en donde dicho primer y segundo sitios objetivo son idénticos; y
- b)
- infectar una célula de una planta con un Agrobacterium que lleva dicho replicón Agrobacterium bajo condiciones que permiten la transferencia de dicho T-ADN y la expresión de dicha recombinasa en dicha célula;
en donde dicha célula, dicho
T-ADN, o dicho replicón vírico contiene una
secuencia de nucleótido que codifica dicha recombinasa o un
fragmento activo o variante de la misma, y dicha secuencia de
nucleótido se liga operablemente a un promotor que controla la
expresión en dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos de la invención son útiles para
proporcionar un alto número de copias de un ADN de interés para la
integración específica de sitio en un cromosoma de planta. En este
caso, el cromosoma de planta contendrá uno o más sitios objetivo
para una recombinasa específica de sitio. Dependiendo de los
sustratos, el evento de recombinación puede consistir de un evento
único o doble cruzado. En el caso más simple, el cromosoma de
planta y el replicón vírico cortado cada uno contiene un único sitio
objetivo. La recombinación específica de sitio entre estos dos
sitios objetivo resulta en la inserción del replicón vírico y
cualquiera asociado al ADN de interés en el cromosoma de
planta.
planta.
La inclusión de un sitio objetivo no idéntico
entre el replicón vírico y el ADN de interés permite la integración
del ADN de interés en un genoma de planta que tiene un sitio
objetivo correspondiente, sin inserción concomitante del replicón
vírico. En este método, los extremos distales del replicón vírico y
el ADN de interés se flanquean mediante sitios objetivo idénticos.
La recombinación entre sitios objetivo idénticos resulta en escisión
de un replicón vírico circular que contiene el ADN de interés
flanqueado mediante sitios objetivo no idénticos para la
recombinasa (Figura 2). Para la inserción objetivo del ADN de
interés, los mismos dos sitios objetivo no idénticos están
presentes en el genoma de organismos objetivo, estableciendo por lo
tanto un sitio objetivo para la inserción del ADN de interés. Un
evento cruzado doble resulta de la recombinación específica de sitio
entre los sitios objetivo idénticos en el genoma anfitrión y el ADN
de interés resulta en la inserción del ADN de interés en el
cromosoma del organismo objetivo, libre del replicón vírico (Figura
3).
Así, en un aspecto adicional, la invención
proporciona un método para proporcionar a una célula de planta una
pluralidad de copias de una secuencia de ADN de interés flanqueado
mediante sitios objetivo no idénticos para una recombinasa
específica de sitio, que comprende:
- a)
- proporcionar un replicón Agrobacterium que tiene un T-ADN, en donde dicho T-ADN contiene en una orientación 5' a 3' o 3' a 5', un primer sitio objetivo para dicha recombinasa, un replicón vírico, un segundo sitio objetivo para dicha recombinasa, dicha secuencia de ADN de interés, y un tercer sitio objetivo para dicha recombinasa, en donde dicho primer y tercer sitios objetivo se repiten directamente y son idénticos con respecto uno del otro, y dicho segundo sitio objetivo no es idéntico en dicho primer y tercer sitios objetivo; y
- b)
- infectar una célula de una planta con un Agrobacterium que lleva dicho replicón Agrobacterium bajo condiciones que permiten la transferencia de dicho T-ADN y la expresión de dicha recombinasa en dicha célula; en donde dicha célula, dicho T-ADN, o dicho replicón vírico contiene una secuencia de nucleótido que codifica dicho o un fragmento activo o variante de la misma, y dicha secuencia de nucleótido se liga operablemente a un promotor que controla la expresión en dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Las composiciones de la invención comprenden
T-ADN que contiene un replicón vírico flanqueado al
repetir directamente sitios objetivo para una recombinasa
específica de sitio. En otro aspecto, las composiciones de la
invención comprenden un T-ADN que contiene en una
orientación 5' a 3' o 3' a 5', un primer sitio objetivo para dicha
recombinasa, un replicón vírico, un segundo sitio objetivo para
dicha recombinasa, dicha secuencia de ADN de interés, y un tercer
sitio objetivo para dicha recombinasa, en donde dicho primer y
tercer sitios objetivo se repiten directamente y son idénticos con
respecto uno del otro, y dicho segundo sitio objetivo no es idéntico
en dicho primer y tercer sitios objetivo. Los T-ADN
de la invención pueden comprender adicionalmente la secuencia de
nucleótido que codifica una recombinasa específica de sitio, en
donde la secuencia de nucleótido se liga operablemente a un
promotor que controla la expresión en una célula de planta. Las
composiciones de la invención comprenden adicionalmente replicones
que contienen estos T-ADN y Agrobacterium que
contiene estos replicones.
"Movilización de un replicón vírico"
significa escisión de un replicón vírico de una secuencia de
T-ADN después que este se ha transformado en una
célula de planta. En los métodos de la invención, se logra la
movilización de ADN vírico mediante recombinación específica de
sitio conservadora entre sitios objetivo directamente repetidos que
flanquean el ADN vírico. En una realización, el producto resultantes
es un ADN vírico circularizado que contiene una copia del sitio
objetivo (ver Figura 1).
"Replicón vírico" significa ADN bicatenario
de un virus que tiene un genoma de ADN bicatenario o intermedio de
replicación. El ADN vírico cortado es capaz de actuar como un
replicón o intermedio de replicación, independientemente, o con
factores suministrados en trans. El ADN vírico puede o no puede
codificar partículas víricas infecciosas y adicionalmente puede
contener inserciones, eliminaciones, sustituciones, redisposiciones
u otras modificaciones. El ADN vírico puede contener ADN
heterólogo. En este caso, el ADN heterólogo se refiere a cualquier
ADN no vírico o ADN de un virus diferente. Por ejemplo, el ADN
heterólogo puede comprender un casete de expresión para una proteína
o ARN de interés.
Los replicones víricos adecuados para uso en los
métodos y composiciones de la invención incluyen aquellos de virus
que tienen un genoma de ADN circular o intermedio de replicación,
tal como: virus mosaico Abuitilon (AbMV), virus mosaico African
cassava (ACMV), virus del rayado del banano (BSV), virus mosaico
enano del fríjol (BDMV), virus mosaico dorado del fríjol (BGMV),
virus de encrespamiento apical de la remolacha (BCTV), virus de
amarillez occidental de la remolacha (BWYV) y otros luteovirus,
virus latente cassava (CLV), virus de clavel grabado (CERV), virus
mosaico del coliflor (CaMV), virus mosaico severo del caupi (CSMV),
virus moteado amarillo de commelina (CoYMV), virus mosaico del
pepino (CMV), virus mosaico dahlia (DaMV), virus de las estrías de
digitaria (DSV), virus mosaico del pasto setaria (FMV), virus del
hérpes (HSV), virus del rayado del maíz (MSV), virus mosaico
mirabilias (MMV), virus del rayado miscanasí (MiSV), virus de de
malformación del tubérculo de papa (PSTV), virus del enanismo del
cacahuete (PSV), virus mosaico amarillo de la papa (PYMV), virus
baciliforme del tungro del arroz (RTBV), virus de moteado clorótico
de la soya (SoyCMV), virus jaspeado de la hoja de tabaco (SqLCV),
virus del bandeado de hojas de la fresa (SVBV), virus del rayado de
la caña de azúcar (SSV), cardo virus del moteado (ThMV), virus
mosaico del tabaco (TMV), virus mosaico dorado del tomate (TMGV),
virus moteado del tomate (TMoV), virus del mosaico anular del
tabaco (TobRV), virus de enanismo amarillo del tabaco (TobYDV),
virus de la hoja enroscada del tomate (TLCV), virus de la hoja
enroscada amarilla del tomate (TYLCV), virus de la hoja enroscada
amarilla del tomate Tailandés (TYLCV-t) y virus del
trigo enano de la india (WDV) y derivados de los mismos.
Preferiblemente el replicón vírico es de MSV, WDV, TGMV o TMV.
"T-ADN" significa el
T-ADN de un plásmido Ti Agrobacterium
tumefaciens o de un plásmido Ri Agrobacterium rhizogenes,
o un derivado de los mismos. El T-ADN puede
comprender un T-ADN completo, pero solo necesita
comprender las secuencias mínimas requeridas en cis para
transferencia (es decir, las secuencias límite izquierda y derecha
de T-ADN). Los T-ADN de la invención
se han insertado en ellos, donde sea entre las secuencias de límite
derecho e izquierdo, un ADN vírico flanqueado por sitios objetivo
para una recombinasa específica de sitio. El T-ADN
puede contener eliminaciones, sustituciones y/o inserciones
adicionales de ADN diferentes al genoma vírico y los sitios
objetivo. Preferiblemente el T-ADN contiene un
casete de expresión para la recombinasa cognato de los sitios
objetivo que flanquea el ADN vírico. Las secuencias que codifican
los factores requeridos en trans para la transferencia del
T-ADN en una célula de planta, tal como genes vir,
se pueden insertar en el T-ADN, o pueden estar
presentes en el mismo replicón como el T-ADN, o en
trans en un replicón compatible en el anfitrión Agrobacterium.
Preferiblemente los factores de acción trans requeridos para la
transferencia de T-ADN están presentes en el mismo
replicón como el T-ADN.
"Replicón Agrobacterium" significa
cualquier replicón (por ejemplo, plásmido u otro vector) que es
capaz de ser mantenido establemente en un anfitrión Agrobacterium.
Tales replicones incluyen el cromosoma Agrobacterium, plásmidos
Agrobacterium, cósmidos, fagémidos, etc., derivados de los mismos, y
cualquier otro vector capaz de replicación estable en
Agrobacterium. Por ejemplo, un vector binario adecuado para
transferencia mediada por Agrobacterium y para manipulación fáciles
recombinantes y replicación en otros organismos es útil en los
métodos y composiciones de la invención. Preferiblemente el replicón
es un plásmido Ti o Ri o un derivado del mismo.
En las composiciones y métodos de la invención,
el replicón vírico es flanqueado al repetir directamente sitios
objetivo para una recombinasa específica de sitio. "Flanqueado
por" significa que los sitios objetivo pueden ser directamente
contiguos con el ADN vírico o pueden ser una o más secuencias
intervinientes presentes entre uno o ambos extremos del ADN vírico
y los sitios objetivo. Las secuencias intervinientes de interés
particular incluirían ligadores, adaptadores, marcadores
seleccionables y/o otros sitios que ayudan en la construcción del
vector o análisis y el casete de expresión para un gene de interés.
Los sitios objetivo para recombinasas específicas de sitio se
conocen por aquellos expertos en la técnica. Ejemplos de sitios
objetivo incluyen, pero no se limitan a FRT, FRT1, FRT5, FRT6,
FRT7, otros mutantes FRT, loxP, mutantes loxP, y similares. Los
sitios loxP y FRT se muestran en la Figura 4.
"Directamente repetido" significa que los
sitios objetivo que flanquean el ADN vírico se disponen en la misma
orientación, ya que la recombinación entre estos sitios resulta en
escisión, que en inversión, del ADN vírico.
"Recombinasa específica de sitio" significa
cualquier enzima capaz de ser expresada funcionalmente en plantas,
que cataliza la recombinación específica conservadora de sitio entre
sus sitios objetivo correspondientes. Para revisiones de
recombinasas específicas de sitio, ver Sauer (1994) Current Opinion
in Biotechnology 5:521-527; Sadowski (1993) FASEB
7:760-767; cuyos contenidos se incorporan aquí como
referencia. Los métodos para utilizar sistemas de recombinación
específicos de sitio para cortar fragmentos de ADN de ADN de planta
cromosómica o extracromosómica se conocen por aquellos expertos en
la técnica. El bacteriófago P1 loxP-Cre y el
plásmido Saccharomyces 2P FRT/FLP de sistemas de recombinación
específica de sitios se han estudiado extensivamente. Por ejemplo,
Russell et al. (1992, Mol. Gen. Genet.
234:49-59) describe recombinasas, ver Sauer (1994)
Current Opinion in Biotechnology 5: 521-527; y
Sadowski (1993) FASEB 7:760-767. Los métodos para
utilizar sistemas de recombinación específicos de sitio para cortar
fragmentos de ADN de ADN de planta cromosómica o extracromosómica
se conocen por aquellos en la técnica. El bacteriófago P1
loxP-Cre y el plásmido Saccharomyces 2P FRT/FLP de
sistemas de recombinación específica de sitios se han estudiado
extensivamente. Por ejemplo, Russell et al. (1992, Mol, Gen.
Genet. 234:49-59) describe la escisión de marcadores
seleccionables de genomas de tabaco y Arabidopsis utilizando el
sistema de recombinación específica de sitio
loxP-Cre.
Se reconoce adicionalmente que la recombinasa,
que se utiliza en la invención, dependerá de los sitios objetivo
del organismo transformado y el casete objetivo. Que es, si se
utilizan sitios FRT, se necesitará la recombinasa FLP. En la misma
forma, donde se utilizan sitios lox, se requiere la recombinasa Cre.
Si los sitios objetivo no idénticos comprenden un sitio FRT y un
sitio lox, la recombinasa FLP y Cre o una recombinasa quimérica que
tiene las funciones Cre y FLP se requerirá en las células de
planta.
Los métodos de la invención comprenden la
introducción de T-ADN a una célula de planta, en
donde el T-ADN contiene un replicón vírico
flanqueado al repetir directamente sitios objetivo para una
recombinasa específica de sitio y opcionalmente un ADN de interés
ligado al replicón vírico. El ADN de interés también puede contener
un sitio objetivo no idéntico para la recombinasa. Un casete de
expresión para la recombinasa específica de sitio está presente en
el T-ADN o el genoma de planta, o se introduce
transitoriamente en la célula de planta. La expresión de la
recombinasa específica de sitio en las células de planta resulta en
escisión del replicón vírico y el ADN asociado de interés. El
replicón vírico y ADN de interés luego se replican para el alto
número de copias en la célula de planta anfitriona.
Las composiciones de la invención comprenden
ácidos nucleicos, tal como T-ADN que contienen un
ADN vírico flanqueado al repetir directamente sitios objetivo para
una recombinasa específica de sitio. La recombinasa específica de
sitio puede ser una recombinasa de ocurrencia natural o un derivado
de fragmento activo de la misma. Las recombinasas específicas de
sitio útiles en los métodos y composiciones de la invención,
incluyen recombinasas de las familias integrasa y resolvasa,
derivados de las mismas, y cualquier otra enzima producida
recombinantemente o de ocurrencia natural o derivado de la misma,
que cataliza la recombinación específica conservadora de sitio
entre los sitios de ADN específicos. La familia integrasa de
recombinasas tiene cerca de treinta miembros e incluye FLP, Cre,
Int y R. La familia resolvasa incluye resolvasa \gamma\delta.
Las enzimas recombinantes que catalizan la recombinación
conservadora específica de sitio incluyen moFLP.
Preferiblemente, la recombinasa es una que no
requiere cofactores o un sustrato superenrollado. Tales recombinasas
incluyen Cre, FLP y moflp.
El moflp se deriva de la recombinasa FLP de
plásmido Saccharomyces 2P, pero se codifica por una secuencia de
ácido nucleico utilizando codones que prefieren maíz. Aunque la
secuencia de ácido nucleico moflp incluye los codones preferidos
para la expresión de aminoácidos en maíz, se entiende que una
secuencia útil puede contener codones que ocurren en maíz con menos
de las frecuencias de codón de maíz altamente reportadas.
Las recombinasas específicas de sitio y
secuencias que los codifican que se utilizan en los métodos y
composiciones de la invención pueden ser variantes de recombinasas
de ocurrencia natural y los genes que las codifican. El término
"variantes conservadoramente modificadas" aplica a secuencias
de aminoácido y ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de
ácido nucleico particulares, las variantes modificadas
conservadoramente se refiere a aquellos ácidos nucleicos que
codifican variantes idénticas o conservadoramente modificadas de las
secuencias de aminoácido. Debido a la degeneración del código
genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente
idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los
codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina.
Así, en cualquier posición donde una alanina GCU codifica el
aminoácido alanina. Así, en cualquier posición donde una alanina se
especifica mediante un codón, el codón se puede alterar en
cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el
polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son
"variaciones silenciosas" y representan una especie de
variación conservadoramente modificada. Una persona medianamente
experta reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG,
que es ordinariamente solo el codón para metionina) se puede
modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica.
Como para las secuencias de aminoácido, un
experto reconocerá que las sustituciones individuales, eliminaciones
o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o la
secuencia de proteína que altera, agrega o elimina un aminoácido
único o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia
codificada es una "variante conservadoramente modificada"
donde la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con
un aminoácido químicamente similar. Así, se puede alterar cualquier
número de residuos de aminoácido seleccionado del grupo que consiste
de enteros que consisten de 1 a 15. Así, por ejemplo, se pueden
hacer 1, 2, 3, 4, 5, 7, o 10 alteraciones. Las variantes
conservadoramente modificadas proporcionan típicamente actividad
biológica similar como la secuencia de polipéptido no modificada de
la cual ellos se derivan. Por ejemplo, especificidad de sustrato,
actividad de enzima, o unión de ligando/receptor es generalmente
por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de la proteína
nativa para su sustrato nativo. Son bien conocidas en la técnica
tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos
funcionalmente similares.
Los siguientes seis grupos cada uno contienen
aminoácidos que son sustituciones conservadoras para cada uno:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M),
Valina (V); y
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofán
(W).
Ver Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and
Company.
Cuando el ácido nucleico se prepara o se altera
sintéticamente, se puede tener ventaja de preferencias de codón
conocidas del anfitrión destinado donde el ácido nucleico se
expresa. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la
presente invención se pueden expresar en especies de plantas
monocotiledóneas y dicotiledóneas, las secuencias se pueden
modificar para contar las preferencias de codón específicas y las
preferencias del contenido de GC de monocotiledóneas o
dicotiledóneas como estas preferencias se han mostrado por diferir
(Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res.
17:477-498; y Campbell et al. (1990) Plant
Physiol. 92:1). Así, el codón preferido de maíz para un aminoácido
particular se puede derivar de secuencias de gen conocidas del maíz.
El codón de maíz utilizado para 28 genes de plantas de maíz se
lista en la Tabla 4 de Murray et al., supra.
El gen de recombinasa FLP de levadura
(Saccharomyces cerevisiae) está disponible comercialmente en
plásmido pOG44 de Stratagene Cloning Systems (11011 North Torrey
Pines Road, La Jolla, CA 92037). De forma similar, las secuencias
de muchos otras recombinasas específicas de sitio y sus sitios
objetivo cognato están disponibles comercialmente o
públicamente.
Los genes que codifican una recombinasa
específica de sitio, ADN vírico, T-ADN y sitios
objetivo se pueden hacer utilizando (a) métodos recombinantes
estándar, (b) técnicas sintéticas, o combinaciones de las mismas.
El uso de los vectores de clonación, los vectores de expresión,
adaptadores, y ligadores es bien conocido en la técnica y se puede
encontrar en tales referencias como Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring
Harbor, New York, 1989). Una variedad de estrategias están
disponibles para ligar fragmentos de ADN, la elección que depende
de la naturaleza del terminal de los fragmentos de ADN y cuyas
elecciones se pueden hacer fácilmente por aquellos expertos en la
técnica. Para una descripción de varios ácidos nucleicos ver, por
ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catálogos 1995, 1996, 1997 (La
Jolla, CA); y, Amersham Life Sciences, Inc, Catálogo = 97
(Arlington Heights, IL). Se pueden obtener genes que codifican FLP,
por ejemplo, al sintetizar genes con oligonucléotidos largos
mutuamente cebados. Ver, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.),
Current Protocols In Molecular Biology, páginas 8.2.8 a 8.2.13,
Wiley Interscience (1990). También, ver Wosniak et al.
(1987) Gene 60:115. Más aún, las técnicas actuales utilizando la
reacción de cadena polimerasa proporcionan la capacidad para
sintetizar genes tan grandes como 1.8 kilobases en longitud (Adang
et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21:1131; Bombat et al.
(1993) PCR Methods and Applications 2: 266).
A diferencia del uso de recombinasas de longitud
completa, los fragmentos funcionales de recombinasas específicas de
sitio se pueden utilizar en los métodos y composiciones de la
invención. Los fragmentos funcionales de recombinasas específicas
de sitio se pueden identificar utilizando una variedad de técnicas
tal como análisis de restricción, análisis Southern, análisis de
extensión cebador, y análisis de secuencia de ADN. El análisis de
extensión cebadora o análisis de protección de nucleasa S1, por
ejemplo, se puede utilizar para localizar el sitio de inicio
putativo de transcripción del gen clonado. Ausubel en las páginas
4.8.1 a 4.8.5; Walmsley et al., Quantitative and Qualitative
Analysis of Exogenous Gene Expression by the S1 Nuclease Protection
Assay, in Methods In Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and
Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 271-281
(Humana Press, Inc. 1991). Por ejemplo, los fragmentos funcionales
de la proteína FLP se pueden identificar por su capacidad, luego de
introducción a células que contienen sustratos FRT apropiados, para
catalizar la recombinación específica de sitio (por ejemplo,
escisión de una secuencia flanqueada FRT que luego de la remoción
activará un gen marcador que se puede ensayar.
El alcance general de tal análisis funcional
involucra fragmentos de subclonación de ADN de un clon genómico,
clon de cADN o secuencia de gen sintetizada en un vector de
expresión, que introduce el vector de expresión en un anfitrión
heterólogo, y que detecta para detectar el producto de recombinación
(es decir utilizando análisis de restricción para verificar el
producto de recombinación en el nivel de ácido nucleico, o que se
basa en un sistema de ensayo para recombinación como se describió
anteriormente). Son bien conocidos los métodos para generar
fragmentos de un CADN o clon genómico. Las variantes de un ADN
aislado que codifica una recombinasa específica de sitio se puede
producir al eliminar, agregar y/o sustituir nucleótidos. Tales
variantes se pueden obtener, por ejemplo, mediante mutagenia
dirigida a oligonucleótido, mutagenia de exploración de ligador,
mutagenia utilizando la reacción de cadena polimerasa, y similares.
Ver, por ejemplo, Ausubel, páginas 8.0.3-8.5.9.
También, ver generalmente, McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A
Practical approach, (IRL Press, 1991).
La secuencia de ácido nucleico que codifica la
recombinasa específica de sitio se liga operablemente a un promotor
que controla la expresión en una planta. Como se utiliza aquí
"ligado operablemente" incluye referencia a un ligado
funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la
secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia
de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Generalmente, ligado
operablemente significa que las secuencias de ácido nucleico que se
ligan son contiguas y, donde sea necesario para unir dos regiones
que codifican la proteína, contiguas y en el mismo marco de
lectura.
Como se utiliza aquí "promotor" incluye
referencia a una región de ADN en la dirección 5' del inicio de
transcripción y se involucra en el reconocimiento y la unión de
polimerasa de ARN y otras proteínas para iniciar transcripción. Un
"promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la
transcripción en células de planta. Promotores de planta de ejemplo
incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se obtienen de plantas,
virus de planta, y genes de bacterias que se expresan en células de
planta tal como aquellas de Agrobacterium o Rhizobium. Los
promotores heterólogos y no heterólogos (es decir, endógenos) se
pueden emplear para dirigir la expresión de una secuencia que
codifica una recombinasa específica de sitio. El promotor puede ser
constitutivo, inducible o específico de tejido.
Muchos diferentes promotores constitutivos se
pueden utilizar en la actual invención. Promotores constitutivos de
ejemplo incluyen lo promotores de virus de planta tal como el
promotor 35S de CaMV (Odell et al. (1985) Nature
313:810-812) y los promotores de tal gen como actina
de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell
2:163-171); ubiquitina (Christensen et al.
(1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen
et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689);
pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet.
81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO
J. 3:2723-2730); histona H3 de maíz H3 (Lepetit
et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276-285 y
Atanassova et al. (1992) Plant Journal
2(3):291-300); el promotor 1'- o
2'-derivado de T-ADN de
Agrobacterium tumefaciens, el promotor ubiquitina 1, el promotor
Smas, el promotor deshidrogenada de alcohol cinnamilo (Patente
Estadounidense No. 5,683,439), el promotor Nos, el promotor Pemu,
el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, y otras
regiones de inicio de transcripción de varios genes de planta
conocidas por aquellos expertos. El promotor ALS, un fragmento
XbaI/NcoI de cebador 5 en el gen estructural Brassica napus ALS3 (o
una secuencia de nucleótido que tienen similitud de secuencia
sustancial en dicho fragmento XbaI/NcoI), representa un promotor
constitutivo particularmente útil para dicotiledóneas. (Ver
Solicitud de Patente Estadounidense Internacional Pioneer
Hi-Bred copendiente 08/409,297 (Patente
Estadounidense No. 5,659,026, presentada en Agosto 19 1997).
Una variedad de promotores inducibles se puede
utilizar en la actual invención. Ver Ward et al. (1993) Plant
Mol. Biol. 22:361-366. Los promotores inducibles de
ejemplo incluyen que del sistema ACE1 que responde al cobre (Mett
et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); el gen In2
del maíz que responde a aseguradores herbicidas bencenosulfonamida
(Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:
229-237 y Gatz et al. (1994) Mol. Gen.
Genetics 243: 32-38); el promotor Adh1 que es
inducible por hipoxia o tensión de frío, el promotor Hsp70 que es
inducible por tensión de calor, y el promotor PPDK que es inducible
por luz; o represor Tet de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen.
Genet. 227:229-237. Un promotor inducible
particularmente preferido es un promotor que responde a un agente
que induce a que las plantas no respondan normalmente. Un promotor
inducible de ejemplo es el promotor inducible de la actividad
transcripcional de un gen de hormona esteroide del que se induce
mediante una hormona glucocorticosteroide (Schena et al.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421).
Ejemplos de promotores bajo control de
desarrollo incluyen promotores que inician transcripción solo, o
preferencialmente, en ciertos tejidos, tal como hojas, raíces,
frutos, semillas, o flores. La operación de un promotor también
puede variar dependiendo de su ubicación en el genoma. Así, un
promotor inducible puede llegar a ser completamente o parcialmente
constitutivo en ciertas ubicaciones.
La recombinasa específica de sitio se puede
expresar en las células de planta con el fin de movilización del
ADN vírico del T-ADN. De acuerdo con lo anterior, la
proteína recombinasa se puede expresar ya que esta está presente en
la célula en una concentración efectiva algunas veces cuando el
T-ADN se transfiere a las células de planta y antes
del T-ADN no integrado se pierde de las células de
planta.
De acuerdo con lo anterior, el casete de
expresión que codifica la recombinasa específica de sitio se puede
suministrar en el TADN en cis al ADN vírico; en trans en un
cromosoma de planta o replicón extracromosómico; o se puede
transferir a la planta cerca al tiempo de transformación
agromediada. El gen recombinasa específica de sitio se puede
expresar constitutivamente o transitoriamente, o puede ser
inducible. Si se requieren cofactores para un sistema de
recombinación específica de sitio particular, ellos se pueden
codificar en el TADN de la invención o en el ADN cromosómico o
extracromosómico de anfitrión de planta.
"Sitio objetivo para una recombinasa
específica de sitio" significa una secuencia de ADN que se
reconoce por una recombinasa específica de sitio particular. Una
variedad de sitios objetivo se conocen por aquellos expertos en la
técnica y se pueden utilizar en los métodos y composiciones de la
invención. El sitio puede tener la secuencia del sitio cognato para
una recombinasa dada, o se puede modificar, mientras este es capaz
de actuar como un sitio objetivo. El sitio puede contener las
secuencias mínimas necesarias para recombinación, o este puede
contener secuencias adicionales que mejoran la recombinación.
Ejemplos de sitios objetivo para uso en la invención se conocen en
la técnica e incluyen FRT y sitios loxP (Ver, por ejemplo, Schlake y
Bode (1994) Biochemistry 33: 12746-12751; Huang
et al. (1991) Nucleic Acids Research
19:443-448; Paul D. Sadowski (1995) In Progress in
Nucleic Acid Research and Molecular Biology vol. 51, pp.
53-91; Michael M. Cox (1989) In Mobile ADN, Berg y
Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D.C., pp.
116- 670; Dixon et al. (1995) 18: 449-458;
Umlauf and Cox (1988) The EMBO Journal 7: 1845-1852;
Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research
24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends
Genet. 9:413-421: Rossant and Geagy (1995) Nat. Med.
1: 592-594; Lox Albert et al. (1995) The
Plant J. 7:649-659: Bayley et al. (1992)
Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al.
(1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; y Dale y Ow
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10558-105620;
Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol.
Biol. 32: 901-913; Hartley et al. (1980)
Nature 286: 860-864; Sauer (1994) Current Opinion in
Biotechnology 5:521-527; y Dale et al.
(1990) Gene 91:79-85).
Cada sitio loxP y FRT contiene 13 pares base que
invierte repeticiones que flanquean el espaciador de 8 pares base.
El sitio FRT contiene una repetición de 13 pares base no esencial
adicional. Las secuencias de los sitios loxP y FRT se muestran en
la Figura 1. Un sitio FRT mínimo que comprende dos repeticiones de
13 pares base, separado por un espaciador de 8 bases, es:
- 5'-GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]
- GTATAGGAACTTC3'
en donde los nucleótidos dentro de los
paréntesis indican la región espaciadora. Los nucleótidos en la
región espaciadora se pueden reemplazar con una combinación de
nucleótidos, mientras las dos repeticiones de
13-bases se separadan por ocho nucleótidos. El FLP
es una recombinasa específica de sitio, conservadora, capaz de
catalizar la inversión de una secuencia de ácido nucleico
posicionada entre dos FRT orientados inversamente; la recombinación
entre dos moléculas cada una que contiene un sitio FRT; y escisión
entre los sitios FRT. La región de núcleo no es simétrica, y dicta
asimétricamente la direccionalidad de la reacción. La recombinación
entre los sitios FRT invertidos origina la inversión de una
secuencia de ADN entre ellos, aunque la recombinación entre los
sitios directamente orientados conduce a escisión del ADN entre
ellos.
Los T-ADN que contienen ADN
vírico flanqueado mediante sitios de recombinación, los casetes de
expresión para recombinasas específicas de sitio y los vectores que
llevan estas secuencias se pueden construir utilizando técnicas de
biología molecular estándar. Ver, por ejemplo, Sambrook et
al. (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda
Edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor,
NY 1989).
Los vectores típicos útiles en los métodos y
composiciones de la invención son bien conocidos en la técnica e
incluyen vectores derivados del plásmido que induce tumor (Ti) de
Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers et al, (1987)
Meth. in Enzymol., 153:253-277. Estos vectores son
vectores que integran plantas en que en transformación, los
vectores integran una porción del vector ADN en el genoma de la
planta anfitriona. Los vectores A. tumefaciens de ejemplo útiles
aquí son plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl et al., Gene,
61:1-11 (1987) y Berger et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 86:8402-8406 (1989). Otro vector
útil aquí es el plásmido pBI101.2 que está disponible de Clontech
Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA).
Las técnicas para transformar una amplia
variedad de especies mayores de planta son bien conocidas y se
describen en la literatura técnica, científica y de patente. Ver,
por ejemplo, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:
421-477 (1988). Estos métodos son útiles para
transformar una célula de planta con un casete de expresión de
recombinasa específica de sitio. Esta etapa será necesaria si el
casete no se incluye en el T-ADN transferido. El
casete de expresión que codifica la recombinasa específica de sitio
puede estar presente en el genoma de planta antes de Agroinfección
o se puede transformar en la planta alrededor del tiempo de la
transferencia del T-ADN a las células de planta ya
que este se expresará transitoriamente. Por ejemplo, la construcción
de ADN se puede introducir directamente en el ADN genómico de las
células de planta utilizando técnicas tal como electroporación,
poración PEG, bombardeo de partícula, suministro de fibra de
silicona, microinyección de protoplastos de células de planta o
callos embriónicos, o transformación mediada por Agrobacterium (Hiei
et al. (1994) Plant J. 6:271-282).
La introducción de construcciones de ADN
utilizando precipitación de polietilenglicol se describe en
Paszkowski et al., Embo J. 3: 2717-2722
(1984). Se describen técnicas de electroporación en Fromm et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1985). Se describen
técnicas de transformación balística en Klein et al., Nature
327: 70-73 (1987).
También se puede introducir ADN en plantas
mediante transferencia directa de ADN en polen como se describe por
Zhou et al., Métodos in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess,
Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plane Mol.
Biol. Reporter, 6:165 (1988). La expresión de genes que codifican
polipéptido se puede obtener mediante inyección del ADN en órganos
reproductivos de una planta como se describe por Pena et al.,
Nature, 325.:274 (1987). El ADN también se puede inyectar
directamente en células de embriones inmaduros y la rehidratación
de embriones disecados como se describe por Neuhaus et al.,
Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); y Benbrook et al., in
Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp.
27-54 (1986). Una variedad de virus de planta que
se pueden emplear como vectores se conocen en la técnica e incluyen
virus mosaico del coliflor (CaMV), geminivirus, virus mosaico de
cebadilla, y virus mosaico del tabaco.
Las células de plantas transformadas
establemente con un casete de expresión de recombinasa específica de
sitio se puede regenerar, por ejemplo, de células únicas, tejido de
callo o discos de hoja de acuerdo con técnicas de cultivo de tejido
de planta estándar. Se conoce bien en la técnica que varias células,
tejidos, y órganos de casi cualquier planta se puede cultivar
exitosamente para regenerar una planta completa. La regeneración de
planta de protoplastos de cultivo se describe en Evans et
al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell
Culture, Macmillilan Publishing Company, New York, pp.
124-176 (1983); y Binding, Regeneration of Plants,
Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, pp. 21-73
(1985).
La regeneración de las plantas que contienen el
gen recombinasa introducido por Agrobacterium de explantes de hoja
se puede lograr como se describe por Horsch et al., Science,
227:1229-1231 (1985). En este procedimiento, los
transformantes se hacen crecer en la presencia de un agente de
selección y en un medio que induce la regeneración de brotes en
especies de plantas transformadas como se describe por Fraley et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Este
procedimiento típicamente produce brotes dentro de dos a cuatro
semanas y estos brotes transformantes luego se transfieren a un
medio que induce raíz apropiada que contiene el agente selectivo y
un antibiótico para evitar el crecimiento bacteriano. Las plantas
transgénicas de la presente invención pueden ser fértiles o
estériles.
La regeneración también se puede obtener de
callos de planta, explantes, órganos, o partes de la misma. Tales
técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee et
al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486
(1987). La regeneración de las plantas de protoplastos de única
planta o varios explantes son bien conocidos en la técnica. Ver,
por ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach y H.
Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988).
Este proceso de regeneración y crecimiento incluye las etapas de
selección de células y brotes transformantes, enraizar los brotes
transformantes y crecimiento de las plántulas en el suelo. Para el
cultivo de células de maíz y regeneración ver generalmente, The
Maize Handbook, Freeling y Walbot, Eds., Springer, New York (1994);
Corn and Corn Improvement, 3ra edición, Sprague and Dudley Eds.,
American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).
Un experto reconocerá que después que se
incorpora establemente el casete de expresión de recombinasa
específica de sitio en plantas transgénicas y se confirma que es
operable, este se puede introducir en otras plantas mediante
cruzamiento sexual. Cualquiera de un número de técnicas cultivo
estándar se puede utilizar, dependiendo de las especies a ser
cruzadas.
Los métodos y composiciones de la invención son
útiles para movilizar ADN vírico de los T-ADN
transferidos mediante agroinfección a cualquier anfitrión de
planta. Como se utiliza aquí, el término "planta" incluye
referencia a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo,
hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células de planta y
progenie de las mismas. La célula de planta, como se utiliza aquí
incluye, sin limitación, cultivos de suspensión de semilla,
embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces,
brotes, gametofitos, esporofitos, polen, y microsporas. La clase de
plantas que se pueden utilizar en los métodos de la invención es
generalmente tan amplio como la clase de plantas mayores
aconsejables para técnicas de transformación de Agrobacterium, que
incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Una
monocotiledónea particularmente preferida es maíz. Otras
monocotiledóneas de interés particular incluyen trigo, arroz,
cebada, sorgo y centeno. Las dicotiledóneas de interés particular
incluyen soya, Brassica, girasol, alfalfa, y coliflor.
El T-ADN que contiene el ADN
vírico flanqueado por los sitios para una recombinasa específica de
sitio se transfiere a una célula de planta mediante agroinfección.
Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium
tumefaciens se describen bien en la literatura científica. Ver,
por ejemplo Horsch et al., Science 233:
496-498 (1984), Fraley et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 80: 4803 (1983) y Kado, (1991), Crit. Rev. Plant Sci.
10:1. Se proporcionan descripciones de los sistemas de vector
Agrobacterium y métodos para transferencia mediada por
Agrobacterium en Gruber et al., supra; Miki, et
al., supra; y Moloney et al. (1989), Plant Cell
Reports 8:238. Aunque el Agrobacterium es principalmente útil en
dicotiledóneas, se pueden transformar ciertas monocotiledóneas
mediante Agrobacterium. Por ejemplo, se describe la transformación
de Agrobacterium de maíz en la Patente Estadounidense No.
5,550,318. Otros métodos de agroinfección incluyen transformación
mediada por Agrobacterium rhizogenes (ver, por ejemplo,
Lichtenstein and Fuller In: Genetic Engineering, vol. 6, PWJ Rigby,
Ed., London, Academic Press, 1987; y Lichtenstein, C. P., y Draper,
J,. In: ADN Cloning, Vol. II, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press,
1985), Application PCT/US87/02512 (WO 88/02405 publicado en Abr. 7,
1988) describe el uso de la cepa A. rhizogenes A4 y su
plásmido Ri junto con vectores A. tumefaciens pARC8 o
pARC16.
Los métodos y vectores optimizados para la
transformación mediada por Agrobacterium de las plantas en la
familia Graminae, tal como arroz y maíz se han descrito por Heath
et al. (1997) Mol. Plant-Microbe Interact.
10: 221-227; Hiei et al. (1994) Plant J.
6:271-282 y Ishida et al. (1996) Nat.
Biotech. 14:745-750.
La eficiencia de transformación de maíz se
afectar por una variedad de factores que incluyen los tipos y etapas
de tejido infectado, la concentración de Agrobacterium, el medio de
cultivo de tejido, los vectores Ti y el genotipo de maíz. Los
vectores super binarios que llevan los genes vir de cepas
Agrobacterium A281 y A348 son útiles para la transformación de alta
eficiencia de monocotiledóneas. Sin embargo, aún sin el uso de
vectores de alta eficiencia, se ha demostrado que el
T-ADN se transfiere al maíz en una eficiencia que
resulta en infección sistémica por virus introducidos mediante
agroinfección, aunque no se forman tumores (Grimsley et al.
(1989) Mol. Gen. Genet. 217: 309-316). Esto se debe
a la integración del T-ADN que contiene el genoma
vírico que no se requiere para multiplicación vírica, ya que el
genoma vírico cortado actúa como un replicón independiente.
Otro protocolo de transformación básico útil
involucra una combinación de lesión de tejido mediante bombardeo de
partículas, seguido por el uso de Agrobacterium para suministro de
ADN, como se describe por Bidney et al. (1992) Plant Mol.
Biol. 18: 301-313. En general, el método de
transformación intacto meristema involucra embeber la semilla
durante 24 horas en la oscuridad, remover las cotiledóneas y los
radicales de raíz, seguido por el cultivo de los explantes
meristema. Veinticuatro horas después, se remueven las hojas
primarias para exponer el meristema de ápice. Los explantes se
colocan del domo del ápice hacia arriba y se bombardean, por
ejemplo, dos veces con partículas, seguido por cocultivo con
Agrobacterium. Para iniciar el cocultivo para meristemas intactos,
el Agrobacterium se coloca en el meristema. Después de
aproximadamente un periodo de 3 días de cocultivo los meristemas se
transfieren al medio de cultivo con agentes de selección.
El método de división de meristema involucra la
semilla embebida, el rompimiento de las cotiledóneas para producir
una fractura limpia en el plano del eje embriónico, el corte de la
punta de la raíz y luego bisectar los explantes longitudinalmente
entre las hojas primordiales. Las dos mitades se colocan cortadas en
la superficie en el medio luego de bombardear dos veces con
partículas, seguido por cocultivo con Agrobacterium. Para la
división de meristemas, después de bombardeo, los meristemas se
colocan en una suspensión de Agrobacterium durante 30 minutos.
Ellos luego se remueven de la suspensión en medio de cultivo sólido
para cocultivo de tres días. Después de este periodo, los
meristemas se transfieren a medio fresco con cefotaxima (más agentes
de selección).
La escisión de ADN vírico del
T-ADN se puede determinar por una variedad de medios
que incluyen pero no se limitan a observación de lesiones víricas
un otros signos de infección vírica en la planta, por detección
basada en anticuerpo de proteínas víricas, por amplificación de
productos PCR específicos al genoma circular, o por análisis
Northern para ARN vírico. Adicionalmente, los ensayos para actividad
recombinasa FLP se conocen y generalmente miden la actividad
general de la enzima en los sustratos ADN que contienen sitios FRT.
En esta forma, se puede determinar una frecuencia de escisión de la
secuencia. La escisión de ADN de una molécula lineal o frecuencia
intermolecular de recombinación inducida por la enzima se puede
evaluar, como se describe, por ejemplo, en Babineau et al.
(1985) JBC 260:12313; Meyer-Leon et al.
(1987) NA Res 15:6469; y Gronostajski et al. (1985) JBC
260:12328.
Los siguientes ejemplos se ofrecen por vía de
ilustración no por vía de limitación.
Los fragmentos de ADN que contienen ADN vírico
flanqueado por sitios de recombinación específica de sitio FRT o
loxP se construyen al sintetizar, hibridar y ligar oligonucleótidos
complementarios o al crear cebadores para amplificación PCR de un
producto de ADN que contiene el sitio FRT o loxP y sitios de
restricción útiles para clonación en T-ADN cerca al
extremo 5' del producto PCR.
Por ejemplo, los cebadores PCR largos se pueden
designar en donde el extremo 3' del cebador hibrida al extremo 5'
del genoma vírico de interés y el extremo 5' del cebador que
contiene adicionalmente un sitio LoxP y sitios de clonación útiles
(Ver Figura 5). El producto PCR resultante se digiere con la enzima
de restricción apropiada y se inserta en el T-ADN
de un vector binario Agrobacterium como se describe por Bevan, M.
(1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721: Un casete de
expresión para Cre también se inserta en el T-ADN.
Las construcciones resultantes se transforman en E. coli, se
detectan, y luego se transfieren al Agrobacterium.
\vskip1.000000\baselineskip
Se propagan células Nicotiana tabacum
BY-2 en medio Murashige y Skoog (Gibco BRL) que
contiene 3% de sacarosa, 1 \mug/ml de tiamina, 0.2 \mug/ml de
2,4-D, y 370 \mug/ml de KH_{2}PO_{4}. Se
propagan células de maíz Black Mexican Sweet (BMS) en medio
Murashige y Skoog que contiene 2% de sacarosa, 2 \mug/ml de
2,4-D, 0.2 mg/ml de mioinositol, 0.13 mg/ml de
L-asparagina, 0.13 \mug/ml de ácido nicotínico, y
0.25 \mug/ml de cada uno de tiamina, piridoxina, y ácido
pantoténico. Los cultivos se agitan a 140 rpm en 25ºC en luz
continua.
Para infectar células de planta, la actividad de
gen de virulencia (vir) se induce mediante tratamiento con
acetosiringona en Agrobacterium que lleva el vector construido en el
Ejemplo 1. Se hacen crecer células de Agrobacterium en una densidad
de 2 x 10^{9} células por ml (A = 100, utilizando un
espectrofotómetro Klett-Summerson, filtro rojo) en
medio de AB-sacarosa. Las células se centrifugan a
10,000 g, se suspenden en una concentración de 1 x 10^{9} células
por ml (A = 50) en medio de inducción (sales AB, 0.5% de glucosa, 2
mM fosfato de sodio, 50 mM Mes, Ph 5.6, 50 \muM acetosiringona),
y se incuban con agitación gentil a 25ºC durante 14 a 18 hr.
Después de lavar las células bacterianas en medio de cultivo de
planta, se inoculan células de planta con Agrobacterium inducido
(-20 células bacterianas por célula de planta, excepto donde se nota
otra cosa) y se cocultiva a 25ºC con agitación a 140 rpm durante
varios periodos. La mayor parte de las bacterias se lava mediante
centrifugación de la mezcla de cocultivo a 300 rpm (centrífuga
clínica modelo GLC-2; Beckman Sorvall, Newtown, CT)
durante 2 min. El glóbulo de células de planta se suspende y se lava
una vez más en medio de cultivo de planta y luego se resuspende en
cultivo que contiene 100 \mug/ml de timentina o 200 \mug/mL de
cefotaxima. La movilización de genomas víricos del
T-ADN se monitorea al cuantificar partículas víricas
infecciosas.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de inoculación, las cepas de Agrobacterium
que llevan el vector construido en el Ejemplo 1 se rayan en YEB
(Grimsley et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:3282-3286) placas solidificadas con 1.5% de agar
y complementado con 100 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml de
canamicina y que permite crecimiento durante 48 h. Se utiliza una
colonia única para inocular 10 ml de medio YEB líquido en un matraz
Erlenmeyer de 100 ml complementado con antibióticos como
anteriormente. Se continúa el crecimiento con agitación a 200
r.p.m. durante 24 h, luego 500 \mul de este cultivo se utiliza
para inocular un matraz similar y continúa el crecimiento durante
20h adicionales. Este procedimiento produce una densidad final de
células viables de Agrobacterium en la región de 109/ml (estimado
por placas). Las células luego se cosechan mediante centrifugación
y se resuspenden en un volumen igual de 10 mM MgSO_{4} sin
antibióticos; tal una suspensión se refiere posteriormente como no
diluido o dilución 10º; para experimentos que involucran una serie
de dilución de 10 mM MgSO_{4} también se utiliza como el
diluyente.
Las semillas de maíz para plantas de 10 días de
edad se siembran en potes en un fitotrón en un ciclo de 12 horas
luz/oscuridad a 25ºC en una intensidad de luz de aproximadamente
10000 lux (lámparas fluorescentes Sylvania 215 W tipo
F96T12/CW/VHO) luego se mueven al laboratorio de contención BL3
inmediatamente antes de inoculación; se han descrito condiciones de
crecimiento posteriores (Grimsley et al. (1987) Nature
325:177-179). Se preparan plántulas de tres días de
edad mediante (i) esterilización mediante agitación durante 20min en
0.7% de solución de hipoclorito de calcio, (ii) lavar tres veces
(agitando durante 20 min cada vez) en agua destilada estéril (iii)
preparar platos Petri presterilizados de 9cm de diámetro con 3
láminas de papel de filtro estéril de 8.5 cm de diámetro
Macherey-Nagel (Alemania) en el fondo y ca. 10 ml de
agua estéril por plato, (iv) poner ca. 20 semillas en cada plato de
geranio, y (v) incubar en la oscuridad a 28ºC durante 3 días, o
hasta la distancia entre el nodo de escudo y la punta de ápice de
los coleóptilos es 1-2 cm.
Para la inoculación de las plantas, se carga una
jeringa fija de 50 \mul o 100 \mul Hamilton con una aguja
desechable de 0.4 mm de diámetro con la suspensión bacteriana que
evita atrapar burbujas de aire. Entre las inoculaciones con
diferentes cepas bacterianas la aguja se descarga y la jeringa se
enjuaga 3 veces con 100% etanol y 3 veces con agua destilada
estéril. Se inoculan plantas de 10 días de edad mediante (i)
abrasión de una hoja superior, aplicando 20 \mul de suspensión, y
se frota con polvo de carborundo hasta que la hoja parece húmeda,
(ii) inyección de 10 \mul de suspensión bacteriana en la parte
central de la planta justo antes de la primera lámina de hoja, o 1
cm por debajo de la primera lámina de hoja, o en la base de la
planta, en la región meristemática donde las raíces accidentales
comienzan luego a aparecer. Se inyectan plántulas de tres días de
edad con 10 \mul de suspensión bacteriana en diferentes formas al
(i) empujar la aguja a través de la punta de ápice del coleóptilo
al nodo coleoptilar, (ii) inyectar 2mm por debajo la punta de ápice
del coleóptilo, (iii) 2 mm por encima del nodo coleoptilar, (iv) en
el nodo coleoptilar, (iv) 2 mm por debajo del nodo coleoptilar, (v)
en el nodo de escudo, y al empujar la aguja a través de la raíz
principal en una región cercana al nodo de escudo. Se utiliza diez
\mul como un inóculo estándar de suspensión bacteriana, pero solo
1-2 \mul permanece rutinariamente en el sitio de
inoculación, el resto se fuerza, usualmente salen del punto de
entrada de la aguja inoculante. Luego de inoculación se plantan las
plántulas inmediatamente en suelo húmedo, se incuban como
anteriormente (Grimsley et al. (1987) Nature 325:
177-179), y observan diariamente para la aparición
de síntomas de infección vírica, caracterizado por la aparición de
manchas amarillas y/o bandas en la base de nuevas hojas.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
mencionadas en la especificación son indicadoras del nivel de
aquellos expertos en la técnica al cual esta invención
pertenece.
Aunque la invención anterior se ha descrito en
algún detalle por vía de ilustración y ejemplo para propósitos de
claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y
modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (24)
1. Un método para movilizar un replicón vírico
de un T-ADN, que comprende:
- a)
- proporcionar un replicón Agrobacterium que comprende un T-ADN, que contiene un replicón vírico flanqueado al repetir directamente sitios objetivo para una recombinasa específica de sitio; y
- b)
- infectar una célula de una planta con un Agrobacterium que lleva dicho replicón Agrobacterium bajo condiciones que permiten la transferencia de dicho T-ADN y la expresión de dicha recombinasa específica de sitio en dicha célula; en donde dicha célula, dicho T-ADN, o dicho replicón vírico comprende una secuencia de nucleótido que codifica dicha recombinasa o un fragmento activo o una variante activa de la misma, y dicha secuencia de nucleótido se liga operablemente a un promotor que controla la expresión en dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde dicho método proporciona a dicha célula de planta una
pluralidad de copias de una secuencia de ADN de interés y en donde
dicho T-ADN contiene en una orientación 5' a 3' o
3' a 5', un primer sitio objetivo para dicha recombinasa específica
de sitio, dicho replicón vírico, dicha secuencia de ADN de interés,
y un segundo sitio objetivo para dicha recombinasa en repetición
directa con dicho primer sitio objetivo, en donde dicho primer y
segundo sitios objetivo son idénticos.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde dicho método proporciona a una célula de planta una
pluralidad de copias de una secuencia de ADN de interés, en donde
dicho T-ADN contiene en una orientación 5' a 3' o
3' a 5', un primer sitio objetivo para dicha recombinasa, dicho
replicón vírico, un segundo sitio objetivo para dicha recombinasa,
dicha secuencia de ADN de interés, y un tercer sitio objetivo para
dicha recombinasa, en donde dicho primer y dicho tercer sitios
objetivo se repiten directamente y son idénticos con respecto uno
del otro, y dicho segundo sitio objetivo no es idéntico a dicho
primer y dicho tercer sitios objetivo.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en donde el genoma de dicha célula de planta comprende por lo menos
un sitio objetivo que corresponde a sitios objetivo idénticos en
dicho T-ADN, y en donde dicho replicón vírico y
dicho ADN de interés se inserta dentro del sitio objetivo en el
genoma de dicha célula de planta.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en donde el genoma de dicha célula de planta comprende por lo menos
dos sitios objetivo no idénticos que corresponden al segundo y
tercero sitios objetivo no idénticos que flanquean la secuencia de
ADN de interés, y en donde dicho ADN de interés se inserta dentro
del sitio objetivo en el genoma de dicha célula de planta.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha recombinasa específica
de sitio es un miembro de la familia integrasa o es FLP, Cre, Int,
SSVI, integrasa R, un fragmento activo, o una variante activa de la
misma.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichos sitios objetivo se
seleccionan de un sitio FRT, un sitio FRT mutante, un sitio LoxP y
un sitio LoxP mutante.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
a 7, en donde dicha célula de planta es de una monocotiledónea o
una dicotiledónea o en donde dicha monocotiledónea es maíz, trigo,
arroz, cebada, sorgo o centeno o en donde dicha dicotiledónea es
soya, Brassica, girasol, alfalfa o alazor.
9. Un T-ADN que contiene un
replicón vírico flanqueado al repetir directamente sitios objetivo
para una recombinasa específica de sitio.
10. Un T-ADN de acuerdo con la
reivindicación 9, dicho T-ADN comprende en una
orientación 5' a 3' o 3' a 5', un primer sitio objetivo para dicha
recombinasa específica de sitio, dicho replicón vírico, una
secuencia de ADN de interés, y un segundo sitio objetivo para dicha
recombinasa en repetición directa con dicho primer sitio objetivo,
en donde dicho primer y segundo sitios objetivo son idénticos.
11. Un T-ADN de acuerdo con la
reivindicación 9 que comprende en una orientación 5' a 3' o 3' a 5',
un primer sitio objetivo para la recombinasa, el replicón vírico,
un segundo sitio objetivo para la recombinasa, una secuencia de ADN
de interés, y un tercer sitio objetivo para dicha recombinasa, en
donde dicho primer y dicho tercer sitios objetivo se repiten
directamente y son idénticos con respecto uno del otro, y dicho
segundo sitio objetivo no es idéntico a dicho primer y dicho tercer
sitios objetivo.
12. Un T-ADN de acuerdo con la
reivindicación 9, 10 o 11, en donde dicho replicón vírico contiene
una secuencia de nucleótido que codifica dicha recombinasa o un
fragmento activo o una variante activa de la misma, y dicha
secuencia de nucleótido se liga operablemente a un promotor que
controla la expresión en una célula de planta.
\newpage
13. Un T-ADN de acuerdo con la
reivindicación 9, 10, 11o 12, en donde dicha recombinasa específica
de sitio es FLP, Cre, Int, SSVI, o Integrasa R o un fragmento
funcional o una variante activa de la misma, y en donde dicho
fragmento o variante retiene la actividad de recombinación
específica de sitio.
14. Un T-ADN de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde dichos sitios
objetivo se seleccionan de un sitio FRT, un sitio FRT mutante, un
sitio LoxP, y un sitio LoxP mutante.
15. Un replicón Agrobacterium o un Agrobacterium
que contiene el T-ADN como se define por cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 14.
16. Una célula de planta que tiene una
construcción de ADN que comprende en una orientación 5' a 3' o 3' a
5'un primer sitio objetivo para una recombinasa específica de sitio,
un replicón vírico, una secuencia de nucleótido de interés, y un
segundo sitio objetivo para dicha recombinasa específica de sitio,
en donde dicho primer y dicho segundo sitio objetivo se repiten
directamente y son idénticos con respecto uno del otro.
17. Una célula de planta de acuerdo con la
reivindicación 16, en donde dicha construcción de ADN comprende en
la orientación 5' a 3' o 3' a 5'el primer sitio objetivo para dicha
recombinasa específica de sitio, dicho replicón vírico, un tercer
sitio objetivo para dicha recombinasa específica de sitio, la
secuencia de nucleótido de interés, y el segundo sitio objetivo
para dicha recombinasa específica de sitio, en donde dicho primer y
dicho segundo sitio objetivo se repiten directamente y son idénticos
con respecto uno del otro, y dicho tercer sitio objetivo no es
idéntico a dicho primer y dicho segundo sitio objetivo.
18. Una célula de planta de acuerdo con la
reivindicación 16 o 17, en donde dicha construcción de ADN se
incorpora en el genoma de dicha célula de planta.
19. Una célula de planta de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16, 17, o 18, en donde dicha
célula de planta comprende una secuencia de nucleótido que codifica
dicha recombinasa específica de sitio.
20. Una célula de planta de acuerdo con la
reivindicación 19, en donde dicha recombinasa específica de sitio
es un miembro de la familia integrasa o es FLP, Cre, Int, SSVI,
Integrasa R, o un fragmento activo o una variante activa de la
misma.
21. Una célula de planta de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en donde dichos sitios
objetivo se seleccionan de un sitio FRT, un sitio FRT mutante, un
sitio LoxP, y un sitio LoxP mutante.
22. Una célula de planta de acuerdo con las
reivindicaciones 16 a 21, en donde dicha célula de planta es de una
monocotiledónea o una dicotiledónea o en donde dicha monocotiledónea
es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo, o centeno o dicha
dicotiledónea es soya, Brassica, girasol, alfalfa, o alazor.
23. Una planta que comprende una célula de
planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a
22.
24. Una semilla transformada que comprende una
célula de planta como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22.
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