DE10131690A1

DE10131690A1 - Verfahren zum kontrollierten Umordnen von Chromosomenfragmenten für die Pflanzenzucht

Info

Publication number: DE10131690A1
Application number: DE2001131690
Authority: DE
Inventors: Victor Klimyuk; Serik Eliby; Sylvestre Marillonnet; Newell Bascomb; Yuri Gleba
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2003-01-16
Also published as: WO2003001900A3; WO2003001900A2; CA2445457A1; EP1399573A2

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Konstruktion einer Bibliothek von Chromosomenfragmenten einer wilden Art im Genom einer Nutzpflanzenart beschrieben. Zuerst wird eine Anzahl von Transformanten der Donor- und Empfängerpflanzenart hergestellt, die DNA Konstrukte tragen, die für einen durch ortsspezifische Rekombination vermittelten Austausch von Chromosomenfragmenten nötig sind. Der Donor und der Empfänger werden so gewählt, dass sie nach sexueller Kreuzung oder nach somatischer Zellfusion eine instabile Nachkommenschaft hervorbringen. Dann wird Kreuzung der Donor- und der Empfängerpflanzenart und Bildung von Chromosomenrekombinanten induziert. Drittens werden unter Ausnutzung der Instabilität der Hybride zwischen Donor und Empfänger rekombinierte Zellen und Pflanzen des Empfängers selektiert, die spezifische Chromosomenfragmente der Donorart enthalten. Es werden auch transgene Pflanzen, Bibliotheken und Zuchtmaterial, das nach diesem Verfahren gewonnen wird, beschrieben.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen, die rekombinierte Chromosomen enthalten, und eine Bibliothek von Chromosomenfragmenten von Pflanzenarten mit nützlichen Merkmalen im Genom einer entfernt verwandten Nutzpflanze. Ferner betrifft sie Zuchtmaterial, das nach dem Verfahren dieser Erfindung erhalten wird oder erhältlich ist.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die gegenwärtigen Anstrengungen zur Genentdeckung und zur funktionellen Genomanalyse von Agrobiotechnologie-Unternehmen, Life-Science-Unternehmen und von akademischen Laboratorien werden schon bald eine große Anzahl neuer und nützlicher Gene hervorbringen. Die meisten großen Genomprojekte haben sich bisher auf Arabidopsis und einige wenige Nutzpflanzen, wie Mais, Sojabohne und Reis, konzentriert. Es gibt jedoch zahlreiche Wildarten und ökonomisch weniger wichtige Arten, die ein großes Reservoir nützlicher genetischer Information, das erforscht werden sollte, darstellen. Die Advanced-Backcross-Methode, die durch die simultane Verwendung von molekularen Markern gekennzeichnet ist, um spezifische chromosomale Regionen zu identifizieren, wurde in letzter Zeit dazu benutzt, nützliche Merkmale in wilden Verwandten der Tomate und von Reis zu entdecken (Tanksley et al., 1996, Teor. Appl. Genet., 92-213-224; Yamamoto et al., 2000, Genetics, 154: 885-891). Um dieses Reservoir auszunutzen, werden billige Verfahren zur Genentdeckung und/oder zur funktionellen Genomanalyse benötigt. Die Entwicklung von Werkzeugen und Technologieplattformen für solche Anstrengungen zur Genentdeckung/Genomanalyse ist deshalb eine wichtige und dringende Aufgabe. Solche genetischen Tools und Anstrengungen sind auch deshalb wichtig, da sie schlussendlich dazu führen könnten, traditionelle Zuchtmethoden durch leistungsfähigere, schnellere und präzisere Methoden zu ersetzen. Trotz der vor kurzem erreichten Verbesserungen durch die Verwendung von Marker-assisted Genotyping (für eine Übersicht siehe Mazur & Tingey, 1995, Current Opinion in Biotechnology, 6: 175-182) beruhen gegenwärtige Zuchtmethoden noch immer auf der Verwendung natürlicher unkontrollierter Chromosomenrekombination und sexuellen Hybridisierungsverfahren. Die Einzucht (Introgression) künstlicher Gene (Transgene) könnte theoretisch durch die Verwendung von Rekombinationssystemen, die von mikrobiellen oder Hefe-Organismen entlehnt sind, stark verbessert und kontrolliert werden (für eine Übersicht siehe Corman & Bullock, 2000, Curr. Opin. Biotechnol., 11, 455-460). Jedoch ist die Einzucht nützlicher Gene von wilden Verwandten schwieriger, da diese als Chromosomenfragmente zur Verfügung stehen. Die Lösung ist schließlich ein teures Genidentifikations- und -isolationsverfahren (z. B. über Positionsklonierung) oder traditionelle und sehr ineffiziente wiederholte Rückkreuzungen (siehe z. B. Harlan & Pope, 1922, J. Heredity, 13: 319-322).
Es gibt viele Publikationen und Patente, die das Kreuzen zwischen entfernten Pflanzenarten beschreiben, mit dem Zweck, einige nützliche Merkmale von einer Art auf eine andere zu übertragen, z. B. die Einzucht von Keimplasma aus Tripsacum in Mais (Maguire, 1962, Can. J. Genet. Cytol., 5: 414-420; Reeves & Bockholt, 1964, Crop Sci., 4: 7-10; deWet et al., 1972, Am. J. Bot., 59: 1026-1029; Simone & Hooker, 1976, Proc. Am. Phytopathol., Soc. 3: 307; Bergquist, 1981, Phytopathology, 71: 518-520; Cohen & Galinat, 1984, Crop Science, 24: 1011-1015). Kindiger und Sokolov (US 5 710 367) beschreiben apomiktische Mais/Tripsacum-Hybride für die Einzucht apomiktischer Reproduktion in einen Maishintergrund. Galinat (US 4 051 629) beschreibt die Verwendung fremder Chromosomen von Tripsacum, um die Expression unerwünschter rezessiver Merkmale bei der Herstellung hybrider Maissamen zu verdecken. Wenn ein fremdes Additionsmonosom als Eiter in einer Hybridkreuzung verwendet wird, führt die geringe Transmissionsrate des fremden Chromosoms zur Expression gewünschter Merkmale in der Nachkommenschaft, die von unerwünschten Merkmalen überdeckt waren. Eubanks (US 5 750 828) beschreibt ein Verfahren zum Transfer nützlicher Merkmale aus Tripsacum in Mais durch Verwendung von Zwischenhybriden Tripsacum x Zea diploperennis (Tripsacorn) mit besserer Kreuzbarkeit mit Mais. Dies kann die Schwierigkeiten beim Transfer von Chromosomenfragmenten infolge der starken Kreuzungsinkompatibilität zwischen Mais und Tripsacum-Chromosomen, die sich nur gelegentlich paaren können, lösen (Maguire, M. P., 1961, Evolution, 115: 393-400; Maguire, M. P., 1963, Can. J. Genet. Cytol., 5: 414-420; Galinat, W. C., 1974, Evolution, 27: 644-605). Alle oben genannten Verfahren führen jedoch zu einem Transfer chromosomaler Fragmente an zufällige Orte im Genom der Empfängerpflanze, was zu komplizierten Mustern von Chromosomenumordnungen führt. Solche Verfahren benötigen große Anstrengung zur Erreichung eines spezifischen Ziels und stellen keine bequeme Lösung für die effiziente Manipulation mit Chromosomenfragmenten dar. Die Patentanmeldung von Kuchuk & Klimyuk (WO 0070019) schlägt ein Verfahren zur Manipulation mit Transgenen durch Verwendung instabiler Hybride vor. Das beschriebene Verfahren betrifft die Manipulation von Transgenen, jedoch nicht den Austausch von Chromosomenmaterial zwischen verschiedenen Pflanzenarten.
Ein anderes Verfahren zum Transfer gewünschter genetischer Information zwischen entfernten Pflanzenarten ist die Verwendung der somatischen Hybridisierung. Dudits und Kollegen (1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8434-8438) beschreiben den Transfer resistenter Merkmale von der Karotte in Tabak durch asymmetrische somatische Hybridisierung. Das von somatischen Hybridisierungsexperimenten erhaltene Pflanzenmaterial ist jedoch häufig mit sehr komplexen chromosomalen Umordnungen kontaminiert, weshalb dieses Verfahren von begrenzter Nützlichkeit ist. Es gibt eine Publikation, die einen Versuch der Verwendung einer Kombination aus ortsspezifischer Rekombination und somatischer Hybridisierung beschreibt, um hybride Chromosomen zwischen Arabidopsis und Tabak zu erhalten (Koshinsky, H. A., Lee, E. & Ow, D., 2000, Plant J., 23: 715-722). Dieses Verfahren produziert klarere Ergebnisse im Vergleich zu denjenigen, die durch zufällige Rekombination zwischen Chromosomen verschiedener Arten erhalten werden, jedoch wurde nach dem Wachstum der Pflanze ohne Selektion kein Pflanzengewebe mit einem fremden Chromosom gefunden. Die Schlussfolgerung war, dass ein Transfer von Chromosomenarmen zwischen Pflanzenzellen verschiedener Arten möglich ist, dass das Aufrechterhalten des hybriden Chromosoms in einer Pflanze jedoch unwahrscheinlich ist.
Es ist deshalb eine Aufgabe dieser Erfindung, ein neues und sehr effizientes Verfahren zur Erzeugung transchromosomaler Pflanzen bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek chromosomaler Fragmente einer Pflanzenart bereitzustellen, die stabil vor dem genetischen Hintergrund einer anderen Pflanzenart aufrechterhalten werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen, die rekombinierte Chromosomen enthalten, zur Verfügung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellen einer Donor- und einer Empfängerpflanze, die beide mit Nukleinsäuren transformiert sind, die Sequenzen aufweisen, die eine ortsspezifische Rekombination der Nukleinsäuren auf den Chromosomen der beiden Pflanzen ermöglichen,
b) Kreuzen der Donor- und der Empfängerpflanze zur Erzeugung von Nachkommen,
c) Halten der Nachkommen unter Bedingungen, die die Eliminierung von Donorchromosomen erlauben,
d) Selektion von Nachkommen der Empfängerpflanze, die (ein) Chromosomenfragment(e) der Donorpflanze enthalten, wobei das (die) Fragment(e) mittels ortsspezifischer Rekombination zwischen den Nukleinsäuren der Donor- und der Empfängerpflanze erlangt wurde.

Der Austausch von Chromosomenfragmenten hat den Vorteil, dass multigene Merkmale in eine Empfängerpflanze eingeführt werden können. Dies ist über konventionelle Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen nicht möglich, bei denen ein einziges oder eine sehr begrenzte Anzahl von Transgenen in eine Pflanze durch Transformation eingeführt werden. Außerdem müssen die Gene, die für ein Merkmale verantwortlich sind, nicht kloniert werden. Diese Gene müssen nicht einmal bekannt sein.
Diese Erfindung erlaubt den Austausch von Chromosomenfragmenten zwischen einer Donor- und einer Empfänger- oder Rezeptorpflanze auf eine sehr viel besser kontrollierte und effizientere Art im Vergleich zu konventionellen Pflanzenzuchtmethoden. Über das erfindungsgemäße Verfahren können vorteilhafte Merkmale aus Wildarten für Nutzpflanzen verfügbar gemacht werden, ohne die Genetik oder die Genomsequenz der Wildart zu kennen.
Gemäß dieser Erfindung müssen die Donor- und die Empfängerpflanze mit einer Sequenz ausgestattet werden, die die ortsspezifische Rekombination von Nucleinsäuren, die diese Sequenzen tragen, erlaubt. Vorzugsweise werden viele Transformanten der Donorpflanze hergestellt, um einen Satz von Transformanten herzustellen, die ortsspezifische Rekombinationsstellen an vielen verschiedenen Orten und über alle Chromosomen der Donorpflanze verteilt integriert haben. Dies erlaubt das Abdecken des gesamten Genoms und die Herstellung einer Bibliothek chromosomaler Fragmente der Donorpflanze. Die Größe der Bibliothek hängt direkt von der Anzahl der Transformanten der Donorpflanze ab, wobei jeder eine ortsspezifische Rekombinationsstelle an einem anderen Ort im Genom enthält.
Eine kleine Anzahl von Akzeptorlinien kann für die Empfängerpflanze für das erfindungsgemäße Verfahren und für die Herstellung der Bibliothek ausreichend sein. Diese Anzahl wird in den meisten Fällen kleiner als 10 sein, vorzugsweise nur 2 oder 3. Jedoch kann bereits eine ausreichend sein. Eine geeignet transformierte Empfängerlinie hat ihre ortsspezifische Rekombinationsstelle an einem Ort, so dass die Rekombination keine wesentliche oder sonst gewünschte Funktion entfernt. Die Eignung der Empfängerlinie kann leicht herausgefunden werden.
Die Nucleinsäuren für die Transformation der Donor- und Empfängerpflanzen können eine ortsspezifische Rekombinationsstelle enthalten. Vorzugsweise enthalten sie zwei ortsspezifische Rekombinationsstellen in unterschiedlicher Orientierung, um die Wahrscheinlichkeit einer produktiven Rekombination zu erhöhen. Vorzugsweise kann die ortsspezifische Rekombination induziert werden. Hierzu kann entweder die Nucleinsäure für die Transformation der Donorpflanze oder diejenige für die Transformation der Empfängerpflanze, oder beide, weiterhin unter der Kontrolle eines Promotors ein Gen enthalten, das für eine Rekombinase kodiert, die zu der ortsspezifischen Rekombinationsstelle passt. Am vorteilhaftesten wird das Rekombinase-Gen von der Empfänger- (Rezeptor-)pflanze infolge der Rekombination entfernt.
Ferner werden vorzugsweise Möglichkeiten für die Selektion des Rekombinationsereignisses bereitgestellt. Dies kann z. B. durch ein Selektionsmarker-Gen auf einer der Nucleinsäuren für die Transformation der Donor- oder der Rezeptorpflanze geschehen. Noch besser ist es, wenn der Selektionsmarker als Ergebnis der ortsspezifischen Rekombination aktiv wird, z. B. durch Aufbau einer vollständigen Expressionskassette oder einer funktionellen Kodiersequenz des Markergens. Als Beispiel dieser Ausführungsform kann die in Fig. 3 gezeigte Nucleinsäure zur Transformation der Donorpflanzen verwendet werden, und die in Fig. 7 gezeigte kann zur Transformation der Empfängerpflanze oder -pflanzen verwendet werden. In diesem Fall wird das BAR-Gen infolge der Rekombination unter die Kontrolle eines Promotors gebracht, und das Rekombinase-Gen wird aus dem Empfänger entfernt.
Ferner können die Nucleinsäuren, die Sequenzen aufweisen, die eine ortsspezifische Rekombination ermöglichen, Transposonelemente aufweisen, und die Transposonelemente können zur Kartierung der erhaltenen Chromosomenrekombinanten über Insertionsmutagenese verwendet werden. Vorzugsweise sind die Transposonelemente inaktiv, d. h. sie enthalten keine geeignete Transposase. Die Transposition kann dann durch Bereitstellen einer Transposase, die mit dem Transposon funktionell ist, aktiviert werden. Dies kann z. B. durch Kreuzen der Pflanze mit einer anderen Pflanze, die die Transposase exprimiert, erreicht werden.
Die transformierten Donor- und Akzeptorpflanzen können sexuell oder nicht-sexuell, d. h. durch somatische Zellfusion, gekreuzt werden. Sexuelles Kreuzen kann verwendet werden, wenn die Donor- und die Empfängerpflanzen für eine sexuelle Kreuzung eng genug miteinander verwandt sind. Dies wird im allgemeinen dann der Fall sein, wenn sie zur selben taxonomischen Familie, vorzugsweise zur selben Gattung gehören. Kreuzen mittels somatischer Zellfusion erlaubt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Donor- und Empfängerpflanzen, die für sexuelles Kreuzen zu fern verwandt sind, oder wenn das Mischen der Chromosomen unwahrscheinlich ist. So können Chromosomenfragmente zwischen Pflanzen ausgetauscht werden, die zu verschiedenen Familien oder zu verschiedenen Klassen gehören. Zum Beispiel können Hybride aus einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzen durch somatische Zellfusion erhalten werden. Wenn gewünscht, kann somatische Zellfusion natürlich auch im Fall naher Verwandtschaft angewandt werden. Die Bedingungen, die für die Eliminierung von Donorchromosomen in der Nachkommenschaft nach einer somatischen Zeilfusion nötig sind, sind im Stand der Technik bekannt.
Nach dem Kreuzen der Donor- und der Empfängerpflanze zur Erzeugung von Nachkommenschaft, werden die Nachkommen Bedingungen ausgesetzt, die es erlauben, dass eine Eliminierung der Donorchromosomen stattfindet. Dies kann durch Segregation der Chromosomen (sorting out) geschehen. Vorzugsweise sind die Nachkommen instabil, so dass die Chromosomen des Donors bevorzugt verloren gehen. Je instabiler die Nachkommenschaft ist, desto schneller gehen unerwünschte Chromosomen des Donors (Chromosomen, die nicht mit der Nucleinsäure für die ortsspezifische Rekombination ausgestattet sind) verloren. Vorzugsweise kann die Eliminierung der Donorchromosomen in wenigen Generationen erreicht werden, am bevorzugtesten in einer oder zwei Generationen. Die Dauer der Koexistenz der Chromosomen des Donors und des Empfängers in den Nachkommen sollte für eine ortsspezifische Rekombination ausreichend sein.
Beispiele für Donor/Empfängerpaare sind unter anderem Tripsacum/Gerste, Tripsacum/Hafer, Orychophragmus/ein Kreuzblütler (Canola oder Raps), Glycine tomentella/Sojabohne, Solanum phreja/Kartoffel, Mais/Weizen, Mais/Gerste, Mais/Hafer, Pennisetum/ Weizen, Pennisetum/Gerste, Pennisetum/Mais, Hordeum bulbosum/Gerste, Hordeum bulbosum/ Weizen, Oryza minuta/Reis, Tripsacum/Weizen, Tripsacum/Mais, Nicotiana africana/Nicotiana tabacum. Außerdem kann der Donor oder der Empfänger Sojabohne mit einer ms-Mutation sein, die Polyembryonie verursacht, oder eine oder beide der Donor- und der Empfängerpflanzen kann Baumwolle mit einer Se-Semigamiemutation sein.
Diese Erfindung betrifft ferner eine Bibliothek chromosomaler Fragmente einer oder mehrerer heterologer Arten inkorporiert in das Genom einer anderen Art, vorzugsweise einer Nutzpflanzenart, die nach dem Verfahren dieser Erfindung erhalten oder erhältlich ist. Eine solche Bibliothek, die in Form von Samen vorliegen kann, erlaubt die Selektion einer transchromosomen Empfängerpflanze mit einem gewünschten Merkmal von einer anderen Art.
Die Bibliothek kann irgendein Merkmal der Donorpflanze enthalten. Sie kann z. B. für die funktionelle Genomanalyse und als Ausgangszuchtmaterial verwendet werden.
Die Erfindung umfasst auch Pflanzen, Pflanzenmaterial und Zuchtmaterial von Nutzpflanzenarten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden oder erhältlich sind, sowie daraus abgeleitete Produkte.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt das allgemeine Prinzip der Umordnung der chromosomalen Fragmente zwischen der Donor- und der Akzeptorpflanzenart; der Stern zeigt ein Transposon an. Die Empfängerpflanze und das Ergebnis der ersten Kreuzung enthalten ein inaktives Transposon, das durch Kreuzen mit einer Pflanze, die als Transposasenquelle fungiert, aktiv wird.
Fig. 2 ist eine lineare Plasmidkarte von pIC1600;
Fig. 3 ist eine lineare Plasmidkarte von pIC3714;
Fig. 4 ist eine lineare Plasmidkarte von pIC529;
Fig. 5 ist eine lineare Plasmidkarte von pIC1251;
Fig. 6 ist eine lineare Plasmidkarte von pIC1262;
Fig. 7 ist eine lineare Plasmidkarte von pIC4041.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das Verfahren dieser Erfindung beruht auf der Verwendung einer Kombination verschiedener Technologien, die bereits früher für andere Zwecke verwendet wurden. Dieser Ansatz stellt einen neuen Weg zur Konstruktion einer vollständigen Genom-Bibliothek chromosomaler Fragmente wilder Arten in dem Genom eines Nutzpflanzenempfängers dar. Das allgemeine. Prinzip der Erfindung ist in Fig. 1 gezeigt. Zuerst wird vorzugsweise eine Anzahl von Transformanten der Donorpflanze generiert, die Insertionen von Rekombinationsstellen gleichmäßig über alle Chromosomen verteilt enthalten. Für die Empfängerpflanze genügt die Herstellung einer kleineren Anzahl von Insertionen von Rekombinationsstellen. Jedoch werden die transgenen Empfängerpflanzen vorzugsweise auf Toleranz einer Deletion des distalen Teiles eines Empfängerchromosoms infolge Substitution mit einem zufälligen heterologen Chromosomenfragment getestet. Theoretisch werden 2 bis 3 getestete Empfängerlinien für die Herstellung einer Bibliothek ausreichen.
Der zweite Schritt umfasst das Kreuzen der Donor- und der Akzeptorpflanzenarten und vorzugsweise die Selektion für Nachkommen der Akzeptorpflanze, die ein Chromosomenfragment der Donorpflanze enthalten. Schließlich kann eine genauere Identifikation und Isolierung mittels Gene-Tagging in einer Linie mit einem bestimmten Chromosomenfragment durchgeführt werden.
Diese Erfindung beschäftigt sich vorzugsweise mit Weizen als interessierende Nutzpflanzenart und Mais und Federähre (pearl millet) als Donoren nützlicher Merkmale. Zusätzlich zur Entwicklung einer neuen Genomics- und Zuchtplattform zielt dieser Ansatz auf die Einzucht nützlicher Merkmale (Apomixis, Pathogenresistenz usw.) in Weizenkeimplasma. Das Verfahren dieser Erfindung kann auf jede gewünschte Nutzpflanzenart, die instabile Hybride mit der Donorpflanze, die ein nützliches Merkmal trägt, angewandt werden (Tripsacum/Mais, Orychophragmus/Brassica, Glycine tomentella/Sojabohne, Solanum phureja/Solanum tuberosum usw.). Im allgemeinen gibt es für jede Nutzpflanzenart (einschließlich aller Varietäten und Linien derselben) einen wilden Verwandten oder eine mutierte Form, die durch Hybridisierung ein instabiles Hybrid bildet, und die als Donor- oder Clipboard-Pflanze, wie hier definiert, dienen kann. Ein empirischer Weg zur Identifizierung eines solchen Organismus beinhaltet das Kreuzen einer gewünschten Nutzpflanzenart mit einer Anzahl verwandter Arten und Prüfung der genetischen Ausstattung der erhaltenen Nachkommenschaft. Verfahren zur vorläufigen Identifizierung von Nachkommen, die uniparental sind, sind in der Literatur bekannt und beruhen auf verschiedenen selektiven oder nicht-selektiven Merkmalen. Es gibt zahlreiche Verfahren des breiten und verlässlichen Genotyping der Nachkommenschaft, die einfach sind und auf der Analyse verschiedener Marker in der genomischen DNA beruhen. Durch ein solches primäres Screening und nachfolgendes Genotyping können geeignete Clipboard-Organismen schnell identifiziert werden. Jenseits dieses grundlegenden Kriteriums werden die Donor/Empfängerpaare vorzugsweise so gewählt, dass die Dauer des hybriden Zustands in Zellen eines Primärhybrids oder seiner Nachkommen geeignet ist. Obwohl die vollständige Eliminierung ein gewünschter Endzustand ist, ist die relative Zeitdauer der Koexistenz der Chromosomen beider Arten in derselben Zelle wichtig, um genügend Zeit für den Austausch chromosomaler Fragmente zwischen der Donor- und der Akzeptorpflanze bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Einführen genetischen Materials als Chromosomenfragmente in Pflanzen, umfassend:
Herstellen einer Donorpflanze, die mit einer heterologen Nucleinsäure transformiert ist, die (eine) Sequenz(en) aufweist, die von einer ortsspezifischen Rekombinase erkannt wird (werden), und einen promotorlosen Selektionsmarker, wobei die Sequenzen eine Rekombination zwischen den fremden Chromosomen, die solche Sequenzen enthalten, sowie die Selektion für Rekombinationsereignisse erlauben;
Herstellen einer Empfängerpflanze, die mit einer heterologen Nucleinsäure transformiert ist, die eine oder mehrere Sequenzen aufweist, die von einer ortsspezifischen Rekombinase erkannt werden, sowie das Gen, das für eine solche Rekombinase kodiert unter der Kontrolle eines induzierbaren, gewebsspezifischen oder konstitutiven Promotors;
Kreuzen der Empfänger- und der Donorpflanze, wobei diese infolge des Kreuzens eine instabile Nachkommenschaft hervorbringen oder eine bevorzugte Segregation oder Aussortierung zeigen; und Auswahl von Nachkommen der zweiten Pflanze (Empfängerpflanze), die ein Chromosomenfragment im Genom des Empfängers enthalten.
Die Verfahren dieser Erfindung erlauben die Manipulation von Chromosomenfragmenten in so gut wie allen Nutzpflanzenarten, insbesondere wirtschaftlich wichtigen Varietäten.
Die Orientierung der Rekombinationsstellen in der Donor- und der Empfängerpflanze bezüglich der Zentromeren stimmen vorzugsweise überein, um erfolgreiche Rekombinationsereignisse zu erzielen. Wenn die Rekombinationsstellen unterschiedlich orientiert sind, werden die Rekombinationsereignisse zur Bildung von dizentrischen Chromosomen, die instabil sind, führen. Um dieses Problem zu lösen und um die Effizienz des Systems zu verbessern, haben die Konstrukte für die Transformation des Donors (z. B. pIC3714, Fig. 3) und eines der Konstrukte für den Empfänger (z. B. pIC4041, Fig. 7) vorzugsweise Rekombinationsstellen in beiden Orientierungen. Für Rekombinationsereignisse zwischen Pflanzenchromosomen, die solche Konstrukte tragen, besteht immer eine gute Wahrscheinlichkeit, dass ein rekombinantes Chromosom ohne der Rekombinase hervorgebracht wird, jedoch mit einem Selektionsmarker, der unter die Kontrolle eines Promotors gestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Rekombination chromosomaler Fragmente durch die Verwendung einer Rekombinase unter der Kontrolle von z. B. dem Reis- Aktin- oder dem Weizen-Histon-H4-Promotor verursacht. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können zwei verschiedene Promotoren gleichzeitig verwendet werden, um die Expression des Rekombinase-Gens zu bewirken (siehe Fig. 7), wodurch die Wahrscheinlichkeit von Rekombinationsereignissen während der kurzen Zeitdauer der Koexistenz der fremden Genome erhöht wird.
Ortsspezifische Rekombinasen aus Bakteriophagen und Hefen sind weit verbreitet als Werkzeuge zur DNA-Manipulation sowohl in vitro als auch in lebenden Organismen.
Bevorzugte Rekombinasen/Rekombinationsstellen zur Verwendung in dieser Erfindung sind Cre-Lox, FLP-FRT und R-RS, worin Cre, FLP und R Rekombinasen sind, und Lox, FRT und RS Rekombinationsstellen. Andere bevorzugte Systeme sind unter anderem die Intron-kodierte Endonuclease I-SceI, siehe Choulika, et al., Mol. Cell Biol., 15: 1968-1973 (1995). Um in Pflanzen funktionell zu sein, benötigen diese Rekombinationsstellen 7 bis 8 Basenpaare (bp) einer Kernsequenz zwichen 12 bis 13 bp langen invertierten Repeats; der asymmetrische Kern bestimmt die Orientierung der Rekombinationsstelle und somit den Typ des Rekombinationsproduktes. Unabhängig davon, ob Rekombinationsstellen in ein einziges DNA- Molekül in direkter oder entgegengesetzter Orientierung oder aber auf nicht verbundene lineare oder zirkuläre DNA-Moleküle eingesetzt wird, kann die entsprechende Rekombinase den reziproken Austausch zur Bildung einer Deletion, Inversion, Translokation oder eines Kointegrationsereignisses katalysieren. Siehe Bollag et al., Ann. Rev. Genet., 23: 199-225 (1989); Kilby et al., Trends Genet., 9: 413-421 (1993); und Ow, Curr. Opinion Biotech., 7: 181-186 (1996). In dieser Erfindung tritt eine Rekombinase-vermittelte ortsspezifische Translokation zwischen verschiedenen und im besonderen zwischen nicht-homologen Chromosomen auf. Dieser in trans-Rekombinaseeffekt ist für den Transfer von Chromosomenfragmenten zwischen Chromosomen, die in einem Hybrid zu verschiedenen Eltern gehören, essentiell. Siehe Koshinsky et al., 2000, Plant J., 23 : 715-722.
Beispiele für geeignete homologe Rekombinationssysteme zur Verwendung in dieser Erfindung werden in der Literatur beschrieben und sind unter anderem das Cre-Lox-System (Sauer, US- Patent 4 959 317, Odell et al., US-Patent 5 658 772; Odell et al., PCT WO 91/09957) und das FLP-FRT System (Hodges and Lyznik, US-Patent 5 527 695). Eine besondere Anwendung bekannter Rekombinationssysteme zur Transgenmanipulation in Pflanzen ist das gerichtete Herausschneiden eines Transgens aus dem Genom einer Pflanze, ein Verfahren, das die Eliminierung von unerwünschtem heterologen genetischen Material, wie antibiotischer Selektionsmarker aus kommerziellen Varietäten erlaubt (Ow und Dale, PCT WO 93/01283). Diese Systeme betreffen jedoch ein völlig verschiedenes Anwendungsgebiet, nämlich die Verwendung der homologen Rekombination zur Eliminierung ungewünschter Teile heterologer DNA im Gegensatz zur Kontrolle des Flusses heterologer chromosomaler Fragmente.
Das Umordnen chromosomaler Fragmente mittels homologer Rekombination weist große Vorteile auf. Durch präzises Abzielen (targeting) auf homologe DNA-Stellen können "Landeplätze" für chromosomale Fragmente geschaffen werden, die sorgsam ausgewählt und zuvor charakterisiert werden können. Im Ergebnis wird ein höheres Maß an Vorhersagbarkeit und Reproduzierbarkeit des Verhaltens heterologer chromosomaler Frägmente, einschließlich der Vererbung, erreicht.
In einer besonderen Ausführungsform kann ein Transposonelement in einem der Konstrukte verwendet werden, so dass es in das rekombinante Chromosom für die Insertionsmutagenese in einer heterologen Chromosomenregion eingebaut wird. Die Tendenz von Transposonelementen, zu eng verknüpften Stellen zu transponieren, ist ein gut etabliertes Phänomen (Jones et al., 1990, Plant Cell, 8 : 701-707; Osborne et al., 1991, Genetics, 129 : 833-844; Carroll et al., 1995, Genetics, 139 : 407-420). Dies kann ein nützliches Werkzeug für die Identifizierung und Isolierung nützlicher Gene aus heterologen Chromosomenregionen sein. Vorzugsweise ist das Transposonelement nicht autonom und benötigt eine Quelle für eine Transposase für seine Transposition. Eine Transposase kann, wenn nötig, in trans durch Kreuzen mit einer Pflanze, die ein stabilisiertes Transposase-Gen trägt, bereitgestellt werden (siehe Fig. 1). Pflanzliche Transposons waren unter den ersten beschriebenen mobilen DNA-Elementen, und eine ganze Reihe pflanzlicher transposabler Elemente wurden kloniert, wie Ac/Ds, Mu und En/Spm, die für diese Erfindung verwendet werden können. Diese Transposonelemente werden derzeit als genetische Tools in der Pflanzenmolekularbiologie und -biotechnologie verwendet. Sie sind unschätzbare Werkzeuge für Entwicklungsuntersuchungen von Pflanzen, für Genomanalysen von Pflanzen sowie für die Isolierung pflanzlicher Gene mittels Insertionsmutagenese und Tagging (siehe z. B. Walbot, Ann. Rev. Plant Mol. Biol., 43 : 49-82 (1992)). Weitere Beispiele für transposable Elemente, die für diese Erfindung verwendet werden können, sind beschrieben in Fedoroff, US-Patent 4 732 856; Doonerk et al., WO 91/156074; Yoder und Lassner, PCT- Anmeldung WO 92/01370, und Ebinuma et al., PCT-Anmeldung WO 96/15252.
Die heterologe DNA kann in die Donor- und die Akzeptorpflanzen nach Standardverfahren eingeführt werden. Transformationsverfahren für Dicotyledonen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen Agrobakterium-vermittelte Verfahren sowie Verfahren, die nicht auf Agrobakterium beruhen. Die letzteren Verfahren verwenden die Aufnahme exogenen genetischen Materials direkt durch Protoplasten oder Zellen. Zu diesen Verfahren gehören unter anderem die PEG- oder Elektroporations-vermittelte Aufnahme, Partikelbombardierung und Mikroinjektion. Beispiele für diese Verfahren werden in Paszkowski et al., EMBO J., 3 : 2717- 2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199 : 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology, 4 : 1001-1004 (1986), und Klein et al., Nature 327 : 70-73 (1987) beschrieben. In all diesen Fällen werden die transformierten Zellen zu vollständigen Pflanzen nach Standardmethoden regeneriert.
Die Agrobakterum-vermittelte Transformation ist für die Transformation von Dicotyledonen wegen ihrer hohen Transformationseffizienz und weiten Anwendbarkeit für viele verschiedene Arten bevorzugt. Zu den vielen routinemäßig mit Agrobakterium transformierten Nutzpflanzenarten gehören Tabak, Tomaten, Sonnenblumen, Baumwolle, Raps, Kartoffeln, Sojabohnen, Alfalfa und Pappeln (EP 0 317 511 (Baumwolle), EP 0 249 432 (Tomate), WO 87/07299 (Brassica), US-Patent 4 795 855 (Pappel). Agrobakterium-Transformation umfasst typischerweise den Transfer eines binären Vektors, der die gewünschte Fremd-DNA trägt (z. B. pCIB200 oder pCIB2001), in einem geeigneten Agrobakterium-Stamm, was von den Vir-Genen des Agrobakterium-Wirts, auf einem Koplasmid oder chromosomal, abhängt (z. B. Stamm CIB542 für pCIB200 (Uknes et al., Plant Cell, 5 : 159-169 (1993)). Der Transfer des rekombinanten binären Vektors in Agrobakterium wird mit einem triparentalen Kreuzungsverfahren unter Verwendung von E. coli, das den rekombinanten binären Vektor trägt, und mit einem Hilfsstamm von E. coli, der ein Plasmid wie pRK2013, trägt, das den rekombinanten binären Vektor für den Agrobakterium-Stamm mobilisieren kann, erreicht. Alternativ wird der rekombinante binäre Vektor mittels DNA-Transformation in Agrobakterium eingeführt (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res., 16, 9877 (1988)).
Die Transformation der Zielpflanzenart mit rekombinantem Agrobakterium umfasst üblicherweise die Kokultivierung des Agrobakterium mit Explantaten der Pflanze nach bekannten Verfahren. Transformiertes Gewebe, das einem Antibiotikum- oder Herbizidresistenzmarker zwischen den T-DNA-Grenzen des binären Plasmids trägt, wird auf einem Selektionsmedium regeneriert.
Bevorzugte Transformationsverfahren für Monocotyledonen ist unter anderem der direkte Gentransfer in Protoplasten unter Verwendung von PEG oder von Elektroporationsverfahren oder Partikelbombardierung in Kallusgewebe. Eine Transformation kann mit einer einzigen DNA-Spezies oder mit mehreren DNA-Spezies (Kotransformation) durchgeführt werden, und beide diese Verfahren können mit dieser Erfindung verwendet werden. Eine Kotransformation kann den Vorteil haben, dass komplizierte Vektorkonstruktionen vermieden werden können, und dass transgene Pflanzen mit ungekoppelten Genorten für das gewünschte Gen und den Selektionsmarker erzeugt werden, was es erlaubt, den Selektionsmarker in nachfolgenden Generationen zu entfernen, wenn dies gewünscht wird. Ein Nachteil der Kotransformation ist jedoch, dass die Häufigkeit, mit der getrennte DNA-Spezies in das Genom integriert werden, geringer als 100% ist (Schocher et al., Biotechnology, 4: 1093-1096 (1986)).
Die Patentpublikationen EP 0 292 435, EP 0 392 225 und WO 93/07278 beschreiben Techniken für die Herstellung von Kallus und Protoplasten von Mais, die Transformation von Protoplasten unter Verwendung von PEG oder der Elektroporation und die Regenerierung von Maispflanzen aus transformierten Protoplasten. Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 2 : 603-618 (1990), und Fromm et al., Biotechnology, 11 : 194-200 (1993), beschreiben Techniken für die Transformation von Inzucht-Maislinien durch Partikelbombardierung.
Die Transformation von Reis kann ebenso durch direkten Gentransfer unter Verwendung von Protoplasten oder Partikelbombardierung durchgeführt werden. Die Protoplasten-vermittelte Transformation wurde für Japonica- und Indica-Typen beschrieben (Zhange et al., Plant Cell Rep., 7 : 739-384 (1988); Shimamoto et al., Nature (1989), 338 : 274-277; Datta et al., Biotechnology, 8 : 736-740 (1990)). Beide Typen können jedoch auch routinemäßig mittels Partikelbombardierung transformiert werden (Christou et al., Biotechnology, 9 : 957-962 (1991). Die Patentanmeldung EP 0 332 581 beschreibt Techniken für die Herstellung, Transformation und Regeneration von Pooideae-Protoplasten. Ferner wird die Transformation von Mais von Vasil et al., Biotechnology, 10 : 667-674 (1992), mittels Partikelbombardierung in Langzeitregenerierbare Kalluszellen vom Typ C beschrieben; Vasil et al. Biotechnology, 11 : 1553-1558 (1993), und Weeks et al., Plant Physiol., 102 : 1077-1084 (1993) beschreiben Partikelbombardierung von unreifen Embryos und von unreifem Kallus aus Embryonen.
Die Transformation von Monocotzellen wie von Zea mays kann dadurch erreicht werden, dass die Monocotzellen mit einer Vielzahl von nadelförmigen Körpern in Kontakt gebracht werden, was eine Punktierung der Zellwand verursacht und den Eintritt transformierender DNA in die Zelle erlaubt (siehe US-Patent 5 302 523). Transformationsverfahren, die auf Mono- und Dicotylidonen anwendbar sind, werden ferner in den US-Patenten US 5 240 855 (Teilchenkanone); 5 204 253 (durch Gasschock beschleunigte Mikroprojektile); 5 179 022 (biolistischer Apparat); 4 743 548 und 5 114 854 (Mikroinjektion); und 5 149 655 und 5 120 657 (Transformation über beschleunigte Partikel); 5 066 587 (gasgetriebener Mikroprojektilbeschleuniger); 5 015 580 (Teilchen-vermittelte Transformation von Sojabohnenpflanzen); 5 013 660 (Laser-vermittelte Transformation); 4 849 355 und 4 663 292. Gemäß den obigen Verfahren transformierte Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe werden dann nach bekannten Methoden zu vollständigen Pflanzen herangezogen. Transgene Samen können dann von transgenen Blütenpflanzen nach Standardverfahren erhalten werden. Ähnlich können nicht-blühende Pflanzen, wie Kartoffeln und Zuckerrüben, nach bekannten Methoden fortgepflanzt werden. Siehe z. B. Newell et al., Plant Cell Rep., 10: 30-34 (1991) (Beschreibung einer Transformation von Kartoffeln über eine Stammkultur).
Die folgenden Beispiele sind Zusammenfassungen erfolgreicher Transformationen und Transfers von chromosomalen Fragmenten für zwei Kombinationen wichtiger Nutzpflanzenarten (Pennisetum/Weizen und Mais/Weizen) unter Verwendung von ortsspezifischen Rekombinasen. Diese konkreten Beispiele schränken den Geltungsbereich dieser Erfindung jedoch nicht ein.

BEISPIELE

REFERENZBEISPIEL 1

Design von Konstrukten für das Umordnen chromosomaler Fragmente

Die Vektoren wurden nach Standardverfahren der Molekularbiologie konstruiert (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Plasmid pIC1600 (Fig. 2) wurde durch einfaches Ersetzen des kleinen HindIII-BamH1- Fragments aus pIC1551 (Appendix 1) mit dem HindIII-BamH1-Fragment, das den Mais- Ubiquitin-Promotor enthält, hergestellt. Vektor pIC3714 (Fig. 3) wurde folgendermaßen hergestellt.
Das Plasmid pIC607 (Appendix 2) wurde mit Xhol und Ncol verdaut, durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 abgestumpft, und das gelgereinigte große Fragment wurde selbstligiert, was das Plasmid pIC3709 (Appendix 3) ergab. Das große Xbal- Hpal-Fragment aus pIC3709 wur4e mit dem kleinen Xba1-Xho1/Klenow-Fragment aus pIC607 ligiert, was Plasmid pIC3714 ergab. Plasmid pIC529 (Fig. 4) wurde durch Ersetzen des 35S- Promotors aus pIC08 (HindIII-Xba1/Klenow-Fragment) mit dem HindIII-Xho1-Fragment aus pIC09, das den Weizen-Histon-H4-Promotor enthält, hergestellt (Tabata et al., 1984, Gene, 31: 285-289).
Plasmid pIC 1251 (Fig. 5) wurde durch Ligation des großen HindIII/Klenow-Kpn 1-Fragments aus pIC529 mit dem 1,3 kb XhollKlenow-KpnI-Fragment aus pIC044 (Appendix 4) hergestellt, was den Weizen-Histon-H4-Promotor mit dem Reis-Aktin-Promotor ersetzt (McElroy et al., 1990, Plant Cell, 2: 163-171).
Die Ligation des HindIII/Klenow-PstI-Fragments aus pIC529 mit dem 0,9 kb-Ec1136II-Pst1- Fragment aus pIC04 ergibt Plasmid pIC 1262 (Fig. 6), das die cre-Rekombinase unter der Kontrolle des Arabidopsis actin-2-Promtors enthält (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121).
Plasmid pIC4041 (Fig. 7) wurde durch Koligation des 2,6 kb HindIII-Sal1-Fragments aus pIC529, des 3,2 kb PvuII-Sal1-Fragments aus pIC1251 und des gelgereinigten Vektors pBS(KS+), behandelt mit HindIII und Ecl136II, hergestellt.

BEISPIEL 1

Transformation von Weizen und Pennicetum

Kulturen unreifer Embryos aus Weizen (cvs Bobwhite und Chinese Spring) und Mais (cv HiII) wurden mit pIC1251 (Fig. 5) und pIC 1600 (Fig. 2) kobombardiert. Die Ergebnisse einiger Transformationsexperimente mit Weizen und Hirse sind in der Tabelle unten gezeigt.
Hirsekulturen wurden mit pIC1600 und pIC3714 (Fig. 3) kobombardiert:
Weitere Kobombardierungen von Weizen wurden mit pIC 1600 und pIC529 durchgeführt.

Calluskulturen

Unreife Samen von Weizen cvs. Chinese Spring und Bobwhite, die Hirselinien PEN3 und HGM100 und Mais-Hill wurden durch Eintauchen in 70% Ethanol für 2 Minuten, gefolgt von Inkubation in 1% Natriumhypochloritlösung unter Schütteln bei 125 U/min für 20 Minuten und schließlich 5 Waschschritte mit sterilem destilliertem Wasser oberflächensterilisiert. Unreife Embryos (1,0 bis 1,5 mm in der Länge, semitransparent) wurden aseptisch isoliert und mit der Skutellumseite nach oben auf einem geeigneten, mit 0,25% Phytagel verfestigtem Kulturmedium platziert. Embryos, die kompakte nodulare Kalli entwickelten, wurden mit einem Stereomikroskop ausselektiert und 5 bis 10 Tage nach der Isolierung für die Bombardierung benutzt. Die Kulturen wurden im Dunkeln bei 25°C gehalten.
Weizen- und Hirsekalli wurden auf festem MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962) mit 2 mg/12,4-D (MS2) gehalten.

Plasmidpräparation und DNA-Goldbeschichtung

Die Plasmidkonstrukte pIC1251, pIC1600, pIC529, pIC3714 und pIC4041 wurden mit Qiagen- Kit gereinigt.
Die DNA-Goldbeschichtung wurde gemäß dem originalen Bio-Rad-Protokoll (Spd/Ca, doppelte Aliquots; Sanford et al., 1993) folgendermaßen durchgeführt: 50 ml Goldpuder (1,0 µm) in 50% Glycerin wurden mit 10 µl DNA (1 µg/µl), 50 µl CaCl₂ (2,5 M) und 20 µl 0,1 M Spermidin gemischt. Für die Kotransformation wurden die Plasmide in einem 1 : 1-Verhältnis (5 µg + 5 µg) gemischt. Die Mischung wurde für 2 Minuten gevortext, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur, kurzer Zentrifugation, und Waschen mit 70% und 99,5% Ethanol. Schließlich wurde das Pellet in 60 µl von 99,5% Ethanol (6 µl/Schuss) resuspendiert. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

Bombardierung

Die Mikroprojektilbombardierung wurde mit dem Biolistic PDS-1000/He-Partikel Delivery System (Bio-Rad) durchgeführt. Unreife Embryos wurden 4 Stunden lang auf MS2-Medium, das mit 0,2 M Mannitol und 0,2 M Sorbitol ergänzt war, vorbehandelt. Embryos (50 pro Platte) wurden in die Mitte einer Platte gelegt, so dass sie einen Kreis mit einem Durchmesser von 10 mm bildeten, und bei 1100 psi bombardiert, bei einem Abstand von 15 mm von dem Makroträgerstart zur Stoppscheibe und 60 mm Abstand von der Stoppscheibe zum Zielgewebe. Der Abstand zwischen der Bruchscheibe und des Makroträgers betrug 12 mm. Die Kalli wurden 16 Stunden nach der Behandlung in MS2-Medium transferiert und im Dunkeln eine Woche lang wachsen gelassen.

Selektion, Regeneration

2 Tage nach der Bombardierung wurden die behandelten Kalli in MS-Medium mit 2,0 mg/l 2,4- D und 150 mg/l Hygromycin B transferiert und im Licht kultiviert. Vier Wochen später wurden grünende Kallusgewebe in MS-Regnerationsmedium mit 1 mg/l BAP, 0,5 mg/l Kinetin, 0,01 mg/l 2,4-D und 150 mg/l Hygromycin B subkultiviert. Regenerierende Pflänzchen wurden in Hefe mit hormonfreiem MS-Medium halber Stärke mit 100 mg/l Hygromycin B transferiert. Die voll entwickelten Pflanzen wurden 7 bis 10 Tage bei 15°C in einem Flüssigmedium, enthaltend die vierfach verdünnten MS-Salze, akklimatisiert. Pflanzen mit starken Wurzeln wurden im Boden eingepflanzt und im Gewächshaus bis zur Reife gezogen.

DNA Isolation

Blattproben wurden in Eppendorf-Gefäßen mit Sandstaub in 0,3 bis 5,0 ml heißem (55°C) 2x CTAB-lösung homogenisiert. Ein gleiches Volumen der CTAB-Lösung und 0,6 bis 10,0 ml Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (24 : 1 v/v) wurden zu dem Extrakt gegeben. Die Gefäße wurden auf einem Schüttler (Mild Mixer PR-12, TAITEC) bei einer Geschwindigkeit von 5 bei Raumtemperatur 15 bis 30 Minuten inkubiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugation (3.600 bis 15.000 U/min. 20°C, 5 Minuten) getrennt, und die Überstände vorsichtig in neue Gefäße mit 0,6 bis 10,0 ml Isopropanol transferiert. DNA-Pellets (12.000 bis 15.000 U/min. 20°C, 20 Minuten) wurden mit 70% Ethanol gewaschen, in 0,3 bis 1,0 ml TE resuspendiert und 30 Minuten mit RNAse behandelt. Nach zwei weiteren Chloroform-Extraktionen wurden die DNA- Proben durch Zugabe von 0,1 bis 0,33 ml 10 M NH4Ac und 0,3 bis 1,0 ml Isopropanol pelletiert (15.000 U/min. 20°C, 20 Minuten). Die Pellets wurden mit 70% und 99,5% Ethanol gewaschen und in 20 bis 500 µl 0,1 TE gelöst.
PCR Analyse und Southern-Hybridisierung
Für die bar- und hpt-Gene spezifische Primer wurden von Gibco-BRL gestellt:
Interne Fragmente einer für bar kodierenden Sequenz von 442 bp und einer für hpt kodierenden Sequenz von 600 bp Länge wurden unter den folgenden PCR-Bedingungen amplifiziert:
95°C 2 Minuten; 94°C 1 Minute, 62°C (0,5°C niedriger/Zyklus) 1 Minute, 72°C 1 Minute, 10 Zyklen,
94°C 1 Minute; 57°C 1 Minute, 72°C 1 Minute (4 Sekunden höher/Zyklus) 35 Zyklen.
Aliquots von 0,5 bis 1 µg DNA pro Probe (100 µl) wurden für die PCR-Reaktionen benutzt.

BEISPIEL 2

Herstellung einer Bibliothek chromosomaler Fragmente von Pennicetum vor dem genetischen Hintergrund von Weizen

Kreuzungen zwischen Pennisetum und Weizen wurden wie von Riera-Lizararu & Mujeeb-Kazi, Crop. Sci., 33 : 973-976 (1993) beschrieben durchgeführt. Primär konvertierte Linien wurden als F₀ diploidisierte Haploide von den Kreuzungen selektiert. Die Weizenlinien mit chromosomalen Fragmenten von Pennisetum wurden leicht anhand ihrer BASTA-Resistenz selektiert. Die Rekombination zwischen den Lox-Stellen von pIC3714 und als Partner der Wahl, pIC529, pIC1251 oder pIC4041 resultiertein der Aktivierung des BAR-Gens infolge seiner Positionierung unter der Kontrolle entweder des Weizen-Hison H4- oder des Reis-Actin Promoters.

Beispiel 3

Erzeugung einer Bibliothek von Chromosomenfragmenten aus Mais vor dem genetischen Hintergrund von Weizen
Kreuzungen von Mais und Weizen wurden wie von Matzk & Mahn (1994, Plant Breeding, 113, 125-129) beschreiben durchgeführt.
Die Weizenlinien, die durch ortsspezifische Rekombination übertragene Chromosomenframente von Mais trugen, wurden wie in Beispiel 2 selektiert.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen, die rekombinierte Chromosomen enthalten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellen einer Donor- und einer Empfängerpflanze, die beide mit Nukleinsäuren transformiert sind, die Sequenzen aufweisen, die eine ortsspezifische Rekombination der Nukleinsäuren auf den Chromosomen der beiden Pflanzen ermöglichen,

b) Kreuzen der Donor- und der Empfängerpflanze zur Erzeugung von Nachkommen,

c) Halten der Nachkommen unter Bedingungen, die die Eliminierung von Donorchromosomen erlauben,

d) Selektion von Nachkommen der Empfängerpflanze, die (ein) Chromosomenfragment(e) der Donorpflanze enthalten, wobei das (die) Fragment(e) mittels ortsspezifischer Rekombination zwischen den Nukleinsäuren der Donor- und der Empfängerpflanze erlangt wurde.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ortsspezifische Rekombination induziert wird.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenzen Rekombinationsstellen sind und wobei die Donorpflanze, die Empfängerpflanze oder sowohl die Donor- als auch die Empfängerpflanze eine Rekombinase produziert, die die Rekombinationsstellen erkennt.

4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Donor- und die Empfängerpflanze sexuell gekreuzt werden.

5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Donor- und die Empfängerpflanze mittels somatischer Zellfusion gekreuzt werden.

6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donor- und die Empfängerpflanze zur selben taxonomischen Familie, jedoch zu verschiedenen Arten oder Unterarten gehören.

7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donor- und die Empfängerpflanze zur selben Gattung, jedoch zu verschiedenen Arten oder Unterarten gehören.

8. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Donor- und die Empfängerpflanze zu verschiedenen taxonomischen Familien gehören.

9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Tripsacum und die Empfängerpflanze Gerste ist.

10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Tripsacum und die Empfängerpflanze Hafer ist.

11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Orychophragmus und die Empfängerpflanze ein Kreuzblütler ist.

12. Das Verfahren nach Anspruch 1 l, wobei der Kreuzblütler Kanola oder Raps ist.

13. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Glycine tomentella und die Empfängerpflanze Sojabohne ist.

14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Solanum phreja und die Empfängerpflanze die Kartoffel ist.

15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Mais und die Empfängerpflanze Weizen ist.

16. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Mais und die Empfängerpflanze Gerste ist.

17. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Mais und die Empfängerpflanze Hafer ist.

18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Pennisetum und die Empfängerpflanze Weizen ist.

19. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Pennisetum und die Empfängerpflanze Gerste ist.

20. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Pennisetum und die Empfängerpflanze Mais ist.

21. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Hordeum bulbosum und die Empfängerpflanze Gerste ist.

22. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Hordeum bulbosum und die Empfängerpflanze Weizen ist.

23. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Oryza minuta und die Empfängerpflanze Reis ist.

24. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Tripsacum und die Empfängerpflanze Weizen ist.

25. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Tripsacum und die Empfängerpflanze Mais ist.

26. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donor- oder die Empfängerpflanze die Sojabohne mit einer ms Mutation ist, was Polyembryonie verursacht.

27. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donor- und/oder die Empfängerpflanze Baumwolle mit einer Se Semigamie Mutation ist.

28. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Donorpflanze Nicotiana africana und die Empfängerpflanze Nicotiana tabacum.

29. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei die Nukleinsäuren, die Sequenzen aufweisen, die eine ortsspezifische Rekombination ermöglichen, zusätzlich Fragmente eines Selektionsmarkergens aufweisen, wobei der Selektionsmarker infolge der beabsichtigten ortsspezifischen Rekombination funktionell wird.

30. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei die Nukleinsäuren, die Sequenzen aufweisen, die eine ortsspezifische Rekombination ermöglichen, zusätzlich Transposonelemente aufweisen, die zur Kartierung erhaltener Chromosomenrekombinanten mittels Insertionsmutagenese verwendet werden können.

31. Eine Bibliothek chromosomaler Fragmente einer oder mehrerer heterologer Arten im Genom einer Nutzpflanzenart erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren einer der Ansprüche 1 bis 30.

32. Züchtungsmaterial von Nutzpflanzen erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren einer der Ansprüche 1 bis 30.

33. Pflanzen oder pflanzliches Material erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren einer der Ansprüche 1 bis 30 oder daraus erhaltene Produkte.