MXPA01011541A - Proceso para una rapida transformacion de plantas independientemente de la variedad. - Google Patents

Abstract

Se expone un metodo para producir plantas transgenicas. El ADN heterologo se introduce primero en una planta donadora, celula o protoplasto vegetal para una celula o protoplasto vegetal y luego se mueve desde la planta donadora hacia una recipiente, la celula o protoplasto vegetal no se acompana por ningun ADN genomico natural del donador. El donador y el recipiente se seleccionan de tal forma que produzcan una progenie inestable o demuestren una segregacion o clasificacion preferencial. El ADN se puede insertar aleatoriamente o en ubicaciones especificas en el genoma de la planta recipiente. Tambien se exponen plantas transgenicas producidas mediante los metodos y una progenie vegetal, porciones de planta y semillas y porciones de semillas provenientes de las plantas.

Description

PROCESO PARA UNA RÁPIDA TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS INDEPENDIENTEMENTE DE LA VARIEDAD CAMPO DE A INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para la introducción de material genético de interés en plantas y más particularmente con métodos que incluyen la transformación y conversión en línea de especies de plantas que han probado ser difíciles de manipular a un nivel genético.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante los últimos 20 años se han desarrollado metodologías para manipular plantas por ingeniería genética. En general, se basan ya sea en la introducción directa de ADN en células vegetales o la transferencia indirecta suministrada por Agrabacterium tumefaciens . Los métodos que implican la transferencia directa incluyen bombardeo de partículas de tejidos vegetales cultivados y la introducción de ADN en células vegetales simples es decir, protoplastos, utilizando polietilenglicol o electroporación. Véase, por ejemplo, Sawahel & Cove, Biotech. Adv. 10:394-412 (1992); Christou, Cur. Opinión Biotech. 4:135-141 (1993); Gelvin, Cur. Opinión Biotech. 9:221-232 (1998) y Birch, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 48:291-326 (1997). La mayoría de Jos métodos son de variedad específica debido a que se basan en el uso de sistemas vegetales con crecimiento regenerable in vitro que a su vez son de variedad específica. Excepto para pocos cultivos económicamente importantes tales como por ejemplo, papa, jitomate y cañóla, los métodos de transformación actualmente disponibles funcionan únicamente con una poca cantidad de variedades. El método de cruza tradicional para siembra ha proporcionado un mecanismo para la transferencia de un rasgo desde una línea (el donador) a otra línea (el precursor recurrente). Véase, por ejemplo, Harían y Pope, J. Heredi ty, 13:319-322 (1922). Ha sido particularmente útil para maíz, soya y algodón.

La siembra para cruza exitosa requiere: un precursor recurrente derivado anteriormente; el mantenimiento del rasgo de interés durante la selección; cruzas suficientes para reconstituir el genoma del precursor recurrente. Allard, Principi es of Pl an t Breeding , Wiley and Sons (1960). Durante el programa de cruza, la población híbrida se vuelve cada vez más homocigoto para los genes del precursor recurrente a un índice descrito por la fórmula: Proporción de homocigosidad = 1 - 0.5m en donde m es el número de generaciones de cruza. Utilizando esta fórmula, se puede calcular que más del 98% del genoma híbrido será homocigoto para genes del precursor recurrente después de seis generaciones. Sin embargo, la fórmula únicamente describe las regiones del genoma que no están vinculadas con respecto a los genes que serán introgresados . El índice al cual las regiones vinculadas se aproximan a la homocigosidad depende de la frecuencia de recombinación cromosómica. En uno de los estudios más detallados que valoran la eficacia de la siembra por cruza tradicional, ocho líneas isogénicas Tm-2-convertidas de jitomate se examinaron en nueve sitios de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción por flanqueo (RFLP, por sus siglas en inglés) . Véase, Young y Tanksley, Theor . Appl . Genet . 77:353-359 (1989). El fragmento cromosómico donador mínimo encontrado después de 10 generaciones de cruzamiento y mantenido sin reducción de tamaño durante unas nueve generaciones adicionales fue 4 cM, el tamaño máximo encontrado incluso después de 11 generaciones fue 51 cM (es decir, más de la mitad del cromosoma correspondiente) . En la selección ayudada por mareaje con base en repeticiones de secuencia simple (SSR, por sus siglas en inglés) o RFLP, la reconstrucción podría realizarse más rápido y de manera más limpia, aunque esto podría requerir de una selección de considerables poblaciones de progenies que utilicen métodos relativamente caros y se podría complicar por la inserción aleatoria de transgenes en transformantes primarios independientes.

Evidentemente, la cruza no es una tarea común debido a que para la mayoría de plantas de cultivo, se necesitan simultáneamente 'cientos de líneas, híbridos o variedades. En 1998 por ejemplo, la semilla de soya de los Estados Unidos comercializada consistió de más de 500 variedades y la semilla de maíz de los Estados Unidos comercializada incluyó más de 600 híbridos. Otra desventaja principal del método de cruza es que éste consume mucho tiempo. La conversión lineal a través de la cruza recurrente normalmente requiere de 3 a 5 cruzas subsiguientes, agregando así al menos dos y algunas veces hasta cuatro años de tiempo de desarrollo en la variedad. Existen muchas desventajas asociadas con los métodos de transformación actuales. La conversión lineal, por ejemplo, es un proceso mediante el cual el ADN heterólogo se transfiere desde una especie o variedad vegetal a otra utilizando diversas formas de hibridación sexual (es decir, polinización) o somática (es decir, celular) . Debido a que los métodos actuales son específicos de la especie y la variedad, se pueden utilizar comercialmente únicamente en combinación con tecnologías de conversión lineal que permitan transferir el transgen desde un transformante primario en múltiples variedades de interés. Además, dan por resultado en la inserción transgénica aleatoria en el genoma hospedero. Por lo tanto, la selección extensiva de muchos eventos de transformación independiente se requiere para identificar los eventos que sean estables, hereditarios y que permitan una expresión transgénica adecuada. Las inserciones transgénicas subsiguientes no se pueden dirigir al mismo sitio, complicando con esto la siembra. El arrastre por la unión (es decir, la co-herencia de rasgos no deseados) y una capacidad limitada para manipular los rasgos transgénicos independientes múltiples presentan incluso dificultades adicionales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los solicitantes han inventado un método para introducir ácido nucleico en vegetales y producir plantas manipuladas por ingeniería genética. Los métodos se pueden aplicar a plantas tales como por ejemplo maíz y trigo que han sido muy difíciles de modificar genéticamente mediante las tecnologías existentes. Además, el método constituye una mejora significativa con respecto a los métodos de cruza debido a que alcanza los mismos o mejores resultados en un periodo de tiempo mucho más corto. El ácido nucleico de interés no se introduce directamente en la planta de interés o la que se denomina como la recipiente. En su lugar, primero se enruta a otra planta, diferente del recipiente y que se denomina como el donador o las especies retenedoras. Por otra parte el ácido nucleico se mueve entonces desde el donador al recipiente. Un método ocasiona la hibridación sexual o "cruza" de las dos plantas. El polen del donador se utiliza para polinizar una planta recipiente. Otro método se conduce a nivel celular con lo cual las células o protoplastos del donador y las plantas recipientes se fusionan. Una característica de la invención permite que el ácido nucleico se mueva desde el donador al recipiente sin el movimiento de ningún ADN genómico natural del donador. Esto se lleva a cabo debido a la selección de los pares donadores/recipientes que normalmente producen híbridos inestables. Esto significa que los genomas respectivos son inestables y de esta forma no se mezclan para producir una planta "híbrida". En lo sucesivo este fenómeno se denominará "producción de progenie inestable o demostración de la segregación o clasificación preferencial". Durante la coexistencia temporal de los cromosomas del donador y el recipiente, el ácido nucleico o el gen de interés se mueve hacia el genoma de la planta recipiente. Otra característica de la presente invención realiza la introducción aleatoria o en el sitio específico del ácido nucleico al rodear al ácido nucleico de interés con secuencias de flanqueo que permiten la transposición del ácido nucleico en una ubicación aleatoria o dirige la inserción del ácido nucleico en una ubicación específica en el genoma del recipiente. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se dirige a un método para introducir material genético en plantas que comprende: preparar una primera planta transformada con un ácido nucleico heterólogo que tiene secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' que permitan el movimiento del ácido nucleico heterólogo desde un genoma a otro; cruzar una segunda planta y la primera planta transformada, en donde la primera y segunda plantas, en el momento de la cruza, producen una progenie inestable o demuestran una segregación o clasificación preferencial; y seleccionar la progenie de la segunda planta de (b) que contiene el ácido nucleico heterólogo. En modalidades preferidas, las secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' comprenden un elemento transponible y la primera planta, la segunda planta o tanto la primera como la segunda plantas producen una transposasa específica para el elemento transponible. En otra modalidad preferida, las secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' son sitios de recombinación y la primera planta, la segunda planta o tanto la primera como la segunda plantas producen una recombinasa específica para los sitios de recombinación.

En otras modalidades preferidas, la primera planta, también denominada como la donadora o la especie retenedora, es Tripsa cum y en la segunda planta, también denominada como la recipiente, es maíz, trigo, cebada o avena. En otra modalidad preferida, la donadora es Orychophragmus y la recipiente es una planta crucifera tal como por ejemplo cañóla. Otros pares donadores/recipientes preferidos son: Glycine tomen tella/ soya , Solanum phreja/papa, maíz/trigo, maíz/cebada, maíz/avena, Pennisetum/trigo, Pennisetum/cebada, Hordeum bulbosum/cebada, Hordeum bulbosum/trigo, Ni coti ana digl uta/Ni cotiana tabacum y Oryza minuta/arroz . En otras modalidades preferidas, la planta donadora y/o la recipiente porta una mutación semigamia Se . Todavía en otras modalidades preferidas, la planta donadora y/o recipiente es soya que porta una mutación ¡ns que provoca poliembrionia . En otras modalidades preferidas del proceso, se identifican transgenes en el interior de los sitios genómicos predefinidos específicos a través de la recombinación identificada como un l ocus integrante . Un aspecto relacionado de la presente invención se dirige a un método para introducir material genético en plantas que se conduce a un nivel somático. Este método incluye los siguientes pasos : preparar una célula o protoplasto de una primera planta transformada con un ácido nucleico heterólogo que tiene secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' que permiten el movimiento del ácido nucleico heterólogo de un genoma a otro; fusionar la célula o protoplasto con una célula o protoplasto de una segunda planta para producir una célula fusionada o un protoplasto fusionado, en donde la primera y segunda plantas, en el momento de la cruza, producen una progenie inestable o demuestran una segregación o clasificación preferencial; regenerar las plantas completas de la célula fusionada o el protoplasto fusionado; y seleccionar la progenie de las plantas regeneradas que contienen el ácido nucleico heterólogo. También se proporcionan las células o protoplastos fusionados per se . Además, los métodos de la presente invención producen plantas que tienen una constitución genética diferente a la de las plantas transgénicas producidas por otros métodos debido al resultado final del proceso es una planta individual que está desprovista genéticamente de cualquier ADN residente de transformante primario (es decir, el donador) . También se proporcionan la progenie, partes y semilla, y partes de la semilla de la planta.

Los métodos de la presente invención proporcionan una manipulación transgénica en esencialmente todas las especies para cultivo, en especial las variedades económicamente importantes. En general, los métodos no sólo se pueden aplicar a prácticamente todas las especies para cultivo, sino que también son rápidos (de una a dos cruzas), libres de arrastre vinculado e independiente de la variedad. Además, los métodos descritos son el único proceso de transformación y la conversión lineal independientes de la variedad que se pueden utilizar para la ingeniería genética de las líneas/híbridos complejos que no se pueden recuperar después de las cruzas con otras variedades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un mapa de plásmido lineal de pIC156 ; La Figura 2 es un mapa de plásmido lineal de pIC216; La Figura 3 es un mapa de plásmido lineal de pIC312; La Figura 4 es un mapa de plásmido lineal de PIC31A2; La Figura 5 es un mapa de plásmido lineal de pIC401; y La Figura 6 es un mapa de plásmido lineal de PIC411.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos de la presente invención producen plantas transformadas mediante la transformación de una especie donadora o mutante con una construcción capaz de realizar una división/reinserción, de preferencia mediante un mecanismo de recombinación homólogo o no homólogo suministrado por transposón, cruzar al donador con un recipiente, mientras que los organismos donador y recipiente se hayan seleccionado de combinaciones de especie/mutante que en el momento de la hibridación sexual/somática produzcan híbridos que sean inestables y demuestren una inestabilidad genómica y segregación de uno o ambos genotipos parentales puros, induciendo o seleccionando por división del ácido nucleico heterólogo del recipiente y la integración en el cromosoma parental donador, y por último, seleccionar una progenie que sea una planta recipiente esencial y genéticamente pura que porte el transgen en cuestión. El flujo de material genético heterólogo se separa completamente del flujo de gen residente durante las manipulaciones genéticas al utilizar especies o combinaciones de mutantes de organismos recipientes y donadores que en el momento de la hibridación sexual/somática produzcan híbridos que no muestren recombinación entre homólogos/cromosomas homólogos y que sean inestables y en el momento de las divisiones mitóticas o meyóticas, clasifiquen los genomas parentales puros de uno o ambos tipos. Por el término "planta" se debe entender que incluye todas las plantas que florecen y todas las formas, líneas y variedades de la planta. "Transformado", en el sentido en el que se utiliza en la presente, significa genéticamente modificado mediante la incorporación de ADN heterólogo en el interior de las células. Mediante el término "heterólogo", se debe entender un ADN no encontrado normalmente en la planta recipiente. La eliminación cromosómica de una especie específica (segregación genómica) en híbridos interespecí ficos/integenéricos es un fenómeno bien documentado. En muchos casos, sin embargo, los híbridos inestables fueron de interés limitado a medida que los principales esfuerzos de reproducción se dirigen al intercambio cromosómico entre dos genomas parentales como un método para la introgresión de material cromosómico extraño. Antes del momento de realizar la presente invención, los híbridos inestables que segregan genomas parentales se describieron únicamente en los términos de sistemas que producen plantas haploides (cruzas interespecíficas, intergenéricas para la producción de trigo, cebada, papa haploide) o en los términos de los resultados negativos de los intentos por alcanzar una introgresión del material cromosómico proveniente de especies silvestres en cosechas cultivadas (tales como por ejemplo, de Tripsacum a maíz o Glycine tomen t ell a a soya) . En general, para cada especie de cultivo, (incluyendo todas las variedades y líneas de las mismas) , existe una forma silvestre relativa o una mutante, que, en el momento de la hibridación, forma un híbrido inestable y puede servir como un donador o planta retenedora como se define en la presente. Una forma empírica para identificar un organismo incluye la cruza de una especie para cultivo de interés con varias especies relacionadas y probar la constitución genética de la progenie resultante. Los métodos para la identificación preliminar de la progenie que es predominantemente uniparental se conocen en la literatura y se basan en diferentes rasgos selectivos o no selectivos. Los métodos de genotificación amplia y confiable de la progenie son muchos, simples y dependen del análisis de diversos marcadores en el ADN genómico. Con base en esta selección primaria y la genotipificación subsiguiente, se pueden identificar rápidamente organismos retenedores adecuados. Más allá de este criterio básico, los pares donadores/recipientes se seleccionan para proporcionar una duración adecuada del estado híbrido en las células del híbrido primario, o de su progenie. Mientras que la eliminación completa es un estado final deseado, la duración relativa de la coexistencia de cromosomas de ambas especies en la misma célula es importante en la medida que proporciona suficiente tiempo para la división del sitio transgénico desde el organismo "retenedor" y su integración en el cromosoma del cromosoma recipiente. La interacción física y en particular, el intercambio de material cromosómico entre los genomas parentales en un híbrido, se puede excluir o reducir al mínimo en varias formas diferentes. La propuesta mejor conocida se basa en el uso de hibridación interespecífica o intergenérica -los híbridos producidos muestran poco, si es que lo hay, pareo cromosómico homólogo, limitando con esto el cruzamiento. Además, muchos de estos híbridos son más o menos genéticamente inestables y muestran tendencia para una rápida eliminación de un genoma parental. Como resultado, al utilizar este cruce, los cromosomas de dos organismos parentales remotos se pueden colocar en un núcleo híbrido para producir un estado híbrido para el intercambio dirigido de material transgénico entre los precursores. Sin embargo, el material cromosómico residente de los dos precursores esencialmente no interactúa y la eliminación cromosómica posterior permitirá la eliminación de un precursor tan pronto como la progenie F0, Fx o BCi . Además de la hibridación entre las especies remotas como un proceso que permite un estado híbrido temporal seguido por una recuperación rápida de los genomas parentales puros, existen otras propuestas que alcanzan resultados similares. Una de estas propuestas se basa en el uso de mutantes que reducen o eliminan el cruzamiento cromosómico y/o aquellos que provocan la segregación genómica parental pura en cruzas intraespecíficas así como también interespecíficas. Un ejemplo es la semigamia en el algodón, una mutación que provoca que el núcleo espermático entre en la célula huevo aunque en la fusión nuclear subsiguiente presuntamente no se lleva a cabo y los dos núcleos se dividen independientemente dando por resultado en plantas Fi que son quiméricas para los sectores de tejidos haploides de tipo paterno y materno. Véase, Turcotte y Feaster, J. Hered. 58:55-57 (1967). Otra propuesta es el sistema Oeno thera bien caracterizado en el cual todos los cromosomas se incluyen en transubicaciones de tal forma que las cruzas Fi con cepas normales tendrán en la meyosis un anillo que contiene el número haploide completo de cromosomas, excluyendo con esto la clasificación cromosómica independiente. Una propuesta adicional para el uso de tratamientos químicos/físicos tales como por ejemplo la irradiación (Pandey, N. Z . J. Bo t . , 1 8 : 203-201 (1980)) u otra, de un precursor que resulta en un daño y la subsiguiente eliminación preferencial del genoma dañado. Esta propuesta ha sido útil para la producción de plantas de cebolla ginogenéticas después de la polinización con polen irradiado por rayos gamma. Véase, Dore & Marie, Plant Breeding 111:142-147 (1993) . Para llevar a cabo la presente invención para cualquier planta determinada, una silvestre o remota relativa se puede encontrar que permite la presencia de híbridos genéticamente inestables que se caracterizan por una rápida segregación genómica. Más adelante se resumen las combinaciones bien caracterizadas que incluyen cultivos económicamente importantes . En cuanto a lo que se relaciona con cultivos de dicotiledóneas, el mejor caso estudiado para papas es una hibridación entre las variedades comerciales de papa, Solanum tuberosum, y una especie silvestre Solanum phureja, que da por resultado en alta frecuencia de producción haploide como resultado de la eliminación cromosómica de phureja anterior en embriones híbridos -Hougas, et al., Crop. Sci. 4:593-595 (1964); Clulow, et al., Theor. Appl. Genet. 82:545-551 (1991). Con respecto a canola/semilla de colza, la separación somática de los genomas parentales en híbridos entre Brassica napus y Orychophragmus violaceous se describe en Li, Z., et al., Theor. Appl. Genet. 91:131-136 (1995); Li, et al., Hereditas 125:69-75 (1996); Li, et al., Theor.

Appl. Genet. 96:251-265 (1998); Wu, J., et al., Plant Breeding 116:251-251 (1997). El híbrido es morfológicamente intermediario aunque es autofértil y produce principalmente la progenie B. napus. El método Orychophragmus también funciona con Brassica júncea y Brassica carinata, dos distintas de la especie Brassica de importancia económica. Esto también funcionará con otras cruciferas económicas tales como B. olerácea , B. campestris, Raphanus sativus. Con respecto a la soya, la eliminación del genoma de la especie silvestre en la progenie de un híbrido entre soya y GJycine tomentella se documenta en Shoemaker, et al., Theor. Appl. Genet. 80:11-23 (1990) . Todavía otros ejemplos de plantas matroclinas resultan de las cruzas entre Fragaria vesca (fresas) y Fragaria chiloens o F. virginiana (Ichíjima, Genetics, 11:590-604 (1926)) así como también plantas patroclinas provenientes de las cruzas entre Nicotiana digluta y N. tabacum (tobáceo, Clausen y Lammerts, Amer. Nat. 63:219-322 (1929)). En cuanto a lo que se relaciona con cultivos de monocotiledóneas, Galinat, Ann. Rev. Genet., 5:447-478 (1971) y Galinat, Evolution, 27:644-655 (1973), demuestran que en una cruza entre un maíz diploide y un Tripsacum dactyloides diploide, el híbrido Fi tuvo el número de cromosomas anfi-haploides esperados. Sin embargo, los cromosomas de Tripsacum podrían no parearse en la meyosis, y debido a esto los cromosomas Tripsa cum tienden a perderse durante la mitosis así como la meyosis, el maíz diploide se recuperó tan pronto como BCi . Estos resultados se han reproducido habitualmente en muchos laboratorios de reproducción alrededor del mundo. Cuando el trigo o la cebada se cruza con la especie silvestre Hordeum bulbosum, se obtiene una alta frecuencia de haploides como resultado de la fertilización y subsiguiente eliminación del genoma bulbosum (Kasha y Kao, Na t ure 225:874-876 (1970); Barclay, Na t ure 255:410-411 (1975)). El método se ha utilizado ampliamente para la producción haploide de muchas variedades de ambos cultivos. El método de Bulbos um se ha reemplazado por cruzas excesivas, en donde el trigo (tanto Tri ti cum esti vum como T. turgidum) , tri ti cal e o plantas de cebada se polinizan por polen de maíz, sorgo, mijo aperlado o Tripsacum . Los híbridos resultantes son bastante inestables y como regla, las plantas en desarrollo retienen únicamente el genoma materno. Este método haploide funciona con docenas de variedades de trigo y esencialmente es independiente de la variedad. Laurie y Bennett, Theor . Appl . Gene t . 76:393-397 (1988); Ohkawa, et al . , Jap . J. Breed. 42:891-894, (1992); Ushiyama, et al . , Jap . J Breed. 41 : 353 - 351 (1991); Furusho, et al . , Jap . J. Breed. 41:175-179 (1991); Laurie, Genome, 32:1063-1067 (1989). El mismo método también se puede aplicar para la producción haploide en avenas. Véase, Riñes y Dahleen, Crop Sci . , 30,1073 (1990). La segregación de genoma preferencial también se presenta en las progenies de combinaciones de arroz interespecífico ( Oryza ) , tales como O . sa ti va y O . min u ta . Véase, Mariam, et al . , Theor .

Appl . Genet . 93:664-671 (1996). En resumen, la literatura proporciona ejemplos de muchas combinaciones de hibridación bien caracterizadas que cuando se utilizan de acuerdo con la presente invención, permiten la creación de un estado híbrido temporal durante el cual el material genético heterólogo se puede intercambiar. Además, muchas especies silvestres se pueden utilizar como donadores transgénicos para una transferencia transgénica libre de arrastre rápido y unión en múltiples especies de cultivos importantes. Las especies silvestres incluyen Tripsacum (por ejemplo, para maíz, trigo, cebada y avenas) ; Oryza minuta (por ejemplo, para arroz), Orychophragmus (por ejemplo, para cañóla y otras cruciferas económicamente importantes); Sol an um ph urej a (por ejemplo, para papa) y Glycine t omen tell a (por ejemplo para soya) . Los mutantes tales como un mutante semigamia de algodón o una mutación ms que provocan poliembrionia en soya también se pueden utilizar para el mismo fin. Combinaciones o mutantes de especies similares se pueden identificar fácilmente para otras especies de cultivo importante que incluyen remolachas, guisantes y jitomates. La especie donadora se transforma con una construcción exógena o heteróloga que contiene la información genética, las instrucciones genéticas necesarias para dirigir la división del transgen en cuestión y su reintegración en otro cromosoma basado en cualesquiera mecanismos de recombinación homologa o no homologa y el ADN de interés. Para facilitar la selección de transformantes exitosos, la construcción también contiene ADN que codifica para un marcador seleccionable tal como un rasgo que será monitoreado (por ejemplo, resistencia a antibióticos o herbicidas o un marcado fenotípico, en particular beta-glucuronidasa y/o proteína fluorescente verde) . El ADN de interés puede contener uno o más genes que codifican para diferentes proteínas. La expresión de los genes en la progenie de la planta recipiente puede dar por resultado en una mayor resistencia a enfermedades por hongos, virales y/o bacterianas, pestes, insecticidas o tensión ambiental o puede dar por resultado en sabor, almacenamiento o propiedades nutricionales mejoradas. El organismo recipiente puede ser una planta no transformada o una planta transformada para contener en su genoma sitios específicos necesarios para el intercambio por recombinación homologa con los insertos de ADN exógeno en el genoma donador. En modalidades preferidas, el ADN heterólogo se mueve del donador al recipiente mediante un sistema basado en (1) transferencia transgénica no homologa suministrada por transposón o (2) transferencia identificada que utiliza mecanismos homólogos de recombinación. Los transposones son elementos genéticos móviles que pueden comprender una parte sustancial del genoma o una planta y crea una enorme diversidad fenotípica. Los elementos transponibles son segmentos móviles de ADN capaces de dividirse y reinsertarse en otro sitio en un cromosoma. Los transposones vegetales están entre los primeros elementos móviles de ADN descritos y varios de los elementos transponibles vegetales que se han clonado, tales como Ac/DS, Mu y En/Spm, se prefieren para utilizarse en la presente invención. Estos elementos transponibles actualmente se utilizan como herramientas genéticas en biología y biotecnología molecular de plantas. Sirven como herramientas invaluables para estudios experimentales en plantas y para análisis genómico en plantas y aislamiento de genes en plantas a través de lo denominado mutagénesis y mareaje insercional. Véase, por ejemplo Walbot, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43:49-82 (1992). Otros ejemplos de elementos transponibles para utilizarse en la presente invención se describen en Fedoroff, Patente de los Estados Unidos No. 4,732,856; Doonerk et al . , solicitud PCT No. WO91/156074; etc.), Yoder y Lassner, Solicitud PCT No. WO92/01370, y Ebinuma et al . , Solicitud del PCT No. W096/15252. Para los fines de la presente invención, la división y reinserción de transgenes con base en transposón es un sistema que permite la desconexión del movimiento transgénico del movimiento del gen de la planta residente durante las cruzas mientras que proporciona una ventaja importante adicional de las instrucciones completas que dirigen la división y reinserción transgénica sólo en una construcción genética y mediante un paso de transformación. De esta forma, el sistema no requiere de la ingeniería genética de los sitios para depósito en los organismos recipientes. En otra modalidad preferida, el ADN heterólogo se integra en un sitio específico del genoma recipiente mediante el uso de una combinación de recombinasa y sitio de recombinación. Las recombinasas sitio-específicas provenientes de bacteriófago y levaduras se han venido utilizando ampliamente como herramientas para la manipulación de ADN tanto en tubos de ensayo como en organismos vivos. Las combinaciones de recombinasas/sitio de recombinación preferidas para utilizarse en la presente invención son Cre-Lox, FLP-F. T y R-RS, en donde Cre, FLP y R son recombinasas y Lox , FRT y RS son los sitios de recombinación. Se pueden utilizar otros sistemas adecuados que incluyen endonucleasa I-Scel de levadura codificada por intrón. Véase, Choulika, et al . , Mol. Cell Biol. 15:1968-1973 (1995). Para que sean funcionales en plantas, estos sitios requieren de 7 a 8 pares de bases (bp) de secuencia de núcleo entre 12 a 13 repeticiones invertidas de pares de bases; el sitio del núcleo asimétrico determina la orientación del sitio y de esta forma los tipos del producto de recombinación. Sin importar que los sitios de recombinación se coloquen o no en o dentro de una molécula de ADN simple en orientación directa u opuesta, o se coloquen sobre moléculas de ADN lineales o circulares sin vincular, la recombinasa correspondiente puede catalizar el intercambio recíproco para producir un evento de supresión, inversión, transubicación o cointegración. Véase, Bollag, et al . , Ann . Rev. Gene t . 23:199-225 (1989); Kilby, et al . , Trends Gene t . 9:413-421 (1993); y Ow, Curr . Opini ón Bi o tech . 7:181-186 (1996). En la presente invención, la transubicación sitio-específica suministrada por recombi-nasa §e presenta entre cromosomas diferentes y en particular no homólogos. Este efecto de recombinasa ¿n-trans es esencial para efectuar la transferencia de transgenes entre dos cromosomas que pertenecen a diferente precursores en un híbrido. Véase, Dale y Ow, Gene 91:79-85 (1990); Odell, et al . , Mol , Gen , Genet. 223 369-378 (1990); Dale y Ow, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 88:10558-10562 (1991); Russell, et al . , Mol . Gen . Gene t . 234:49-59 (1992); Lyznik, et al . , Pl an t J, 8:177-186 (1995); Albert, et al . , Pl an t J. 7:649-659 (1995); van Deuersen et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 92:7376-7380 (1995). Ejemplos d sistemas homólogos de recombinación adecuados para utilizarse en la presente invención se exponen en la literatura, que incluye el sistema Cre-Lox (Sauer, Patente de los Estados Unidos No. 4,959,317, Odell, et al . , Patente de los Estados Unidos No. 5,658,772; Odell, et al., PCT WO91/09957) y el sistema FLP-FRT (Hodges y Lyznik, Patente de los Estados Unidos No. 5,527,695), Una utilidad. particular de los .sistemas de recombinación conocidos para el manejo transgénico en plantas se dirige a la división de un transgen del genoma vegetal, un procedimiento que permite la eliminación de un material genético heterólogo no deseado tal como los marcadores selectivos antibióticos provenientes de una variedad comercial (Ow y Dale, PCT WO93/01283) . Sin embargo, estos sistemas se dirigen a un área de utilidad completamente diferente, a saber, el uso de recombinación homologa para eliminar porciones no deseadas de ADN heterólogo, en lugar de manipular la separación de flujos de tra.nsgenes y genes vegetales residentes. Otra utilidad se describe en Hooykaas y Mozo, Patente de los Estados Unidos No. 5,635,381 y Offringa, et al., Patente de los Estados Unidos No. ,501,967 dirigidas al uso de sistemas homólogos de recombinación para alcanzar una integración identi icada sitio-dirigida de ADN en genomas vegetales mediante la transformación suministrada por AgrQbacteri um , Estos casos también están limitados a la transferencia identificada entre bacterias y células vegetales distintas de aquellas entre dos organismos vegetales. El entremezclado transgénico homólogo con base en la recombinación tiene ventajas tanto claras como importantes. Al emplear una identificación precisa mediante sitios de ADN dirigidos por homología, los "sitios de depósito" transgénicos se pueden crear para que se seleccionen y caractericen cuidadosamente de antemano. Como resultado, se alcanza un nivel mayor de capacidad de predicción y de reproducción del comportamiento transgénico, que incluye la capacidad de heredar, el nivel de expresión, ausencia de silenciación, etc. También, más tarde las versiones del cásete transgénico se pueden dirigir al mismo sitio, remplazando las versiones viejas de transgenes con unas más nuevas. La reproducción subsiguiente del material con sitios de integración preseleccionados, determinados y mapeados es mucho más fácil y directa. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que este sistema se puede utilizar únicamente si todos los recipientes se han "pre-reforzado" para contener sitios de integración. Esta introgresión es posible al utilizar otros mecanismos de transf rencia, por ejemplo, transferencia suministrada por transposón o introgresión clásica mediante cruzamiento. En casos más específicos, un gen de recombinasa también se puede introducir en las especies aceptoras además de su sitio de recombinación. En estos casos, el gen de recombinasa estará bajo el control de un promotor suministrado por factor de transcripción artificial en donde el factor de trascripción se expresa constitutivamente mediante el gen ubicado en la planta donadora (retenedora) la recombinasa se puede producir únicamente durante la coexistencia de dos genomas en híbridos inestables. Alternativamente, la recombiansa se puede ubicar en una planta retenedora, aunque el factor de trascripción se expresa constitutivamente en la planta recipiente. El ADN heterólogo se puede introducir en la planta donadora de acuerdo con técnicas estándar. Las técnicas de transformación para dicotiledóneas son bien conocidas en la técnica e incluyen técnicas basadas en Agroba c t eri um y técnicas que no requieren Agrobact eri um . Las técnicas sin Agroba c t eri um incluyen la ingestión del material genético exógeno directamente por los protoplastos o células. Estas técnicas incluyen PEG o ingestión suministrada por electroporación, transferencia y microinyección suministrados por bombardeo de partículas. Ejemplos de estas técnicas se describen en Paszkowski et al . , EMBO J 3:2717-2722 (1984), Potrykis e t al . , Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich e t al . , Biotechnology 4:1001-1004 (1986), y Klein et al . , Nature 327:70-73 (1987). En cada caso, las células transformadas se regeneran a plantas completas utilizando técnicas estándar. La transformación suministrada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de dicotelidóneas debido a su alta eficacia de transformación y su amplia utilidad con muchas especies diferentes. Las muchas especies para cultivo para que se puedan transformar habitualmente por Agrobacteri um incluyen tabaco, jitomate, girasol, algodón, colza de semilla oleaginosa, papa, soya, alfalfa y álamo (EP 0 317 511 (algodón), EP 0 249 432 (jitomate), WO 87/07299 ( Brassi ca ) , Patente de los Estados Unidos No. 4,795,855 (álamo)). La transformación de Agroba c teri um normalmente incluye la transferencia del vector binario que porta el ADN extraño de interés (por ejemplo, pCIB200 o pCIB2001) a una cepa de Agroba cteri um adecuada que puede depender del complemento de genes vi r portados por la cepa de Agrobacteri um hospedera ya sea en un plásmido co-residente o ci -.osómicamente (por ejemplo, cepa CIB542 para pCIB200 (Uknes et al . , Plant Cell 5: 159-169 (1993)). La transferencia del vector binario recombinante, para Agrobacteri um se lleva a cabo mediante un procedimiento de apareamiento triparental utilizando E. coli que porta el vector binario recombinante, una cepa de E . coli auxiliar que porta un plásmido tal como pRK2013 que es capaz de movilizar el vector binario recombinante a la cepa de Agroba cteri um blanco. Alternativamente, el vector binario recombinante se transfiere a Agrobac teri um mediante la transformación de ADN (Hófgen & Willmitzer, Nucí. Acids Res. 1 6, 9877 (1988)). La transformación de las especies vegetales blanco mediante Agrobact eri um recombinante normalmente incluye el co-cultivo del Agroba ct eri um con explantaciones provenientes de la planta y sigue los protocolos conocidos en la técnica. El tejido transformado se regenera en medio que se puede seleccionar que porta un marcador de resistencia a antibióticos o herbicidas presente entre los límites de ADN T de plásmido binario. Las técnicas de transformación preferidas para monocotiledóneas incluyen transferencia directa de genes en protoplastos utilizando técnicas PEG o de electroporación y bombardeo de partículas en tejido de callo. La transformación se puede intentar con una especie de ADN simple o especies de ADN múltiples (es decir, co-transformación) y ambas de estas técnicas son adecuadas para utilizarse con esta invención. La co-transformación puede tener la ventaja de evitar la construcción del vector complejo y de generar plantas transgénicas con sitios no vinculados para el gen de interés y el marcador que se puede seleccionar, haciendo posible la eliminación del marcador seleccionable en generaciones subsiguientes, lo cual se debe considerar deseable. Sin embargo, una desventaja del uso de la cotransformación es que menos del 100% de frecuencia con la cual se separan las especies de ADN se integran en el genoma (Schocher et al . , Biotechnology 4: 1093-1096 (1986) ) . Las solicitudes de Patente Publicadas EP O 292 435, EP O 392 225 y WO 93/07278 describen técnicas para la preparación de callos y protoplastos de maíz, transformación de protoplastos utilizando PEG o electroporación y la regeneración de plantas de maíz provenientes de protoplastos transformados. Gordeon-Kamm, et al . , Plant Cell 2:603-618 (1990), y Fromm, et al., Biotechnology 11:194-200 (1993), describen técnicas para la transformación de líneas endogámicas élite de maíz mediante bombardeo de partículas . La transformación de arroz también se puede intentar mediante técnicas de transferencia directa de genes que utilizan protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación suministrada por protoplastos se ha descrito para los tipos Japóni ca y los tipos Indi ca (Zhange, et al . , Plant Cell Rep. 7:739-384 (1988); Shimamoto, et al . , Nature 338:274- 277 (1989); Datta, et al . , Biotechnology 8:736-740 (1990)). Los dos tipos también se pueden transformar habitualmente utilizando bombardeo de partículas (Christou, et al . , Biotechnology 9:957-962 (1991)). La solicitud de Patente EP 0 332 581 describe las técnicas para la generación, transformación y regeneración de protoplastos de Pooi dea e . Además, la transformación del trigo se describe en Vasil, et al . , Biotechnology 10:667-674 (1992) utilizando bombardeo de partículas en células del tipo C de callo regenerable a largo plazo, Vasil, et al . , Biotechnology 11:1553-1558 (1993) y Weeks, et al , . Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993) describen bombardeo de partículas de embriones inmaduros y callos derivados de embriones inmaduros. La transformación de células monocotiledóneas tales como Zea mays se alcanza al hacer que las células monocotiledóneas entren en contacto con una multiplicidad de cuerpos similares a agujas sobre los cuales estas células se pueden cercar, provocando una ruptura en la pared celular permitiendo con esto la entrada del ADN transformante en el interior de las células. Véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,302,523. Las técnicas de transformación que se pueden aplicar tanto a monocotiledóneas como dicotiledóneas también se exponen en las siguientes Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,240,855 (pistola de partículas); 5,204,253 (microproyectiles acelerados por choque de gas frío); 5,179,022 (aparato biolístico); 4,743,548 y 5,114,854 (microinyección); y 5,149,655 5,120,657 (transformación suministrada por partículas aceleradas); 5,066,587 (acelerador de microproyectiles impulsados por gas); 5,015,580 (transformación de plantas de soya suministrada por partículas); 5,013,660 (transformación suministrada por haz láser); 4,849,355 y 4,663,292. Las células vegetales así transformadas o tejido vegetal se desarrollan entonces en plantas completas de acuerdo con técnicas estándar. La semilla transgénica se puede obtener de plantas transgénicas que florecen de acuerdo con técnicas estándar. Asimismo, las plantas que no florecen tales como la papa y las remolachas se pueden propagar mediante una variedad de procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Newell et al . Plant Cell Rep. 10:30-34 (1991) (que exponen la transformación de papas mediante el cultivo de tallos) . En otra modalidad de la presente invención, el ácido nucleico heterólogo se transfiere desde el donador al genoma de la planta recipiente mediante la fusión de células somáticas o protoplastos. Una ventaja de esta modalidad es que se desvían algunas de las barreras de hibridación que limitan la cruza sexual. Sin embargo, esta tecnología es más compleja que la cruza sexual y se puede utilizar únicamente para las cruzas entre especies que se puedan regenerar a partir de un protoplasto. De esta forma, se prefiere utilizar plantas donadoras y recipientes que no estén relacionadas. Ejemplos de estos apareamientos incluyen Ara£>idopsis/algodón, Arabi opsis/soya, Arabidopsis/arroz y tabaco/soya. Por otro lado, aunque se han creado híbridos entre especies relacionadas distantemente (integenéricas, intertribales e interfamiliares) que utilizan hibridación por protoplastos, se ha limitado la capacidad de dos genomas filogenéticamente distantes para cooperar en una célula híbrida y las células híbridas con frecuencia son inestables y rápidamente pierden material genético de una de las especies parentales. Véase, Gleba & Sytnik, Monogr . Theor . Appl . Gene t . 8:1-220 (1984), Dudits, et al . , Proc . Na t . Acad. Sci . USA 84:8434-8438 (1987), y Babiychuck, et al . , Mol. Gen . Genet . 84:87-91 (1992). De esta forma, se prefieren en mayor medida los pareos de plantas donadoras y recipientes que estén distantemente relacionadas. Los experimentos descritos más adelante son resúmenes de la transformación exitosa y la conversión lineal para cuatro especies de cultivo importantes (cañóla, papa, maíz y trigo) con base en el uso de combinaciones de hibridación de especies específicas y cualquier división/reinserción transgénica con base en transposón o recombinación homologa. Estos ejemplos se presentan simplemente para ilustrar las modalidades específicas de la presente invención y no pretenden proporcionar ninguna limitación a la invención que no se establezca en las reivindicaciones.

E EMPLOS Ejemplo I Transformación/conversión lineal de la especie Brassi ca Desi gnaci ón de las construcci ones Los vectores binarios ' que contienen componentes del elemento transponible de Z . mays Spm dentro de los límites de ADN-T se elaboran como se describe más adelante. El plásmido pIC012 se digirió con Xhol y Smal, un fragmento grande fue gel purificado y ligado con el fragmento RS producido mediante el tratamiento con Xhol y Clal/Klenow. El plásmido pIC013 resultante, que contenía pNOS-RS-3 ' OCS en pUC118, se digirió con Ps t l y Bel l , gel-purificado y ligado con un fragmento grande de pIC017 digerido con las mismas enzimas. El plásmido pIC23, que contenía el elemento dSpm con pNOS-RS-3 ' OCS se trató posteriormente con i?in iri/Klenow y BamHl /Klenow para eliminar los sitios Hi ndl l ? y BajpHl . El fragmento Clal grande de pIC23 ( - BamHl ; -BJndI I I ) se clonó en el sitio Clal de pIC201, proporcionando el elemento dSpm flanqueado por p35S y GUS -3 r N0S (pIC132) . El plásmido pIC132 se digirió con £coRl y BJndI I I . El fragmento grande fue gel purificado y clonado en los sitios BcoRl y Hindl l l del vector binario basado en pRK290 y que porta el gen NPTII como el marcador de transformación vegetal. El plásmido pIC141 resultante se digirió con £cll36II y BJndI I I , ligado con el fragmento 0.3 kb Xhol-BamHl de pIC022 y el fragmento 7.7 kb Xhol-Smal de pIC023 para introducir la transposasa Spm bajo el control del promotor 35S en el vector binario. El plásmido pIC156 se obtuvo y se utilizó en experimentos de transformación. El plásmido pIC156 se elaboró de una forma similar, aunque el fragmento Xhol-BamJHl de pIC022 se reemplazó por el fragmento 0.2 kb Xhol-BglII (pSpm) de pICßl. Los pasos de clonación para otros cuatro vectores únicamente fueron diferentes del descrito anteriormente en las etapas de equipamiento del elemento dSpm con cualquier pNOS : BAR-OCS3 ' o con pNOS : BAR-OCS3 ' , en donde BAR se flanqueo por dos sitios RS . El plásmido pIC132 se digirió con Pstl, Bell, gel purificado y ligado con el fragmento 1.5 kb Pstl, Bell de pICOlß, proporcionando el elemento dSpm con pNOS : BAR-OCS3 ' . Para las construcciones pIC401 y pIC411, el fragmento Xhol -Ncol de pICOl grande se ligó con el fragmento pequeño del fragmento BspHl-BamHl de pICOld y dos fragmentos RS flanqueados con los sitios Ncol -BspHl y Bglll-Xhol respectivamente. El plásmido pIC38 resultante consistió de un gen BAR flanqueado por dos sitios RS . El fragmento Xhol pequeño de pIC36 se volvió a clonar en el sitio Xhol de pIC334 proporcionando el plásmido pIC342 con pNOS : RS -BAR-RS-OCS3 ' . El último cásete se volvió a clonar en el elemento dSpm como se describió anteriormente. En resumen, las construcciones obtenidas consistieron de un marcador de trasformación (gen NPTII que confiere resistencia a la canamicina) , fuente de la transposasa Spm bajo el control de cualquier 35S o su propio promotor, el elemento dSpm no autónomo insertado dentro del marcador de división p35S : GUS . Se elaboraron tres diferentes versiones del elemento dSpm : a) dSpm contiene el promotor NOS separado por el sitio RS (sitio de recombinación reconocido por la recombinasa R de Z . rouxi i ) proveniente del terminador de trascripción del gen OCS . (Véase: pIC156 y pIC216, Figuras 1 y 2) . b) dSpm contiene pNOS . - BAR-0CS3 ' . (pIC312, pIC31A2, Figuras 3 y 4) . c) dSy ~ contiene pNOS : BAR-OCS3 r , aunque el gen BAR está flanqueado por dos sitios RS no dirigidos (pIC401, pIC411, Figuras 5 y 6) .

Las construcciones se probaron en Arabidopsis utilizando un procedimiento de transformación in planta. La división dSpm se puede monitorear fácilmente en transformantes primarios mediante la presencia de sectores GUS+ después de la tinción de los tejidos vegetales con X-gluc. Todas las construcciones mostraron una alta actividad de transposición en Arabidopsis y se utilizaron para obtener y caracterizar diversos transformantes Orychophragmus violaceus .

Conversión lineal que utiliza O. violaceus La semilla de Orychophragmus violaceous se esterilizó y se hizo germinar in vitro. La transformación de las plantas desarrolladas in vitro de la especie se realizó como se describió anteriormente para la especie Brassica (De Block, et al., Plant Physiol., 91,694-701 (1989)). Las construcciones utilizadas se basaron en Agrobacterium que porta transposasa Spm junto con diferentes versiones del elemento dSpm no autónomo insertado entre el promotor 35S CaMV y el gen GUS (véase la Figura 1). Los plásmidos se utilizaron para producir plantas Orychophragmus transformadas. Se han producido y caracterizado diversas plantas transgénicas. Dos transformantes independientes que contienen una inserción de copia simple se han cruzado como padres macho para diferentes especies de Brassica (B. nigra, B. júncea, B. napus, B. carinata) y Sinapsis alba como se describió anteriormente. En total, se realizaron aproximadamente 600 cruzas. Los híbridos resultantes se dejaron para si mismos y la progenie Fi se seleccionó para la presencia del elemento dSpm (análisis PCR o resistencia a la fosfinotricina) . Aquellos que sobrevivieron a la selección se seleccionaron adicionalmente para el fenotipo puro de Brassica y para la ausencia de actividad GUS, y, finalmente, se probaron para la ausencia de cualesquiera secuencias de transposasa, o repeticiones Orychophragmus específicas de la especie. Por último, la co-segregación de dSpm con un patrón RFLP de cromosoma específico de Brassica se ha establecido mediante el análisis de la progenie F2.

Conversión lineal utilizando Arabidopsis thaliana En los siguientes ejemplos, todos los experimentos se realizaron como se describió anteriormente excepto que en lugar de O. violaceus , se utilizaron plantas A. thaliana como padres macho. La Arabidopsis es fácil de transformar y tiene un ciclo corto de vida. Estas características hacen de la Arabidopsis una candidata excelente para la especie retenedora.

Ejemplo II Transformación/conversión lienal de Bra ssi ca napus Una semilla de la variedad Brassi ca napus y aquellas de Orychophragmus vi ol a ceo us se esterilizaron y se hicieron germinar i n vi tro . La transformación se realizó como se describió en (De Block, et al . , Pl an t Physi ol . 91:694-701 (1989)). La semilla de Orychophragmus se transformó con el vector pII2 con base en Agrobac teri um que contenía el gen para la recombinasa R y un gen sin promotor para resistencia a higromicina flanqueado por dos sitios de recombinación rsx . El organismo de semilla de colza se transformó con el vector pII3 que contenía un promotor 35S CaMV con un sitio recombinante RS, de tal forma que la recombinación adecuada pudiera crear un gen HPT activo que confiera resistencia a higromicina. Dos plantas independientes transformadas de cada especie se seleccionaron con base en el análisis molecular de los transgénicos. Las cruzas y el análisis de la progenie se realizó como en el Ejemplo II.

Ejemplo III Transformación/conversión lineal de papa Los experimentos se realizaron como anteriormente (Ejemplo I) excepto que se utilizó Sol an um ph urej a transgénica como un partícipe de transposasa o repeticiones Tripsa cum de especie-específica. Por último, la co-segregación de cualquier resistencia a fosfinotricina o señal PCR dSpm-específica con un patrón RFLP de cromosoma específico de maíz se estableció al analizar la progenie BC/F2.

Ejemplo V Transformación/conversión lineal de trigo Los experimentos se realizaron como en el ejemplo anterior (Ejemplo IV) con la excepción de que las cruzas se realizaron como se describe en Riera-Lizararu & Mujeeb-Kazi, Crop Sci . 33:973-976 (1993). Las líneas convertidas primarias se seleccionaron como haploides diploidizados F0 que surgen de las cruzas .

APLICACIÓN INDUSTRIAL La presente invención es útil en la producción de plantas manipuladas por ingeniería genética que exhiben una amplia disposición de propiedades que pueden incluir resistencia mejorada a virus, hongos, enfermedades bacterianas, pestes, pesticidas o tensión ambiental, así como también para la mejora de otras proDiedades comercialmente deseables tales como sa or, almacenamiento o propiedades nutricionales mejoradas. Todas las publicaciones mencionadas en esta polen. Las cruzas se realizaron como se describe en Her sen, et al . , Euphyti ca 22:244-259 (1973), y las líneas convertidas primarias se seleccionaron como dihaploides diploidizados F0.

Ejemplo IV Transformación/conversión lineal de maíz La línea Tripsacum da c tyl oi des se utilizó en este experimento como un donador transgénico. Las construcciones utilizadas fueron con base en Agroba cteri um como se muestra en la Figura 1, que porta transposasa Spm junto con el elemento dSpm no autónomo insertado entre el promotor 35S CaMV y el gen GUS. El dSpm contenía cualquier sitio de recombinación RS o un marcador que se puede seleccionar (BAR) con (pIC401, pIC411) o sin (pIC312, pIC31A2) sitos RS . La transformación del material parental se realizó esencialmente como se describe en Hiei, et al . , Pl an t Mol . Bi ol . 35:205-218 (1997). Las plantas transgénicas se cruzaron con una variedad de maíz y la progenie resultante se autoalimento . Los segregados del tipo maíz puro se seleccionaron de entre los BCi que mostraron una resistencia a fiosfinotricina o una señal PCR dSpm-específica . Aquellos que sobrevivieron a la selección se seleccionaron adicionalmente para el fenotipo de maíz puro y para ausencia de actividad GUS, y, por último, se probaron para ausencia de cualesquiera secuencias especificación son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas estas publicaciones se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación individual se indicará específica e individualmente para estar incorporada como referencia. Diversas modificaciones de la invención descritas en la presente se harán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Estas modificaciones pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (36)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un método para introducir material genético en plantas, que comprende: preparar una primera planta transformada con un ácido nucleico heterólogo que tenga secuencias de flanqueo que se puedan dividir en la dirección 5' y 3' que permitan el movimiento del ácido nucleico heterólogo de un genoma a otro, cruzar una segunda planta y la primera planta transformada, en donde la primera y segunda plantas, en el momento de la cruza, producen una progenie inestable o demuestran una segregación o clasificación preferencial; y seleccionar la progenie de la segunda planta de (b) que contiene el ácido nucleico heterólogo.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde las secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' comprenden un elemento transponible, y en donde la primera planta, la segunda planta o las dos tanto la primera planta como la segunda planta producen una transposasa específica para el elemento transponible.
3. 3. El método según la reivindicación 1, en donde las secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' son sitios de recombinación y en donde la primera planta, la segunda planta o tanto la primera como la segunda plantas producen una recombinasa específica para los sitios de recombinación.
4. 4. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Tripsacum y la segunda planta es maíz.
5. 5. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Tripsa cum y la segunda planta es trigo.
6. 6. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Tripsa cum y la segunda planta es cebada.
7. 7. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Tripsacum y la segunda planta es avena.
8. 8. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Orychophragmus y la segunda planta es una crucifera.
9. 9. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Arabi dopsi s y la segunda planta es una crucifera.
10. 10. El método según la reivindicación 8, en donde la crucifera es cañóla.
11. 11. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Glycine t omen tel l a y la segunda planta es soya.
12. 12. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Sol an um phrej a y la segunda planta es papa.
13. 13. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es maíz y la segunda planta es trigo.
14. 14. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es maíz y la segunda planta es cebada.
15. 15. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es maíz y la segunda planta es avena.
16. 16. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Penni se t um y la segunda planta es trigo.
17. 17. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Penni se t um y la segunda planta es cebada.
18. 18. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Hordeum bulbos um y la segunda planta es cebada.
19. 19. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Hordeum bulbos um y la segunda planta es trigo.
20. 20. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Oryza min u ta y la segunda planta es arroz.
21. 21. El método según la reivindicación 1, en donde la primera planta es Ni co ti ana di l gu ta y la segunda planta Ni co ti ana taba cum .
22. 22. El método según la reivindicación 1, en donde una o tanto la primera como la segunda plantas es algodón que porta una mutación semigamia Se .
23. 23. El método según la reivindicación 1, en donde una de la primera y segunda plantas es soya que porta una mutación ms que provoca poliembrionia .
24. 24. El método según la reivindicación 1, un donde la primera planta es Arabi dopsi s .
25. 25. Un método para introducir material genético en plantas, que comprende: (a) preparar una célula o protoplasto de una primera planta transformada con un ácido nucleico heterólogo que tiene secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' que permita el movimiento del ácido nucleico heterólogo de un genoma a otro; (b) fusionar la célula o protoplasto con una célula o protoplasto de una segunda planta para producir una célula fusionada o un protoplasto fusionado, en donde la primera y segunda plantas, en el momento de la cruza, producen una progenie inestable o demuestran una segregación o clasificación preferencial; (c) regenerar plantas completas de la célula fusionada o el protoplasto fusionado; y (d) seleccionar la progenie de las plantas regeneradas de (c) que contienen el ácido nucleico heterólogo .
26. 26. El método según la reivindicación 25, en donde las secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' comprenden un sitio de recombinación.
27. 27. El método según la reivindicación 25, en donde la fusión se conduce en medio que contiene una recombinasa específica para el sitio de recombinación.
28. 28. El método según la reivindicación 25, en donde la primera especie de planta, la segunda especie de planta o tanto la primera como la segunda especie de plantas producen una recombinasa específica para los sitios de recombinación.
29. 29. El método según la reivindicación 25, en donde las secuencias de flanqueo que se pueden dividir en la dirección 5' y 3' comprenden un elemento transponible, y en donde la primera planta, la segunda planta o tanto la primera planta como la segunda planta producen una transposasa específica para el elemento transponible.
30. 30. El método según la reivindicación 25, en donde la primera planta es Arabi dopsi s y la segunda planta es algodón.
31. 31. El método según la reivindicación 25, en donde la primera planta es Arabi dopsi s y la segunda planta es soya.
32. 32. El método según la reivindicación 25, en donde la primera planta es Arabi dopsi s y la segunda planta es arroz.
33. 33. Una planta completa que contiene un ácido nucleico heterólogo, preparada mediante el método según la reivindicación 1 o la reivindicación 24.
34. 34. La semilla o porciones de la semilla provenientes de la planta completa según la reivindicación 33.
35. 35. La progenie de la planta según la reivindicación 33.
36. 36. Una célula fusionada o protoplasto fusionado producido mediante el método según la reivindicación 25 (b) .