DE10132780A1

DE10132780A1 - Plastidäre Genexpression über autonom replizierende Vektoren

Info

Publication number: DE10132780A1
Application number: DE10132780A
Authority: DE
Inventors: Hans-Ulrich Koop; Stefan Muehlbauer; Sebastian Klaus; Christian Eibl
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2001-07-06
Publication date: 2003-01-16
Also published as: JP2004533266A; US20050015829A1; AU2002304711B2; MXPA03011874A; DE60239462D1; EP1404848B1; US7371923B2; EP1404848A2; ATE502111T1; JP4340148B2; CA2453023A1; WO2003004658A2; CA2453023C; WO2003004658A3

Abstract

Verfahren zur genetischen Transformation von Pflanzenplastiden, das die folgenden Schritte umfasst: DOLLAR A (a) Ausstatten einer Pflanzenzelle mit DNA, die DOLLAR A (i) eine Nukleotidsequenz aufweist, die die autonome Replikation der DNA in einer Pflanzenzelle ermöglicht, DOLLAR A (ii) mindestens eine gewünschte Sequenz enthält, und DOLLAR A (iii) für die Transkription DOLLAR A (alpha) frei ist von mit der mindestens einen gewünschten Sequenz operationell verknüpften Transkriptions- und/oder Terminationskontrollelementen, oder DOLLAR A (beta) frei ist von mit der mindestens einen gewünschten Sequenz operationell verknüpften Transkriptionsterminationskontrollelementen, jedoch ein Transkriptionsinitiationskontrollelement aufweist, das operationell mit der mindestens einen gewünschten Sequenz verknüpft ist, DOLLAR A (b) die Replikation der DNA ermöglichen, und DOLLAR A (c) Auslese von Zellen und/oder Pflanzen, die genetisch transformierte Plastide enthalten.

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung gehört zum Bereich der pflanzlichen Biotechnologie im Allgemeinen und zu neuartigen Verfahren und Vektoren zur Plastidentransformation im Speziellen. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur genetischen Transformation pflanzlicher Plastiden, Vektoren für dieses Verfahren sowie Pflanzen oder Pflanzenzellen, die anhand dieses Verfahrens gewonnen werden können. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf Vektoren, die Sequenzen enthalten, welche solche Fähigkeiten zur autonomen Replikation vermitteln, die für die Erfindung nützlich sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Prozess, mittels dem transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen erhalten werden können, die in ihrem Plastom transformiert sind und die keinen Selektionsmarker enthalten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Nach allgemeinem Kenntnisstand leiten sich die beiden Klassen von Zellorganellen - Plastiden und Mitochondrien - von ursprünglich unabhängigen Prokaryoten ab, die von einem Vorläufer heutiger eukaryotischer Zellen in getrennten Endosymbiose-Vorgängen aufgenommen wurden (Gray, 1991). Als Folge davon enthalten diese Organellen ihre eigene DNA, DNA-Transkripte in der Form von Boten-RNA (mRNA), Ribosomen und wenigstens einige der für eine Decodierung der genetischen Information benötigten tRNA-Moleküle (Marechal- Drouard et al., 1991).
Zwar waren diese Organellen kurz nach der endosymbiotischen Aufnahme noch genetisch autonom, da sie alle für das prokaryotische Leben notwendigen Elemente besaßen. Doch wurde diese Autonomie während der Evolution durch einen Transfer von genetischer Information zum Zellkern hin reduziert. Trotzdem blieb ihren genetischen Kompartimenten genug Komplexität erhalten, um sie zu einem attraktiven Ziel für die Gentechnik werden zu lassen. Das trifft insbesondere für die Plastiden zu, da diese Organellen immer noch ca. 50% der für ihre wichtigste Funktion innerhalb der Pflanzenzelle - Fotosynthese - benötigenden Proteine kodieren. Außerdem kodieren die Plastiden ihre eigenen ribosomalen RNAs, die meisten ihrer tRNAs und die ribosomalen Proteine. Die Gesamtzahl der Gene im Plastom liegt bei etwa 120 (Palmer, 1991). Allerdings wird die überwiegende Mehrheit aller in den Plastiden vorhandenen Proteine vom Zellkern bzw. dem Cytosol importiert.

Plastiden können durch Transformation genetisch verändert werden

Mit der Entwicklung molekularer Klonierungstechniken gelang es bald, höhere Pflanzen durch Transformation genetisch zu verändern. Die Hauptanstrengungen im Bereich der Pflanzen-Transformation war und ist die Zellkern-Transformation, da sich die Mehrheit aller Gene dort befindet. Im Falle von Arabidopsis thalina, dessen komplette Genomsequenz kürzlich publiziert wurde (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), sind das ca. 26.000 Gene. Die Transformation des Zellkerns konnte einfacher erreicht werden, da biologische Vektoren wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens verfügbar waren, die so verändert werden konnten, dass sie eine effiziente Kern-Transformation ermöglichen (Galvin, 1998). Hinzu kommt, dass der Zellkern fremden Nukleinsäuren direkter zugänglich ist, während die Organellen von zwei Hüll-Membranen umgeben sind, die - allgemein ausgedrückt - für Makromoleküle wie DNA undurchdringbar sind.
Die Möglichkeit, Plastide transformieren zu können, ist sehr wünschenswert. Denn damit könnte die sehr hohe Gendosis in diesen Organellen, die das Potenzial für außergewöhnlich starke Transgen-Expression trägt, nutzbar gemacht werden.
Eine weitere attraktive Eigenschaft der Plastiden-Transformation besteht darin, dass Plastiden-kodierte Merkmale nicht über den Pollen übertragen werden können. Folglich wird die potenzielle Gefahr eines unerwünschten Ausbreitens der Transgene auf zu den Transformanten verwandte Wild-Typ Arten stark reduziert. Zu den weiteren potenziellen Vorteilen der Plastidentransformation gehört die Möglichkeit, mehrere Gene gleichzeitig als polycistronisches Operon zu exprimieren, sowie das Ausschalten von Positionseffekten und "gene silencing" (Abschaltung von Genen), die in Folge von Zellkern-Transformationen auftreten können.
Tatsächlich konnten für höhere Pflanzen Methoden entwickelt werden, die die stabile Transformation von Plastiden ermöglichen. Bisher sind zwei unterschiedlich Methoden verfügbar: Beschuss von Geweben - insbesondere Blattgewebe - mit einer Genkanone ("particle gun") (Svab et al., 1990), sowie die PEG (Polyethylen-Glykol) Behandlung von Protoplasten in Anwesenheit eines geeigneten Transformations-Vektors (Koop et al., 1996). Beide Methoden vermitteln ein Eindringen von Plasmid DNA in das Stroma der Plastiden durch zwei Hüllmembranen hindurch.
Konventionelle Methoden zur Plastidentransformation werden in Heifetz, 2000 und Koop et al. dargestellt.
Konventionelle Plastidentransformations-Vektoren müssen üblicherweise mindestens zwei Anforderungen erfüllen: (1) die Insertion von einem oder mehreren Fremdgene(n) zu ermöglichen, die durch den genetischen Apparat der Plastiden exprimiert werden, und (2) die Selektion von Zellen zu ermöglichen, die das transformierte Plastom enthalten. Dies kann durch Selektion unter Verwendung von Inhibitoren oder mittels Durchmusterung auf einen erkennbaren Phänotyp hin erfolgen. Plastidentransformations-Vektoren enthalten normalerweise mindestens zwei vollständige Gen-Kassetten, die jeweils aus vier funktionell miteinander verbundenen Elementen bestehen: eine Promotor-Sequenz, ein nicht-translatierter 5'-Bereich, eine codierende Region und ein nicht-translatierter 3'-Bereich.
Jedoch nutzen diese Kassetten nicht die Möglichkeit aus, mehrere Gene als Operon unter der Kontrolle eines einzigen Promoters zu exprimieren.
Selektion wird entweder erreicht, indem ein vollständiges bereits vorhandenes plastidäres Gen durch eine mutante Version ersetzt wird, die Resistenz gegen den Inhibitor bewirkt (US 5451513). Die Selektion kann aber auch durchgeführt werden, indem eine vollständige Expressions-Kassette in das Plastom eingebracht wird, die zu einer enzymatischen Inaktivierung des Inhibitors führt (US 5877402).
Die Markergene, die für die Selektion der transgenen Pflanzenzellen vom riesigen Hintergrund der nicht transformierten Zellen benötigt werden, kodieren für Antibiotika- oder Herbizidresistenz-Gene. Beispiele für plastidäre Resistenz-Gene sind aadA, das eine Resistenz gegen Spectinomycin und Streptomycin vermittelt (Svab & Maliga, 1993) oder nptII, das eine Resistenz gegen Kanamycin vermittelt (Carrer et al., 1993). Da diese Marker zusammen mit den gewünschten Genen ("gene of interest" = GOI) stabil in das Genom integriert werden, bleiben sie auch in den homoplastomischen transgenen Pflanzen erhalten, obwohl sie für die Funktion der gewünschten Gene (GOI) nicht benötigt werden. Diese in den Pflanzen verbleibenden Markergene sind ein Haupt-Kritikpunkt an der Pflanzen-Biotechnologie, da sie theoretisch die Antibiotika-Resistenz von Pathogenen oder die Herbizid-Resistenz von Wildkräutern erhöhen könnten. Die Entwicklung eines Selektionssystems, bei dem in der transgenen Pflanze keine Resistenzgene mehr vorhanden sind, ist deshalb höchst erstrebenswert (lamtham and Day, 2000).
Außer den zwei oder mehr Gen-Kassetten enthalten die Transformations-Vektoren üblicherweise flankierende Regionen aus dem Insertionsbereich, die für den Einbau der artifiziellen Sequenzen in das Plastom durch zwei reziproke Rekombinationsereignisse benötigt werden.
Bisher enthalten Chloroplasten-Transformationsvektoren Chloroplastengenom- Sequenzen, die als homologe Flanken dienen. Da sich die Chloroplastengenome unterschiedlicher Arten in ihrer Sequenz unterscheiden, müssen speziesspezifische Transformationsvektoren verwendet werden. Dies bedeutet einen erheblichen Aufwand bei der Klonierung von Transformationsvektoren und steht im Gegensatz zur Situation bei der Zellkern- Transformation.
Darüber hinaus kann die Kopienzahl eines beliebigen, stabil in das Plastommolekül integrierten Transgens ganz offensichtlich nie die Kopienzahl des Plastoms übertreffen. Damit wird die erreichbare Expressionsstärke auf einer bestimmten Stufe begrenzt.
Die Kopienzahl des Transgens bzw. der Transgene kann folglich weiter erhöht werden, wenn diese auf einem extrachromosomalen Element lokalisiert sind.
Das Patent US-A 5,693,507 offenbart eine Methode zum Einbringen von heterologer DNA in einen Chloroplasten, wobei die heterologe DNA funktionell verbundene Kontrollelemente enthält, die eine Expression in dem Chloroplasten ermöglichen. Die Methode nach US-A 5,693,507 ermöglicht aber keine Erhaltung der heterologen DNA in einem Plastiden über einen längeren Zeitraum. Darüber hinaus ist die Expression der heterologen DNA in dem Plastiden für praktische Anwendungen ausreichend.
Es ist deshalb ein Ziel dieser Erfindung, eine effiziente und höchst vielseitige Methode zur genetischen Transformation von pflanzlichen Plastiden bereitzustellen, mit der genetisch stabile transgene Pflanzen erzeugt werden können.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Methode zur genetischen Transformation von pflanzlichen Plastiden bereitzustellen, welche stabil transformierte Pflanzen hervorbringt und welche ein sehr hohes Niveau der Transgen-Expression ermöglicht.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Methode zur genetischen Transformation von pflanzlichen Plastiden bereitzustellen, welche die Expression von mehreren gewünschten Genen ermöglicht (polycistronische Expression).
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine neue Methode zur genetischen Transformation von pflanzlichen Plastiden bereitzustellen, mit der transgene Pflanzen erzeugt werden, die kein Markergen - wie zum Beispiel ein Antibiotikaresistenzgen - enthalten.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zur genetischen Transformation pflanzlicher Plastiden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Ausstatten einer Pflanzenzelle mit DNA, die
- a) eine Nukleotidsequenz aufweist, die die autonome Replikation der DNA in einer Pflanzenzelle ermöglicht,
- b) mindestens eine gewünschte Sequenz enthält, und
- c) für die Transkription
  - 1. (α) frei ist von mit der mindestens einen gewünschten Sequenz operationell verknüpften Transkriptions- und/oder Terminationskontrollelementen, oder
  - 2. (β) frei ist von mit der mindestens einen gewünschten Sequenz operationell verknüpften Transkriptionsterminationskontroll-Elementen, jedoch ein Transkriptionsinitiationskontroll-Element aufweist, das operationell mit der mindestens einen gewünschten Sequenz verknüpft ist,
b) die Replikation der DNA ermöglichen, und
c) Auslese von Zellen und/oder Pflanzen, die genetisch transformierte Plastide enthalten.

Das in der Erfindung beschriebene Verfahren kann zu außerordentlich hohen Expressions-Niveaus von mindestens einer gewünschten Sequenz führen. Gleichzeitig erlaubt die in der Erfindung beschriebene Methode die Expression mehrerer gewünschter Sequenzen (polycistronische Expression).
Entsprechend der vorliegenden Erfindung trägt die DNA eine Nukleotidsequenz, welche die autonome Replikation dieser DNA in einer Pflanzenzelle vermittelt. Dies führt zur Erzeugung vieler Kopien dieser DNA. Diese erwähnte, Replikation vermittelnde Nukleotidsequenz, kann jede beliebige Sequenz sein, welche zur Replikation der entsprechenden DNA in einer Pflanzenzelle - vorzugsweise in den Plastiden - führt. Beispiele für solche Sequenzen sind die plastidäre Replikationsurspünge oriA und oriB. Weitere Beispiele sind neuartige, in den Plastiden Replikation vermittelnde Sequenzen, wie sie in SEQ. ID. NO: 1 und SEQ. ID. NO: 2 beschrieben sind. Autonome Replikation dieser DNA bedeutet: die entsprechende DNA kann innerhalb der Pflanzenzelle unabhängig von der Replikation anderer DNA (-Moleküle) in der entsprechenden Zelle repliziert werden; insbesondere ohne Integration in das Plastom.
Das in der Erfindung beschriebene Verfahren kann verwendet werden, wenn die Integration in das Plastom gewünscht wird (Fall α). Für diesen Zweck hat die (Vektor-) DNA vorzugsweise keine Transkriptionsinitiations- und/oder Terminations-Kontrollelemente, welches funktionell mit dieser (mindestens einen) gewünschten Sequenz verbunden sind. In diesem Fall kann die Transkription der entsprechenden gewünschten Sequenz vollständig auf Kontrollelementen (für die Initiation und Termination) beruhen, welche bereits im Plastom vorhanden sind (plastomisch).
Alternativ kann nur das Kontrollelement für die Transkriptionsinitiation plastomisch (bereits im Plastom enthalten) sein, während das Kontrollelement für die Termination durch die zur Verfügung gestellt wird. Alternativ kann nur das Kontrollelement für die Termination plastomisch sein, während das Kontrollelement für die Initiation durch die (vektorielle) DNA zur Verfügung gestellt wird. In jedem Falle entbehrt die (vektorielle) DNA mindestens eines der Regelelemente für die Transkription. Dies führt dazu, dass die Transformation nach Fall α) effizienter und stabiler wird.
Außerdem kann das in der Erfindung beschriebene Verfahren in Fällen angewandt werden, in denen eine Integration der gewünschten Sequenzen in das Plastom nicht erwünscht ist (Fall β). Für diesen Zweck hat die (Vektor-) DNA vorzugsweise kein Transkriptionsterminations-Kontrollelement, welches funktionell mit dieser (mindestens einen) gewünschten Sequenz verbunden sind. Währenddessen enthält die DNA ein Transkriptionsinitiations-Kontrollelement, welches funktionell mit dieser (mindestens einen) gewünschten Sequenz verbunden sind. In diesem Falle läuft die Transkription an der autonomen DNA ohne Integration ab. Deshalb enthält die DNA ein Transkriptionsinitiations-Element, welches funktionell mit der gewünschten Sequenz verbunden ist. Dennoch enthält diese DNA kein Transkriptionsterminations-Element, welches mit der genannten gewünschten Sequenz funktionell verbunden ist. Dies bedeutet, dass die Transkription nach Art eines "rolling circle" ("rollendes Rad", vergleichbar der "rolling circle"-Replikation bei manchen Viren) abläuft und dass die Termination unabhängig von Terminations-Kontrollelementen eher auf statistischer Basis auftritt.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat mindestens eine der gewünschten Sequenzen keine funktionell damit verbundenen Kontrollelemente für die Transkriptionstermination. Vorzugsweise ist die genannte DNA oder Teile davon nicht in das Plastom integriert. Sobald die Transkription dieser DNA oder einer gewünschten Sequenz begonnen hat, wird sie nicht oder kaum terminiert (abgebrochen). Dies führt zu sehr langen Transkripten, die mehrere Einheiten der zur entsprechenden DNA gehörenden RNA enthalten oder - vorzugsweise - mehrere Einheiten der transkribierten gewünschten Sequenzen enthalten. Als Folge davon ist/sind die Transkriptmenge(n) der entsprechenden gewünschten Sequenz(en) im Vergleich zum herkömmlichen Fall (bei dem eine gewünschte Sequenz einen funktionell damit verbundenen Transkriptionsterminator hat) erhöht. Folglich tritt auch eine verstärkte Translation auf.
Das Vorhandensein der Merkmale (i), (ii) und (iii) ist multiplikativ und potenziert auf diese Weise die Expressionsstärke der entsprechenden gewünschten Sequenz(en). Darüber hinaus können mehrere gewünschte Sequenzen der genannten DNA mittels desselben Promoters exprimiert werden.
Die (mindestens eine) gewünschte Sequenz kann eine erwünschte Funktion durch die Interaktion mit jedem beliebigen Bestandteil der Pflanzenzelle hervorbringen. Vorzugsweise kann dies mit dem Bestandteil von Plastiden - wie beispielsweise dem Plastidengenom oder einem Expressionsprodukt des Plastidengenoms - erfolgen. Alternativ kann ein Expressionsprodukt der genannten (mindestens einen) gewünschten Sequenz eine Funktion durch die oben erwähnte Interaktion hervorbringen. Solche Interaktionen können für die Konstruktion von Expressionssystemen für transgene Pflanzen verwendet werden, die aus zwei Komponenten bestehen. Diese tragen in hohem Maße zur biologischen Sicherheit von transgenen Pflanzen bei, da die Expression nur dann aktiv ist, wenn zwei künstlich erzeugte Komponenten in der selben Pflanze anwesend sind.
Die Expression besteht nur aus der Transkription, wenn beispielsweise RNA das erwünschte Produkt ist (z. B. für die "anti-sense"-Technologie). Vorzugsweise beinhaltet die Expression Transkription und Translation zur Erzeugung eines Polypeptides oder Proteins. Im Falle der Polypeptid-Expression bezieht sich die "gewünschte Sequenz" vorzugsweise auf den kodierenden Bereich des Polypeptides.
Vorzugsweise ist die genannte DNA zirkulär. Sie sollte vorzugsweise zum autonomen Replizieren fähig sein. Die Replikation kann in den Plastiden und/oder außerhalb der Plastiden erfolgen. In dem Falle, bei dem eine gewünschte Sequenz exprimiert wird, wird diese Sequenz vorzugsweise ein funktionell damit verbundenes Transkriptionsinitiations-Element enthalten, nicht aber ein Transkriptionsterminations-Element (Fall β). Allgemein ausgedrückt hat im Falle der Verwendung mehrerer gewünschter Sequenzen vorzugsweise nur eine - vorzugsweise die erste Sequenz - ein Transkriptionsinitiations-Element, während kein Terminationselement vorhanden ist. Alternativ können mehrere oder alle gewünschte Sequenzen Initiationselement haben, während die Transkriptionsterminations-Elemente fehlen. Es ist daher bevorzugt, dass ein Initiationselement(e) vorhanden ist (sind), während Terminationselemente fehlen.
Zur effizienten Translation hat vorzugsweise jede gewünschte Sequenz eine Ribosomenbindestelle. Andere Sequenzen, die die Translation fördern - wie Translations- Enhancer - können funktionell mit einer oder mehreren gewünschten Sequenzen verbunden sein.
Entsprechend dieser Erfindung werden pflanzliche Plastiden mit DNA (einem Vektor) transformiert, indem Plastiden die genannte DNA bereitgestellt wird. Dieses Bereitstellen mit der genannten DNA kann direkt oder indirekt sein. Ein Beispiel für indirekte Bereitstellung der genannten DNA ist der Fall, bei dem die genannte DNA außerhalb der Plastide (z. B. im Zellkern) autonom repliziert wird und damit viele Kopien der genannten DNA erzeugt werden. Diese Kopien können anschließend in die Plastiden gebracht werden. Vorzugsweise ist das erwähnte Bereitstellen der genannten DNA für Plastiden direkt und die DNA wird autonom in den Plastiden repliziert. Die Art von Nukleotidsequenz, die verwendet wird, um eine Replikation der genannten DNA zu vermitteln, ist vorzugsweise auf das (Zell)-Kompartiment abgestimmt, von dem angenommen wird, dass die autonome Replikation der genannten DNA darin stattfindet. Beispielsweise muss für eine autonome Replikation in Plastiden die genannte Nukleotidsequenz, welche eine Replikation vermittelt, auch in Plastiden funktionell sein.
Diese Nukleotidsequenzen, welche eine autonome Replikation der genannten DNA vermitteln, können sein: jeder beliebige bekannte Replikationsursprung, solche, wie sie hier offen gelegt werden (SEQ. ID. NO: 1 und SEQ. ID. NO: 2 und Varianten davon) oder jede beliebige andere Nukleotidsequenz, welche die Funktion hat, die autonome Replikation zu vermitteln. Die hier offen gelegten Sequenzen werden bevorzugt, um das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren durchzuführen. In Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung kann es von Vorteil sein, die Fähigkeit der genannten Nukleotidsequenzen, Replikation zu vermitteln, zu modulieren. Beispielsweise kann ein sehr aktiver Replikationsursprung (hohe Replikationsrate) es ermöglichen, dass die genannte DNA in einer Pflanzenzelle erhalten wird, ohne dass auf die Erhaltung dieser DNA hin selektiert wird. Ein Replikationsursprung mit begrenzter Fähigkeit Replikation zu vermitteln kann es ermöglichen, die genannte DNA aus einer Pflanzenzelle zu entfernen, wenn der Selektionsdruck vermindert wird. Eine Modulation der genannten Fähigkeit (Replikation zu vermitteln) kann erreicht werden, indem eine solche Nukleotidsequenz von einer geeigneten Pflanzenspezies ausgesucht wird. Alternativ kann ein bestimmter Replikationsursprung verändert werden, beispielsweise durch Mutationen, Verkürzungen, Kombination und Verschieben oder Rekombination von mehr als einem Replikationsursprung, um eine Fähigkeit Replikation zu vermitteln zu erreichen, die für eine bestimmte Verkörperung oder einen bestimmten Zweck geeignet ist.
Die genannte DNA kann weiterhin ein oder mehr Sequenzen enthalten, um eine Selektion (selektierbarer Marker) von transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen oder Plastiden zu ermöglichen. Ein solcher selektierbarer Marker kann ein Antibiotika- oder Inhibitorresistenzgens sein. Alternativ könnte in einem vorangegangenem Schritt ein plastidäres Gen, welches für das Wachstum unter bestimmten Bedingungen benötigt wird, funktionsunfähig gemacht worden oder eliminiert worden sein. Der Einschluss eines solchen plastidären Gens auf dem genannten Plasmid kann als selektierbarer Marker genutzt werden, wenn dies in einer Weise geschieht, dass eine positive Selektion einer solchen Transformation ermöglicht wird. Beispiele für ein solches Gen sind Fotosynthese-bezogene Gene wie rpoA oder petA. Das letztgenannte Vorgehen hat den sehr großen Vorteil, dass das in der Erfindung beschriebene Verfahren durchgeführt werden kann, ohne dass ein Antibiotikaresistenzgen in eine Pflanze eingebracht wird.
In einer allgemeinen Ausführungsform der Erfindung repliziert die genannte DNA autonom in Plastiden, d. h. es stellt ein extrachromosomales oder episomales Element in Plastiden dar. In dieser Ausführungsform wird die genannte DNA oder Teile davon nicht in das Plastom integriert. Darüber hinaus enthält die genannte DNA vorzugsweise kein Transkriptionsterminations-Element, welches funktionell mit einer gewünschten Sequenz verbunden ist und erlaubt so die polycistronische Expression von mehreren gewünschten Genen. Im Vergleich zu konventionellen Plastidentransformations-Strategien kann dieser Prozess zu einem viel höheren Expressions-Niveau führen, da die Kopienzahl des autonom replizierenden Plasmids die Kopienzahl der Plastommoleküle bei weitem übertreffen kann. Dies führt zu einer erhöhten Gendosis der mindestens einen gewünschten Sequenz. In dieser Ausführungsform können Vektoren konstruiert werden, welche nicht Spezies-spezifisch sind, da der Einsatz von homologen Flanken für die Rekombination mit dem Plastom nicht nötig ist. Der Aufwand zur Klonierung der Vektoren ist deshalb stark reduziert, was einen enormen Vorteil dieser Methode darstellt. Außerdem sind die daraus hervorgehenden transgenen Pflanzen aufgrund der weitgehenden Abwesenheit von zum Plastom homologen Sequenzen genetisch sehr stabil.
Vektoren oder die genannte DNA mit Plastom Sequenzelementen, welche als Startpunkte für die Replikation dienen, führen nicht zur stabilen Integration der fremden Sequenzen in das Chlorplastengenom. Aber sie werden in den Plastiden erhalten, wenn eine geeignete Selektion vorhanden ist oder wenn die Replikationsfrequenz der extrachromosomalen DNA die Replikationsfrequenz der entsprechenden Plastommoleküle übertrifft.
Es ist offensichtlich, dass autonom replizierende Elemente ohne Selektion verlorengehen, wenn die Replikationsfrequenz des Plasmids geringer als die Replikationsfrequenz des Plastoms ist. Um die Anwesenheit der autonom replizierenden DNA auch dann zu erhalten, wenn sie gegenüber dem Plastom eine geringere Replikationsfrequenz hat, kann ein selektierbarer Marker in die genannte DNA mit aufgenommen werden. Wie oben erwähnt, kann in einem ersten Transformationsschritt ein zur Fotosynthese in Bezug stehendes Gen aus dem Plastom entfernt oder inaktiviert werden. In einem zweiten Schritt kann das fehlende Gen entsprechend dem in der Erfindung beschriebenen Prozess mit einem autonom replizierenden Elemente versehen werden. Unter Verwendung dieser Methode werden in Erde wachsende Pflanzen "gezwungen" das/die eingeführte(n) Element(e) zu erhalten. Darüber hinaus erlaubt dieses Vorgehen die Erzeugung von transplastomischen höheren Pflanzen, die keine Antibiotikaresistenz- oder Herbizidresistenzmarkergene enthalten. Die Ko-Transformation mit einem weiteren Plasmid ermöglicht das Entfernen des im ersten Transformationsschritt verwendeten Selektionsmarkers.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung enthält die genannte DNA zusätzlich Sequenzen, welche die stabile Integration in das Plastom von zumindest einem Teil der DNA durch homologe Rekombination ermöglichen. Die genannte DNA kann als "shuttle" ("Fähre") für das Einbringen einer Teilsequenz der genannten DNA - vorzugsweise einer gewünschten Sequenz - in das Plastom dienen. Derzeit ist die Plastidentransformation von dem Einsatz von Antibiotikaresistenzgenen als Selektionsmarker abhängig. Diese bleiben im Endprodukt als unerwünschter und sehr umstrittener Nebeneffekt erhalten. Um dieses Problem zu lösen, kann die genannte DNA mit einer Plastom-Integrationskassette ausgestattet werden, d. h. eine in das Plastom zu integrierende Sequenz, welche von Sequenzen, die eine stabile Integration ermöglichen, flankiert ist (Sequenzen, die zu einem Teil des Plastoms homolog sind). Vorzugsweise ist das selektierbare Markergen auf der genannten DNA außerhalb dieser Integrationskassette lokalisiert und wird deshalb nicht integriert. Die Selektion wird vorzugsweise so lange aufrechterhalten, bis die zu integrierende Sequenz (vorzugsweise eine gewünschte Sequenz) in eine ausreichende Anzahl von Plastomkopien stabil integriert ist. Dann wird die Selektion aufgehoben, was zu einem Verlust der autonom replizierenden DNA - welche den Selektionsmarker enthält - führt und damit die Erzeugung von markerfreien transplastomischen Pflanzen erlaubt. Um den Verlust des autonom replizierenden extrachromosomalen Plasmides zu gewährleisten, wird die Plasmid-DNA vorzugsweise mit einer Sequenz ausgestattet, die die autonome Replikation in einer geeigneten Frequenz vermittelt; d. h. eine Frequenz, welche nicht zu hoch ist um den Verlust der genannten DNA zu verhindern. Solche die Replikation vermittelnden Sequenzen können auf einfache Weise erzeugt werden, indem genau definierte Teil der hier beschriebenen Sequenzen (SEQ. ID. NO: 1 und SEQ. ID. NO: 2) verwendet werden, welche eine autonome Replikation mit hohen Frequenzen vermitteln.
Auch ein weiterer Weg, um markerfreie Transformanten zu erhalten wird hier beschrieben: der Selektionsmarker wird von dem Shuttle-Plasmid durch homologe Rekombination entfernt. Diese (homologe Rekombination) wird durch direkte Wiederholungen von Plasmidvektor-Sequenzen, die ein nicht integrierbares Markergen flankieren, vermittelt.
Diese Erfindung stellt außerdem Vektoren für das oben erwähnte Verfahren zur Verfügung. Insbesondere wird ein Vektor zur Verfügung gestellt, welcher eine Nukleotidsequenz enthält, die die Fähigkeit zur autonomen Replikation in pflanzlichen Plastiden vermittelt. Die genannte Nukleotidsequenz wird aus der folgenden Gruppe ausgewählt:

a) die Sequenz von SEQ. ID. NO: 1 oder eine funktionskonservative Variante oder Teil derselben,
b) die Sequenz von SEQ. ID. NO: 2 oder eine funktionskonservative Variante oder Teil derselben,
c) eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz hybridisiert, die zu einer Sequenz aus (a) oder (b) komplementär ist,
d) eine Sequenz gemäß (a) oder (b), die ausgewählte Mutationen zur Abschwächung oder Verstärkung der Fähigkeit zur Verleihung zur autonomen Replikation enthält,
e) eine Sequenz, die mindestens 80% Identität zur SEQ. ID. NO: 1 oder SEQ. ID. NO: 2 aufweist,
f) eine zu SEQ. ID. NO: 1 oder SEQ. ID. NO: 2 orthologe Sequenz.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Sequenzen SEQ. ID. NO: 1 oder SEQ. ID. NO: 2 eine effiziente Replikation von DNA in pflanzlichen Plastiden vermitteln. Besonders überraschend ist, dass die genannten Sequenzen keinen bekannten plastidären Replikationsursprung enthalten. Die Sequenzen SEQ. ID. NO: 1 oder SEQ. ID. NO: 2 oder Varianten davon können beispielsweise in einem Verfahren verwendet werden, bei dem die Fähigkeit, autonome Replikation zu vermitteln, auf eine DNA übertragen wird. Die Frequenz, mit der diese Sequenzen autonome Replikation vermitteln, kann wie oben erwähnt moduliert werden. Insbesondere können homologe oder orthologe Sequenzen von anderen Organismen in einem solchen Verfahren verwendet werden.
Außerdem liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren, transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen zu erzeugen, die in ihrem Plastom transformiert sind und keinen Selektionsmarker enthalten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Transformation von Plastiden einer Pflanze oder Pflanzenzelle mit DNA umfassend
- a) eine Nukleotidsequenz, die der DNA die Replikation in einer Pflanzenzelle ermöglicht,
- b) mindestens eine gewünschte Sequenz,
- c) Sequenzen, die die mindestens eine gewünschte Sequenz flankieren und für die stabile Integration der mindestens einen gewünschten Sequenz in das Plastidengenom nötig sind, und
- d) einen Selektionsmarker außerhalb der Sequenzen, die die gewünschten Sequenz(en) flankieren,
b) Ermöglichen der Integration der mindestens einen gewünschten Sequenz in das Plastom in Gegenwart von Selektionsdruck,
c) den Verlust der Selektionsmarkersequenz durch Aufheben des Selektionsdruckes ermöglichen,
d) Auslese von Zellen und/oder Pflanzen, die auf dem Plastom genetisch transformiert und frei von dem Selektionsmarker sind.

Dieses Verfahren erlaubt die Erzeugung von transgenen Pflanzen, die keinen selektierbaren Marker haben. Solche Verfahren sind aus Gründen der biologischen Sicherheit und des "Containment" (Verhinderung der Ausbreitung) von Antibiotikaresistenzgenen höchst wünschenswert. Soweit dies anwendbar ist, treffen die für das Verfahren nach Anspruch 1 gegebenen Informationen auch für dieses Verfahren zu. Das Verfahren der Erzeugung von transgenen Pflanzen bedarf der Transformation von Plastiden mit einer DNA, welche eine plastidäre Integrationskassette hat. Diese (Integrationskassette) enthält mindestens eine gewünschte Sequenz, die von Sequenzen flankiert ist, welche für die stabile Integration in das Plastom durch homologe Rekombination dieser genannten mindestens einen gewünschten Sequenz nötig ist. Diese DNA hat zudem einen selektierbaren Marker, beispielsweise ein Antibiotikaresistenz-Gen, welcher vorzugsweise dazu benützt wird, um die Anwesenheit der genannten DNA in einem Plastiden sicherzustellen. Dieser selektierbare Marker ist außerhalb der genannten Integrationskassette lokalisiert. Folglich wird er weitgehend nicht in das Plastom integriert. Nach der Integration kann der Verlust der nicht integrierten DNA durch ein Entfernen des Selektionsdruckes erreicht werden. Die genannte DNA kann weiterhin auch eine Nukleotidsequenz haben, welche die Replikation der genannten DNA vermittelt und eine Vermehrung der genannten DNA ermöglicht.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Pflanze oder Pflanzenzellen, welche Plastiden enthält, die nach der in dieser Erfindung beschriebenen Methode erhalten wurden oder erhalten werden können unter Einschluss von Produkten, die aus solchen Pflanzen abgeleitet werden. DEFINITIONEN 3'-UTR: transkribierte aber nicht translatierte Region eines (>) Gens, abwärts einer codierenden Region; in (>) plastidären (>) Genen;
5'-UTR: transkribierte aber nicht translatierte Region eines (>) Gens, aufwärts einer codierenden Region; in (>) plastidären (>) Genen, der 5'-UTR enthält die Sequenzinformation für die Translations Initiation (Ribosomen Binde Stelle, (>) RBS) in der Nähe seines 3-Endes;
aadA: (>) codierende Region von bakterieller Aminoglykosid-adenyl-Transferase, einem häufig benutztem Protein, das die (>) antibiotischen Selektions Inhibitoren Spectinomycin und/oder Streptomycin entgiftet.
Chloroplast: (>) Plastide die Chlorophyll enthält;
Codierende Region: Nukleotid-Sequenz die Information für a) die Aminosäure-Sequenz eines Polypeptides oder b) die Nukleotide einer funktionellen RNA, enthält; codierende Regionen können optional von einem oder mehreren (>) Intron(s) unterbrochen sein;
Gewünschte(s) Gen (Sequenz): veränderte oder neu eingeführte Sequenz: der Grund für eine Transformation;
Flanke, flankierende Region: DNA-Sequenz am 5' und 3'-Ende eines Inserts in einem (>) plastidären Transformations (>) Vektor, welche die Integration in das Ziel (>) Plastom von Sequenzen zwischen den Flanken durch doppelt reziproke homologe Rekombination vermittelt. Durch denselben Mechanismus können Sequenzen verändert oder vom Ziel (>) Plastom entfernt werden. Daher legen die Flanken des (>) plastidären (>) Transformations (>) Vektors fest, wo Veränderungen im Ziel (>) Plastom durch Transformation erzeugt werden;
Gen Expression: Prozess bei dem Geninformation in Funktion umgesetzt wird; in (>) Genen die für Polypeptide codieren, wird für die Genexpression die Aktivität eines (>) Promoters benötigt, der die RNA-Polymerase Aktivität startet und steuert, dies führt zur Bildung einer Messenger RNA, die anschließend in ein Polypeptid. übersetzt wird; in (>) Genen, die für RNA codieren, generiert die Promoter-vermittelte Aktivität der RNA-Polymerase die codierte RNA.
Gen(e): Nukleotid Sequenz(en), welche für alle Elemente codiert, die notwendig sind um das unabhängige Funktionieren z. B. Expression sicherzustellen;
Gene sind in (>) Operons organisiert, die mindestens eine komplette codierende Region beinhalten;
In (>) Genen die für Polypeptide codieren sind diese Elemente: (1) ein (>) Promoter, (2) eine 5'-untranslatierte Region ((>) 5'-UTR), (3) eine (>) komplette codierende Region, (4) eine 3'-untranslatierte Region ((>) 3'-UTR);
in (>) Genen die für RNA codieren, fehlen der (>) 5'-UTR und der (>) 3'-UTR; in (>) Operons die aus mehr als einer codierenden Region bestehen, sind zwei aufeinander folgende vollständige (>) codierenden Regionen durch (>) Spacer getrennt; (>) Promoter, (>)) 5'-UTR und (>) 3'-UTR Elemente werden von allen codierenden Regionen diese Operons geteilt;
Genom: Komplette DNA Sequenz eines Zellkerns oder einer Zell-Organelle;
Homologe Rekombination: Prozess der zum Austausch, Insertion oder Deletion von Sequenzen führt, aufgrund der Anwesenheit von (>) Flanken mit genügender Sequenz Homologie zur Zielstelle in einem (>) Genom;
Intron: Sequenz die eine (>) codierende Region unterbricht;
Operon: Organisationsstruktur von mehreren (>) Genen, die einen Promoter teilen;
Pflanze(n): Organismus, der (>) Plastiden in seinen Zellen enthält; diese Erfindung bezieht sich besonders auf multizelluläre (>) Pflanzen; das schließt die Gruppe der Nacktsamer (wie Kiefer, Fichte, Tanne) und Bedecktsamer (wie die einkeimblättrigen Nutzpflanzen Mais, Weizen, Gerste, Reis, Roggen, Triticale, Hirse, Zuckerrohr, Spargel, Knoblauch, Palmen und einkeimblättrigen Nicht-Nutzpflanzen, und zweikeimblättrige Nutzpflanzen wie Tabak, Kartoffel, Tomate, Rübsamen, Zuckerrübe, Kürbis, Gurke, Melone, Pfeffer, Citruspflanzen, Aubergine, Weintrauben, Sonnenblume, Soja, Luzerne, Baumwolle usw.), und zweikeimblättrige Nicht-Nutzpflanzen wie auch Farne, Lebermoose, Moose und mehrzellige grüne, rote und braune Algen;
Plastide(n): Organelle(n) mit eigener genetischer Maschinerie in (>) Pflanzen Zellen, die in verschiedenen funktionellen und morphologisch unterschiedlichen Formen vorkommen, z. B. Amyloplasen, (>) Chloroplasten, Chromoplasten, Etioplasten, Gerontoplasten, Leukoplasten, Proplastiden etc.;
Plastome: Komplette DNA-Sequenz von (>) Plastiden;
Promoter: Nukleotid. Sequenz, die Transkription initiiert und reguliert;
RBS, Ribosomenbindungsstelle: DNA-Sequenz-Element aufwärts des (>) Translation Start Kodons eines (>) codierenden Bereichs, diese vermittelt Ribosomen Bindung und Translations Initiation vom entsprechenden RNA-Transkript; RBS Elemente sind entweder Teil eines (>) 5'-UTRs oder eines (>) Spacers;
Selektions Inhibitor: Chemische Verbindung, die Wachstum und Entwicklung von nicht transformierten Zellen oder Organellen stärker behindert als von Transformierten;
Termination: in der Beschreibung dieser Erfindung bedeutet "Termination" den Figruch der Transkription von RNA von einer DNA-Sequenz;
Terminator: Sequenzelement, das für die (>) Termination verantwortlich ist
Transformations Vektor: geklontes DNA-Molekül, das hergestellt wurde um (>) Transformation eines (>) Genoms zu vermitteln;
Transformation: Prozess der zum Einführen, Entfernen oder Verändern von DNA- Sequenzen durch Behandlung von (>) Pflanzen oder Pflanzen Zellen einschließlich der Benutzung von wenigstens einem (>) Transformations Vektor, führt;
Transgen: DNA-Sequenz die aus einem (>) Genom in ein anderes überführt wurde;
uidA: (>) codierender Bereich bakterieller β-Glucuronidase, einem häufig benutzten Reporter- Protein.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 Plastidentransformationsvektor plCFB1,
Fig. 2 Southern-Analyse von mit plCFB1 transformierten Pflanzen
NcoI-geschnittene Gesamt-DNA wurde auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und mit einer radioaktiv markierten Sonde markiert, die der Tabak-Plastomsequenz 109986 bis 111112 entspricht. Spur 1: DNA aus nicht transformierten Pflanzen (Nicotiana tabacum cv. Petite Havana); Spur 2: DNA aus der transplastomischen Linie 239-1 nach einem Sprossregenerationszyklus; Spur 3: DNA aus der transplastomischen Linie 239-1 nach fünf Sprossregenerationszyklen,
Fig. 3 Restriktionsanalyse von aus transplastomischen Pflanzen isoliertem Plasmid plCFB1
Spur 1: DNA-Standard Lambda DNA/Eco130l-Mlul (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania) mit den Fragmenten 956, 1268, 1489, 882, 2205, 2419, 2690, 3472, 4254, 5090, 6223, 7743, 9824, 19329 und 26287 bp; Spur 2: Plastideritransformationsvektor plCFB1, HindIII- geschnitten, mit den Fragmenten 1276, 1507, und 3428 bp; Spuren 3 bis 5: HindIII-geschnittene Plasmid-DNA aus drei verschiedenen Bakterienkolonien, die nach Transformation von E. coli mit DNA aus der transplastomischen Pflanzenlinie 239-2 erhalten worden waren,
Fig. 4 Plastidentransformationsvektor plCF652,
Fig. 5 Plastidentransformationsvektor plCF6531,
Fig. 6 Plastidentransformationsvektor plCF6541,
Fig. 7 Plastidentransformationsvektor plCF6551,
Fig. 8 Plastidentransformationsvektor petAOri0; die HindII-Schnittstelle ist die Klonierungsstelle für die 4 Derivate petAOri1, petAOri2, petAOri3 und petAOri4,
Fig. 9 Plastidentransformationsvektor petAOri-Delta aadA,
Fig. 10 Plastidentransformationsvektor plCMFl1,
Fig. 11 SEQ. ID. NO: 1 und SEQ. ID. NO: 2.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Konventionelle Plastidentransformationsvektoren haben eine gemeinsame Struktur

Neben der Entwicklung von Methoden, um DNA in Organellen einzubringen, müssen zwei weitere Voraussetzungen für die Plastidentransformation erfüllt werden, als da wären, die Benutzung von plastidären Sequenz Elementen um die Gen Expression zu regulieren und ortspezifische Integration von neuen oder veränderten Sequenzen durch homologe Rekombination zu erreichen. Homologe Rekombination erfordert die Anwesenheit von Flanken aus Plastom Sequenzen aufwärts und abwärts der gewünschten Insertionsstelle im Transformationsvektor (Zoubenko et al., 1994). Daraus ergibt sich die Anforderung, dass Plastiden-Transformationsvektoren, die zum Einfügen fremder Gene in das Plastom höherer Pflanzen benutzt werden, folgende Elemente gemeinsam haben: (1) eine 5'-Flanke, (2) eine Promoter Sequenz, (3) einen 5'-untranslatierten Bereich, (4) eine codierende Region, die für die komplette Sequenz eines Protein-Gens oder eines nicht-Protein-Gens (wie ein RNA-Gen) codiert, (5) einen 3'-untranslatierten Bereich und eine (6) 3'-Flanke. Zusätzlich (7) wurde postuliert, dass ein plastidärer Replikationsursprung die Integration von Sequenzen ins Plastom erleichtere (US 5693507).
Aus dieser allgemeinen Struktur ergeben sich einige Beschränkungen in der Anwendung dieser Vektoren: (1) diese Vektoren sind artspezifisch, (2) ein Selektionsmarker bleibt in den transplastomischen Pflanzen zurück, (3) jedes Gen muss aufgrund des Terminator-Elements von einem eigenen Promotor transkribiert werden, (4) die verschiedenen plastidären Kontrollelemente, die zur gleichzeitigen Expression von mehreren Gene benötigt werden, können aufgrund von unerwünschten homologen Rekombinationsereignissen zu genetischer Instabilität führen, (5) die Kopienzahl des Transgens/der Transgene kann die Kopienzahl des Plastoms nie übersteigen.
Diese Erfindung beschreibt ein neues Verfahren der Plastidentransformation, durch das die oben beschriebenen Beschränkungen überwunden werden.

Die neuartigen Vektoren dieser Erfindung verwenden Plastom-Elemente, die als Replikationsinitiationsstellen dienen ("Replikationsursprünge")

Das bisherige Verständnis der Replikation von Plastidenchromosomen höherer Pflanzen kann wie folgt zusammengefasst werden: die zirkulären, doppelsträngigen Moleküle (ca. 130-150 kbp) bestehen aus vier Regionen: einer großen singulären Region, einer wiederholten Region A, einer kleinen singulären Region und einer wiederholten Region B, die zur Region A hinsichtlich ihrer Sequenz identisch, hinsichtlich ihrer Orientierung aber invertiert ist. Es wird angenommen, dass die Replikation von den Sequenzelementen "oriA" und "oriB" ausgeht. Da diese Elemente im Tabakplastom innerhalb der wiederholten Regionen liegen, gibt es von jedem Element zwei Kopien. Charakteristisch für die frühe Replikation sind sogenannte "displacement loops". Diese gehen im Verlauf der Replikation in "rolling circles" über (Übersichtsartikel von Kunnimalaiyaan und Nielsen, 1997).
Vektoren, die plastidäre Replikationsstartsequenzen enthalten, aber nicht zur stabilen Integration von fremden Sequenzen ins Chloroplastengenom führen, können in Plastiden erhalten werden, wenn geeignete Selektion angewendet wird, oder wenn die Replikationsfrequenz der extrachromosomalen Plasmide diejenige der Plastommoleküle übersteigt. Tatsächlich wurden solche plasmidähnlichen Strukturen in der Literatur beschrieben. Staub und Maliga (1994) beobachteten bei der Durchführung von Plastidentransformationsexperimenten die spontane Bildung von "NICE1", einem plasmidähnlichen Molekül, welches viel kleiner als der ursprünglich verwendete Transformationsvektor war. Wenn zusätzlich ein geeignetes bakterielles Replikationssignal eingefügt wurde, konnte dieses Molekül sogar als "Schaukelvektor" zwischen E. coli und Chloroplasten aus höheren Pflanzen verwendet werden. Das NICE1-Element wurde verloren, sobald der Selektionsdruck wegfiel. Sequenzen auf den Schaukelvektoren zeigten homologe Rekombination mit homologen Sequenzen im Plastom (Staub und Maliga, 1995); diese Beobachtung spricht für die Erklärung, dass diese Elemente nicht autonom repliziert werden, sondern während der Replikation im Plastom integriert sind und durch Rekombinationsereignisse ausgeschnitten werden. Diese Interpretation gilt höchstwahrscheinlich auch für die in hoher Kopienzahl vorliegenden extrachromosomalen Elemente, die in Chloroplasten von Chlamydomonas reinhardtii als unerwartetes Ergebnis einer Plastidentransformation gefunden wurden (Suzuki et al. 1997). Diese Element gingen mit Umlagerungen im Plastom einher und konnten nicht als Basis für Schaukelvektoren verwendet werden; sekundäre Transformationen destabilisierten das Auftreten dieser Elemente.
Die Verwendung von "ori"-Sequenzelementen wird auch in einem anderen Zusammenhang beschrieben (Daniell et al. 1990; US 5,693,507). Hier wurden Sequenzen, die das oriA-Element aus Erbse enthalten, bei zeitlich begrenzten Expressionsstudien (bis 120 h) in kultivierten Tabakzellen verwendet, die hauptsächlich in vitro ausgeführt wurden. Konzepte zur Gentechnologie in Chloroplasten erfordern dagegen langfristige und stabile Expression von Fremdgenen in vivo.
Wir konnten nun überraschenderweise eine langfristige Erhaltung von Plasmiden in transformiertem Gewebe beobachten (über ein Jahr; bis zu neun Zyklen wiederholter Regeneration aus Blattexplantaten in der Abwesenheit von Selektionsdruck; s. Beispiel 1). Transformation von Bakterien mit der aus transformiertem Gewebe extrahierten Gesamt-DNA ergab Plasmide, die hinsichtlich Größe und Restriktionsmuster mit dem Chloroplasten- Transformationsvektor identisch sind. Da der Transformationsvektor eine Integrationskassette enthielt, konnte mittels Southern-Analyse die Integration von Sequenzen in die angestrebten Stellen im Plastom gezeigt werden, ebenso wie die Anwesenheit von plasmidähnlichen Molekülen. Es konnten keine Anzeichen für eine Integration der kompletten Plasmidsequenz ins Plastom gefunden werden. Die Southern-Analyse ergab eine erhöhte Kopienzahl des Plasmids im Vergleich zur Kopienzahl der Plastommoleküle.
Die für die Erhaltung der extrachromosomalen Plasmide verantwortlichen Sequenzen konnten identifiziert werden. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Sequenzen, die sich für die langfristige Erhaltung als essentiell erwiesen, keine bekannten plastidären Replikationsursprungssequenzen enthalten. Auf der Grundlage dieser Beobachtung konnten Vektoren konstruiert werden, die - im Gegensatz zu konventionellen Plastidentransformationsvektoren - keine homologen Flanken für die Rekombination enthalten. Ebenso enthalten diese Vektoren keinerlei Terminatorsequenzen oder 3'-UTR-Strukturen, wodurch lange polycistronische Transkriptionseinheiten gebildet werden.

Die neuartigen Vektoren dieser Erfindung ermöglichen die polycistronische Expression von Genen

Die in dieser Erfindung beschriebenen Vektoren enthalten keine Transkriptions-Terminations- und/oder -Initiationssequenzen für die plasmidkodierten Gene. Vorzugsweise fehlen Terminatorsequenzen. Mehrere Gene können von einem funktionellem Promotor als künstliches Operon transkribiert werden. Um eine effektive Translation jeder einzelnen gewünschten Sequenz des polycistronischen Transkripts sicherzustellen, werden geeignete ribosomale Bindestellen vorzugsweise in die Spacer-Elemente, die die jeweiligen gewünschten Sequenzen trennen, eingefügt. Der Klonierungsaufwand für die Konstruktion der Expressionskassetten wird beträchtlich verringert. Darüber hinaus kann, da die extrachromosomalen Elemente zirkulär sind, kontinuierliche Transkription erfolgen ("rollingcircle"-artig), wodurch höhere Expressionsniveaus von gewünschten Sequenzen möglich werden.

Überschüssige Homologie-Bereiche führen zu genetischer Instabilität - die neuen Vektoren dieser Erfindung vermeiden überschüssige homologe Sequenzen

Homologe Sequenzen, die für die Expression von Transgen(en) benötigt werden, können genetische Instabilitäten hervorrufen, besonders solange transformiertes und untransformiertes Plastom nebeneinander in der selben Organelle vorliegen (Eibl et al., 1999). Die neuen Vektoren bestehen aus weniger Elementen als konventionelle Plastiden Transformations-Vektoren. Als Konsequenz ermöglicht diese Erfindung stabile Plastiden- Veränderungen, aufgrund der Benutzung von weniger homologen Sequenzen, besonders das stabile Einfügen von transgenen Sequenzen, so dass sie funktionell vererbt werden und in stabile Zelllinien und Pflanzen übertragen werden können. Diese Strategie wird auch auf die "entfernbaren Schaukelvektoren" angewendet, die Integrationskassetten tragen (s. u.).

Die neuartigen Vektoren dieser Erfindung weisen erhöhte Kopienzahlen auf

Die Genexpression wird von einer großen Zahl von Parametern beeinflusst, darunter Promotorstärke, RNA-Stabilität, Translationseffizienz und Protein-Turnover. Ein weiterer wichtiger Parameter ist die Kopienzahl der kodierenden DNA-Sequenz. Eine lineare Abhängigkeit zwischen Kopienzahl und Expression kann bis zu einem gewissen Grad angenommen werden. Die in dieser Erfindung verwendeten Plasmide zeigen signifikant erhöhte Kopienzahlen im Vergleich zu den Plastommolekülen (2- bis 5fach). Folglich bieten diese Plasmidvektoren eine optimale Grundlage für extrem hohe Expressionsniveaus von Transgenen in Plastiden. Sehr hohe Expressionsniveaus rekombinanter Gene können für eine Reihe von Anwendungen äußerst nützlich sein, so z. B. für die Produktion von proteinbasierenden pharmazeutischen Substanzen, biologisch Figaubaren Rohstoffen oder anderen Proteinen im plastidären Kompartiment. Bei gleichzeitiger Ausnutzung von starken Regelelementen und hoher Kopienzahl können extrachromosomale Plasmide in Plastiden zu außerordentlich hohen Konzentrationen von Fremdprotein(en) führen, die mit konventionellen Pflanzentransformationsmethoden nicht erreicht werden können.

Die neuartigen Vektoren dieser Erfindung sind nicht artspezifisch

Konventionelle Chloroplasten-Transformationsvektoren enthalten Sequenzen aus dem Chloroplastengenom der zu transformierenden Pflanzenart, die als homologe Flanken für die Integration von Transgenen mittels homologer Rekombination dienen. Üblicherweise sind die Expressionskassette(n) von zwei Plastomsequenzen aus der angestrebten Integrationsstelle flankiert. Die Plastome verschiedener Arten zeigen signifikante Abweichungen sowohl in der übergeordneten Struktur als auch in der Sequenz, was die Verwendung von artspezifischen Flanken bei der Entwicklung von Transformationsvektoren nötig macht. Darüber hinaus ist die plastidäre DNA-Sequenz und die Genabfolge der meisten Pflanzenarten noch nicht bekannt. Dies erfordert zusätzlichen Aufwand bei der Konstruktion von Transformationsvektoren für verschiedene Pflanzenarten. Die in dieser Erfindung beschriebene neue Methode umgeht - wenigstens in einigen Teilen - die Notwendigkeit, Flanken für die stabile Insertion des Transgens zu klonieren. Auch kann die Integration in die Plastiden-DNA zu unerwünschten Effekten auf die plastidäre Genexpression führen, auch dann, wenn sogenannte intergenische Sequenzen angezielt werden, die regulatorische Sequenzen enthalten können. Die Verwendung von nicht-integrierenden Transformationsvektoren umgeht auch dieses Problem.

Die neuartigen Vektoren dieser Erfindung können dazu verwendet werden, Antibiotikamarkerfreie transplastomische Pflanzen herzustellen

Ein Hauptkritikpunkt an der Pflanzenbiotechnologie ist die Anwesenheit von - hauptsächlich bakteriellen - Markergenen in den transformierten Pflanzen. Es gibt Bedenken, dass es zu einem unkontrollierten Ausbreiten dieser Gene in die Umwelt kommt, entweder durch unerwünschtes Einkreuzen in Wildarten oder durch horizontalen Gentransfer, der durch Bodenbakterien vermittelt wird. Obwohl die erste Möglichkeit (Kreuzung) bei den hauptsächlich mütterlich vererbten Plastom-Transgenen unwahrscheinlich ist, kann die zweite Möglichkeit (horizontaler Gentransfer) nicht absolut ausgeschlossen werden. Daher ist es höchst erstrebenswert, Methoden zum Gentransfer zu entwickeln, die in Antibiotikamarker-freien Pflanzen resultieren. Eine Möglichkeit zum Erreichen dieses Ziels wurde kürzlich von lamtham und Day (2000) gezeigt, die demonstrieren konnten, dass es möglich ist, einen Antibiotika- Marker aus Plastomtransformanten zu entfernen, indem man nach Exzisionsereignissen, die von wiederholten Elementen auf dem Transformationsvektor vermittelt werden, sucht. In dieser Erfindung werden mehrere verschiedene Prozeduren beschrieben, die zu Transplastomen führen, die keinen Antibiotika-Selektionsmarker enthalten.
Ein Beispiel (Beispiel 5) verwendet ein endogenes Plastidengen als Selektionsmarker, welches direkt oder indirekt funktionell an der Fotosynthese beteiligt ist. Ein Beispiel für ein direkt an der Fotosynthese beteiligtes Gen ist petA, welches für den fotosynthetischen Elektronentransport essentiell ist (ein Beispiel für ein indirekt in die Fotosynthese involviertes Gen ist rpoA, welches die plastidencodierte RNA-Polymerase codiert. Knockout-Mutanten von rpoA können keine Fotosynthese betreiben, weil die Transkription der direkt an der Fotosynthese beteiligten Gene blockiert ist). In einem ersten Schritt wird das betreffende fotosynthese-relevante Gen unterbrochen. Dieses Material dient dann als Rezipientenlinie für eine zweite Plastidentransformation, bei der die Selektion nach Plastiden, die den Transformationsvektor enthalten, erreicht wird, indem die wiederhergestellte Fotosynthesefunktion als Marker verwendet wird. Dieser neuartige Typ von "Marker" wird nicht von homologen Sequenzen zur Integration flankiert, sondern bleibt in den Plastiden auf dem autonom replizierenden Plasmid. Da die Fotosynthese für Pflanzen, die auf Erde wachsen, essentiell ist, besteht ein konstanter Selektionsdruck für die Erhaltung des Plasmids, das die fotosynthese-relevante Funktion trägt. Wenn der erste Transformationsschritt durch die Insertion eines Antibiotika-Selektionsmarkers (oder Herbizid-Selektionsmarkers) erreicht worden ist (wie in Beispiel 4 und 5), ist es möglich, diesen Marker durch Ko-Transformation mit einem geeigneten Plasmid. während der zweiten Transformation zu entfernen oder zu inaktivieren, wie in Beispiel 5 beschrieben. Das betreffende Fotosynthese-Gen ist nicht mit einem Terminatorelement verbunden, um die Transkription eines oder mehrerer gewünschter Gene zu ermöglichen und um durch die "rolling-circle"-artige Transkription ein sehr hohes Expressionsniveau zu erreichen.
Ein anderes Vorgehen (Beispiel 6) verwendet die autonom replizierenden Plasmide als "Schaukelvektoren", die die Integration von gewünschten Genen, aber nicht des Selektionsmarkers, vermitteln. Der Selektionsmarker bleibt auf dem autonom replizierenden Plasmidvektor, da er nicht von homologen Sequenzen flankiert wird. Wenn der Selektionsdruck entfernt wird, nachdem das transformierte Pflanzenmaterial den homoplastomischen Zustand erreicht hat, geht der Vektor verloren, während das gewünschte Gen stabil ins Plastom integriert ist. Dieses Verfahren basiert auf der Verwendung eines Teils der Sequenz, die die autonome Replikation vermittelt, da ein vollständiges Element eine unerwünscht hohe Replikationsfrequenz bewirken würde. Eine Replikationsfrequenz, die die Replikationsfrequenz des Plastoms übersteigt, führt zur Stabilisierung des Plasmids auch in der Abwesenheit von Selektionsdruck (solch eine hohe Replikationsfrequenz wird von den hier beschriebenen Elementen vermittelt). Folglich lässt sich der Verlust des Plasmids in der Abwesenheit von Selektionsdruck vorzugsweise durch die Verwendung von Deletionsmutanten der beschriebenen Sequenzelemente erreichen, die zu einer verringerten Replikationsgeschwindigkeit führen.
Eine Variante dieser Methode erlaubt die Herstellung von Selektionsmarker-freien Transformanten auch dann, wenn Elemente, die eine sehr hohe Replikationsfrequenz vermitteln, verwendet werden. Die Markerkassette - z. B. das aadA-Gen in Beispiel 6 - wird von einer direkten Wiederholung von Sequenzen flankiert, die nicht homolog zum Plastom sind. In Beispiel 6 wird die direkte Wiederholung durch ein Sequenzelement aus dem bakteriellen Vektor hergestellt. Homologe Rekombination führt zum Ausschneiden des Markergens aus den Schaukelplasmiden. Dieses Verfahren zeigt einige Ähnlichkeiten zu der von lamtham und Day (2000) beschriebenen Entfernung des Markergens. Im Gegensatz dazu wird das Markergen jedoch nicht nach einem Integrationsereignis aus dem Plastom entfernt, sondern aus einem autonom replizierenden Plasmid ausgeschnitten.

Die hier beschriebene neuartige Plastidentransformationsmethode vereinigt mehrere Vorteile

Diese Erfindung ist neuartig, da sie die Verwendung einer neuen Plastidentransformationsmethode beschreibt, bei der Vektoren verwendet werden, die (1) nicht notwendigerweise plastidäre Flanken für die homologe Rekombination enthalten, die (2) durch Erhöhung der Kopienzahl des DNA-Templates UND durch Ausnutzung einer "rolling-circle"- artigen Transkription ohne Terminatorelemente ungewöhnlich hohe Expressionsniveaus erlauben, und die (3) das Auftreten von Marker-Genen in den transgenen Pflanzen, zumindest in einigen Verkörperungen, vermeiden.
Die Methoden dieser Erfindung können benutzt werden, um Pflanzenzellen. oder Pflanzen mit stabil oder nicht-stabil transformierten Plastiden zu erzeugen. Plastiden vieler verschiedener Pflanzenarten können transformiert werden. Die Erfindung ist auf ein- und zweikeimblättrige Pflanzen anwendbar. Nutzpflanzen sind besonders bevorzugt. Beispiele solcher Nutzpflanzen sind Mais, Reis, Weizen, Hafer, Roggen, Gerste, Soja, Tabak, Tomate, Kartoffel, Trauben, Erdnuss, Süßkartoffel, Luzerne, Hirse, Erbse und Baumwolle.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weitergehend beschrieben.

BEISPIELE

Beispiel 1

Autonom replizierender Plastidentransformationsvektor mit Integrationskassette (plCFB1)

Herstellung des Plastidentransformationsvektors plCFB1

Eine Kassette aus der Aminoglycosid-3'-adenyltransferase (aadA) aus E. coli unter der Kontrolle des rrn16-Promotors aus Tabak wurde wie folgt hergestellt: ein den rrn16-Promotor enthaltendes DNA-Fragment wurde mittels PCR aus Tabak-DNA (Nicotiana tabacum cv. Petite Havana) mit den Primern "5-24" (5'-ccgaattcgccgtcgttcaatgag-3') und "3-21" (5'- cacgatatcgcccggagttg-3') amplifiziert. Dieses Fragment wurde mit EcoRI und EcoRV geschnitten. Ein Linker-DNA-Fragment, welches die ribosomale Bindestelle (RBS) des rbcL- Gens aus Tabak beinhaltet, wurde durch Hybridisierung der Primer "5-rbs" (5'- ctcgatatcactagttgtagggaggga-3') und "3-rbs" (5'-gtgccatggatccctcct-3') hergestellt. Die Überhänge wurden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und das Fragment mit EcoRV und NcoI geschnitten. Das Plasmid pUC-atpX-AAD (zur Verfügung gestellt von Dr. M. Goldschmidt- Clermont, Department of Plant Biology and Molecular Biology, University of Geneva, Switzerland; Goldschmidt-Clermont, 1991), welches die kodierende Sequenz des bakteriellen aadA-Gens, gefolgt von einem 440 bp Fragment aus der nichtkodierenden Sequenz stromabwärts des rbcL-Gens von Chlamydomonas reinhardtii, enthält, wurde mit EcoRI und NcoI geschnitten, um den ursprünglichen Promotor zu entfernen. Das mit EcoRV und NcoI geschnittene RBS-Fragment und das mit EcoRI und EcoRV geschnittene rrn16-Promotor- Fragment wurden gleichzeitig in den promotorlosen Vektor pUC-atpX-AAD eingefügt, wodurch das Plasmid pUC16SaadA erhalten wurde. Eine zusätzliche SmaI/XmaI-Schnittstelle stromaufwärts vom rrn16-Promotors wurde durch Insertion eines Linker-Oligonukleotids (gaattcccgggaattc) in die EcoRI-Schnittstelle geschaffen (pUC16SaadA-Sma).
Ein Fragment der Plastiden-DNA aus Tabak (Nicotiana tabacum cv. Petite Havana) (Basenpaar 112061 bis 113058; Accession Number Z00044) wurde mittels PCR aus isolierter Tabak-DNA unter Verwendung der Primer b1-1 (5'-ggggtaccgaatttgattcacaaagttg-3') und b1-2 (5'- gctctagatgtggtattccacctcttgc-3') amplifiziert. Das resultierende Fragment wurde mit KpnI und XbaI geschnitten und in die entsprechenden Schnittstellen des Plasmids pUC16SaadA-Sma eingefügt (stromabwärts vom aadA-Gen). Ein zweites Tabak-Plastiden-DNA-Fragment (109986 bis 111112) wurde unter Verwendung der Primer b1-3 (5'-tccccccgggctcagaggattagagcacg-3') und b1-4 (5'-tccccccgggagtccgaccacaacgacc-3') amplifiziert, mit XmaI geschnitten und in die entsprechende Schnittstelle des oben beschriebenen Plasmids, stromaufwärts von dem chimärischen aadA-Gen, eingeführt, so dass das b1-4-Ende des Fragments an den rrn16- Promotor grenzt. In dem resultierenden Transformationsvektor plCFB1 (Fig. 1) wird die aadA- Kassette von plastidären DNA-Sequenzen flankiert, die die Integration des chimärischen Gens ins Plastom ermöglichen, wobei die Plastomsequenz 111113 bis 112060 ersetzt wird. Außerdem kann dieser Vektor als intaktes Plasmid in transformierten Chloroplasten erhalten bleiben.

Plastidentransformation von N. tabacum durch Genbeschuss

Tabaksamen (Nicotiana tabacum cv. Petite Havana) wurden oberflächensterilisiert (1 Min in 70% Ethanol, 10 Min in 5% Dimanin C, Bayer, Leverkusen, Deutschland), 3mal für 10 Min. in sterilem H2O gewaschen und auf B5-Medium (siehe unten) ausgebracht. Pflanzen wurden bei 25°C in einem Zyklus von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkel angezogen (0.5-1 W/m², Osram L85 W/25 Universal-White Fluoreszenz-Lampen).
6 Blätter von 4 Wochen alten, steril angezogenen Nicotiana tabacum-Pflanzen wurden abgeschnitten und auf RMOP-Medium (Herstellung siehe unten) gelegt. 35 µl einer Goldsuspension (0.6 Micron, Biorad, München; 60 mg/ml in Ethanol) wurden in ein steriles Reaktionsgefäß (Treff, Fisher Scientific, Ingolstadt, Deutschland) überführt, das Gold durch Zentrifugation gesammelt und mit 1 ml sterilem H2O gewaschen. Zum Goldpellet wurden 230 µl steriles H2O und 250 µl 2.5 M CaCl2 sowie 25 µg Plasmid-DNA (Transformationsvektor B1) gegeben. Nach sorgfältigem Resuspendieren wurden 50 µl 0.1 M Spermidin zugegeben, gemischt und 10 Min. auf Eis inkubiert. Die beladenen Goldpartikel wurden durch Zentrifugation (1 Min., 10 000 UpM) gesammelt, zweimal mit 600 µl Ethanol (100%, p. A.) gewaschen und abschließend in 72 µl Ethanol (100%, p. A.) resuspendiert. Je 5,4 µl der Goldsuspension wurden auf einen Macrocarrier aufgebracht. Der Beschuss wurde mit einem Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery System unter Einhaltung folgender Parameter durchgeführt:

- Berstscheibe 900 psi
- Heliumdruck 1100 psi
- Vakuum 26-27 inches Hg
- Macrocarrier auf oberstem Einschub
- Blatt auf drittem Einschub

Zwei Tage nach dem Beschuss wurden die Blattstücke in kleine Teile (ca. 3 × 3 mm) geschnitten und auf RMOP-Medium mit 500 µg/ml Spectinomycin übertragen. Nach zwei Wochen wurden die Blattstücke nochmals geschnitten, dann alle 3 Wochen bis keine weiteren Regenerate mehr erschienen. Grüne Regenerate wurden gesammelt und auf einzelne Platten übertragen. Die erhaltenen Pflanzenlinien wurden wiederholten Sprossbildungszyklen durch Abschneiden kleiner Blattstücken unterworfen, die neue Regenerate auf RMOP-Medium mit 500 µg/ml Spectinomycin bildeten. Die Bewurzelung ausgewählter Regenerate wurde auf B5-Medium mit 500 µg/ml Spectinomycin durchgeführt.

RMOP (pH 5.8 mit KOH)

NH4NO3	1650 µg/ml
KNO3	1900 µg/ml
CaCl2 × 2H2O	440 µg/ml
MgSO4 × 7H2O	370 µg/ml
KH2PO4	170 µg/ml
EDTA-Fe(III)Na	40 µg/ml
KI	0.83 µg/ml
H3BO3	6.2 µg/ml
MnSO4 × H2O	22.3 µg/ml
ZnSO4 × 7H2O	8.6 µg/ml
Na2MoO4 × 2H2O	0.25 µg/ml
CuSO4 × 5H2O	0.025 µg/ml
CoCl2 × 6H2O	0.025 µg/ml
Inositol	100 µg/ml
Thiamin-HCl	1 µg/ml
Benzylaminopurin	1 µg/ml
Naphthalenessigsäure	0.1 µg/ml
Zucker	30000 µg/ml
Agar, gereinigt	8000 µg/ml

B5 (pH 5.7 mit KOH)

KNO3	2500 µg/ml
CaCl2 × 2H2O	150 µg/ml
MgSO4 × 7H2O	250 µg/ml
NaH2PO4 × H2O	150 µg/ml
(NH4)2SO4	134 µg/ml
EDTA-Fe(III)Na	40 µg/ml
KI	0.75 µg/ml
H3BO3	3 µg/ml
MnSO4× H2O	10 µg/ml
ZnSO4 × 7H2O	2 µg/ml
Na2MoO4 × 2H2O	0.25 µg/ml
CuSO4 × 5H2O	0.025 µg/ml
CoCl2 × 6H2O	0.025 µg/ml
Inositol	100 µg/ml
Pyridoxin-HCl	1 µg/ml
Thiamin-HCl	10 µg/ml
Nikotinsäure	1 µg/ml
Zucker	20000 µg/ml
Agar, gereinigt	7000 µg/ml

Molekulare Analyse von Plastidentransformanten

Isolation von DNA aus Pflanzen

100 mg frisches Blattgewebe wurden mit 200 µl AP1-Puffer (DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Hilden, Germany) + 1 µl Reagens DX (Schaumverhinderung, QIAGEN) in einem 1.5 ml-Reaktionsgefäß mit einer 3 mm Wolfram-Karbid-Kugel in einer Kugelmühle mm 300 (Retsch, Germany) aufgeschlossen (2 × 1 Min. bei 25 Hz). Die DNA wurde anschließend unter Verwendung des DNeasy Plant Mini Kits gereinigt.

Southern-Analyse

Pro zu untersuchender Pflanze wurde 1 µg Gesamt-DNA mit NcoI verdaut und auf einem 1%-Agarosegel aufgetrennt. Die DNA wurde denaturiert und nach einem Standardprotokoll (Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition, Unit 2.9A) auf eine positiv geladene Nylonmembran (Hybond-N+, Amersham Pharmacia Biotech, UK) übertragen. Die Membran wurde mit einer P32-markierten Sonde in 250 mM Na- Phosphat, 7% SDS bei 65° hybridisiert und mit 0.5 × SSC, 0.1% SDS bei der gleichen Temperatur gewaschen. Die Hybridisierungssignale wurden mit einem Phosphoimager (Fujifilm BAS 1500) detektiert.
Ein 1131 bp großes SmaI-Fragment aus Plasmid. plCFB1, das der Tabak- Plastomsequenz 109986 bis 111112 (und 131514 bis 132640) entspricht, wurde als Sonde zum Nachweis von Wildtyp-Plastom, transformiertem Plastom und extrachromosomalem Transformationsvektor verwendet. Das Fragment wurde nach Gelelektrophorese mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen, Hilden, Germany) gereinigt und mit Klenow-DNA- Polymerase und Random-Primern radioaktiv markiert. Diese Sonde hybridisiert in Wildtyp- Plastiden-DNA mit NcoI-Fragmenten von 17 836 bp und 7055 bp Länge, entsprechend den zwei Kopien der Sequenz im Inverted Repeat A bzw. B (Fig. 2, Spur 1). In Plastommolekülen, in denen die aadA-Kassette durch homologe Rekombination an der vorgesehenen Stelle integriert ist, wird aufgrund einer neuen NcoI-Schnittstelle ein 4761 bp-Fragment anstelle des 7055 bp- Fragments detektiert (Fig. 2, Spuren 2 und 3). Extrachromosomaler Transformationsvektor wird in seiner linearisierten Form detektiert (6211 bp NcoI-Fragment, Fig. 2, Spuren 2 and 3). Die stärkere Markierung dieser Bande deutet darauf hin, dass das extrachromosomale Element in höherer Kopienzahl als das Plastom vorhanden ist. Das extrachromosomale Element wurde auch nach 5 Zyklen wiederholter Sprossregeneration nicht verloren (Fig. 2, Spur 3).

Wiedergewinnung von plCFB1 aus transplastomischen Pflanzen

Um die Intaktheit des Transformationsvektors nach Vermehrung in Pflanzen zu überprüfen, wurde isolierte Pflanzen-DNA der transplastomischen Linie 239-2 (nach 3 Zyklen wiederholter Sprossregeneration) zur Transformation von E. coli verwendet (Standardmethode mit CaCl2). Aus dieser Transformation gingen ampicillinresistente Bakterienkolonien hervor, bei denen anschließend eine Plasmidisolation durchgeführt wurde (Standardmethode alkalische Lyse). Eine Restriktionsanalyse der aus diesen Kolonien isolierten Plasmid-DNA ergab das identische Restriktionsmuster wie bei dem ursprünglichen Transformationsvektor plCFB1 (Fig. 3). Dies zeigt, dass das Plasmid in transplastomischen Pflanzen ohne rekombinatorische Veränderungen propagiert wird und als ursprünglicher Transformationsvektor wiedergewonnen werden kann.

Beispiel 2

Autonom replizierende Plastidentransformationsvektoren plCF652, plCF653, plCF654, plCF655

Zur Herstellung autonom replizierender Plastidentransformationsvektoren, bei denen keine teilweise Integration in das Plastom durch flankierende homologe Rekombinationsereignisse möglich ist, wurde das Plasmid plCFB1 so modifiziert, dass nur jeweils ein Bereich plastidärer Sequenz enthalten ist. Zusätzlich wurde die Terminatorsequenz des chimärischen aadA-Gens entfernt, um kontinuierliche Transkription um das zirkuläre Plasmid herum zu ermöglichen.
Der Transformationsvektor plCF652, der nur die linke Plastiden: DNA-Flanke von plCFB1 zusammen mit einer terminatorlosen aadA-Sequenz enthält (Fig. 4), wurde durch Restriktion von Plasmid plCFB1 (s. Beispiel 1) mit PstI und anschließender Religation hergestellt. Der Transformationsvektor plCF652, der nur die rechte Plastiden-DNA-Flanke von plCFB1 zusammen mit einer terminatorlosen aadA-Sequenz enthält (Fig. 5), wurde durch Ausschneiden der rechten Flanke aus plCFB1 mit SacI und XbaI und Insertion des mit T4-DNA-Polymerase behandelten 1,1 kb-Fragments in Plasmid pUC16SaadA-Sma (s. Beispiel 1) hergestellt, welches mit PstI und HindIII geschnitten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden war, um die Terminatorsequenz zu entfernen. Diese Ligation ergab zwei unterschiedliche Plasmide, die das Insert in verschiedenen Orientierungen enthalten, nämlich plCF6531 und plCF6532, welche beide zur Pflanzentransformation verwendet wurden.
Die Transformationsvektoren plCF654 und plCF655, die jeweils nur einen Teil der rechten Flanke von plCFB1 zusammen mit einer terminatorlosen aadA-Sequenz enthalten (Fig. 6 und 7), wurden auf die gleiche Weise wie plCF653 hergestellt, aber unter Verwendung eines 0,3 kb großen ScaI-XbaI-Fragments aus plCFB1 (für plCF654) oder eines 0,8 kb großen SacI-ScaI- Fragments (für plCF655).
Die daraus resultierenden Plasmide wurden zur Transformation von Tabak wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet, um Elemente zu definieren, die für die autonome Replikation in Plastiden essentiell sind.
Die Anwesenheit und relative Kopienzahl der autonom replizierenden Plastidentransformationsvektoren in den Plastiden transformierter Pflanzenlinien wird nach drei Zyklen wiederholter Sprossregeneration wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht.

Beispiel 3

Autonom replizierende Plastidenexpressionsvektoren

Die in Beispiel 2 identifizierten Fragmente, die autonome replikation in Plastiden vermitteln, wurden zur Herstellung von Kassetten zur Expression von Transgenen ausgewählt. In diesen Expressionskassetten wird eine gewünschte Gensequenz, welche eine 5'-nichttranslatierte translationsvermittelnde Sequenz, enthält, stromabwärts von der terminatorlosen aadA- Kassette eingefügt. Zu diesem Zweck wird die uidA-Sequenz zusammen mit einem 52 bp- Fragment der nichtkodierenden intergenischen rps19/rpl22 Tabaksequenz (ctgcagataaaaaaaatctacatgcttatgattcagtagtaggaggcaaacc) aus Plasmid. plC582 (s. Beispiel 5) mit PstI und KpnI ausgeschnitten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt.
Dieses Fragment wird in die T4-DNA-Polymerase behandelte PstI-Schnittstelle von plCF652 eingefügt, wodurch der plastidäre Expressionsvektor plCF652-GUS entsteht. In ähnlicher Weise wird dieses Fragment auch in die T4-DNA-Polymerase behandelte KpnI-Schnittstelle von plCF653 bzw. plCF655 eingefügt, um so die plastidären Expressionsvektoren plCF653-GUS bzw. plCF655-GUS zu erhalten.
Zur Herstellung des plastidären Expressionsvektors plCF654-GUS wird besagtes Fragment zusammen mit dem 0,3 kb-ScaI-XbaI-Fragment in das PstI-HindIII-geschnittene Plasmid pUC16SaadA-Sma eingefügt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die korrekte Orientierung der Expressionskassette wird durch Restriktionsanalyse überprüft. Die resultierenden Plasmide werden zur Transformation von Tabak wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet.

Beispiel 4

Autonom replizierende Plastidentransformationsvektoren petAOri1, petAOri2, petAOri3 und petAOri4 unter Verwendung fotoautotropher Selektionsbedingungen

Die Plasmide petAOri1-4 enthalten die gleichen Replikationselemente wie in Beispiel 2 beschrieben, hier wird aber das petA Gen als Selektionsmarker verwendet. Diese Vektoren wurden für die Transformation petA defizienter Pflanzen hergestellt, um die Fähigkeit zu autotrophem Wachstum wiederherzustellen. PetA-defiziente Tabak Linien wurden durch Transformation mit Vektor plC588 hergestellt, wobei die codierende Sequenz des petA Gens durch eine aadA Kassette deletiert wurde. Vektor petAOri0 enthält ein dicistronisches Operon bestehend aus 5'-Regelelementen, der petA codierenden Sequenz, einem Spacer (RBS), und der codierenden Sequenz eines gewünschten Gens (uidA). Von diesem Vektor ausgehend wurden vier Derivate konstruiert (petAOri1, petAOri2, petAOri3, petAOri4), mit unterschiedlichen zusätzlichen DNA Fragmenten, die der autonomen Replikation dienen.

Konstruktion von Transformationsvektor plC558, der zur Inaktivierung des plastidär kodierten petA Gens verwendet werden kann

Alle Klonierungen wurden nach Standardprotokollen durchgeführt (Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition).
Der Transformationsvektor plC558 beinhaltet die aadA-Kassette (pUC16S aadA Sma vollst, Koop et al., 1996, siehe Beispiel 1) umgeben von zwei flankierende Sequenzen (Tabak Plastiden-DNA). Diese beiden homologen Flanken entsprechen den DNA-Sequenzen der 5' und 3' Bereiche des petA Gens; die aadA-Kassette ersetzt im transgenen Plastom die Sequenz des petA Gens (962 bp) und 300 bp des direkt anschließenden 3' Bereichs.
Beide flankierenden Fragmente werden mittels PCR amplifiziert, wofür die folgenden Primer verwendet werden: oSK13 (5'-ggaattccatatggtataaaactcatgtgtgtaagaaa-3') und oSK14 (5'- tcccccgggggtccaatcattgatcgcgaaa-3), mit Hilfe derer NdeI/SmaI Restriktionsschnittstellen erzeugt werden, und oSK15 (5'-ttccccgggttctaaatagaaagaaagtcaaatttg-3') und oSK16 (5'- catgcatgcgaatgaataagattctcttagctc-3'), mit deren Hilfe SmaI/SphI Restriktionsschnittstellen erzeugt werden. Folgendes Programm wurde für die PCR verwendet: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 1.5 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Die PCR Fragmente (linke/rechte Flanke) und die aadA-Kassette werden mit den entsprechenden Enzymen verdaut und in einem Schritt in den Vektor pUC19 kloniert, der NdeI/SphI verdaut wird. Das entstandene Plasmid (Vektor plC558) kann über Restriktionsanalysen und Sequenzierung auf Richtigkeit hin überprüft werden.

Erste Transformation und Selektion homoplastomischer petA defizienter Mutanten

Die Plastiden Transformation mit Vektor plC558 unter Verwendung der Particle Gun und die Selektion potentieller Transformanten wird durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben. Homoplastomische petA-defiziente Tabak Linien können als Zielgewebe für Plastidentransformation unter Verwendung der Vektoren petAOri1, petAOri2, petAOri3, petAOri4 dienen. Die Analyse petA defizienter Linien wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Konstruktion der Transformationsvektoren petAOri1, petAOri2, petAOri3, petAOri4

Alle Klonierungen wurden nach Standardprotokollen durchgeführt (Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition).
Die Konstruktion der Vektoren petAOri1, petAOri1, petAOri2, petAOri3, petAOri4 wurde wie folgt durchgeführt: die codierende Sequenz (CS) des petA Gens wurde per PCR amplifiziert unter Verwendung der Primer 'petAfor' (5' aaaaggarccatgcaaactagaaatgctttt tcttg 3') und petArev' (5' ctagaaattcatttcggccaattgaa 3'), wobei am 5' Ende eine BamHI Schnittstelle erzeugt wurde. Folgendes Programm wurde für die PCR verwendet: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 1.5 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Die 5' regulatorischen Elemente von Vektor pUC16SaadA-Sma (Koop et al., 1996, siehe Beispiel 1) wurden durch EcoRI/BamHI Verdau herausgeschnitten. Das PCR amplifizierte petA Genfragment und die 5' regulatorischen Elemente wurden in einem Schritt in Vektor pUC19 kloniert, der vorher mit EcoRI and SmaI verdaut worden war. Um die RBS und das uidA Gen downstream zum petA Gen klonieren zu können, wurde ein DNA Fragment, welches die RBS und das uidA Gen enthält, aus dem Vektor pUC16SRBSuidA (Koop et al., 1996) durch KpnI und partiellen EcoRV Verdau isoliert. Dieses Fragment wurde blunt in die XbaI Schnittstelle des Vektors mit der petA CS und den 5' regulatorischen Elementen kloniert. Das entstandene Plasmid (Vektor petAOri0) kann über Restriktionsanalysen und Sequenzierung auf Richtigkeit hin überprüft werden.
Dieser Vektor, petAOri0, kann für die Klonierung der Vektoren petAOri1, petAOri2, petAOri3, petAOri4 verwendet werden: das Plasmid wurde mit HindIII verdaut und die sticky Enden mit Hilfe der T4 Polymerase abverdaut. Für die Konstruktion von Vektor petAOri1 wurde die linke Flanke von Vektor plCFB1 (siehe Beispiel 1) durch SmaI Verdau isoliert und in die HindIII Schnittstelle von Vektor petAOri0 kloniert. Für die Konstruktion von Vektor petAOri2 wurde die rechte Flanke von Vektor plCFB1 (siehe Beispiel 1) durch SacI/XbaI Verdau isoliert und blunt in die HindIII Schnittstelle kloniert. Für die Konstruktion von Vektor petAOri3 wurde ein 0,3 kb Fragment der rechten Flanke von Vektor plCFB1 (siehe Beispiel 1) durch ScaI/XbaI Verdau isoliert und blunt in die HindIII Schnittstelle eingefügt. Für die Konstruktion von Vektor petAOri4 wurde ein 0,8 kb Fragment der rechten Flanke von Vektor plCFB1 (siehe Beispiel 1) durch SacI/ScaI Verdau isoliert und blunt in die HindIII Schnittstelle eingefügt. Die entstandenen Konstrukte (Vektoren petAOri1, petAOri2, petAOri3 und petAOri4) können über Restriktionsanalysen auf Richtigkeit hin überprüft werden. Plastidentransformationsvektor petAOri0 ist in Fig. 8 zu sehen.

Zweite Transformation und Selektion rekonstituierter homoplastomischer petA defizienter Mutanten

Homoplastomische petA-defiziente Tabaklinien können als Zielgewebe für die Plastidentransformation unter Verwendung der Vektoren petAOri1, petAOri2, petAOri3, petAOri4 verwendet werden Die Transformation mit Hilfe der Particle Gun wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Selektion der Transformanten wurde auf RMOP Medium mit reduziertem Zuckergehalt (0,3%) durchgeführt. Nur Transformanten, bei denen das petA Gen wiedereingeführt wurde, sind in der Lage, fotosynthetische Energie zum Wachstum nutzen. Transformanten sollten während der Zyklisierung eine Reduktion an hcf (high chlorophyll fluorescence) und eine Veränderung des "pale green" Phänotyps hin zum Wildtyp aufzeigen. Die Analyse potentieller Transformanten wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 5

Entfernung des aadA Gens von transplastomischen petA-defizienten Pflanzen mittels Co-Transformation

PetA-defiziente Tabakpflanzen, die als Zielgewebe für die Plastiden Transformation mit den Vektoren petAOri1, petAOri2, petAOri3, petAOri4 verwendet werden, enthalten eine aadA- Kassette. Im Verlauf der zweiten Transformation mit einem der petAOri Vektoren verbleibt das aadA Gen im Plastom, während das petA Gen wiedereingeführt wird. Um den aadA Marker vom Plastom zu entfernen wurde eine Co-Transformation durchgeführt, bei der a) einer der petAOri Vektoren und b) ein Vektor zur Deletion des aadA Gens (petAOri-delta-aadA) eingesetzt wurden.

Konstruktion des Vektors petAOri-delta-aadA

Alle Klonierungen wurden nach Standardprotokollen durchgeführt wie in Beispiel 1 und in Ausubel et al., 1999 (Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition) beschrieben. Die Konstruktion des Vektors wurde wie folgt durchgeführt: die aadA Genkassette aus dem Vektor pUC16SaadA Sma vollst (Koop et al., 1996) wurde durch einen SmaI Verdau herausgeschnitten und in die SmaI Schnittstelle von Vektor pUC19 kloniert. Dann wurde ein Teil der codierenden Sequenz des aadA Gens (358 bp) durch BcII/BsmFI Verdau entfernt, mit Hilfe der T4 Polymerase die überhängenden Enden abverdaut und der Vektor dann religiert. Das entstandene Konstrukt (Vektor petAOri-delta-aadA) kann über Restriktionsanalysen auf korrekte Klonierung und Deletion überprüft werden. Der Plastiden Transformationsvektor petAOri-deltaaadA ist in Fig. 9 gezeigt.

Plastiden Transformation und Selektion reintegrierter homoplastomischer petA defizienter Mutanten, die keinen Antibiotika Resistenzmarker enthalten

Homoplastomische petA-defiziente Pflanzen können als Zielgewebe für die Plastidentransformation unter Verwendung der Vektoren petAOri1-4 und petAOri-delta-aadA zur Co-Transformation eingesetzt werden. Die Plastiden Transformation mit diesen Vektoren unter Verwendung der Particle Gun wurde durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Selektion der Transformanten wurde auf RMOP Medium mit reduziertem Zuckergehalt (0,3%) durchgeführt. Nur Transformanten, bei denen das petA Gen wiederhergestellt wurde, sind in der Lage, die fotosynthetische Energie zum Wachstum nutzen. Transformanten sollten während der Zyklisierung eine Reduktion an hcf (high chlorophyll fluorescence) und eine Veränderung des "pale green" Phänotyps hin zum Wildtyp aufzeigen.
Die Analyse potentieller Transformanten wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 6

Autonom replizierender Schaukel-Vektor plCMFl1

Die Teile, welche autonome Replikation in Plastiden vermitteln (identifiziert wie in Beispiel 2 beschrieben) werden zur Konstruktion eines Schaukelvektors verwendet, der die stabile Integration von einem oder mehreren gewünschten Genen in das Plastom vermittelt.

Herstellung von Plasmid plCF567 - Klonierungsvektor mit erweitertem Multiklonierungsbereich

Der Multiklonierungsbereich des Plasmids pUC19 zwischen der EcoRI und SphI Erkennungssequenz wurde durch das synthetische Oligonukleotid 5'- aattcgggcccgtcgaccctgcaggcccggggatccatatgccatggtctagatgatcatcatcaccatcatcactaatctagagagct cctcgaggcggccgcgcatgcatg-3' ersetzt, woraus sich Plasmid plC567 ergibt.

Herstellung von Plasmid plCF567 - Promotorloser Plastiden-Transformations-Vektor

Plasmid plCF567 wurde mit Bsp120l und HindIII verdaut. Das Vektorfragment mit 2641 Bp wurde mittels Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt, resultierend in Fragment plCF567-B/H. Die psbA 3'-region von Bp 357-1335 des N. tabacum Plastoms wurde mittels PCR mit den Primern 5'-tatagggcccagctataggtttacatttttaccc-3' und 5'-catgctgcagcaagaaaataacctctccttc-3' unter Verwendung von isolierter DNA aus Nicotiana tabacum cv. Petite Havana als Matrize vervielfältigt. Die rpl2 3'-region von Bp 155394-353 des N. tabacum Plastoms wurde mittels PCR mit den Primern 5'-tttcctgcagttattcatgattgagtattc-3' and 5'- ccagaaagaagtatgctttgg-3' unter Verwendung von isolierter DNA aus Nicotiana tabacum cv. Petite Havana als Matrize, vervielfältigt. Die vervielfältigte psbA 3'-region wurde mit Bsp120l und PstI verdaut und mittels des PCR-Reinigungs-Kits von Qiagen (Hilden, Deutschland) gereinigt, resultierend in Linke- Flanke-B/P. Die vervielfältigte rpl2 3-region wurde mit HindIII und PstI verdaut und mittels des PCR-Reinigungs-Kits von Qiagen (Hilden, Deutschland) gereinigt, resultierend in Rechte- Flanke-P/H. Die drei Fragmente, plCF567-B/H, Linke-Flanke-B/P und Rechte-Flanke-P/H wurden gleichzeitig mit T4-Ligase ligiert und ergaben Plasmid plCF569.
Das E. coli aadA Gen wurde mittels PCR mit den Primern 5'- TGAATTCCCATGGCTCGT GAAGCGG-3' und 5'-TATGGATCCTTGCCAACTACCTTAGTGATCTC-3' unter Verwendung von pFaadA II (Koop et al., 1996) als Matrize, vervielfältigt. Das PCR-Produkt wurde mit NcoI und BamHI verdaut und in das zuvor mit denselben Restriktionsenzymen verdaute Plasmid plCF567 ligiert, woraus sich plCF506 ergab. Der N. tabacum rpl32 3'-UTR wurde mittels PCR mit den Primern 5'-ACAAGAGCTCATAAGTAATAAAACGTTCGAATAATT-3' und 5'- AATTCCTCGAGTAGGTCGATGGGGAAAATG-3' unter Verwendung von N. tabacum DNA als Matrize vervielfältigt. Der N. tabacum rpl32 3'-UTR wurde mit SacI und XhoI verdaut und in das zuvor mit denselben Restriktionsenzymen verdaute Plasmid plCF506 ligiert, woraus sich plCF519 ergab. Die E. coli aadA-Sequenz und der N. tabacum rpl32-3'-UTR wurden mittels PCR mit den Primern 5'-ggatccatgcgtgaagcggttatcgccg-3' and 5'-aattcctcgagtaggtcgatggggaaaatg-3' vervielfältigt. Die E. coli uidA-Sequenz wurde mittels PCR mit den Primern 5'- ACAAGAGCTCATAAGTAATAAAACGTTCGAATAATT-3' und 5'- AATTCCTCGAGTAGGTCGATGGGGAAAATG-3' unter Verwendung von Plasmid pRAJ275 (Mike Bevan, gene bank accession U02456.1) als Matrize vervielfältigt. Die PCR-Produkte wurden mit dem PCR-Reinigungs-Kits von Qiagen (Hilden, Deutschland) gereinigt, resultierend in aadA+Trpl32 bzw. uidA. 6 µmol aadA+Trpl32 und 50 µmol des Oligonukleotides 5'-ggggtaccagttgtagggagggatccatgcgtgaagc-3' wurden mit Taq-Polymerase in 1×-Taq-Puffer (MBI) einschließlich 0.2 mM dNTPs für 20 Min. bei 72°C inkubiert. Das daraus resultierende Fragment enthält eine 5'-RBS-Region: RBS+aadA+Trpl32. Es wurde mit KpnI und XhoI verdaut, resultierend in RBS+aadA+Trpl32-K/X. Das PCR-Produkt uidA wurde mit KpnI und XhoI verdaut, resultierend in uidA-N/K. Plasmid plCF567 wurde mit PstI und XbaI verdaut und auf einem 0,8% Agarose-Gel gereinigt. Das Vektor-Fragment mit 2690 BP wurde gereinigt, resultierend in plCF567-PX. 0.6 µmol plCF567-P/X und 300 µmol des synthetischen Oligonukleotides Srps19/rpl22 (5'-ctataccatggtttgcctcctactactgaatcataagcatgtagattttttttatctgca-3') wurden mit T4-Ligase inkubiert und der zweite Strang wurde mit Taq-Polymerase bei 72°C aufgefüllt. Das Produkt wurde mit NcoI und XhoI verdaut, resultierend in plCF567-N/X. 25 fmol plCF567-N/X, 25 fmol uidA-N/K und 25 fmol RBS+aadA+Trpl32-K/X wurden mit T4-Ligase ligiert und ergaben Vektor plCF576. Plasmid plCF576 wurde mit PstI und Mph11031 verdaut. Das Fragment welches SpsaA/B+uidA+RBS+aadA+Trpl32 enthielt, wurde auf einem Agarose- Gel gereinigt und in plCF569, der zuvor mit PstI linearisiert wurde, ligiert, woraus sich Plasmid plCF582 ergab.

Herstellung von plCMFl1-Vektor zur markerfreien Integration

Das aadA-Gen aus plCF582 wurde durch Verdau mit KpnI und SacI entfernt. Die überstehenden Enden wurden mit Klenow-Fragment entfernt und der Vektor wurde mit T4- Ligase religiert, daraus resultierte plCF582A. Die psbA-rpl2 Flanken einschließlich des heterologen uidA-Gens wurde mit Bsp120l und HindIII entfernt. Die Enden des psbA-uidA- rpl2-Fragments wurden mit Klenow-Fragment aufgefüllt und in Plasmid plCF6521 (siehe Beispiel 2), das zuvor mit NdeI linearisiert und mit Klenow-Fragment aufgefüllt wurde, ligiert, woraus sich plCMF1 ergab.

Herstellung von plCMFl2-Vektor zur markerfreien Integration

Die Herstellung wurde wie für plCMFl1 beschrieben, durchgeführt, aber plCF6531 (siehe Beispiel 2) wurde anstelle von plCF6521 benutzt.

Herstellung von plCMFR-Vektor zur Markerentfernung durch Rekombination

Die aadA vorausgehende Vektorregion von plCMFl2 wurde mittels PCR mit den Primern 5'- gatcggtaccatgttctttcctgcgttat-3' und 5'-gatcggtaccaaagtgtaaagcctggggtg-3' vervielfältigt. Das PCR-Produkt wurde mit KpnI linearisiert und in plCMFl2 ligiert, welcher vorher mit KpnI linearisiert wurde. Das daraus resultierende Plasmid wurde sequenziert und ein Plasmid (plCMFR) wurde ausgewählt, in dem die Orientierung des integrierten PCR-Produkts 3' von aadA dieselbe ist wie in der Matrizen-Region 5' von aadA, so dass die aadA-Region von einer direkten Sequenzwiederholung flankiert wird. Die aadA-Kassette kann dadurch mittels homologer Rekombination zwischen diesen beiden Sequenzen entfernt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur genetischen Transformation von Pflanzenplastiden, das die folgenden Schritte umfasst:

1. (a) Ausstatten einer Pflanzenzelle mit DNA, die

a) eine Nukleotidsequenz aufweist, die die autonome Replikation der DNA in einer Pflanzenzelle ermöglicht,

b) mindestens eine gewünschte Sequenz enthält, und

c) für die Transkription

1. (α) frei ist von mit der mindestens einen gewünschten Sequenz operationell verknüpften Transkriptions- und/oder Terminationskontroll-Elementen, oder

2. (β) frei ist von mit der mindestens einen gewünschten Sequenz operationell verknüpften Transkriptionsterminationskontroll- Elementen, jedoch ein Transkriptionsinitiationskontroll-Element aufweist, das operationell mit der mindestens einen gewünschten Sequenz verknüpft ist,

2. die Replikation der DNA ermöglichen, und

3. Auslese von Zellen und/oder Pflanzen, die genetisch transformierte Plastide enthalten.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA zirkulär ist und sich in Plastiden autonom replizieren kann.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Transkription der gewünschten Sequenz(en) nicht terminiert wird.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Transkription mRNA generiert, die mehrere Einheiten der transkribierten gewünschten Sequenz(en) umfasst.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz, die die Replikation der DNA ermöglicht, die autonome Replikation der DNA in einem Pflanzenplastid verursacht.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz, die die Replikation der DNA ermöglicht, die autonome Replikation der DNA außerhalb eines Pflanzenplastids verursacht, wodurch mehrere Kopien der DNA für den anschließenden Transfer in Plastide generiert werden.

7. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die DNA ferner eine oder mehrere Sequenzen enthält, die eine Selektion transformierter Pflanzen, Zellen oder Plastide ermöglicht.

8. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei ein photosyntheserelevantes Gen in einem vorhergehenden Schritt unfunktionell gemacht oder eliminiert wird.

9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das photosyntheserelevante Gen rpoA ist.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das photosyntheserelevante Gen petA ist.

11. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die DNA das photosyntheserelevante Gen in einer zur positiven Selektion der Transformation funktionellen Form enthält.

12. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die DNA ferner Sequenzen enthält, die die stabile Integration mindestens eines Teils der DNA in ein Plastidengenom ermöglicht.

13. Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die DNA sich nach der Integration mindestens eines Teils der DNA in das Plastidengenom unerwünschter Sequenzen durch Rekombination entledigt.

14. Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der mindestens eine Teil der DNA die mindestens eine gewünschte Sequenz umfasst.

15. Das Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei bei der Integration des mindestens einen Teils der DNA in das Plastidengenom eine Sequenz, die eine Selektion ermöglicht, auf einem zweiten Teil der DNA verbleibt, der nicht in das Plastidengenom integriert wird.

16. Das Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei nach der Integration des mindestens einen Teils der DNA in das Plastidengenom der Selektionsdruck aufgehoben wird, was das Verlieren der Sequenz, die eine Selektion ermöglicht, erlaubt.

17. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die DNA so geplant ist, dass ihr Erhalt in dem Pflanzenplastid Selektionsdruck erfordert.

18. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei eine Interaktion der mindestens einen gewünschte Sequenz oder ihres Expressionsproduktes mit dem Plastidengenom oder (einem) Expressionsprodukt(en) des Plastidengenoms eine gewünschte Funktion hervorbringt.

19. Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die auf ihrem Plastom transformiert sind und keinen Selektionsmarker aufweisen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

1. (a) Transformation von Plastiden einer Pflanze oder Pflanzenzelle mit DNA umfassend

a) eine Nukleotidsequenz, die der DNA die Replikation in einer Pflanzenzelle ermöglicht,

b) mindestens eine gewünschte Sequenz,

c) Sequenzen, die die mindestens eine gewünschte Sequenz flankieren und für die stabile Integration der mindestens einen gewünschten Sequenz in das Plastidengenom nötig sind, und

d) einen Selektionsmarker außerhalb der Sequenzen, die die gewünschten Sequenz(en) flankieren,

2. Ermöglichen der Integration der mindestens einen gewünschten Sequenz in das Plastom in Gegenwart von Selektionsdruck,

3. den Verlust der Selektionsmarkersequenz durch Aufheben des Selektionsdruckes ermöglichen,

4. Auslese von Zellen und/oder Pflanzen, die auf dem Plastom genetisch transformiert und frei von dem Selektionsmarker sind.

20. Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Nukleotidsequenz, die die Replikation der DNA in einer Pflanzenzelle ermöglicht, die autonome Replikation der DNA in einem Pflanzenplastid verursacht.

21. Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Nukleotidsequenz, die die Replikation der DNA ermöglicht, die autonome Replikation der DNA außerhalb eines Pflanzenplastids verursacht, wodurch mehrere Kopien der DNA für den anschließenden Transfer in Plastide generiert werden.

22. Vektor zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21.

23. Vektor zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, der flankierende Sequenzen für die Integration mindestens eines Teils der DNA in das Plastom und eine Selektionsmarkersequenz aufweist, die außerhalb der flankierenden Sequenzen liegt.

24. Vektor, der eine Nukleotidsequenz enthält, die die Fähigkeit zur autonomen Replikation in einem Pflanzenplastid verleiht, wobei die Nukleotidsequenz aus der folgende Gruppe ausgewählt ist:

1. (a) die Sequenz von SEQ. ID. NO: 1 oder eine funktionskonservative Variante oder Teil derselben,

2. die Sequenz von SEQ. ID. NO: 2 oder eine funktionskonservative Variante oder Teil derselben,

3. eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz hybridisiert, die zu einer Sequenz aus (a) oder (b) komplementär ist,

4. eine Sequenz gemäß (a) oder (b), die ausgewählte Mutationen zur Abschwächung oder Verstärkung der Fähigkeit zur Verleihung zur autonomen Replikation enthält,

5. eine Sequenz, die mindestens 80% Identität zur SEQ. ID. NO: 1 oder SEQ. ID. NO: 2 aufweist,

6. eine zu SEQ. ID. NO: 1 oder SEQ. ID. NO: 2 orthologe Sequenz.

25. Pflanze oder Pflanzenzelle enthaltend Plastiden erhalten oder erhältlich durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 oder davon erhaltene Produkte.

26. Verfahren, einer DNA die Fähigkeit zur autonomen Replikation in einem Pflanzenplastid zu verleihen, indem in die DNA eine Nukleotidsequenz eingeführt wird, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

a) die Sequenz von SEQ. ID. NO: 1 oder eine funktionskonservative Variante oder Teil derselben,

b) die Sequenz von SEQ. ID. NO: 2 oder eine funktionskonservative Variante oder Teil derselben,

c) eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz hybridiesiert, die zu einer Sequenz aus (a) oder (b) komplementär ist,

d) eine Sequenz gemäß (a) oder (b), die ausgewählte Mutationen zur Abschwächung oder Verstärkung der Fähigkeit zur Verleihung zur autonomen Replikation enthält,

e) eine Sequenz, die mindestens 80% Identität zur SEQ. ID. NO: 1 oder SEQ. ID. NO: 2 aufweist,

f) eine zu SEQ. ID. NO: 1 oder SEQ. ID. NO: 2 orthologe Sequenz.