BR112019004850A2 - métodos e composições para edição de genoma por meio de indução de haploides - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a métodos e composições para melhoramento de plantas aprimorado com o uso de edição de genes e indução de haploides.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o Pedido Provisório US n° 62/394.409, depositado em 14 de setembro de 2016 que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM TE SEQUÊNCIAS [002] Uma listagem de sequências contida no arquivo denominado “61934WO_ST25.txt” que tem 65536 bytes (medidos em MS-Windows®) e foi criada em 7 de setembro de 2017, é depositada eletronicamente com o presente documento e incorporada a título de referência em sua totalidade.
CAMPO [003] A presente divulgação fornece métodos e composições para efetuar a modificação de genoma usando a edição de genoma em combinação com a indução de cruzamentos de haploides.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [004] A distribuição útil de características para diversos germoplasmas envolve tradicionalmente múltiplas rodadas de retrocruzamento para mover a característica de um germoplasma doador para a linhagem (ou linhagens) de interesse. Este processo pode levar anos para completar, e isto requer, frequentemente, campo extensivo ou espaço de estufas para cultivar as plantas necessárias. Além disto, para algumas características nativas, a recombinação ruim em torno da característica de interesse resulta no arraste de ligação de uma porção substancial do genoma doador que pode ter efeitos fenotípicos indesejados, ou até mesmo prejudiciais. Os melhoristas de planta podem usar as linhagens de indução de haploides e haploides duplos para acelerar
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2/81 a integração de uma característica desejada em uma linhagem de interesse.
[005] Descobertas recentes em tecnologias de edição de genoma revelaram novos sistemas pelos quais as mutações, incluindo redisposições genômicas, podem ser alvejados para loci específicos dentro de um genoma da planta, por exemplo, dedos de zinco, efetores semelhantes a ativador de transcrição, e repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente agrupadas (CRISPR). Estas novas ferramentas mostraram comprometimento na permissão de maiores possibilidades para cientistas de planta possibilitarem a incorporação de edições de nucleotídeo específicas para sequências-alvo específicas dentro de um genoma-alvo que eram anteriormente impossíveis, ou, então, estaticamente improváveis de ocorrer de modo a serem improváveis em uma configuração de alta produtividade e/ou industrial.
[006] No entanto, uma desvantagem importante destes sistemas é a persistência de elementos mutantes na célula após a edição desejada ter sido feita o que poderia, ainda, afetar a expressão de gene e/ou criar mutações indesejadas adicionais no genoma da planta. Os métodos de melhoramento de planta atuais ensinam que para eliminar tais componentes de edição de genoma (GECs) de uma planta após uma edição desejada ser feita, é necessário retrocruzar plantas que contêm as sequências para um ascendente recorrente que carecem das sequências e selecionam aquela progênie que perdeu o GEC, mas retêm a edição desejada incorporada em seu genoma. Este processo é lento, custoso, e requer investimento considerável em recursos para alcançar.
[007] Assim, há uma necessidade na técnica para eliminar eficientemente o GEC em uma célula que segue a edição e para escalonar para cima um sistema de GE para produzir eficientemente uma ampla variedade e/ou combinação de diferentes edições em um grande número de germoplasmas de planta diferentes em uma escala industrial
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3/81 ou comercial, para satisfazer a demanda de sistemas de agricultura competitiva moderna.
[008] Os métodos e composições descritos no presente documento satisfazem as necessidades na técnica expondo-se componentes de edição de genes em uma linhagem de doador para modificar o genoma em uma linhagem desejada sem a necessidade de múltiplas rodadas de retrocruzamento e sem arraste de ligação substancial.
SUMÁRIO [009] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método de modificação de um genoma da planta que compreende fornecer uma primeira planta que compreende pelo menos um componente de edição de genoma (GEC) e cruzar a primeira planta com uma segunda planta para gerar um genoma modificado da segunda planta em que o genoma da segunda planta é modificado por o pelo menos um componente GEC. Uma terceira planta é produzida a partir do cruzamento da primeira e da segunda planta em que a terceira planta compreende o genoma modificado da segunda planta e em que a terceira planta carece substancialmente do GEC. Em algumas modalidades, a primeira planta é uma planta indutora de haploide.
[010] Em uma outra modalidade, a invenção se refere a um método de modificação de um genoma da planta que compreende fornecer uma primeira planta que compreende pelo menos um cromossomo supranumerário, em que o cromossomo supranumerário compreende pelo menos um componente de edição de genoma (GEC). A primeira planta é cruzada com uma segunda planta para gerar um genoma modificado da segunda planta pela ação do componente GEC no genoma da segunda planta. O cruzamento entre a primeira e a segunda planta resulta em uma terceira planta que compreende o genoma modificado da segunda planta, mas carece substancialmente do GEC.
[011] Em uma modalidade adicional, a invenção se refere a um
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4/81 método de modificação de um genoma da planta que compreende fornecer uma primeira planta que compreende pelo menos um componente de edição de genoma (GEC) em uma molécula de DNA carreadora. A primeira planta é cruzada com uma segunda planta, em que a genoma da segunda planta é suficientemente exposta ao pelo menos um GEC para modificar as proteínas codificadas por o pelo menos um GEC. O cruzamento da primeira e da segunda planta resulta, então, em uma terceira planta que compreende o genoma modificado da segunda planta, mas carece substancialmente do GEC. Em algumas modalidades, a primeira planta é uma planta indutora de haploide.
[012] Em uma outra modalidade, a invenção se refere a um método de modificação de um genoma da planta que compreende fornecer uma primeira planta de uma primeira espécie de planta que compreende pelo menos um componente de edição de genoma (GEC). A primeira planta da primeira espécie de planta é cruzada com uma segunda planta de uma segunda espécie de planta, em que o pelo menos um GEC modifica um genoma da segunda planta da segunda espécie de planta para gerar um genoma modificado da segunda planta. O método compreende ainda recuperar uma planta híbrida F1 do cruzamento da primeira e da segunda planta e cruzar, ainda, a planta híbrida F1 para obter uma planta progenitora que compreende o genoma modificado da segunda planta, mas em que a planta progenitora carece substancialmente do genoma nuclear da primeira planta.
[013] Aspectos e modalidades adicionais da presente invenção serão evidentes a partir da descrição fornecida no presente documento. Deve-se compreender que a descrição e os exemplos fornecidos se destinam para propósitos de ilustração apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção da Depositante.
DESCRIÇÃO DETALHADA [014] A menos que seja definido de outro modo, todos os termos
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5/81 técnicos e científicos usados têm o mesmo significado que comumente compreendido por um indivíduo com habilidade comum na técnica ao qual esta divulgação pertence. Quando um termo for fornecido no singular, os inventores também contemplam os aspectos da divulgação descritos pelo plural desse termo. Onde há discrepâncias nos termos e definições utilizados nas referências que são incorporadas por referência, os termos utilizados neste pedido devem ter as definições aqui dadas. Outros termos técnicos utilizados têm seu significado comum na técnica em que são utilizados, como exemplificado por vários dicionários específicos da técnica, por exemplo, “The American Heritage® Science Dictionary” (Editores dos American Heritage Dictionaries, 2011, Houghton Mifflin Harcourt, Boston e Nova York), o “McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms” (6a edição, 2002, McGraw-Hill, Nova York), ou o “Oxford Dictionary of Biology” (6a edição, 2008, Oxford University Press, Oxford e Nova York). Os inventores não pretendem se limitar a um mecanismo ou modo de ação. A referência ao mesmo é fornecida apenas para propósitos ilustrativos.
[015] A prática da presente divulgação emprega, a menos que indicado o contrário, técnicas convencionais de bioquímica, química, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genômica e biotecnologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Consulte Green e Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a edição (2012); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); a série Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor eds. (1995)); Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)); Recombinant Protein Purification: Principles And Methods, 18-1142-75, GE Healthcare Life Sciences; C. N. Stewart, A. Touraev, V. Citovsky, T. Tzfira eds. (2011) Plant Transformation Technologies (Wiley-Blackwell); e R. H. Smith
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6/81 (2013) Plant Tissue Culture. Techniques And Experiments (Academic Press, Inc.).
[016] Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas a título de referência em suas totalidades.
[017] Tal como aqui utilizado, a forma singular um, uma e o/a incluem referências plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Deste modo, por exemplo, referência a “planta”, “a planta” ou “uma planta” também inclui uma pluralidade de plantas; também, dependendo do contexto, o uso do termo “planta” também pode incluir progênie geneticamente similar ou idêntica daquela planta; o uso do termo “um ácido nucleico” opcionalmente inclui, como uma matéria prática, muitas cópias daquela molécula de ácido nucleico; similarmente, o termo “sonda” opcionalmente (e tipicamente) abrange muitas moléculas de sonda similares ou idênticas.
[018] Conforme usado no presente documento, “planta” se refere a uma planta integral ou uma célula ou cultura de tecido derivada de uma planta, que compreende qualquer um dentre: plantas integrais, componentes ou órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), tecidos vegetais, sementes, células vegetais e/ou progênie das mesmas. Uma planta progenitora pode ser de qualquer geração filial, por exemplo, F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, etc. Uma célula vegetal é uma célula biológica de uma planta, tirada de uma planta ou derivado através da cultura de uma célula tirada de uma planta. As partes de planta incluem partes coletáveis e partes úteis para a propagação de plantas progenitoras. As partes de planta úteis para propagação incluem, por exemplo, e sem limitação: semente; fruta; um corte; uma muda; um tubérculo; e um porta-enxerto. Uma parte coletável de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, incluindo, por exemplo, e sem limitação: flor; pólen; muda; tubérculo; folha; caule; fruta; semente; e raiz. As células vegetais, conforme usado no presente documento, incluem
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7/81 protoplastos e protoplastos com uma parede celular. Uma célula vegetal pode ser um protoplasto, uma célula produtora de gameta, ou uma célula ou coleção de células que pode se regenerar em uma planta integral.
[019] Conforme usado no presente documento, “genoma da planta” se refere a um genoma nuclear, um genoma mitocondrial, ou um genoma plastidial (por exemplo, cloroplasto) de uma célula vegetal.
[020] Conforme usado no presente documento, “transgênico” se refere a uma célula vegetal, uma planta, uma parte de planta, ou uma semente cujo genoma foi alterado pela integração estável de DNA exógeno. Uma linhagem transgênica inclui uma planta regenerada a partir de uma célula vegetal originalmente transformada e plantas transgênicas progenitoras de gerações ou cruzamentos anteriores de uma planta transformada. Conforme usado no presente documento, um “transgene” se refere a um polinucleotídeo que foi transferido para um genoma por meio de qualquer método conhecido na técnica. Em um aspecto, um transgene é um polinucleotídeo exógeno. Em um aspecto, um transgene é um polinucleotídeo endógeno que é integrado em um novo locus genômico em que o mesmo não é normalmente encontrado.
[021] O uso do termo “polinucleotídeo” não se destina a limitar a presente divulgação para polinucleotídeos que compreendem ácidos desoxirribonucleicos (DNA). Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que as moléculas de polinucleotídeos e ácido nucleico podem compreender ribonucleotídeos (RNAs) e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem moléculas de ocorrência natural e análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da presente divulgação também abrangem todas as formas de sequências incluindo, mas sem limitação, formas de filamento único, formas de filamento duplo, hairpins, estrutura do tipo haste e alça, e semelhantes.
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8/81 [022] É divulgado no presente documento a constatação de que um sistema inteíramente diferente, usado para propósitos muito diferentes, poderia ser combinado com um sistema de GEC para criar rapidamente uma ampla variedade de edições diferentes, e combinações de edições (por exemplo, “pilhas de características”) dentre um grande número de germoplasmas diversos. A constatação inclui, dentre outros conceitos, a percepção de que um sistema de indução de haploides fornece um meio para solucionar muitos dos problemas que afligem atualmente os programas de melhoramento de planta em grande escala que tentam adotar os sistemas de GE como CRISPR-Cas9.
[023] Em determinadas modalidades, um GEC pode ser colocado em qualquer uma dentre uma variedade de moléculas de DNA carreador que são espontaneamente eliminadas de uma célula após uma edição ter sido realizada, ou que podem ser facilmente removidas de uma célula após uma edição ter sido realizada. Um exemplo importante de uma molécula de DNA carreadora é o genoma de uma planta que é usada como um indutor de haploide. Outros exemplos incluem cromossomos supernumerários, por exemplo, um cromossomo B. Outros exemplos importantes são fornecidos em qualquer lugar no presente documento. [024] Em determinadas modalidades, uma planta é produzida, a qual contém um cromossomo de carreador que compreende um GEC, por exemplo, um GEC transformado no genoma de um indutor de haploide materno de mais, e então, essa planta indutora pode ser usada como um ascendente macho em um grande número de cruzamentos diferentes para uma ampla gama de germoplasmas. Vantagens importantes reveladas pela constatação deste sistema incluem que 1) um grande número de edições diferentes (isto é, mutações) e combinações de mutações (isto é “pilhas”) podem ser rapidamente implantadas para um grande número de germoplasmas diferentes sem ter que projetar de modo personalizado cada edição para cada germoplasma toda vez, e
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2) o GEC, e as atividades de edição que o mesmo codifica, são rapidamente eliminadas (por exemplo, espontaneamente através dos mecanismos comuns de eliminação de genoma indutor) após a edição ter sido realizada, finalmente produzindo uma célula haploide cujo genoma é substancialmente idêntico a seu ascendente fêmea, com exceção da edição que foi gerada pelo GEC. Por exemplo, uma vez que um indutor de haploide de mais foi transformado com um GEC desejado (em determinadas modalidades, capaz de alterar muitos genes), o mesmo pode ser, então, usado repetidamente como um ascendente em cruzamentos por indução com uma ampla gama de germoplasmas diferentes para criar uma edição desejada e discreta em uma ampla gama de genomas muito rapidamente, e com muito menos investimento do que é necessário usando os métodos atuais.
HAPLOIIDES/LJNHAGENS DE INDUÇÃO DE HAPLOIDE/HAPLOIDES DE DOBRAMENTO [025] A presente divulgação fornece métodos e composições úteis para modificar um genoma usando técnicas de indução de haploides.
[026] Conforme usado no presente documento, uma célula ou núcleo “haploide” compreende um único conjunto de cromossomos não emparelhados (x). Em contrapartida, uma célula ou núcleo “diploide” compreende dois conjuntos completos de cromossomos (2x) que são capazes do emparelhamento homólogo. O número haploide de cromossomos pode ser representado por “n”, e o número diploide de cromossomos pode ser representado por “2n”. Por exemplo, em uma espécie diploide tal como milho, n-x-W, e 2n~2x~20. Uma célula ou núcleo poliploide compreende mais de dois conjuntos completos de cromossomos. Por exemplo, algumas linhagens de trigo são hexaploides, o que significa que as mesmas contêm três conjuntos de cromossomos emparelhados (2n~6x~42). Tanto as células quanto os núcleos diploides e poliploides podem ser reduzidos para estados haploides.
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10/81 [027] Conforme usado no presente documento, uma “planta haploide” descreve um esporófito que compreende uma pluralidade de células que compreendem um genoma nuclear haploide. Ocasionalmente, os setores de uma planta haploide, de outro modo, podem espontaneamente se duplicar para formar setores diploides ou poliploides. A frequência de dobramento de cromossomo espontâneo varia dependendo da espécie. Taxas de dobramento de cromossomo espontâneo até 70 a 90% em cevada, até 25 a 70% em trigo, até 50 a 60% em arroz, até 50 a 90% em centeio, e até 20% em milho foram relatadas.
[028] Uma planta haploide fornecida no presente documento pode ser uma planta haploide materna, o que significa que a mesma perdeu seu genoma nuclear paterno enquanto retém seu genoma nuclear materno. Alternativamente, uma planta haploide fornecida no presente documento pode ser uma planta haploide paterna, o que significa que a mesma perdeu seu genoma nuclear materno enquanto retém seu genoma nuclear paterno. Tipicamente, os genomas mitocondriais e plastidiais maternos (por exemplo, cloroplasto) estão retidos tanto nas plantas haploides maternas quanto paternas.
[029] As plantas haploides fornecidas no presente documento podem se originar espontaneamente, ou as mesmas podem ser produzidas usando várias técnicas de indução de haploides. Em um aspecto, as plantas haploides fornecidas no presente documento são geradas polinizando-se uma planta fêmea com pólen de uma linhagem de “indução de haploides” (HI) da mesma espécie. Conforme usado no presente documento, uma “planta de indução de haploides (HI)” é uma planta capaz de induzir a haploidização em uma planta progenitora eliminandose um conjunto de cromossomos. As linhagens de HI tipicamente produzem haploides maternos em baixas frequências (-10%). Como um exemplo não limitante, o pólen de uma planta da linhagem de milho de
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11/81 indução de haploide Stock 6 pode ser usado para gerar haploides matemos em plantas progenitoras por meio de eliminação dos cromossomos do Stock 6. Como um outro exemplo não Iimitante, uma planta de milho que abriga uma mutação no locus do gametófito intermediáriol (ig1) é capaz de induzir haploides paternos mediante a fertilização por meio da eliminação dos cromossomos maternos; os genomas mitocondriais e plastidiais matemos são retidos nos haploides paternos induzidos por ig1. Como um exemplo não Iimitante adicional, o pólen de uma planta de algodão que abriga uma mutação no locus de semigamia (se) é capaz de produzir um haploide paterno ou um materno mediante fertilização. No entanto, as plantas de algodão são geradas apenas quando o ascendente materno abriga a mutação se requisitada. Consulte, por exemplo, Chaudhari. 1978. Bulletin of the Torrey Botanical Club. 105:98-103. Em um aspecto, esta divulgação fornece uma planta HI. Como um outro exemplo não Iimitante, foi mostrado que a manipulação da histona específica a centômero CENH3 pode induzir a formação de haploides em Arabidopsis thaliana. Consulte, por exemplo, Ravi e Chan. 2010. Nature. 464:615-619. Em um aspecto, uma linhagem HI fornecida no presente documento compreende uma proteína CENH3 modificada. Como um outro exemplo não Iimitante, constatou-se também que as plantas com perda de proteína Msi2 funcional devido a um polimorfismo de nucleotídeo que resulta na introdução de um códon de parada prematuro na proteína Msi2, são capazes de induzir descendentes haploides após um cruzamento com uma planta do tipo selvagem que compreende uma proteína Msi2 funcional (WO 2017058023 A1). Em um outro aspecto, uma linhagem HI fornecida no presente documento compreende uma proteína Msi2 modificada. Como um outro exemplo não Iimitante, constatou-se que as plantas que compreendem a proteína CENPC modificada que compreende uma ou mais mutações ativas que afetam o funcionamento da proteína CENPC ainda permitem
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12/81 que as plantas que expressam a dita proteína CENPC modificada sejam viáveis, sejam capazes de induzir os descendentes haploides após um cruzamento com uma planta do tipo selvagem que compreende uma proteína CENPC endógena (WO 2017058022 A1). Em um outro aspecto, uma linhagem HI fornecida no presente documento compreende uma proteína CENPC modificada. Como um outro exemplo não limitante, constatou-se que as plantas com uma fosfolipase 2A semelhante a patatina silenciada são capazes de induzir descendentes haploides (US 9.677.082 B2). Em um outro aspecto, uma linhagem HI fornecida no presente documento compreende um gene de fosfolipase 2A semelhante a patatina silenciada.
[030] Em um aspecto, uma planta HI fornecida no presente documento é de uma espécie selecionada dentre o grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de centeio, uma planta de trigo, uma planta de cevada, uma planta de Tripsacum, uma planta de sorgo, uma planta de milheto, uma planta de soja, uma planta de alfafa, uma planta de cana-de-açúcar, uma planta de algodão, uma planta de canola, uma planta de batata e uma planta de arroz.
[031] Em um outro aspecto, a indução de haploides pode ser obtida por meio de polinização de uma variedade de planta domesticada com pólen de um parente selvagem em um cruzamento intragênico e/ou interespecífico. Em ainda um outro aspecto, a indução de haploides é obtida por meio de polinização de uma célula-óvulo de uma primeira espécie de um primeiro gênero com pólen de uma planta de uma segunda espécie em um segundo gênero em um “cruzamento intergênico”. Tais cruzamentos intragênicos e intergênicos são frequentemente denominados como “cruzamentos amplos” ou “hibridizações amplas”. Em um aspecto, um cruzamento amplo fornecido no presente documento resulta na perda do genoma nuclear paterno. Em um outro aspecto, um cruzamento amplo fornecido no presente documento resulta
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13/81 na perda do genoma nuclear materno. Aqueles versados na técnica reconhecerão que, em alguns casos, a progênie híbrida que resulta de um cruzamento amplo deve ser retrocruzado com a espécie parental que compreende o genoma nuclear desejado a fim de eliminar o genoma nuclear da segunda espécie indesejada. Em um aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é selecionada dentre o grupo que consiste em trigo, centeio, aveia, cevada e Tripsacum, e a segunda espécie é milho. Em um outro aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é Tripsacum e a segunda espécie é milho. Em um outro aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é trigo, e a segunda espécie é milho. Em um outro aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é uma espécie selvagem de cevada e a segunda espécie é uma espécie domesticada de cevada. Em um outro aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é trigo, e a segunda espécie é selecionada dentre o grupo que consiste em sorgo e milheto. Em ainda um outro aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é uma espécie selvagem de batata (por exemplo, Solanum phreja), e a segunda espécie é uma espécie domesticada de batata. Em um outro aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é uma espécie do gênero Orychophragmus e a segunda espécie é canola. Em um outro aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é Glycine tomentella e a segunda espécie é soja. Em um outro aspecto, a primeira espécie em um cruzamento amplo é Oryza minuta e a segunda espécie é arroz. [032] Em um aspecto, uma planta haploide fornecida no presente documento é produzida por meio de polinização de uma planta usando pólen erradicado. Em um outro aspecto, uma planta haploide fornecida no presente documento é produzida in vitro. Em um outro aspecto, uma planta haploide materna fornecida no presente documento é produzida a partir da cultura in vitro de partes de flor fêmea não polinizadas (por exemplo, óvulos, óvulos fixados à placenta, ovários, brotos de planta
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14/81 integrais). Em ainda um outro aspecto, uma planta haploide paterna fornecida no presente documento é produzida a partir da cultura in vitro de anteras imaturas.
[033] Em um aspecto, o resgate de embrião in vitro é necessário para recuperar uma planta haploide fornecida no presente documento seguindo um evento de indução de haploides. Em um outro aspecto, uma característica (por exemplo, marcador de cor, como um marcador de atrocianina como R1-nj, e/ou um marcador que contém óleo, tal como aquele descrito no Pedido PCT PCT7US2015/049344, intitulado Improved Methods of Plant Breeding Using High-Throughput Seed Sorting, depositado em 10 de setembro de 2015 e que corresponde ao Pedido de Patente US 14/206.238, sendo que a divulgação de cada um é incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade, e/ou um marcador morfológico capaz de distinguir embriões haploides de embriões diploides) é incorporado em um genoma de uma planta HI fornecida no presente documento, uma planta receptora fornecida no presente documento, ou ambas para facilitar a identificação, diferenciação e/ou classificação de embriões haploides de embriões diploides. A indução de haploides pode ser confirmada pela presença/ausência de um marcador fenotípico no revestimento da semente, aleurona, embrião, endosperma, ou uma combinação dos mesmos. Como um exemplo não limitante, o marcador de cor R-nj de milho (R é um locus que condiciona a pigmentação de antrocianina vermelha e roxa), que colore a porção de coroa da aleurona da semente e do embrião com vermelho ou roxo, pode ser incorporado em uma linhagem de milho indutora HI. Quando a linhagem HI que compreende R-nj é cruzada como um macho com uma linhagem fêmea incolor, os candidatos haploides podem ser selecionados escolhendo-se as sementes que têm um padrão de R-nj no endosperma acoplado com um embrião incolor. A indução de haplo
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15/81 ides também pode ser confirmada por marcadores moleculares que indicam uma falta de heterogeneidade. Tais marcadores podem ser examinados pelas técnicas conhecidas na técnica tais como, sem limitação, análise de sequência (por exemplo, Sanger, 454, Illumina, Pac-Bio), PCR, hibridização Southern, hibridização in situ por fluorescência (FISH), e ELISA.
[034] As plantas haploides frequentemente formam estruturas florais anormais e são incapazes de proceder através de meiose devido à ausência de um conjunto de cromossomos homólogos. É frequentemente desejável converter uma planta haploide em uma planta diploide (um “haploide dobrado”) em um processo conhecido como “dobramento de haploide” ou “dobramento de cromossomo”. A dobramento de haploide permite a geração de uma planta que é homozigota em todos os loci no genoma nuclear em uma geração única. Em um aspecto, uma planta haploide fornecida no presente documento é convertida em uma planta haploide dobrada. Em um aspecto, um método de dobramento de cromossomo fornecido no presente documento compreende o uso de um agente de dobramento de cromossomos selecionado dentre o grupo que consiste em gás de óxido nitroso (N2O), colquicina, orizalina, amiprofosmetila, trifluralina, cafeína e pronamida. Consulte por exemplo, Doubled Haploid Production in Crop Plants: A Manual (Eds. M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster, e I. Szarejko (2003), Kluwer Academic Publishers); Prigge e Melchinger, 2012, Plant Cell Culture Protocols, 877: 161-172; e Kato e Geiger, 2002, Plant Breeding, 121: 370-377 (cada uma das quais é incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade). Em um outro aspecto, um método de dobramento de cromossomo fornecido no presente documento compreende o uso de colquicina. Em ainda um outro aspecto, um método de dobramento de cromossomo fornecido no presente documento compreende o uso de gás N2O. Em ainda um outro aspecto, um método de
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16/81 dobramento de cromossomo fornecido no presente documento compreende o uso de colquicina ou gás de óxido nitroso. Conforme usado no presente documento, quando se refere a contagem de cromossomo, “dobramento” se refere ao aumento do número de cromossomo por um fator de dois. Por exemplo, um genoma nuclear haploide que compreende 10 cromossomos é dobrado para se tornar um genoma nuclear diploide que compreende 20 cromossomos. Como um outro exemplo, um genoma nuclear diploide que compreende 20 cromossomos é dobrado para se tornar um genoma nuclear tetraploide que compreende 40 cromossomos. A confirmação de dobramento de cromossomo pode ser realizada por meio de FISH ou outras técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica.
[035] Em um aspecto, uma planta haploide fornecida no presente documento é submetida ao dobramento de cromossomo espontâneo. O dobramento de cromossomo espontâneo pode produzir setores diploides que original as estruturas florais diploides normais. Tais setores espontaneamente dobrados são desejáveis devido ao fato de que as estruturas florais diploides que resultam do dobramento de cromossomo espontâneo produzem óvulos normais e pólen que pode ser autopolinizado ou usado para realizar cruzamentos com outras plantas.
MODIFICAÇÃO/RECOMBINAÇÃO DE GENOMA [036] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para modificar um genoma da planta. Conforme usado no presente documento, “modificar” um genoma da planta se refere à inserção, substituição, deleção, dobramento, inversão ou translocação de um ou mais nucleotídeos em um genoma da planta. Em um aspecto, uma modificação de genoma fornecida no presente documento é uma modificação estável. Uma “modificação estável” é uma modificação que é capaz de ser transferida para a próxima geração de uma célula.
[037] Em um aspecto, um genoma nuclear fornecido no presente
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17/81 documento é um genoma nuclear haploide. Em um outro aspecto, um genoma nuclear fornecido no presente documento é um genoma nuclear diploide. Em ainda um outro aspecto, um genoma nuclear fornecido no presente documento é um genoma nuclear triploide. Em ainda um outro aspecto, um genoma nuclear fornecido no presente documento é um genoma nuclear tetraploide. Em um aspecto, um genoma nuclear fornecido no presente documento compreende pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 cromossomos supernumerários. [038] Conforme usado no presente documento, o termo “redisposição genômica” se refere a uma translocação, inversão, deleção ou dobramento de dois ou mais nucleotídeos em um genoma. Conforme usado no presente documento, o termo “translocação” se refere a uma alteração na posição de um segmento cromossômico de uma primeira região para uma segunda região em qualquer um dentre o mesmo cromossomo ou um segundo cromossomo. Conforme usado no presente documento, o termo “segmento cromossômico” se refere a pelo menos 2, 5, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 25000, 50000, 100000, 250000, 500000, 1000000, 2500000, 5000000, 10000000, 25000000, ou pelo menos 50000000 nucleotídeos contíguos de um cromossomo, um genoma plastidial ou um genoma mitocondrial. Em um aspecto, um segmento cromossômico fornecido no presente documento compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 megaloci. Em um outro aspecto, um segmento cromossômico fornecido no presente documento compreende pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 genes. Conforme usado no presente documento, “gene” se refere a uma sequência que codifica uma proteína, ou uma sequência que codifica um RNA de codificação de não proteína. Conforme usado no presente documento, “codificação de proteína” se refere a um polinucleotídeo que codifica os aminoácidos de um polipeptídeo. Conforme
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18/81 usado no presente documento, “codificação” se refere a um polinucleotídeo que pode produzir uma unidade funcional (sem limitação, por exemplo, uma proteína, um microRNA (miRNA), um RNA de transferência (tRNA), um RNA ribossômico (rRNA), um RNA interferente pequeno (siRNA), um RNA interferente pequeno de transação (ta-siRNA), um RNA~guia (gRNA), um RNA-rastreador (tcRNA), um RNA-guia único (sgRNA)) por meio de transcrição e/ou tradução. Exemplos não limitantes de RNAs de codificação de não proteína incluem um miRNA, um precursor de miRNA, um siRNA, um RNA pequeno (18 a 26 nucleotídeos de comprimento) e precursor que codifica o mesmo, um siRNA heterocromático (hcRNA), um RNA de interação de Piwi (piRNA), um RNA de hairpin de filamento duplo, um siRNA antissenso de ocorrência natural (nat-siRNA), um tcRNA, um gRNA e um sgRNA.
[039] Conforme usado no presente documento, “megalocus” (ou a forma no plural, “megaloci”) se refere a um bloco de características transgênicas geneticamente ligadas, características nativas, ou uma combinação das mesmas, que são normalmente herdadas como uma única unidade. Um megalocus de acordo com a presente divulgação pode fornecer a uma planta uma ou mais características desejadas, que podem incluir, mas sem limitação, crescimento melhorado, rendimento melhorado, tolerância à seca, tolerância a sal, tolerância a herbicida, resistência a inseto, resistência à praga, resistência à doença, utilização de nitrogênio melhorado e semelhantes. Em alguns aspectos, um megalocus compreende pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13 ou 15 loci transgênicos (eventos) que são fisicamente separados, mas geneticamente ligados de modo que os mesmos possam ser herdados como uma única unidade. Cada locus transgênico em um megalocus pode ser 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 5, 10, 15, ou 20 cM separados entre si. Em um aspecto, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 megaloci são transferidos ou translocados de
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19/81 uma linhagem HI, um cromossomo supranumerário, ou ambos para um genoma de uma linhagem de receptor. Sem limitação, a transferência ou translocação de um megalocus de uma linhagem HI ou cromossomo supranumerário para uma linhagem de receptor pode ser confirmada pela análise da sequência (por exemplo, Sanger, 454, Illumina, PaeBio); análise de marcador molecular (por exemplo, FISH, PCR, ELISA, DART); ou qualquer método de biologia molecular aplicável conhecido por aqueles versados na técnica. A análise fenotípica também pode ser usada para confirmar a transferência ou translocação de um megalocus de uma linhagem HI ou um cromossomo supranumerário para uma linhagem de receptor. Por exemplo, se um megalocus transferido ou translocado compreender uma característica de tolerância a herbicida, a aplicação do herbicida pode ser usada para confirmar a presença do megalocus.
[040] Em um aspecto, uma translocação fornecida no presente documento é uma translocação intracromossômica. Conforme usado no presente documento, uma “translocação intracromossômica” se refere à translocação de um segmento cromossômico de um primeiro locus para um segundo locus dentro do mesmo cromossomo. Em um outro aspecto, uma translocação fornecida no presente documento é uma translocação intercromossômica. Conforme usado no presente documento, uma “translocação intercromossômica” se refere à translocação de um segmento cromossômico de um primeiro locus em um primeiro cromossomo para um segundo locus em um segundo cromossomo. Em um outro aspecto, uma translocação fornecida no presente documento transloca um segmento cromossômico de um cromossomo ou genoma paterno para um cromossomo ou genoma materno. Em um aspecto adicional, uma translocação fornecida no presente documento transloca um segmento cromossômico de um cromossomo ou genoma materno para um cromossomo ou genoma paterno. Em ainda um outro aspecto,
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20/81 uma translocação fornecida no presente documento transloca um segmento cromossômico de um genoma mitocondrial ou plastidial para um genoma nuclear. Em um aspecto adicional, uma translocação fornecida no presente documento transloca um segmento cromossômico de um genoma nuclear para um genoma mitocondrial ou plastidial. Em um aspecto, uma translocação fornecida no presente documento transloca um fragmento cromossômico de um cromossomo supranumerário para um cromossomo A, um genoma plastidial, ou um genoma mitocondrial. Conforme usado no presente documento, um “cromossomo A” se refere a qualquer um dos cromossomos de ocorrência natural no genoma nuclear de uma célula. Em um outro aspecto, uma translocação fornecida no presente documento transloca um fragmento cromossômico de um cromossomo A para um cromossomo supranumerário. Em ainda um outro aspecto, uma translocação fornecida no presente documento transloca um fragmento cromossômico de um genoma mitocondrial ou plastidial para um cromossomo supranumerário.
[041] Em um aspecto, uma redisposição genômica fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma translocação recíproca e em uma translocação não recíproca. Em um aspecto, uma redisposição genômica fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma translocação recíproca, uma translocação não recíproca, uma translocação de robertsoniana, uma inversão paracêntrica e uma inversão pericêntrica. Uma translocação recíproca compreende trocar fragmentos acêntrico de material genômico entre dois cromossomos não homólogos de modo que os fragmentos essencialmente troquem de posições. Uma translocação não recíproca compreende uma transferência unidirecional de um segmento cromossômico de um primeiro cromossomo ou genoma para um segundo cromossomo ou genoma. Uma translocação robertsoniana compreende a translocação de todo um braço de cromossomo de um
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21/81 primeiro cromossomo para um segundo cromossomo e resulta, frequentemente, na perda de um ou mais braços de cromossomo. Uma inversão paracêntrica compreende uma inversão de uma região de um único cromossomo em que o centômero não está incluído na região invertida. Uma inversão pericêntrica compreende uma inversão de uma região de um único cromossomo que inclui o centômero na região invertida.
[042] Os versados na técnica podem usar qualquer técnica de biologia molecular relevante para confirmar a presença de um genoma modificado. Por exemplo, sem limitação, as plantas haploides, sementes ou células podem ser identificadas por meio de análise de sequência (por exemplo, Sanger, 454, Illumina, Pac-Βίο); ELISA; FISH; análise de compatibilidade de DNA usando Célula ou uma enzima semelhante; ou análise de curva de fusão de alta resolução de amplicons de PCR que contêm a sequência modificada.
[043] Em um aspecto, uma redisposição genômica fornecida no presente documento é efetuada por um ou mais GECs fornecidos no presente documento.
[044] Conforme usado no presente documento, o termo “recombinação” se refere à troca de nucleotídeos entre duas moléculas de ácido nucleico. O termo “recombinação homóloga” (HR) se refere à troca de nucleotídeos em uma região conservada compartilhada por duas moléculas de ácido nucleico. HR inclui recombinação homóloga simétrica e recombinação homóloga assimétrica. A recombinação homóloga assimétrica também pode significar a recombinação desigual. Conforme usado no presente documento, “união de extremidade não homóloga” (NHEJ) se refere à ligação de duas extremidades de DNA de filamento duplo sem a necessidade de uma sequência homóloga para direcionar a ligação. A modificação de um genoma da planta fornecida no presente documento pode compreender HR ou NHEJ.
COMPONENTES DE EDUÇÃO DE GENE
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22/81 [045] Conforme usado no presente documento, um “Componente de Edição de Gene (GEC)” se refere a uma enzima e/ou um modelo de polinucleotídeo doador capaz de elicitar uma modificação de genoma. Em um aspecto, um GEC fornecido no presente documento elicita uma modificação de genoma alvejada. Em um outro aspecto, um GEC fornecido no presente documento elicita uma modificação de genoma não alvejada. Conforme usado no presente documento, a “modificação de genoma alvejada” se refere ao uso de enzimas específicas a sítio para direcionar a edição de uma sequência de polinucleotídeos alvejada, predeterminada. Em um aspecto, um GEC fornecido no presente documento compreende 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais enzimas; 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais modelos de polinucleotídeo doador; ou ambos que são capazes de elicitar uma modificação em um genoma da planta. Em um aspecto, uma planta, uma célula vegetal ou um genoma da planta fornecida no presente documento compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs. Em um outro aspecto, uma célula de pólen fornecida no presente documento compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs. Em um outro aspecto, uma célula-óvulo de planta fornecida no presente documento compreende pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs. Em um aspecto, uma planta HI fornecida no presente documento compreende pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs. Em um outro aspecto, um genoma da planta fornecido no presente documento é modificado por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais GECs. Em um aspecto, a presente divulgação fornece 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais ácidos nucleicos que codificam um GEC. Em um aspecto, um GEC fornecido no presente documento compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais enzimas específicas a sítio. Em um outro aspecto, um GEC fornecido no presente documento compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
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23/81 ou mais enzimas específicas a sítio. Em um aspecto, um GEC fornecido no presente documento compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais modelos de polinucleotídeo doador. Conforme usado no presente documento, um “modelo de polinucleotídeo doador” se refere a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de polinucleotídeos desejada para ser inserida em um genoma de uma linhagem de receptor.
[046] Em um aspecto, o Componente de Edição de Genoma na presente divulgação compreende pelo menos um replicon viral. Sistemas de replicon viral foram desenvolvidos, os quais se baseiam em vírus de RNA. Sistemas de replicon viral compreendem dois componentes essenciais: um gene de replicase e a sequência-alvo (ou sequênciasalvo) da proteína de replicase. O produto de gene de replicase (“proteína de replicase) age na sequência-alvo (ou sequências-alvo) para amplificar as sequências-alvo e quaisquer sequências associadas, coletivamente denominadas como o replicon. Um precursor de replicon pode ser inserido estavelmente em um genoma de uma maneira que permite a formação de replicon e amplificação para ser subsequentemente ativada. Em um aspecto, um precursor de replicon viral fornecido no presente documento compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos um gene de replicase, pelo menos uma sequência-alvo de um produto de gene de replicase, e pelo menos um GEC; quando expressa ou amplificada, esta sequência de ácidos nucleicos é denominada como um “replicon”. Uma proteína de replicase pode se ligar a sequências-alvo de um replicon gerando, desse modo, replicons adicionais. Pelo menos um gene de replicase está incluído na sequência a ser amplificada além do pelo menos um GEC para que as cópias adicionais da proteína de replicase sejam produzidas. A produção de cópias adicionais do replicon e proteína de replicase permite que
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24/81 os replicons persistam nas múltiplas divisões celulares, embora os replicons conhecidos não persistam através de todo o ciclo de vida de uma planta. Devido ao fato de que os replicons não estão fisicamente localizados em um cromossomo, os mesmos podem persistir em células que seguem a perda de um genoma nuclear paterno ou materno que permite a fertilização de uma célula-óvulo por uma célula de pólen. Em um aspecto, uma célula vegetal fornecida no presente documento compreende 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais replicons virais após perda de um genoma nuclear paterno ou um genoma nuclear materno. Em um outro aspecto, um replicon fornecido no presente documento está presente em um núcleo de uma célula. Em ainda um outro aspecto, um replicon fornecido no presente documento está presente em um citoplasma de uma célula.
[047] Um replicon viral fornecido no presente documento está ligado de modo operativo a um promotor que é usado para acionar a expressão de replicase, formação de replicon subsequente e amplificação. Em um aspecto, uma planta HI que compreende um ou mais replicons virais é cruzada com uma planta não HI, em que um ou mais replicons estão presentes antes, durante ou depois da fertilização. Em um aspecto, esta divulgação fornece um construto de transformação que compreende um marcador selecionável e um replicon viral.
[048] Em um aspecto, um genoma fornecido no presente documento compreende 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais replicons virais. Em um outro aspecto, um genoma fornecido no presente documento compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais replicons virais. Em um aspecto, um genoma fornecido no presente documento compreende múltiplos replicons virais posicionados em múltiplos loci dentro do genoma. Em um outro aspecto, um genoma fornecido no presente documento compre
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25/81 ende múltiplos replicons virais posicionados em um locus dentro do genoma. Em um aspecto, um replicon viral fornecido no presente documento é amplificado em uma célula vegetal mediante liberação de seu genoma hospedeiro.
[049] Em um aspecto, um replicon viral fornecido no presente documento é um replicon de geminivírus ou um replicon de nanovírus. No caso de um sistema de replicon de geminivírus, o precursor compreende duas sequências-alvo, chamadas LIRs (NVRs em sistemas de replicon de nanovírus), orientação direta que pode agir mediante uma proteína de replicase para criar um replicon que compreende uma LIR e qualquer sequência presente entre as duas LIRs. Os sistemas de replicon de nanovírus trabalham de uma maneira semelhante aos sistemas de replicon de geminivírus. Alternativamente, um replicon pode ser gerado flanqueando-se uma única cópia de uma sequência-alvo de replicase (por exemplo, LIR, NVR) e um ou mais GECs com um par de sequênciasalvo de recombinase específicas a sítio. Quando a recombinase adequada for fornecida, a mesma corta uma molécula de DNA circular que pode ser replicada por uma proteína de replicase que reconhece a sequência-alvo de replicase.
[050] Em um aspecto, um GEC fornecido no presente documento modifica um genoma da planta. Em um outro aspecto, um GEC fornecido no presente documento modifica um genoma da planta selecionado dentre o grupo que consiste em um genoma nuclear, em um genoma mitocondrial e em um genoma plastidial. Em um outro aspecto, um GEC fornecido no presente documento modifica um genoma da planta materno ou um genoma da planta paterno. Em um aspecto, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um GEC fornecido no presente documento é posicionada em um genoma materno. Em um outro aspecto, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um GEC fornecido no
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26/81 presente documento é posicionada em um genoma paterno. Em um aspecto, um GEC fornecido no presente documento não elicita uma modificação em um genoma de uma planta HI ou célula. Em um outro aspecto, um GEC fornecido no presente documento elicita uma modificação em um genoma de uma planta HI ou célula contanto que a modificação não seja letal à planta HI ou célula.
[051 ] Em um aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador fornecido no presente documento é flanqueado pelas sequências de ácidos nucleicos que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos a um sítio-alvo em uma linhagem de receptor. Conforme usado no presente documento, uma “linhagem de receptor” se refere a uma linhagem ou variedade de planta que compreende um genoma que deve ser editado.
[052] Em um aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador fornecido no presente documento é inserido a partir de um genoma de linhagem HI em uma região genômica correspondente em uma linhagem de receptor. Em um outro aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador fornecido no presente documento é inserido a partir de um genoma de linhagem HI em uma região genômica não alvejada em uma linhagem de receptor. Em um aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador fornecido no presente documento está presente em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais cópias em um genoma de linhagem HI.
[053] Em um aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou pelo menos 99,9% idêntico a uma sequência genômica alvejada de interesse. Conforme usado no presente documento, uma “sequência genômica alvejada de interesse” se refere a uma sequência de ácidos nucleicos em um genoma que é capaz de ser editado por uma enzima específica a sítio. Em um aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador fornecido no presente documento é 100% idêntico
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27/81 a uma sequência genômica alvejada de interesse exceto por uma modificação desejada. Uma modificação desejada pode compreender a inserção, deleção, dobramento, substituição ou inversão de pelo menos
1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, ou pelo menos 10000 nucleotídeos em comparação com o estado não modificado do locus. Em um aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador compreende um alelo endógeno de uma sequência genômica alvejada de interesse. Em um outro aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador fornecido no presente documento é uma sequência de ácidos nucleicos exógena. Em um outro aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador fornecido no presente documento compreende um transgene. Em um aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador modifica pelo menos 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 sequências genômicas alvejadas de interesse.
TIPOS DE ENZIMAS [054] Em um aspecto, uma enzima fornecida no presente documento é uma enzima específica a sítio. Conforme usado no presente documento, uma “enzima específica a sítio” se refere a qualquer enzima que possa clivar uma sequência de nucleotídeos de uma maneira específica a sítio. Em um aspecto, uma enzima específica a sítio fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma endonuclease (sem limitação, por exemplo, uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease guiada por RNA (sem limitação, por exemplo, uma nuclease Cas9 de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente agrupadas (CRISPR), ou uma nuclease Cpf1); uma recombinase (sem limitação, por exemplo, uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA, uma tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA); uma transposase (sem limitação, por exemplo, uma DNA
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28/81 transposase fixada a um domínio de ligação de DNA); ou qualquer combinação das mesmas.
[055] Em um aspecto, uma enzima específica a sítio fornecida no presente documento reconhece e cliva e/ou se liga a uma sequência de ácidos nucleicos que flanqueia uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em uma sequência genômica alvejada de interesse, em um megalocus, em um modelo de polinucleotídeo doador, em um gene endógeno ou um transgene.
[056] Em um aspecto, uma enzima específica a sítio fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma recombinase, em uma endonuclease e em uma transposase.
[057] Em um aspecto, uma recombinase fornecida no presente documento é uma tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA ou uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA. Conforme usado no presente documento, um “domínio de ligação de DNA” ou um “motivo de reconhecimento de DNA” é um domínio de polipeptídeo que é capaz de reconhecer e/ou se ligar a sequências específicas de DNA de filamento único e/ou de filamento duplo. Em um aspecto, uma tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma Cre recombinase, em uma Gin recombinase, em uma FLP recombinase e em uma Tnp1 recombinase. Em um outro aspecto, uma Cre recombinase ou uma Gin recombinase fornecida no presente documento é titulada para um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco. Em um aspecto, uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma Bxb1 integrase, em uma phiC31 integrase, em uma R4 integrase e em uma TP-901 integrase. Em um aspecto, uma recombinase fornecida no presente documento é titulada ou, de outro modo, fixada a um motivo
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29/81 de reconhecimento de DNA.
[058] As endonucleases específicas a sítio (por exemplo, meganucleases, ZFNs, TALENs, nucleases Cas9, nucleases Cpf1) induzem uma quebra de DNA de filamento duplo no sítio-alvo de uma sequência genômica que é, então, reparada pelos processos naturais de recombinação homóloga (HR) ou união de extremidade não homóloga (NHEJ). As modificações de sequência ocorrem, então, nos sítios clivados, que podem incluir deleções ou inserções que resultam na ruptura de gene no caso de NHEJ, ou integração de sequências de ácidos nucleicos por HR.
[059] Em um aspecto, uma endonuclease fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma nuclease associada a CRISPR, em uma TALEN, em uma proteína semelhante a TALE, em uma nuclease de dedo de zinco e em uma meganuclease.
[060] Em um aspecto, uma endonuclease específica a sítio fornecida no presente documento é uma nuclease de dedo de zinco. As nucleases de dedo de zinco são proteínas sintéticas que consistem em um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco geneticamente modificado fundido ao domínio de divagem da endonuclease de restrição de Fokl. As nucleases de dedo de zinco podem ser projetadas para clivar quase qualquer estiramento longo de DNA de filamento duplo para modificação do domínio de ligação de DNA de dedo de zinco. As nucleases de dedo de zinco formam dímeros a partir de monômeros compostos de um domínio de divagem de DNA específico a sítio de Fokl endonuclease fundido a um arranjo de dedo de zinco modificado geneticamente para ligar uma sequência-alvo de DNA. O domínio de nuclease Fokl requer dimerização para clivar o DNA e, portanto, duas nucleases de dedo de zinco com suas regiões de C-terminal são necessárias para ligar filamentos de DNA opostos do sítio de divagem (separados por 5 a 7 bp). [061] O domínio de ligação de DNA de uma nuclease de dedo de
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30/81 zinco é tipicamente composto de 3 a 4 arranjos de dedo de zinco. Os aminoácidos nas posições -1, +2, +3 e +6 em relação ao início do 00 hélice de dedo de zinco, que contribui para a ligação específica a sítio ao DNA-alvo, podem ser mudados e personalizados para se adaptar a sequências-alvo específicas. Os outros aminoácidos formam a estrutura principal de consenso para gerar nucleases de dedo de zinco com diferentes especificidades de sequência. As regras para selecionar sequências-alvo para nucleases de dedo de zinco são conhecidas na técnica. Um monômero de nuclease de dedo de zinco pode cortar 0 sítio-alvo se os dois sítios de ligação de dedo de zinco forem palindrômicos. O termo “nuclease de dedo de zinco”, conforme usado no presente documento, é amplo e inclui uma nuclease de dedo de zinco monomérica que pode clivar 0 DNA de filamento duplo sem auxílio de uma outra nuclease de dedo de zinco. O termo “nuclease de dedo de zinco” também é usado para se referir a um ou ambos os membros de um par de nucleases de dedo de zinco que são geneticamente modificadas para funcionarem juntas para clivar 0 DNA no mesmo sítio.
[062] Devido às especificidades de ligação de DNA de domínios de dedo de zinco poderem, em princípio, ser geneticamente remodificadas usando um dentre vários métodos, as nucleases de dedo de zinco personalizadas podem ser teoricamente construídas para alvejar quase qualquer sequência genética. Métodos publicamente disponíveis para modificar domínios de dedo de zinco incluem Conjunto dependente de Contexto (CoDA), Modificação de Agrupamento Oligomerizado (OPEN) e Conjunto Modular.
[063] Em um aspecto, uma endonuclease específica a sítio fornecida no presente documento é uma TALEN ou nuclease do tipo TALE. TALENs são enzimas de restrição artificiais geradas fundindo-se 0 domínio de ligação de DNA efetor semelhante a ativador de transcrição a
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31/81 um domínio de nuclease. Em algumas modalidades, o domínio de nuclease de uma TALEN ou nuclease do tipo TALE fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em Pvull, MutH, Tevl e Fokl. Quando cada membro de um par TALEN se liga ao sítio de DNA que flanqueia um sítio-alvo, os monômeros de domínio de nuclease (por exemplo, Fokl) dimerizam e causam uma quebra de DNA de filamento duplo no sítio-alvo. O termo “TALEN”, conforme usado no presente documento, é amplo e inclui uma TALEN monomérica que pode clivar o DNA de filamento duplo sem auxílio de uma outra TALEN. O termo “TALEN” também é usado para se referir a um ou a ambos os membros de um par de TALENs que funcionam juntas para clivar o DNA no mesmo sítio.
[064] Efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs) podem ser geneticamente modificados para se ligar a praticamente qualquer sequência de DNA. As proteínas TALE são domínios de ligação de DNA derivados de vários patógenos bacterianos vegetais do gênero Xanthomonas. Os patógenos X secretam TALEs na célula de planta hospedeira durante a infecção. A TALE se move para o núcleo, onde a mesma reconhece e se liga a uma sequência de DNA específica na região de promotor de uma sequência de DNA específica na região de promotor de um gene específico no genoma hospedeiro. A TALE tem um domínio de ligação de DNA central compreendido por 13-28 monômeros de repetição de 33-34 aminoácidos. Os aminoácidos de cada monômero são altamente conservados, exceto pelos resíduos de aminoácidos hipervariáveis nas posições 12 e 13. Os dois aminoácidos variáveis são chamados de dirresíduos variáveis de repetição (RVDs). Os pares de aminoácidos NI, NG, HD e NN de RVDs preferencialmente reconhecem adenina, timina, citosina e guanina/adenina, respectivamente, e a modulação de RVDs pode reconhecer bases de DNA consecutivas. Esta simples relação entre sequência de aminoácidos e reconhecimento de
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DNA permitiu a modificação de domínios de ligação de DNA específicos selecionando uma combinação de segmentos de repetição contendo os RVDs apropriados.
[065] Além do domínio de divagem de Fokl do tipo selvagem, as variantes do domínio de divagem de Fokl com mutações foram projetadas para aprimorar a especificidade de divagem e a atividade de divagem. As funções de domínio de Fokl como um dímero, requerem dois construtos com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma-alvo com orientação e espaçamento adequados. Tanto o número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação de DNA de TALEN e o domínio de divagem de Fokl quanto o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais são parâmetros para obter altos níveis de atividade. Os domínios de divagem Pvull, MutH e Tevl são alternativas úteis para Fokl e variantes de Fokl para uso com TALEs. As funções de Pvull como um domínio de divagem altamente específico quando acoplado a um TALE (consulte Yank et al. 2013. PLoS One. 8: e82539). MutH é capaz de introduzir nicks específicos a filamento em DNA (consulte Gabsalilow et al. 2013. Nucleic Acids Research. 41: e83). Tevl introduz quebras de filamento duplo em DNA em sítios alvejados (consulte Beurdeley et al., 2013. Nature Communications. 4: 1762).
[066] A relação entre sequência de aminoácidos e reconhecimento de DNA do domínio de ligação de TALE permite proteínas projetáveis. Programas de software como DNA Works podem ser utilizados para projetar construtos de TALE. Outros métodos de projeção de construtos de TALE são conhecidos pelos versados na técnica. Consulte Doyle et al., Nucleic Acids Research (2012) 40: W117-122.; Cermak et al., Nucleic Acids Research (2011). 39:e82; e tale-nt.cac.cornell.edu/about.
[067] Em um aspecto, uma endonuclease específica a sítio fornecida no presente documento é uma meganuclease. Meganucleases,
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33/81 que são comumente identificadas em micróbios, são enzimas únicas com alta atividade e longas sequências de reconhecimento (>14 bp) que resultam na digestão específica a sítio de DNA~alvo. As versões geneticamente modificadas de meganucleases de ocorrência natural têm tipicamente sequências de reconhecimento de DNA extensas (por exemplo, 14 a 40 bp).
[068] A modificação genética de meganucleases é mais desafiadora do que aquelas de ZFNs e TALENs devido ao fato de que o reconhecimento de DNA e funções de divagem de meganucleases estão entrelaçados em um domínio único. Métodos especializados de mutagênese e varredura de alto rendimento foram utilizados para criar variantes de meganuclease inovadoras que reconhecem sequências exclusivas e possuem atividade de nuclease melhorada.
[069] Em um aspecto, uma endonuclease específica a sítio fornecida no presente documento compreende uma nuclease Cas9 ou Cpf1. Em um outro aspecto, uma endonuclease específica a sítio fornecida no presente documento compreende qualquer combinação de uma nuclease Cas9 guiada por RNA ou uma nuclease Cpf1 guiada por RNA; proteínas Csc1 e Csc2 associadas a CRISPR; Cas6, Cas6e e Cas6f; e um RNA-guia necessário para alvejar as respectivas nucleases.
[070] As nucleases Cas9 são parte do sistema imune adaptativo de bactérias e archaea, que protege contra ácidos nucleicos invasores tais como vírus por meio de divagem do DNA estranho de uma maneira dependente de sequência. A imunidade é adquirida pela integração de fragmentos curtos do DNA invasor conhecido como espaçadores entre duas repetições adjacentes na extremidade proximal de um locus de CRISPR. Os arranjos de CRISPR, incluindo os espaçadores, são transcritos durante encontros subsequentes com DNA invasivo e são processados em RNAs de CRISPR (crRNAs) interferentes pequenos aproximadamente 40 nt de comprimento, que combinam com o RNA de
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CRISPR de transativação (tracrRNA) para ativar e guiar a nuclease Cas9. Isto cliva sequências de DNA de fita dupla homólogas conhecidas como protoespaçadores no DNA invasor. Um pré-requisito para a divagem é a presença de uma jusante de motivo adjacente a fotoespaçador (PAM) conservado do DNA-alvo, que tem, normalmente, a sequência 5NGG-3, mas menos frequentemente, NAG. A especificidade é fornecida pela chamada “sequência de sequência” aproximadamente 12 bases a montante do PAM, que precisa ser compatível entre o RNA e o DNAalvo. Cpf1 atua de maneira similar para Cas9, mas Cpf1 não exige um tracrRNA.
[071] Exemplos não limitantes de transposases específicas a sítio fornecidas no presente documento incluem qualquer DNA transposase fixada a um domínio de ligação de DNA, tal como um TALE-piggyBac de Mutador TALE.
PROMOTORES [072] Em um aspecto, o Componente de Edição de Genoma na presente divulgação compreende pelo menos um promotor.
[073] Um “promotor” contém uma sequência de bases de nucleotídeo que sinaliza a RNA polimerase para se associar ao DNA e para iniciar a transcrição em mRNA usando um dos filamentos de DNA como um modelo para produzir um filamento complementar de RNA correspondente. Em um aspecto, um promotor fornecido no presente documento é ligado de modo operativo ao DNA que codifica pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs. Conforme usado no presente documento, “ligado de modo operativo” significa que as sequências de ácidos nucleicos ligadas de modo operativo exibem sua função desejada. Por exemplo, em um aspecto desta divulgação, uma sequência promotora de DNA fornecida pode iniciar a transcrição de uma sequência de DNA operativamente ligada no RNA. Uma sequência de ácidos nucleicos fornecida no presente documento pode estar a montante
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35/81 ou a jusante de uma sequência de ácidos nucleicos ligada de modo físico ou operativo. Em um aspecto, uma primeira molécula de ácido nucleico fornecida no presente documento é tanto ligada de modo físico quanto ligada de modo operativo a uma segunda molécula de ácido nucleico fornecida no presente documento. Em um outro aspecto, uma primeira molécula de ácido nucleico fornecida no presente documento não é ligada de modo físico nem de modo operativo a uma segunda molécula de ácido nucleico fornecida no presente documento. Conforme usado no presente documento, “a montante” significa que a sequência de ácidos nucleicos é posicionada antes da extremidade 5! de uma sequência de ácidos nucleicos ligada. Conforme usado no presente documento, “a jusante” significa que a sequência de ácidos nucleicos é posicionada após a extremidade 3’ de uma sequência de ácidos nucleicos ligada.
[074] Em um aspecto, um GEC fornecido no presente documento é ligado de modo operativo a pelo menos um promotor. Em um outro aspecto, uma molécula de ácido nucleico que codifica um GEC é transientemente expressa. Conforme usado no presente documento, “transientemente expresso” se refere a expressão temporariamente restrita. Em ainda um outro aspecto, uma molécula de ácido nucleico que codifica um GEC fornecido no presente documento é constitutivamente expressa.
[075] Em um aspecto, um promotor fornecido no presente documento é selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor constitutivo, em um promotor induzível e em um promotor específico de tecido. Em um outro aspecto, um promotor fornecido no presente documento é um promotor constitutivo. Em um outro aspecto, um promotor fornecido no presente documento é um promotor induzível. Em um outro aspecto, um promotor fornecido no presente documento é um promotor específico de tecido. Em um aspecto, um promotor específico de tecido
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36/81 fornecida no presente documento é selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor específico de embrião, em um promotor específico de gameta e em um promotor precoce específico de zigoto. Em um aspecto, um promotor fornecido no presente documento é funcional em um zigoto no momento da primeira divisão celular seguindo a fertilização de um óvulo por um grão de pólen. Em um aspecto, um promotor fornecido no presente documento é funcional em uma célula de pólen ou em um óvulo dentro de 48 horas de fertilização.
[076] Um número de promotores que estão ativos nas células vegetais foi descrito na literatura. Tais promotores incluem, mas sem limitação, os promotores de napolina sintase (NOS) e octopina sintase (OCS) que são carregados em plasmídeos de Ti de Agrobacterium tumefaciens, os promotores de caulimovírus tais como os promotores 19S e 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (FMV), e o promotor CaMV35S intensificado (e35S). Uma variedade de outros promotores de gene de planta que são regulados em reposta aos sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento, também podem ser usados para expressão de genes heterólogos em células vegetais, incluindo, por exemplo, promotores regulados por (1) calor (Callis et al., Plant Physiology, (1988) 88: 965-968), (2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A da ervilha, Kuhlemeier et al., Plant Cell, (1989) 1: 471-478; promotor RbcS de mais, Schaffner et al., Plant Cell (1991) 3: 997-1012); (3) hormônios, tais como ácido abscísico (Marcotte et ai., Plant Cell, (1989) 1: 969-976), (4) ferimentos (por exemplo, Siebertz et al., Plant Cell, (1989) 961-968); ou outros sinais ou produtos químicos.
[077] Em algumas modalidades, um promotor é capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz do produto de gene de interesse. Exemplos que descrevem tais promotores incluem, sem limitação, Patente n° US 6.437.217 (promotor
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RS81 de mais), Patente n° US 5.641.876 (promotor de actina do arroz), Patente n° US 6.426.446 (promotor RS324 de mais), Patente n° US 6.429.362 (promotor PR-1 de mais), Patente n° US 6.232.526 (promotor A3 de mais), Patente n° US 6.177.611 (promotores constitutivos de mais), Patentes n^ US 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), Patente n° US 6.433.252 (promotor de oleosina L3 de mais), Patente n° US 6.429.357 (promotor 2 de actina do arroz assim como um intron 2 de actina do arroz), Patente n° US 5.837.848 (promotor específico do arroz), Patente n° US 6.294.714 (promotores induzíveis por luz), Patente n° US 6.140.078 (promotores induzíveis por sal), Patente n° US 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno), Patente n° US 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo), Patente n° US 6.635.806 (promotor de gama-coixina), e Pedido de Patente US n° de série 09/757.089 (promotor de aldolase de cloroplasto de mais). Promotores adicionais que podem encontrar uso são um promotor de napolina sintase (NOS) (Ebert et al., 1987), o promotor de octopina sintase (OCS) (que é carregado em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., Plant Molecular Biology (1987) 9: 315-324), o promotor 35S CaMV (Odell et al., Nature (1985) 313: 810-812), promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (Patente US n^ 6.051.753; 5.378.619), o promotor de sacarose sintase (Yang e Russell, Proceedings of the National Academy of Sciences, EUA (1990) 87: 4144-4148), o promotor de complexo de gene R (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), e o promotor de gene de proteína de ligação de clorofila a/b, PC1SV (Patente US n° 5.850.019), promotores e AGRtu.nos (n° de Acesso GenBank V00087; Depicker et al., Journal of Molecular and Applied Genetics (1982) 1: 561573; Bevan et al., 1983).
[078] Em algumas modalidades, os híbridos de promotor podem
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38/81 ser construídos para intensificar a atividade transcricional (Patente US n° 5.106.739), ou para combinar a atividade transcricional, capacidade de indução e especificidade de tecido ou especificidade de desenvolvimento desejadas. Os promotores que funcionam em plantas incluem, mas sem limitação, promotores que são induzíveis, virais, sintéticos constitutivos, temporariamente regulados, espacialmente regulados e espaço-temporalmente regulados. Outros promotores que são intensificados por tecido, específicos a tecido ou regulados de modo relacionado ao desenvolvimento são conhecidos na técnica e contemplados para ter utilidade na prática desta divulgação.
[079] Os promotores usados nas moléculas de ácido nucleico e vetores fornecidos desta divulgação podem ser modificados, se desejado, para afetar suas características de controle. Os promotores podem ser derivados por meio de ligação com regiões de operador, mutagênese aleatória ou controlada, etc. Além disto, os promotores podem ser alterados para conter múltiplas “sequências intensificadoras” para auxiliar na elevação da expressão de gene.
[080] Sem limitação, os promotores constitutivos exemplificativos incluem o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados na Patente US n° 6.072.050; o promotor 35S CaMV de núcleo (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); promotores de ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J 3:2723-2730); promotor ALS (Patente US n° 5.659.026), e semelhantes.
[081] Sem limitação, os promotores induzíveis por produtos químicos exemplificativos incluem o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores induzíveis de produtos químicos de interesse incluem promotores responsivos a esteroides (consulte,
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39/81 por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) e promotores induzíveis por tetraciclina (consulte, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229237, e Patentes US n22 5.814.618 e 5.789.156). Promotores exemplificativos adicionais que podem ser usados no presente documento são aqueles responsáveis por expressão de gene regulada por calor, expressão de gene regulada por luz (por exemplo, o rbcS-3A da ervilha; o promotor rbcS do mais; o gene da proteína de ligação de clorofila a/b encontrado na ervilha; ou o promotor Arabssu), expressão de gene regulada por hormônio (por exemplo, as sequências responsivas a ácido abscísico (ABA) do gene Em do trigo; os promotores HVA1 e HVA22 induzíveis por ABA, e promotores rd29A da cevada e Arabidopsis; e expressão de gene induzida por ferimentos (por exemplo, de wunl), expressão de gene específica a órgão (por exemplo, do gene da proteína de armazenamento específico a tubérculo; o gene 23-kDa zeina do mais descrito; ou a vagem (gene β-faseolina), ou promotores induzíveis por patógeno (por exemplo, o PR-1, prp-1, ou (promotores de β-1,3 glucanase, o promotor wirla induzível por fungo do trigo, e os promotores induzíveis por nematódio, TobRB7-5A e Hmg-1, do tabaco e salsa, respectivamente).
[082] Sem limitação, os promotores específicos a tecido exemplificativos incluem aqueles revelados em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343: Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157~168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant
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Mol. Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka etal. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. EUA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505.
TRANSFORMAÇÃO [083] Métodos de transformação de células vegetais são conhecidos por pessoas de habilidade comum na técnica. Por exemplo, instruções específicas para transformar células vegetais por meio de bombardeamento de microprojétil com partículas revestidas com DNA recombinante são encontradas em Patentes US 5.015.580 (soja); 5.550.318 (milho); 5.538.880 (milho); 5.914.451 (soja); 6.160.208 (milho); 6.399.861 (milho); 6.153.812 (trigo); 6.002.070 (arroz); 7.122.722 (algodão); 6.051.756 (Brassica); 6.297.056 (Brassica); Publicações de Patente US 20040123342 (cana-de-açúcar) e transformação mediada por Agrobacterium é divulgada em Patentes US 5.159.135 (algodão); 5.824.877 (soja); 5.591.616 (milho); 6.384.301 (soja); 5.750.871 (Brassica); 5.463.174 (Brassica); e 5.188.958 (Brassica), todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Métodos para transformar outras plantas podem ser encontradas em, por exemplo, Compendium of Transgenic Crop Plants (2009) Blackwell Publishing. Qualquer método adequado conhecido por aqueles versados na técnica pode ser usado para transformar uma célula vegetal com qualquer uma das moléculas de ácido nucleico fornecidas no presente documento.
[084] Em um aspecto, uma célula vegetal fornecida no presente documento é estavelmente transformada com pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs. Conforme usado no presente documento, “estavelmente transformada” se refere a uma transferência de DNA para um genoma de uma célula alvejada que permite que a célula alvejada passe o DNA transferido para a próxima geração. Em um outro aspecto, uma célula vegetal fornecida no presente documento é transientemente transformada com pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo
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41/81 menos 10 GECs. Conforme usado no presente documento, “transientemente transformado” é definido como uma transferência de DNA para uma célula que não é integrada em um genoma da célula transformada. Em um aspecto, uma planta capaz de induzir a haploidização fornecida no presente documento compreende pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs estavelmente transformados. Em um outro aspecto, uma planta capaz de induzir a haploidização fornecida no presente documento compreende pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs transientemente transformados. Em um aspecto, um método de transformação de uma célula vegetal fornecida no presente documento compreende uma transformação biolística ou uma transformação mediada por bactérias. Em um aspecto, um método de transformação de uma célula vegetal fornecida no presente documento compreende transformação mediada por bactérias que compreende adicionalmente colocar a célula vegetal em contato com pelo menos uma célula de Agrobacterium, em que a célula de Agrobacterium é capaz de transformar a célula vegetal.
[085] Métodos de transformação para fornecer células vegetais transgênicas e plantas transgênicas que contêm moléculas de ácido nucleico estavelmente integradas fornecida no presente documento são, de preferência, praticadas em cultura de tecido em meios e em um ambiente controlado. Conforme usado no presente documento, “meios” se refere às várias misturas de nutrientes que são usadas para cultivar as células in vitro, ou seja, fora do organismo vivo intacto.
[086] Em um aspecto, esta divulgação fornece células vegetais que não são material reprodutivo e não mediam a reprodução natural da planta. Em um outro aspecto, esta divulgação também fornece células vegetais que são material reprodutivo e mediam a reprodução natural da planta. Em um outro aspecto, esta divulgação fornece células vegetais que não podem se manter por meio de fotossíntese. Em um outro
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42/81 aspecto, esta divulgação fornece células vegetais somáticas. Células somáticas, ao contrário de células germinativas, não mediam reprodução de planta.
[087] Os alvos de célula receptora para transformação incluem, mas sem limitação, uma célula de semente, uma célula de fruta, uma célula de folha, uma célula de cotiledônea, uma célula de hipocótilo, uma célula de meristema, uma célula de embrião, uma célula de endosperma, uma célula de raiz, uma célula de broto, uma célula de tronco, uma célula de vagem, uma célula de flor, uma célula de inflorescência, uma célula de haste, uma célula de pedicelo, uma célula de estilo, uma célula de estigma, uma célula de receptáculo, uma célula de pétala, uma célula de sépala, uma célula de pólen, uma outra célula, uma célula de filamento, uma célula de ovário, uma célula de óvulo, uma célula de pericarpo, uma célula de floema, uma célula de botão ou uma célula de tecido vascular. Em um outro aspecto, esta divulgação fornece um cloroplasto vegetal. Em um aspecto adicional, esta divulgação fornece uma célula epidérmica, uma célula de estorna, uma célula de tricoma, uma célula de raiz capilar, uma célula de raiz de armazenamento ou uma célula de tubérculo. Em um outro aspecto, esta divulgação fornece um protoplasto. Em um outro aspecto, esta divulgação fornece uma célula de calo vegetal. Qualquer célula da qual uma planta fértil pode ser regenerada é contemplada como uma célula receptora útil para a prática desta divulgação. O calo pode ser iniciado de várias fontes de tecido, incluindo, mas sem limitação, embriões imaturos ou partes de embriões, meristemas apicais de muda, microporos e semelhantes. Aquelas células que são capazes de se proliferar como calos podem servir como células receptoras para transformação. Os métodos e materiais de transformação práticos para produzir plantas transgênicas desta divulgação (por exemplo, vários meios e células-alvo receptoras, transforma
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43/81 ção de embriões imaturos, e regeneração subsequente de plantas transgênicas férteis) são divulgados, por exemplo, em Patentes US 6.194.636 e 6.232.526 e Publicação de Pedido de Patente US 2004/0216189.
[088] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma célula vegetal transformada por qualquer método fornecido no presente documento. Em um aspecto, uma célula vegetal fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma célula de acácia, uma célula de alfafa, uma célula de endro, uma célula de maçã, uma célula de damasco, uma célula de alcachofra, uma célula de rúcula, uma célula de aspargo, uma célula de abacate, uma célula de banana, uma célula de cevada, uma célula de feijão, uma célula de beterraba, uma célula de amora, uma célula de mirtilo, uma célula de brócolis, uma célula de couve-de-Bruxelas, uma célula de repolho, uma célula de canola, uma célula de cantalupo, uma célula de cenoura, uma célula de mandioca, uma célula de couve-flor, uma célula de aipo, uma célula de couve chinesa, uma célula de cereja, uma célula de coentro, uma célula de cítricos, uma célula de tangerina, uma célula de café, uma célula de milho, uma célula de algodão, uma célula de pepino, uma célula douglásia, uma célula de ovo vegetal, uma célula de endívia, uma célula de escarola, uma célula de eucalipto, uma célula de funcho, uma célula de figo, uma célula de árvores florestais, uma célula de cabaça, uma célula de uva, uma célula de toranja, uma célula de melaço, uma célula de jícama, uma célula de kiwi, uma célula de alface, uma célula de alhoporo, uma célula de limão, uma célula de lima, uma célula de pinus (Loblolly pine), uma célula de manga, uma célula de bordo, uma célula de melão, uma célula de cogumelo, uma célula de nectarina, uma célula de nozes, uma célula de aveia, uma célula de quiabo, uma célula de cebola, uma célula de laranja, uma célula de planta ornamental, uma célula de mamão papaia, uma célula de salsinha, uma célula de ervilha,
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44/81 uma célula de pêssego, uma célula de amendoim, uma célula de pera, uma célula de pimenta, uma célula de caqui, uma célula de pinha, uma célula de abacaxi, uma célula de banana-da-terra, uma célula de ameixa, uma célula de romã, uma célula de choupo-branco, uma célula de batata, uma célula de abóbora, uma célula de marmelo, uma célula de pinus radiata, uma célula de chicória, uma célula de nabo, uma célula de colza, uma célula de framboesa, uma célula de arroz, uma célula de centeio, uma célula de sorgo, uma célula de pinus do sul, uma célula de soja, uma célula de espinafre, uma célula de abobrinha, uma célula de morango, uma célula de beterraba sacarina, uma célula de cana-deaçúcar, uma célula de girassol, uma célula de milho doce, uma célula de batata doce, uma célula de liquidâmbar, uma célula de tangerina, uma célula de chá, uma célula de tabaco, uma célula de tomate, uma célula de turfa, uma célula de videira, uma célula de melancia, uma célula de trigo, uma célula de inhame e uma célula de pepino. Em um outro aspecto, uma célula vegetal fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma célula de milho ou mais, uma célula de soja, uma célula de canola, uma célula de algodão, uma célula de trigo e uma célula de cana-de-açúcar.
[089] Em um outro aspecto, uma célula vegetal fornecida no presente documento é selecionada dentre o grupo que consiste em uma célula de embrião imaturo de milho, em uma célula de embrião maduro de milho, em uma célula de semente de milho, em uma célula de embrião imaturo de soja, em uma célula de embrião maduro de soja, em uma célula de semente de soja, em uma célula de embrião imaturo de canola, em uma célula de embrião maduro de canola, em uma célula de semente de canola, em uma célula de embrião imaturo de algodão, em uma célula de embrião maduro de algodão, em uma célula de semente de algodão, em uma célula de embrião imaturo de trigo, em uma célula de embrião maduro de trigo, em uma célula de semente de trigo, em
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45/81 uma célula de embrião imaturo de cana-de-açúcar, em uma célula de embrião maduro de cana-de-açúcar, em uma célula de semente de cana-de-açúcar.
[090] Em um aspecto, a transformação de uma célula vegetal é realizada por um método mediado por Agrobacterium (Patentes US n^ 6.265.638, 5.731.179; Publicações de Pedido de Patente US 2005/0183170; 2003/110532). Os construtos de DNA usados para transformação nos métodos da presente divulgação geralmente também contêm segmentos de DNA de estrutura principal de plasmídeo que fornecem função de replicação e seleção antibiótica em células bacterianas, por exemplo, uma origem de replicação de Escherichia coli tal como ori322, uma origem de replicação de Agrobacterium tal como oriV ou oriRi, e uma região de codificação para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica aminoglicosídeo adeniltransferase (aadA) Tn7 que confere resistência a espectinomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável de gentamicina (Gm, Gent). Para a transformação de planta, a cepa bacteriana hospedeira é frequentemente Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, LBA4404, AGLO, AGL1, EHA101, ou EHA105 que carrega um plasmídeo que tem uma função de transferência para a unidade de expressão. Outras cepas conhecidas por aqueles versados na técnica de transformação de planta podem funcionar nesta divulgação.
[091] Para confirmar a presença de DNA integrado em uma célula ou em um genoma transformado, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios biológicos moleculares (por exemplo, Southern e northern blotting, POR™); ensaios bioquímicos, tais como detecção da presença de um produto de proteína (por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e western blots), ou por função enzimática (por exemplo, ensaio GUS)); histoquímica de pólen; ensaios de parte de planta, (por exemplo, ensaios de folha ou raiz); e
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46/81 também, analisando-se o fenótipo de toda a planta regenerada.
[092] A presente divulgação também fornece uma célula vegetal transgênica que compreende uma sequência de interesse integrada em um genoma da célula vegetal de acordo com os métodos divulgados no presente documento. Também é fornecida uma planta transgênica produzida pelos métodos divulgados no presente documento.
CROMOSSOMOS B [093] Conforme usado no presente documento, o termo “cromossomo supranumerário” se refere a um cromossomo extra encontrado além do complemento normal de cromossomos A. Em um aspecto, uma linhagem HI fornecida no presente documento compreende pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 cromossomos supernumerários. Em um outro aspecto, uma linhagem de receptor fornecida no presente documento compreende pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 cromossomos supernumerários. Em um aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento é um cromossomo B. Em um outro aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento é um cromossomo derivado artificialmente. Em ainda um outro aspecto, um cromossomo derivado artificialmente fornecido no presente documento é um cromossomo truncado ou um cromossomo gerado de novo.
[094] Em um aspecto, um cromossomo B fornecido no presente documento é um cromossomo B de mais. Em um outro aspecto, um cromossomo B fornecido no presente documento é um cromossomo B de centeio. Em um aspecto, um cromossomo B fornecido no presente documento é um cromossomo B de Tripsacum. Os cromossomos B são encontrados além do complemento diploide normal de cromossomos em uma célula. Por exemplo, em mais, o complemento diploide normal de cromossomos é 20. Os cromossomos B são dispersáveis e não são
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47/81 necessários para o desenvolvimento de planta normal. Quando dois cromossomos B estiverem presentes em uma única planta, os dois cromossomos B podem se emparelhar um com o outro na prófase meiótica e a recombinaçâo pode ocorrer. Os cromossomos B não se emparelham ou recombinam com os cromossomos A.
[095] Em um aspecto, um método fornecido no presente documento compreende a incorporação de um DNA de interesse em um cromossomo supranumerário. Em um outro aspecto, um método fornecido no presente documento compreende a modificação pelo menos um locus em um cromossomo supranumerário. Em um outro aspecto, um método fornecido no presente documento compreende a translocação de uma molécula de ácido nucleico de um cromossomo supranumerário para um cromossomo A, um genoma plastidial ou um genoma mitocondrial.
[096] Em um aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento compreende pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 GECs. Em um aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento compreende pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 modelos de polinucleotídeo doador. Em um aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento compreende pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 enzimas específicas a sítio. Em ainda um outro aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 megaloci. Em um aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento compreende pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 transgenes. Em um outro aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento é ligado e/ou clivado por uma enzima específica a sítio.
[097] Em um aspecto, um GEC posicionado em um cromossomo
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A, em um genoma mitocondrial ou em um genoma de plastídio (por exemplo, cloroplasto) fornecido no presente documento modifica pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos de um cromossomo supranumerário. Em um outro aspecto, um GEC posicionado em um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento modifica pelo menos um ácido nucleico de um cromossomo A, um genoma mitocondrial ou um genoma de plastídio (por exemplo, cloroplasto).
[098] Em um aspecto, uma célula que compreende um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento é submetida à irradiação para gerar 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais redisposições genômicas.
[099] Em um aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento é um cromossomo B-A ou um cromossomo A-
B. Os cromossomos B-A e A-B resultam de translocações recíprocas entre cromossomos A normais e cromossomos B supernumeraries em milho. Uma translocação B-A resulta em um cromossomo B-A e em um cromossomo A-B, com o segundo cromossomo listado denotando o braço de cromossomo sem seu centômero nativo. Por exemplo, um cromossomo 9S-B compreende um braço de cromossomo B fixado a um braço curto normal de cromossomo 9 e o centômero de cromossomo 9; o cromossomo B-9L recíproco compreende um braço de cromossomo B e centômero fixados ao braço longo de cromossomo 9 normal. Os cromossomos B-A e A-B podem se recombinar meioticamente com os cromossomos A normais correspondentes. Como um exemplo não limitante, um cromossomo 9S-B pode se recombinar meioticamente com o braço curto de cromossomo 9 normal.
[0100] Em um aspecto, um megalocus fornecido no presente documento é posicionado em um cromossomo B-A ou em um A-B. Em um outro aspecto, um transgene fornecido no presente documento é posicionado em um cromossomo B-A ou em um A-B. Em ainda um outro
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49/81 aspecto, um GEC fornecido no presente documento é posicionado em um cromossomo B-A ou em um A-B. Em um aspecto, um modelo de polinucleotídeo doador fornecido no presente documento é posicionado em um cromossomo B-A ou em um A-B. Em ainda um outro aspecto, uma enzima específica a sítio fornecida no presente documento é posicionada em um cromossomo B-A ou em um A-B.
[0101] Em um aspecto, esta divulgação fornece um método de translocação de um megalocus, transgene, ou GEC de um cromossomo B-A ou um A-B para um cromossomo normal correspondente por meio de recombinação meiótica.
[0102] Um ou mais cromossomos B, de acordo com determinados aspectos da presente divulgação, podem ser distribuídos para uma planta progenitora sem o resto do genoma paterno ou materno (por exemplo, por meio de um cruzamento por indução de haploides que retém o cromossomo B), permitindo a conversão completa para uma nova variedade em um único cruzamento. Em um outro aspecto, um cromossomo B pode ser transferido de uma primeira espécie de planta para uma segunda espécie de planta, permitindo o teste do transgene ou transgenes em outras culturas. Por exemplo, a transmissão de um cromossomo B para a aveia foi demonstrada, assim como a transmissão de um cromossomo de milho para trigo (Koo et al., Genome Research 21(6):908-914, 2011; Comeau et al., Plant Science 81(1):117-125, 1992).
[0103] Em determinados casos, tais como em milho e centeio, os cromossomos B têm “mecanismos de acumulação” que permitem que os mesmos transmitam em frequências maiores que mendelianas. Por exemplo, em milho, as cromátides irmãs do cromossomo B falham na separação durante a segunda divisão de pólen (primeira generativa). Como resultado, ambas as cromátides irmãs são distribuídas para um
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50/81 dos espermas, enquanto a outra não recebe nenhum. Este efeito, chamado de não disjunção, significa que uma planta com apenas um único cromossomo B pode distribuir zero, um ou dois cromossomos B para a próxima geração quando usada como um macho. Tal efeito pode ser desejável durante o progresso de introgressão de característica, uma vez que o mesmo permite que indivíduos que são homozigotos (em oposição ao hemizigoto) para um megalocus carregado em um cromossomo B seja recuperado em um retrocruzamento, contanto que o cromossomo B seja distribuído a partir do pólen.
[0104] O efeito de não disjunção requer que porções específicas do cromossomo B estejam presentes. Um pedaço de ação trans na ponta do braço longo e um pedaço de ação cis perto do centômero são necessários. As deleções muito pequenas na ponta do braço longo do cromossomo B são recuperáveis e os cromossomos B resultantes não exibem não disjunção. Em determinadas modalidades da divulgação, tal variante de deleção do cromossomo B pode ser desejada, por exemplo, com o propósito de distribuir um megalocus para características comerciais. Em um aspecto, um cromossomo supranumerário fornecido no presente documento é submetido à não disjunção.
CRUZAMENTO [0105] Determinados aspectos destes métodos compreendem “cruzar” uma planta ascendente com uma outra para criar plantas progenitoras. O cruzamento também inclui a “autofecundação (selfing)” em que a mesma planta (ou um parente geneticamente semelhante) é usada tanto como ascendente macho quanto fêmea. Aqueles de habilidade comum na técnica também compreenderão que vários tipos diferentes de cruzamentos podem ser empregados no presente documento, dependendo, frequentemente, dos tipos de ascendente (ou ascendentes) selecionados, para criar um cruzamento. Outras maneiras de esquemas
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51/81 de cruzamento complexo conhecidos na técnica podem ser adicionalmente usadas para criar uma população de cruzamentos, incluindo, por exemplo, cruzamentos de tridirecionais, cruzamentos tetradirecionais, cruzamentos pentadirecionais, etc., dentro e dentre diferentes grupos de híbridos, consanguíneos, designações heteróticas, raças, níveis de ploidia (por exemplo, haploides, diploides, haploides dobrados, triploides, poliploides, etc.), espécies, etc. Além disso, uma variedade de diferentes maneiras de criar descendentes entre duas plantas ou células vegetais também pode ser usada em conjunto com a criação de células progenitoras.
[0106] Em determinados aspectos, um cruzamento é feito quando o pólen faz contato com as estruturas reprodutoras fêmeas (por exemplo, o estigma, tubo de pólen, megagametófito, óvulo, etc.). Em determinados aspectos, o resultado de fazer um cruzamento é produzir uma célula de zigoto progenitor. A célula de zigoto precisa conter material genético a partir de ambos os ascendentes, por exemplo, uma planta progenitora produzida a partir de um cruzamento com uma linhagem de indutor de haploide pode não conter DNA herdado do ascendente indutor, ainda uma planta progenitora célula produzida a partir de tais métodos ainda é considerada progênie do ascendente indutor.
[0107] Um aspecto desta invenção é que o GEC é aproximado o suficiente do genoma-alvo para que os produtos que o mesmo codifica sejam capazes de agir mediante um genoma-alvo que está próximo. Por exemplo, exemplos dos métodos descritos no presente documento explicam como isto pode ser obtido por meio de fertilização e/ou singamia para distribuir um GEC contido em uma célula de esperma no núcleo de uma célula-óvulo em que um genoma que um usuário deseja editar reside. Um indivíduo pode compreender facilmente que a expressão de um GEC no mesmo núcleo como um genoma-alvo pode resultar em uma edição desejada. No entanto, também é conhecido na técnica que
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52/81 os produtos da transcrição e/ou tradução de GEC podem ser transportados através de membranas, para que o GEC não precise passar por todo o caminho dentro do mesmo núcleo que o genoma-alvo para os produtos que o mesmo codifica para difundir, e/ou ser transportado ou, de outro modo, migrar através do envelope nuclear para o genoma-alvo em que os mesmos podem, então, criar uma edição desejada. Além disto, é até mesmo possível que o GEC não seja expresso na mesma célula que um genoma-alvo, à medida que também é conhecido na técnica que os produtos de transcrição e/ou tradução podem se difundir, migrar e/ou ser transportados através de uma membrana celular e para uma célula, e daí, através do envelope nuclear para criar uma edição desejada em um genoma-alvo.
[0108] Determinados aspectos dos métodos divulgados no presente documento incluem realizar cruzamentos entre tipos de plantas cujos genomas são conhecidos por não persistir nas células da progênie e/ou cujos genomas são conhecidos para recombinar pouquíssimo ou nada com o genoma de um outro ascendente na progênie, ou nada, durante o tempo que os dois genomas persistem na mesma célula da progênie. Por exemplo, variedades poliploides de soja foram descritas (Beversdorf WD. (1979) Can J Plant Sei. 59:945-948), então antecipa-se que, ao invés de usar um genoma indutor de haploide de mais como um cromossomo de carreador, por exemplo, um indivíduo poderia colocar um GEC no genoma de uma soja diploide e, então, cruzar esta planta com uma planta de soja tetraploide a fim de produzir uma edição desejada em um genoma da planta de soja tetraploide. O cruzamento das duas plantas produzirá descendentes triploides; um genoma herdado do ascendente diploide que contém o GEC, e dois genomas herdados do ascendente tetraploide, um ou ambos os quais poderiam ser alvos para o GEC. Os dois genomas existirão dentro da distância de edição entre si (por exemplo, na mesma célula) por tempo suficiente para que o GEC
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53/81 realize a edição desejada, mas uma vez que é conhecido na técnica que o genoma herdado do ascendente diploide em um cruzamento 2x x 4x é logo eliminado na descendência, pode-se compreender que o GEC em um cromossomo do ascendente 2x também seria eliminado, e que seria possível recuperar eventualmente a progênie diploide que continha apenas os genomas herdados do ascendente tetraploide, pelo menos um dos quais contém a edição desejada. Dependendo da natureza da edição e da homologia entre genomas, a edição desejada pode ser feita em um ou em ambos os genomas herdados da ascendente tetraploide. É antecipado que com esta divulgação, os melhoristas de planta reconhecerão, agora, como esta ideia não se limita a diploides e tetraploides, mas podería ser aplicada a um hospedeiro de outros cruzamentos entre plantas de níveis de ploidia diferentes sem alterar o conceito fundamental de como os mecanismos de eliminação de cromossomo de cruzamentos interploidia poderíam ser usados para levar um GEC dentro da distância de edição de um genoma-alvo, e/ou como este mecanismo podería ser usado para remover um GEC das células progenitoras.
[0109] Então, um cruzamento, conforme usado no presente documento, é um termo amplo que inclui qualquer situação em que um cromossomo de carreador que contém um GEC é aproximado o bastante de um genoma-alvo cujos produtos expressos pelo GEC são capazes de criar uma edição desejada em um genoma-alvo. Aqueles versados na técnica compreenderão que há métodos para estender esta distância, mas que o princípio permanece o mesmo.
[0110] Conforme usado no presente documento, “retrocruzar” e “retrocruzamento” se referem ao processo através do qual uma planta de progênie é repetidamente retrocruzado com um de seus ascendentes. Em um esquema de retrocruzamento, o ascendente “doador” se refere à planta parental com o gene ou locus desejado a ser introgredido. O
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54/81 ascendente “receptor” (usado uma ou mais vezes) ou ascendente “recorrente” (usado duas ou mais vezes) se refere à planta parental na qual o gene ou locus está sendo introgredido. O cruzamento inicial origina a geração F1. O termo “BC1” se refere ao segundo uso do ascendente recorrente, “BC2” se refere ao terceiro uso do ascendente recorrente, e assim em diante. Em um aspecto, um retrocruzamento é realizado repetidamente, com uma progênie individual de cada geração de retrocruzamento sucessiva sendo retrocruzada por si com o mesmo genótipo parental. Em um aspecto, uma planta que compreende um genoma modificado fornecido no presente documento é retrocruzada ou autofertilizada para remover um cromossomo supranumerário.
[0111] Conforme usado no presente documento, “variedade de elite” significa qualquer variedade que tenha resultado do melhoramento e da seleção para desempenho agronômico superior.
[0112] Conforme usado no presente documento, “selecionar ou “seleção” no contexto de melhoramento se refere à colheita ou escolha de indivíduos desejados, normalmente de uma população, com base em determinados critérios predeterminados.
[0113] Em um aspecto, as plantas fornecidas no presente documento são plantas híbridas. As híbridas podem ser produzidas prevenindo-se a autopolinização de plantas ascendentes fêmeas (por exemplo, ascendentes de semente) de uma primeira variedade, permitindo que o pólen das plantas ascendentes machos de uma segunda variedade fertilizem as plantas ascendentes fêmeas, e permitindo que as sementes híbridas F1 se formem nas plantas fêmeas. Plantas híbridas também podem ser produzidas cruzando-se plantas de duas espécies diferentes.
[0114] Uma híbrida instável caracterizada pela eliminação dos cromossomos de um ascendente durante a meiose, resulta em um gameta que retém cromossomos de apenas um ascendente. A progênie de um
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55/81 retrocruzamento com o ascendente de interesse desejado produz uma planta em que o genoma de um ascendente é substancialmente não presente. Uma espécie doadora que forma um híbrido instável com a espécie desejada pela transformação é preparada adicionando-se GECs e/ou polinucleotídeos de interesse e/ou segmentos genômicos. Os componentes desejados são adicionados pela transformação ou pela introgressão. A espécie doadora é cruzada com a espécie receptora para formar uma híbrida instável que compreende os GECs.
EXEMPLOS [0115] Os exemplos a seguir fornecem modalidades ilustrativas da presente divulgação. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, observar que muitas alterações podem ser feitas em aspectos específicos destas modalidades sem que se afaste do conceito, essência e escopo da presente divulgação. Além do mais, é evidente que determinados agentes que estão tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos no presente documento enquanto os resultados iguais ou semelhantes seriam obtidos. Todos os tais substitutos e modificações semelhantes evidentes àqueles versados na técnica são considerados como dentro da essência, do escopo e conceito da presente divulgação conforme definido pelas reivindicações anexas.
EXEMPLO 1. MODIFICAÇÃO DE GENOMA COM O USO DE UM GENOMA INDUTOR DE HAPLOIDES COMO UM CROMOSSOMO CARREADOR DE GEC.
[0116] A modificação de um genoma de uma planta de interesse pode ser realizada por meio do uso de um cruzamento por indução de haploides materno para expressar transientemente um componente de edição de genoma (GEC) na proximidade de um genoma herdado da planta de interesse.
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56/81 [0117] Por exemplo, um construto Cas9/gRNA pode ser transformado no genoma de uma planta conhecida por sua habilidade de induzir a produção de descendentes haploides, por exemplo, um indutor de haploide materno de mais que compreende um fenótipo com alto teor de óleo como CAUHOI (X Dong, X Xu, L U, C Liu, X Tian, W Li, S Chen (2014) Mol Breeding 34:1147-1158) usando qualquer método de transformação conhecido na técnica (por exemplo, GA de la Riva, J Gonzalez-Cabrera, R Vasquez-Padron, e C Ayra~Pardo, Elec J of Biotech (1998) 115:12). O gRNA pode ser projetado para alvejar um gene ou locus do genoma de uma linhagem-alvo de mais, por exemplo, uma mutação knockout da sequência genética Waxy (WX) (M Shure, S Wessler, N Fedoroff, Cell (1983) 35:225-233) no genoma da linhagem de milho B73. O Cas9 pode ser ligado de modo operativo a um promotor, por exemplo, Ubi-1 de mais (AH Christensen, RASharrock, PH Quail, Plant Mol boil (1992) 18:675-689) e o gRNA pode ser ligado de modo operativo a um promotor capaz de expressar o Cas9 e gRNA em uma célula de pólen e/ou em um óvulo e/ou em uma célula de zigoto e/ou em uma célula de embrião antes e/ou durante e/ou depois da fertilização (por exemplo, o promotor U6 do arroz, PU6.1).
[0118] A linhagem de indutor de haploide transformada que compreende o Cas9-gRNA pode, então, ser cultivado para produzir pólen também compreende o Cas9-gRNA e, este pólen pode ser usado para fertilizar uma ascendente fêmea da linhagem de milho B73. Após o pólen do ascendente indutor de haploide macho entrar em contato com o ascendente fêmea, haverá um período de tempo durante o qual as sequências de Cas9-gRNA herdadas do ascendente indutor existirão em proximidade com o genoma herdado do ascendente fêmea (por exemplo, perto do tempo de singamia) e, então, pouco antes e/ou durante e/ou depois da fertilização do ovo, o Cas9-gRNA será expresso a partir do genoma herdado do indutor e os produtos serão subsequentemente
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57/81 capazes de modificar o genoma próximo que foi herdado da ascendente fêmea, por exemplo, modificando-se o gene Wxde B73. Em determinadas modalidades, o processo de edição de genoma ocorre enquanto a progênie do cruzamento por indução está na fase de zigoto de seu ciclo de vida. Em determinadas modalidades, o processo de edição de genoma requer um período de tempo mais longo, que abrange, potencialmente, diversas rodadas de divisões mióticas nos tecidos da planta progenitora.
[0119] Seguindo a edição do genoma de B73, o genoma do indutor e o Cas9-gRNA que o mesmo contém, serão perdidos das células em uma determinada frequência da progênie por meio de um dos mecanismos espontâneos da eliminação de genoma que é característica dos indutores de haploide maternos de mais produzindo, assim, uma frequência correspondente de plantas progenitoras haploides que contêm o genoma B73 editado. De uma perspectiva de melhoramento de planta, segue-se que o genoma B73 editado pelo Cas9-gRNA e herdado pela progênie haploide será idêntico ao genoma B73 contido no ascendente fêmea da progênie haploide, com exceção dos tipos de mutações naturais e/ou espontâneas (por exemplo, aleatórias) que se espera que ocorram durante a divisão celular e/ou replicação de DNA.
[0120] Desse modo, neste exemplo, uma determinada frequência de plantas progenitoras haploides será produzida que compreende genomas B73 que são substancialmente idênticos ao genoma B73 original do ascendente fêmea da progênie, exceto pela mutação knockout de Wx que foi criada pelo Cas9-gRNA transiente de ação trans (sendo que o Cas9-gRNA é eliminado juntamente com o genoma do indutor às vezes durante ou depois da fertilização).
[0121] A progênie haploide pode ser identificada usando qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, um marcador de atocianina visível como Se um indutor com alto teor de óleo como CAUHOI
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58/81 fosse utilizado, então, um sistema automatizado pode ser usado para identificar e classificar sementes da progênie haploides da progênie diploide usando métodos de classificação de semente com alto teor de óleo descritos no presente documento.
[0122] A progênie haploide que contém especificamente o genoma B73 editado pode ser identificada usando qualquer marcador conhecido para ser associado à edição (seja positivamente associado ou de outro modo) usando uma ampla gama de métodos conhecidos na técnica. Em determinadas modalidades, as sementes haploides podem ser submetidas à raspagem de semente e caracterização molecular usando os métodos descritos no Pedido de Patente US 11/213.430, que foi depositado em 26 de setembro de 2005 e publicado como US20060048247 e emitido como Patente US n° 7.502.113, no presente documento incorporado a título de referência em sua totalidade. Estes e outros métodos e marcadores conhecidos na técnica poderiam ser usados em combinação com esta invenção para triar e/ou identificar progênie haploide contendo a edição desejada, incluindo, mas sem limitação, qualquer método de detecção ou determinando as sequências de nucleotídeos e/ou aminoácidos produzidas em ou pelas células vegetais e/ou tecidos (por exemplo, triagem fenotípica, sequenciamento de DNA, sequenciamento de proteína, análise de incompatibilidade de DNA usando a Ce//, ou semelhante, enzima, uma análise de curva de fusão de alta resolução de amplicons de PCR contendo a sequência-alvo, ou outros métodos moleculares, etc.).
[0123] Os métodos descritos no presente documento não se limitam a qualquer atividade que possa ser realizada na progênie haploide seguindo a geração da edição. Em determinadas modalidades, um usuário pode desejar dobrar os cromossomos de uma célula na progênie haploide, em cujo caso, qualquer método de dobramento de cromossomo po
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59/81 deria ser usado para este propósito. Por exemplo, um usuário pode desejar um método de dobramento altamente eficaz como aquele descrito no Pedido de Patente Provisório US 61/687.260, depositado em 1o de maio de 2014 e Pedido PCT correspondente PCT/US2015/028955, depositado em 1o de maio de 2015 e intitulado “Aided Delivery of Plant Treatment Agents”, no presente documento incorporado a título de referência em sua totalidade. Uma ampla gama de métodos alternativos poderia ser usada para dobrar as células da progênie haploide geradas usando métodos descritos no presente documento, incluindo qualquer tipo de agente de dobramento e/ou técnica de dobramento descrita na técnica.
[0124] Os métodos descritos no presente documento não se limitam a quaisquer atividades que possam ser usadas para afetar a frequência e/ou eficiência com a qual a progênie haploide é produzida. Por exemplo, um usuário pode desejar aumentar a eficiência de indução de haploides usando os métodos descritos no Pedido de Patente Provisório US 61/987.260 e Pedido PCT correspondente PCT/US2016/042471, depositado em 15 de julho de 20116 e intitulado “Methods for Creating Doubled Haploid Plants”. Além disto, qualquer tipo de indutor poderia ser usado como um ascendente em cruzamentos descritos no presente documento e/ou como um carreador de um GEC. Um usuário destes métodos pode selecionar indutores por qualquer razão que pareça adequada para várias situações, incluindo algum limiar de frequência com a qual um genoma de indutor possível é eliminado em células progenitoras. Em determinadas modalidades, um usuário pode induzir haploidia em várias frequências realizando-se um cruzamento amplo com uma espécie relacionada. Supõe-se que usando a divulgação no presente documento, um indivíduo com habilidade comum na técnica possa, agora, perceber imediatamente que qualquer número de GECs e gRNAs diferente poderia ser transformado no genoma de uma ampla
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60/81 gama de plantas capazes de gerar embriões haploides em uma cultura de interesse, por exemplo, transformando uma planta de Tripsacum com um Cas9 e um gRNA que codificam um knockout mutacional do gene Wx do mais e, então, usando esta planta como um ascendente em um cruzamento com B73 para produzir descendentes haploides que compreendem um genoma B73 que contém uma edição de knockout de gene Wx (por exemplo, incorporando-se métodos descritos por RV Saíram, C Wilber, J Franklin, et al. (2002) In Vitro Cell Dev Biol -Plant 38: 435).
[0125] Os métodos no presente documento não são limitados, de qualquer modo, a determinados tipos ou sequências de GEC ou gRNA. Qualquer GEC ou gRNA capaz de ser codificado pelas sequências de nucleotídeos poderia ser usado em combinação com os métodos descritos no presente documento, incluindo transgenes, genes nativos, ou qualquer outro processo que altere as sequências de nucleotídeos (isto é, mutações). Com base nesta divulgação, um indivíduo com habilidade comum na técnica de biologia molecular de planta pode usar até mesmo sistemas relativamente complicados em combinação com esta invenção, por exemplo, transformando um indutor de haploide com um precursor de replicon viral que compreende um GEC, que, por sua vez, compreende um gene de replicase ligado de modo operativo aos promotores adequados e flanqueados por sequências de geminivírus LIR, então, usando esta planta para polinizar uma planta B73 e, então, recuperando a progênie haploide que compreende um genoma B73 que contém uma edição desejada codificada pelo GEC.
[0126] Além disto, antecipa-se que os melhoristas de planta de habilidade comum reconheçam imediatamente que até mesmo seções muito grandes de DNA, por exemplo, QTLs, megaloci, intervalos de cromossomo que abrangem diversos (dezenas) centimorgans, e até mesmo seções substanciais de um braço de cromossomo podem ser
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61/81 translocadas para dentro e/ou para fora de um genoma-alvo usando os métodos descritos no presente documento. Em determinadas modalidades, métodos e composições descritos no Pedido de Patente Provisório US 61/787.894, depositado em 15 de março de 2013 e/ou Pedido de Patente US correspondente 14/209.731, intitulado “Creation and Transmission of Megaloci” e depositado em 13 de março de 2014, pode ser usado. Em determinados exemplos, a edição criada no genoma-alvo compreende uma sequência de nucleotídeos transgênica ligada de modo operativo a um promotor que pode ser usado para acionar e/ou controlar a expressão do transgene, por exemplo, um promotor 35S de CaMV ligado de modo operativo à proteína inseticida CrylAb.
[0127] Alternativamente, uma linhagem de indutor de haploide que carrega um GEC e uma linhagem de receptor que carrega a edição-alvo podem ser, ambas, dobradas para criar plantas tetraploides. A linhagem de indutor tetraploide pode, então, ser cruzada com a linhagem de receptor tetraploide para criar progênies diploides que carregam a edição desejada. O genoma do indutor e o GEC são, ambos, eliminados durante o processo de cruzamento tetraploide. Portanto, o método não requer qualquer dobramento adicional após ocorrer a edição de genoma. EXEMPLO 2. MODIFICAÇÃO DE UM GENOMA DA PLANTA USANDO UM CROMOSSOMO SUPRANUMERÁRIO COMO UM CROMOSSOMO DE CARREADOR DE GEC.
[0128] Uma edição de genoma pode ser criada em um genoma-alvo da planta cruzando-se uma planta com uma linhagem de indutor de haploide que compreende um cromossomo supranumerário, por exemplo, um cromossomo B, que contém um cassete de expressão que codifica um GEC, tal como o Cas9 e o sistema gRNA associado.
[0129] Análogos à expressão transiente de um GEC do genoma do indutor pouco antes e/ou durante e/ou depois da fertilização descrita no
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Exemplo 1, as células de um indutor de haploide, neste exemplo, contêm um cromossomo supranumerário, por exemplo, um cromossomo B, que compreende um gRNA projetado para alvejar um gene ou locus de uma linhagem-alvo de mais, por exemplo, o gene Wx em um genomaalvo B73. O Cas9 pode ser ligado de modo operativo a um promotor, por exemplo, Ubi-1 de mais e o gRNA pode ser ligado de modo operativo a um promotor capaz de expressar o Cas9 e gRNA em uma célula de pólen, e/ou em uma célula-óvulo e/ou em uma célula de zigoto e/ou em uma célula embrionária pouco antes e/ou durante e/ou depois da fertilização (por exemplo, o promotor U6 de arroz, PU6.1).
[0130] O pólen do indutor de haploide que compreende este cromossomo B pode ser, então, usado para fertilizar um ascendente fêmea da linhagem de milho B73. Após o pólen do ascendente de indutor de haploide macho entrar em contato com o ascendente fêmea, haverá um período de tempo durante o qual as sequências de Cas9-gRNA carregadas pelo cromossomo B e herdadas do ascendente indutor existirão em proximidade com o genoma herdado do ascendente fêmea (por exemplo, perto do tempo de singamia) e, então, pouco antes e/ou durante e/ou depois da fertilização do ovo, o Cas9-gRNA será expresso a partir do cromossomo B herdado de indutor e os produtos serão subsequentemente capazes de modificar o genoma A próximo que foi herdado do ascendente fêmea, por exemplo, modificando-se o gene Wx de B73. Em determinadas modalidades, o processo de edição de genoma ocorre enquanto a progênie do cruzamento por indução está na fase de zigoto de seu ciclo de vida.
[0131] Devido ao fato de que os cromossomos B podem ser submetidos à não disjunção quando cruzados como um macho, a progênie resultante de um ascendente macho com um cromossomo B pode compreender zero, um, dois, ou mais cromossomos B quando cruzados com
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63/81 uma planta fêmea que contém zero cromossomos B mesmo após o genoma A do ascendente indutor ter sido eliminado na progênie. Então, em determinadas modalidades, o cromossomo supranumerário persiste nas células da progênie além da fase de zigoto, por exemplo, por diversas rodadas de divisões mióticas, fornecendo uma janela extensa para o processo de edição de genoma para ocorrer antes de o cromossomo supranumerário ser eliminado na progênie. A progênie que contém pelo menos um cromossomo B herdado do ascendente indutor pode ser identificada e isolada usando qualquer método desejado pelo usuário, por exemplo, sequenciamento de nucleotídeo, detecção de marcador molecular, etc.
[0132] Em determinadas modalidades, pode-se desejar e/ou precisar “procriar” o cromossomo supranumerário contido nas plantas progenitoras após a edição ser feita, por exemplo, cruzando-se ou autofecundando-se as plantas progenitoras e analisando-se e selecionando-se (por exemplo, por meio de marcador (ou marcadores) molecular e/ou análise de sequência de nucleotídeos e/ou aminoácidos, e/ou algum outro método) aquelas progênies que perderam o cromossomo supranumerário.
[0133] Em determinadas modalidades, seguindo a edição do genoma B73, o cromossomo B, e o Cas9-gRNA que o mesmo contém, pode ser eliminado das células de uma determinada frequência de progênie por meio de um dos mecanismos espontâneos de eliminação que é característico da eliminação de cromossomo supranumerário do mais, produzindo, então, uma frequência correspondente de plantas progenitoras haploides que contêm o genoma B73 editado.
[0134] De uma perspectiva de melhoramento de planta, segue-se que o genoma B73 editado pelo Cas9-gRNA e herdado pela progênie haploide será idêntico ao genoma B73 contido no ascendente fêmea da progênie haploide, com exceção dos tipos de mutações naturais e/ou
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64/81 espontâneas (por exemplo, aleatórias) que se espera que ocorram durante a divisão celular e/ou replicação de DNA.
[0135] Conforme descrito no Exemplo 1 e em qualquer lugar no presente documento, estes métodos não se limitam a qualquer maneira de atividades adicionais, que podem ser conduzidos antes, durante ou depois da edição ser feita. Dependendo dos objetivos do usuário, por exemplo, dobramento de cromossomo e/ou análise genotípica e/ou fenotípica e triagem, e/ou etapas para aprimorar a indução de haploides, e/ou autofecundação para confirmar o dobramento, etc. também pode ser realizados, por exemplo, semelhantes àqueles descritos no Exemplo 1 no presente documento. Um indivíduo com habilidade comum na técnica de genética de planta observará imediatamente as aplicações de uma planta haploide que contém um genoma de elite que compreende uma determinada edição específica, por exemplo, um genoma B73 com uma mutação knockout no locus de Wx.
[0136] Os métodos não são descritos no presente documento limitados, de qualquer modo, ao processo pelo qual um cromossomo supranumerário que contém um GEC é derivado. Uma ampla gama de opções possíveis para criar cromossomos supernumerários que compreendem sequências desejadas foram descritos. Por exemplo, antecipa-se que se pode cruzar uma primeira planta ascendente que contém um cromossomo B com uma segunda planta ascendente que codifica uma recombinase e/ou uma nuclease ligada de modo operativo a um promotor que é capaz de incorporar uma sequência específica no genoma A no cromossomo B na progênie. Outros exemplos incluem irradiar o pólen que contém um cromossomo B para gerar uma ou mais quebras espontâneas (por exemplo, aleatórias) no cromossomo B e/ou cromossomos A, que podem, na mesma frequência, se recombinar para formar um novo cromossomo B que contém um GEC e uma sequência de DNA de modelo desejado. Ainda outros exemplos incluem usar um
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65/81 mecanismo de translocação B-A, por exemplo, um GEC posicionado no braço curto do cromossomo 9 do genoma A que é capaz de translocar uma sequência de DNA do genoma A para o cromossomo B. Um versado na técnica observará imediatamente que estes e outros métodos para criar cromossomos supernumerários (por exemplo, B) com sequências desejadas podem ser usados em combinação com esta invenção.
EXEMPLO 3. INDUÇÃO DE HAPLOIDES ACOPLADA COM DISTRIBUIÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS EXÓGENOS PARA UMA LINHAGEM DE RECEPTOR [0137] As características transgênicas podem ser distribuídas para uma planta de interesse por meio do uso de um cruzamento por indução de haploides. Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica transgene de interesse (“transgene doador”) e uma enzima específica a sítio são introduzidas em uma planta HI de milho por meio de melhoramento padrão ou técnicas de transformação de planta. A enzima específica a sítio é ligada de modo operativo a um promotor capaz de expressar o GEC em uma célula de pólen, em uma célula-óvulo e/ou um zigoto antes, durante ou depois da fertilização.
[0138] A planta HI de milho que compreende o transgene doador e GEC é cruzada como um macho a uma segunda planta de milho, e o GEC é transientemente expresso pouco antes, durante ou depois da fertilização. O GEC transloca o transgene doador do genoma da planta HI de milho para um local alvejado dentro de um genoma materno da célula-óvulo antes de o genoma nuclear paterno se perder.
[0139] A semente haploide induzida compreendendo é identificada conforme descrito no Exemplo 1. O receptor do transgene doador na semente haploide induzida é confirmado por meio de PCR, ELISA, ou outros métodos moleculares conhecidos por aqueles versados na téc
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66/81 nica. Seguindo a confirmação de integração de transgene doador e indução de haploides, a semente haploide pode ser submetida ao dobramento de cromossomo usando qualquer método conhecido na técnica, se desejado.
EXEMPLO 4. MODIFICAÇÃO DE UM GENOMA DA PLANTA USANDO UM GENOMA DE CLOROPLASTO COMO UM CROMOSSOMO DE CARREADOR DE GEC.
[0140] Um genoma de cloroplasto de milho é transformado para compreender um gRNA de alvejamento de Wx e Cas 9 ligado de modo operativo a um promotor capaz de expressar o GEC em uma célulaóvulo, e/ou um zigoto antes, durante ou depois da fertilização de acordo com técnicas de biologia molecular padrão. Um peptídeo de transferência pode ser ligado de modo operativo ao Cas9 para permitir que o mesmo seja transferido do cloroplasto para o núcleo. Um exemplo de tal peptídeo é uma porção da proteína whirly (Isemer R, Mulisch M, Schafer SK, Koop HU, Krupinska K. (2012) Cartas FEBS 58:85-55). As plantas de milho que compreendem cloroplastos corretamente transformados são identificadas usando técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, análise de sequência, PCR) ou triagem fenotípica. As plantas de milho que compreendem genomas de cloroplasto transformado são melhoradas para um antecedente de gametófito intermediário1 (ig 1) cruzando-se a linhagem de milho que compreende um genoma de cloroplasto transformado como uma fêmea e uma planta de milho ig 1 como um macho, seguido por autopolinização ou retrocruzamentos adicionais com as plantas Ig1 (usando ig1 como o ascendente macho) a fim de obter uma planta que é homozigota para ig1 que também compreende o cloroplasto transformado. Os homozigotos de plantas de milho para a mutação de Ig1 são capazes de gerar haploides paternos após fertilização eliminando-se o genoma nuclear materno.
[0141] Uma planta ig1 que compreende o genoma de cloroplasto
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67/81 transformado com um gRNA de alvejamento de Wx e GEC de Cas 9 é cruzada como uma fêmea com uma planta de milho de uma linhagem de receptor, por exemplo, B73. O genoma nuclear materno é perdido após fertilização produzindo, então, a progênie haploide que compreende o genoma B73 nuclear e o genoma de cloroplasto transformado. O gRNA e de alvejamento de Wx Cas 9 são expressos a partir do genoma de cloroplasto após fertilização e ao longo do desenvolvimento da planta haploide ou diploide subsequente, o que resulta em modificação do genoma B73 nuclear. A progênie haploide resultante que carrega a modificação desejada em seu genoma B73 derivado de ascendente pode ser identificada conforme descrito no Exemplo 1 e em qualquer lugar no presente documento e na técnica.
[0142] Em determinadas modalidades, o gRNA e de alvejamento de Wx e componentes de Cas9 podem ser “melhorados” a partir da progênie cruzando-se os mesmos com uma planta que compreende uma segunda mutação de ig1, mas que carece das sequências de gRNA e/ou Cas9 e recuperar os descendentes que contêm a modificação de Wx, mas não as sequências de gRNA e/ou Cas9. Alternativamente, o gRNA de alvejamento de Wx e componentes de Cas9 podem ser “melhorados” da progênie de B73 que compreende a modificação de Wx cruzando-se os mesmos como machos com B73 ou outras linhagens e recuperandose os descendentes que contêm a modificação de Wx. Devido ao fato de que o cloroplasto não é eficientemente transferido por meio de pólen, o descendente que carece das sequências de gRNA e/ou Cas9 é recuperado.
EXEMPLO 5. GENES NATIVOS COMO MODELOS PARA DIRECIONAR O REPARO DE DNA [0143] Variantes de gene nativo (alelos) podem ser usados para guiar a modificação do gene correspondente em uma linhagem dese
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68/81 jada. A alelo nativo é cortado de um genoma nuclear usando uma nuclease e, então, o DNA cortado é reparado por meio de recombinação homóloga usando o alelo nativo de uma linhagem HI como modelo de reparo.
[0144] TALENs são projetadas para cortar o alelo de testa glabral transparente (ttg1 -1) da Arabidopsis thaliana, com um TALEN projetado para se ligar no sítio da mutação presente no alelo ttg1-1. Tal projeto permite que a TALEN se ligue e corte o alelo ttg1-1, mas não o alelo TTG1 do tipo selvagem funcional. A expressão de TTG1 fornece pigmentação para as sementes de Arabidopsis.
[0145] Um construto de transformação é gerado em que as sequências de ácidos nucleicos que codificam o par de TALENs são ligadas de modo operativo a uma versão modificada do promotor específico a ovo/zigoto EC1,2en__EC1.1p. O construto de transformação compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína fluorescente (GFP) e um marcador selecionável para fornecer uma tolerância a herbicida. O construto de transformação é transformado em um heterozigoto de planta de Arabidopsis para um alelo nulo para o gene CENH3 (que codifica a proteína de histona específica a centômero CENH3), homozigoto para o transgene GFP-tailswapCenH3 (consulte Ravi e Chan. 2010. Nature. 464:615-619), e homozigoto para o alelo TTG1 do tipo selvagem.
[0146] A progênie resultante é triada usando um herbicida; transfermantes que compreendem o construto de transformação são resistentes ao herbicida. Os transformantes tolerantes ao herbicida são, então, genotipados para identificar eventos que são heterozigotos para o alelo nulo CENH3. As plantas que compreendem o construto de transformação e que são heterozigotos para o alelo nulo CENH3 são autopolinizados.
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69/81 [0147] A progênie resultante é selecionada para indivíduos de indução de haploides que são homozigotos para o alelo nulo CENH3 e homozigoto para o construto de transformação. Indivíduos selecionados são cultivados e cruzados como linhagens mutantes ttg1 -1 de fêmeas e machos. A semente resultante é triada para indivíduos que carecem de expressão de GFP, mas têm pigmentação de TTG1 do tipo selvagem na semente. Tais plantas são cultivadas e examinadas usando técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, análise de sequência, POR, DART) para confirmar que o alelo ttg 1-1 foi convertido no alelo TTG1 do tipo selvagem.
EXEMPLO 6. EXTENSÃO DO PERÍODO DE TEMPO DURANTE O QUAL OS ELEMENTOS DE EDIÇÃO DE GENOMA PODEM FUNCIONA PARA CRIAR EDIÇÕES EM UM GENOMA-ALVO.
[0148] Prevê-se que qualquer método na técnica conhecido para alterar o crescimento celular, divisão celular e/ou desenvolvimento celular em uma planta poderia ser usado em combinação com os métodos divulgados no presente documento. Em determinadas modalidades, um usuário pode usar qualquer método conhecido para retardar, atrasar e/ou parar a divisão celular em uma planta para prolongar o período de tempo durante o qual uma molécula de carreador que contém um GEC permanece próximo o bastante de um genoma-alvo, em que os produtos do GEC podem completar uma edição desejada. Estes métodos incluem o uso de vários PGRs (por exemplo, citocininas) e outros tratamentos químicos, assim como a alteração de outros aspectos de um ambiente de crescimento de planta. Por exemplo, reduzindo-se a temperatura sob a qual um embrião é cultivado, pode-se reduzir a taxa de divisão celular. Deste modo, antecipa-se que se pode usar uma linhagem indutora de haploide de mais transformada para compreender um GEC que compreende uma mutação knockout de Wx ligada de modo operativo a um promotor (por exemplo, Ubi-1) em seu genoma, por exemplo, conforme
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70/81 descrito no Exemplo 1, para polinizar uma planta que contém um genoma em que um usuário deseja criar uma edição, por exemplo, B73. Seguindo a polinização pelo indutor, o embrião e/ou zigoto haploide é cultivado em uma temperatura reduzida reduzindo, deste modo, a probabilidade de que o genoma do indutor e o GEC que o mesmo contém sejam perdidos antes de o GEC ser capaz de criar a edição desejada. [0149] Estes métodos não se limitam aos tipos específicos de sequências reguladoras e qualquer sequência de nucleotídeos conhecida para regular a expressão de genoma da planta poderia ser usada em combinação com estes métodos, incluindo qualquer regulação póstranscrição ou pós-tradução e/ou sequência de silenciamento e/ou mecanismo conhecido na técnica. Um aspecto deste método é que a regulação codificada por estes tipos de sequências não criaria, necessariamente, uma alteração genética no genoma-alvo, permitindo a recuperar de descendentes que contêm genomas substancialmente idênticos a um ascendente, com exceção da edição codificada pelo GEC, sem retrocruzamento sucessivo.
[0150] Em determinadas modalidades, as plantas que carregam sequências transgênicas que permitem a divisão celular podem ser usadas, por exemplo, uma planta transgênica que carrega uma mutação no gene CDKA;1 (Morgan DO (1997) Annu Reverso Cell Dev Biol 13:261291; E Wijnker, A Schnittger (2013) Plant Reprod 26:143-158) poderia ser usada. Esta mutação poderia ser codificada por uma planta fêmea ou por uma planta macho usada em um cruzamento, por exemplo, em um cruzamento de indução de haploides materno. Este controle transgênico pode ser codificado pelas células do ascendente fêmea perto das células progenitoras, e/ou codificado pelo pólen do ascendente macho e/ou pelo zigoto e/ou embrião progenitor. Este controle transgênico pode retardar, atrasar ou parar a divisão celular na planta progenitora estendendo, deste modo, a janela durante a qual o genoma do indutor
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71/81 que carrega um GEC permanece próxima o bastante do genoma-alvo para os produtos de GEC expressos para criar uma edição desejada.
[0151] Em determinadas modalidades, um cromossomo de carreador é criado, o qual contém sequências além de e/ou adicionalmente a, sequências de GEC, e este cromossomo de carreador é usado para não apenas criar edições em um genoma-alvo, como também regular a expressão de determinados genes em um genoma-alvo.
[0152] Por exemplo, uma linhagem indutora de haploide de mais pode ser transformada para compreender um GEC que compreende uma mutação knockout de Wx ligada de modo operativo a um promotor (por exemplo, Ubi-1} em seu genoma, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 1. Este indutor também é transformado para conter sequências de DNA que podem retardar/romper a divisão celular e/ou o ciclo celular de um zigoto de planta e/ou célula embrionária, por exemplo, uma sequência de quinase dependente de ciclina tal como CDKA;1. Um usuário pode, então, usar este indutor de haploide transformado como um ascendente macho em um cruzamento com um ascendente fêmea que contém um genoma que o usuário deseja editar, por exemplo, B73. Após o pólen do ascendente de indutor de haploide macho entrar em contato com o ascendente fêmea, haverá um período de tempo durante o qual as sequências de regulação de ciclo celular herdadas do ascendente indutor existirão em proximidade com o genoma herdado do ascendente fêmea (por exemplo, perto do tempo de singamia) e, então, pouco antes e/ou durante e/ou depois da fertilização do ovo, tanto os genes do GEC quanto os genes do ciclo celular serão expressos a partir do genoma herdado do indutor e os produtos serão subsequentemente capazes de modificar a expressão do genoma próximo que foi herdado do ascendente fêmea, por exemplo, criando-se uma mutação knockout no gene Wx de um genoma B73 que compreende uma mutação de CDKA:1.
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72/81 [0153] Uma vantagem deste exemplo é que o ciclo celular do zigoto e/ou embrião pode ser desacelerado, atrasando a eliminação do genoma do indutor e do GEC que o mesmo contém estendendo, desse modo, a janela durante a qual o GEC no cromossomo de carreador permanece em proximidade com o genoma-alvo. Em determinados exemplos, a divisão celular no zigoto progenitor pode ser arrastada por muitas horas ou até mesmo dia, fornecendo um tempo mais longo para os componentes de edição de GEC para realizar sua função de criar uma edição desejada.
[0154] Claramente, estes métodos não se limitam a sequências específicas codificadas em um cromossomo de carreador ou a determinados mecanismos de regulação. Embora este exemplo realce a utilidade do uso de determinados elementos que atrasam, por fim, a eliminação de sequências de GEC em células, os métodos na técnica descrevem como um indivíduo de habilidade comum pode transformar o genoma de uma planta indutora com qualquer maneira de sequências de DNA. Qualquer gene conhecido por afetar o crescimento, desenvolvimento ou desempenho de uma planta podería ser transformado em uma planta indutora, seja estavelmente integrada no genoma nuclear da planta indutora, estavelmente integrada em um cromossomo supranumerário e/ou transientemente integrada nas células da planta indutora.
[0155] Além disto, estes aspectos não se limitam ao tipo de cromossomo de carreador que contém as sequências de DNA capazes de trans-regular a expressão em um genoma-alvo. Qualquer molécula que contém um GEC podería conter também um elemento regulador projetado para funcionar no zigoto e/ou embrião e/ou muda de uma planta que poderia ser usada em combinação com esta invenção. No entanto, as sequências de DNA reguladoras que não necessitam estar no mesmo cromossomo de carreador, conforme é previsto que uma célula
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73/81 vegetal que contém um GEC em uma molécula de carreador (por exemplo, um genoma A nuclear do indutor de haploide) e que contém elementos reguladores adicionais em uma molécula de carreador diferente (por exemplo, um cromossomo B), ou vice-versa, poderíam ser usadas para obter objetivos semelhantes sem ficar fora do escopo dos métodos descritos no presente documento.
[0156] Além disto, os elementos reguladores precisam ser fornecidos pelo mesmo ascendente que o GEC. Em determinados exemplos, uma planta que contém o genoma que o usuário deseja editar é transformada para conter os elementos reguladores. Por exemplo, a planta B73 pode ser transformada com uma sequência de quinase dependente de ciclina, tal como CDKA;1 ligada de modo operativo a um promotor específico de zigoto ou embrião, por exemplo, um promotor específico de embrião da região reguladora 5’ de um gene emb5, conforme descrito na Patente US n° 7.078. 234, intitulada “Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof’, concedida em 18 de julho de 2006, e Pedido de Patente correspondente US 10/732.721, depositada em 10 de dezembro de 2003, e publicada como Pedido de Patente US n° US20040163144 sob o mesmo título. Esta planta pode, então, ser polinizada por uma linhagem indutora de haploide transformada com um GEC, por exemplo, um que compreende uma mutação knockout de l/Vx ligada de modo operativo a um promotor (por exemplo, Ubi-1} em seu genoma, conforme descrito no Exemplo 1. Haverá um período de tempo após o pólen do ascendente de indutor de haploide macho entrar em contato com o ascendente fêmea durante o qual as sequências de GEC herdadas do ascendente indutor serão expressas em proximidade com o genoma herdado do ascendente fêmea em ou quase ao mesmo tempo que o CDKA-1 é expresso a partir do genoma herdado do ascendente fêmea. Então, o gene de ciclo celular no genoma herdado do ascendente fêmea funcionará para retardar ou parar
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74/81 a divisão celular no zigoto e/ou embrião atrasando, deste modo, também os mecanismos de eliminação de cromossomo que podem fazer com que, de outro modo, o cromossomo de carreador que contém o GEC seja perdido antes de os componentes GEC tenham tido tempo suficiente para completar a edição desejada no genoma B73.
[0157] Em determinadas modalidades, o processo de edição de genoma ocorre enquanto a progênie do cruzamento por indução está na fase de zigoto de seu ciclo de vida. Em determinadas modalidades, o processo de edição de genoma requer um período de tempo mais longo, que abrange, potencialmente, diversas rodadas de divisões mióticas nos tecidos da planta progenitora.
EXEMPLO 7. EDIÇÃO DE GENOMA BEM-SUCEDIDA POR MEIO DE INDUÇÃO DE HAPLOIDES [0158] O calo embhogênico foi produzido a partir de explantas derivadas de muda da linhagem indutora de haploide de caruru com alto teor de óleo proprietário e usadas para transformação mediada por Agrobacterium essencialmente conforme descrito por Sidorov et al. (2006). Brevemente, 125 sementes maduras foram esterilizadas na superfície por 20 minutos em uma solução Clorox® a 50% contendo algumas gotas de Tween®20 como um tensoativo. O recipiente foi infiltrado a vácuo brevemente diversas vezes durante o tratamento com Clorox® para ajudar a remover o ar aprisionado da semente. Após 5 enxágues em água estéril, a semente foi colocada em placas em meio MS3 ou MSVS34 (Sidorov et al., 2006) em placa de Petri de 6 sementes por 100x25 mm, colocada em caixas térmicas plásticas transparentes, e incubadas a 28 °C, com uma intensidade de luz de 100 pmol m~2s“1 fornecida pelas lâmpadas fluorescentes brancas frias, e um fotoperíodo de 16:8.
[0159] Após 7 dias no meio de germinação, as seções nodais foram preparadas e colocadas em placas com a superfície cortada para baixo
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75/81 no meio MSW57 ou CM4C (Sidorov et al., 2006). Estas placas foram retornadas para as caixas térmicas plásticas transparentes e incubadas a 28°C, 100 pmol m’2s’1, fotoperíodo de 16:8 em relação à germinação. 25 dias depois, as culturas foram examinadas sob um microscópio de dissecação e quaisquer regiões que mostram sinais de desenvolvimento de calo embriogênico foram subcultivadas no meio fresco da mesma composição e, então, retornadas para as caixas térmicas e incubadas no escuro a 28°C. Quatro subculturas adicionais foram realizadas em intervalos de 2 semanas, selecionando calos embriogênicos de alta qualidade, para proliferar uma grande quantidade para transformação. O calo embriogênico foi usado para transformação 7 dias após a subcultura final.
[0160] A cepa de Agrobacterium ABI derivada de C58 (Koncz e Schell, 1986) que abrange o vetor binário Construto-630 foi usado para transformação. O Construto-630 contém um gene de neomicina fosfotransferase II (nptll; Bevan et al., 1983) acionado pelo promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (Odell et al., 1985) como um marcador selecionável por planta, e o gene de Cre recombinase (Zhang et al., 2003) acionado pelo promotor de actina do arroz (McElroy et al., 1990). A cepa de Agrobacterium ABI::Construto-630 foi cultivada em meio LB (Sambrook et al., 1989), induzida em meio mínimo AB modificado (Zhang et al., 2003) com acetosiringona 200 μΜ, e ressuspenso em meio de inoculação (Sidorov et al., 2006, mas para um ODeeofinal de 0,5 ao invés de 1,0). Imediatamente antes do uso, 1 pl de uma solução ácida de Pluronic® a 10% foi adicionado por 1 ml de Agrobacterium.
[0161] 2,77 gramas de calo embriogênico foram colocados em um tubo de centrifugação de 50 ml, seguido pela adição de 12 ml de inóculo de Agrobacterium. O tubo foi invertido diversas vezes para misturar completamente e, então, centrifugado a 1270 rpm por 30 min. A solução de Agrobacterium foi derramada e o tecido foi despejado nos papéis
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76/81 filtro estéreis e apagados para remover o Agrobacterium em excesso. O tecido foi, então, colocado em dois papéis filtro Whatman#1 estéreis em uma placa de petri de 100x25 mm, vedado com parafilme, e incubado a 23°C no escuro. Seguindo um período de cocultura de 4 dias durante o qual o tecido se torna parcialmente dessecado (Cheng et al., 2003), o tecido foi dividido em pedaços menores de 2 a 3 mm de diâmetro seguindo pontos de quebra naturais, e transferidos para o meio de seleção. Com este propósito, o tecido foi dividido uniformemente através de quatro filtros Whatman#1 estéreis de 9 cm de diâmetro individuais, que foram, cada um, colocados no topo dos dois quadrados estéreis de 2 cm x 2 cm de feltro branco acrílico saturado com meio de seleção líquido (MSW57 por Sidorov et al, 2006, mas com 500 mg de L“1 carbenicilina para controlar o crescimento de Agrobacterium e 100 mg de L~1 paromomicina para seleção de planta). As placas foram incubadas (não vedadas) em caixas térmicas plásticas no escuro a 28°C. Duas semanas depois, o meio foi aspirado dos feltros usando uma pipeta, e 15 ml de meio de seleção líquido fresco foram adicionados. O meio de seleção fresco foi novamente adicionado uma semana depois para manter os feltros saturados, mas sem líquido em excesso se acumulando no tecido. Nove dias depois, o tecido foi movido para o meio de regeneração conforme descrito em Sidorov et al. 2006 (MS = Murashige e Skoog, 1962, basal mais 3,5 mg de L·1 6-benzilaminopurina mais 250 mg L1 carbenicilina). Seis dias depois, o tecido foi movido para o meio MS livre de hormônio com 250 mg de L~1 carbenicilina e 100 mg de L·1 paromomicina. Pequenos brotos que se desenvolvem neste meio foram transferidos para o meio MS livre de hormônio fresco em Phytatrays™ para crescimento do broto continuado e desenvolvimento de raiz. Os brotos enraizados foram movidos para os plugues de propagação (International Horticultural Technologies, Hollister CA, EUA) e transferidos para uma câmara de crescimento.
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77/81 [0162] Um total de sete plantas foi recuperado. Todos originados do mesmo setor de calor resistente a paromomicina e foram presumidos como clones. Destas 7 plantas, 4 sobreviveram à transferência para plugues de propagação. As amostras de folha foram tiradas para extração de DNA, e analisadas para o número de cópias dos genes Cre e nptll, e a região de sequência mais ampla esquerda do T-DNA, por Taqman em tempo real. Todas as quatro plantas continham 1 a 2 cópias de cada região testada. A presença ou ausência da sequência de OriV na estrutura principal do vetor foi testada por meio de PCR, e todas as quatro plantas careceram desta sequência. Três das quatro plantas foram autopolinizadas com sucesso e foram, também, cruzadas para teste como machos com homozigotos de plantas fêmeas para um inserto transgênico de única cópia do Construto-133. O Construto-133 contém um gene GFP (Pang etal., 1996) controlado pelo promotor 35S (Kayetal., 1987) e região de poliadenilação de napolina sintase (nos) (Fraley et al., 1983). O mesmo também contém um intron hsp70 de mais na região não traduzida 5’ (Brown e Santino, 1995). Um gene nptH flanqueado pelos sítios ioxP é inserido na sequência de íntron hsp70. Na ausência de proteína Cre, o gene nptH permanece estavelmente inserido e serve como um marcador selecionável de planta. Há um sinal de terminador de transcrição como parte do cassete de nptll, que previne a transcrição de GFP. Mediante a exposição à proteína ativa Cre, os sítios de loxP se recombinam e a sequência de codificação de nptll e o terminador são cortados, permitindo a transcrição de GFP.
[0163] Um total de 284 sementes de progênie de cruzamento de teste foram geradas e plantadas, e 47 não germinaram. 29 marcadores polimórficos que se dispersaram através do genoma do mais e são informativos entre o genoma do indutor e as linhagens de teste foram selecionados para confirmar a ploidia por meio de ensaio PCR TaqMan de ponto final (Tabela 1). As sementes haploides eram homozigotas e as
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78/81 sementes diploides eram heterozigotas para estes marcadores polimórficos. Das 237 progênies de cruzamento de teste que germinaram e produziram plantas, 233 progênies de cruzamento de teste são diploides. Dentre as 233 diploides, havia correlação perfeita entre a presença de Cre e a expressão de GFP. 4 das 237 progênies de cruzamento de teste foram confirmados como haploides e ausentes de genoma do indutor. [0164] Na Tabela 1, “IcM” se refere às unidades de mapa do Mapa Genético de IBM2 2008 Neighbors, que foi gerado com uma população consanguínea recombinante interacasalada (syn 4) que resultou em aproximadamente um aumento de quatro vezes no número de meiosies em comparação com o típico experimento de recombinação que é usado para gerar distâncias cM (Lee et al., 2002, Plant Mol Biol 48:453 e o Maize Genetics and Genomics Database). “cM” se refere à definição clássica de um centimorgan em que um cM é igual a uma chance de 1 % de que uma característica em um locus genético será separada de uma característica em um outro locus devido ao cruzamento em uma única geração (o que significa que as características se cossegregram 99% do tempo durante meiose), e esta definição é usada no presente documento para delinear os locais no mapa que pertencem a esta invenção. TABELA 1. INICIADORES E SONDAS DE 29 MARCADORES POLl· MÓRFICOS PARA DETECÇÃO DE PLOIDIA CM = CENTIMORGANS, ICM = UNIDADES DE MAPA DO MAPA GENÉTICO IBM2 2008 NEIGHBORS.
SEQ ID NO.
SEQ ID NO. Cromos- somo Mapa ΜΟΝ v5.2 (cM) Mapa IBM2008 (IcM) Posição SNP Polimor- fismo Inicia- dor Di- reto Inicia- dor Re- veiso Sonda 1 Sonda 2
1 1 7,5 20,2 399 [A/C] 30 59 88 117
2 1 64,1 184,3 96 [A/Tj 31 60 89 118
3 1 121,2 458,2 132 [C/Gl 32 61 90 119
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4 1 197,7 780,9 I 93 [C/T] 33 62 91 120
5 2 27 57,6 I 501 [A/C] 34 63 92 121
6 2 140,5 468 I 477 [C/T] 35 64 93 122
7 2 206,8 693,1 I 278 [G/T] 36 65 94 123
8 3 92,2 315,8 I 59 [G/T] 37 66 95 124
9 3 206,6 792,3 ! 248 [A/G] 38 67 96 125
10 4 64,9 154,8 ! 124 [C/G] 39 68 97 126
11 4 89,3 279,9 ! 432 [A/C] 40 69 98 127
12 4 163 573,9 ! 234 [A/G] 41 70 99 128
13 4 185,7 656,5 ! 81 [C/T] 42 71 100 129
14 5 42,2 163,6 ! 299 [A/G] 43 72 101 130
15 5 66 222,5 I 247 [A/G] 44 73 102 131
16 5 109,3 376,5 I 571 [A/G] 45 74 103 132
17 6 34,5 189,7 I 286 [C/G] 46 75 104 133
18 6 68,3 318,7 I 209 [C/G] 47 76 105 134
19 6 136,7 544,4 I 187 [A/T] 48 77 106 135
20 7 66,4 209,6 I 133 [A/C] 49 78 107 136
21 7 132,2 469,1 I 92 [G/T] 50 79 108 137
22 7 146,4 513,1 I 488 [A/C] 51 80 109 138
23 8 102,5 361,9 I 287 [A/G] 52 81 110 139
24 8 144,9 478,5 I 470 [A/G] 53 82 111 140
25 9 62,7 195,7 I 305 [A/G] 54 83 112 141
26 9 74,7 263,6 I 309 [C/T] 55 84 113 142
27 9 144,9 581,4 ! 166 [C/G] 56 85 114 143
28 10 114 472,4 ! 223 [A/T] 57 86 115 144
29 10 134,3 525,1 I 256 [A/G] 58 87 116 145
[0165] A análise molecular adicional foi projetada para amplificar um segmento de DNA através da junção de excisão para confirmar que NPTII foi cortado. O DNA das raízes e/ou tecido foi extraído usando o Kit DNeasy Plant Min (Qiagen) e quantificado usando o Kit de Ensaio Picogreen dsDNA (Thermo Fisher) seguindo as instruções do fabri
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80/81 cante. Dois conjuntos de iniciador de POR foram projetados internamente para amplificar um fragmento de 551 bp e 801 bp em tecido cortado (Tabela 2). Ao contrário, se a excisão não ocorresse, os fragmentos esperados seriam 1758 bp e 2108 bp. Aproximadamente 1 a 10 ng de DNA modelo foi adicionado a uma reação de 50 ul mistura DreamTaq Green (Thermo Fisher). As condições de ciclagem eram 95C por 2 min, e 30 ciclos de 95C (30 s), 57C (30 s) e 72C (2 min), seguido por uma extensão final a 72C por 7 min. A água destilada estéril foi usada como um controle negativo. Os produtos de PCR foram analisados em uma eletroforese de gel de agarose a 1% manchados com GelGreen (Biotium). O marcador de DNA Hi-lo (Bionexus) foi usado como uma referência. Todas as reações foram realizadas usando o termociclo GeneAmp 9700 (Applied Biosystems /Thermo Fisher). Das 4 plantas haploides, o tecido de raiz de 1 planta haploide foi confirmado com expressão de GFP e excisão de cassete NPTII. Iniciadores e sondas também foram projetados para detectar a presença ou ausência de Cre pelo ensaio de PCR TaqMan de ponto final (Tabela 3). A mesma planta haploide foi confirmada como ausente de Cre. Em suma, o experimento demonstrou edição de genoma bem-sucedida (excisão de NPTII), e a eliminação de GEC (Cre) e genoma do indutor na progênie haploide.
TABELA 2. ÍNHCIADORES PARA DETECÇÃO DE CASSETE NPTU
Iniciador Direto: 5’-CCC GTT CAC ATC ACC ATC CA-3’
Iniciador Reverso: 5!-GAA CCT ACA GAG CAA TAG GAG AAA-3’
TABELA 3. INICIADORES E SONDAS PARA DETECÇÃO DE CRE
Iniciador Direto: 5’-CAAGTGACAGCAATGCTGTTTCA-3,
Iniciador Reverso: 5’-GTCGAAATCAGTGCGTTCGAA-3’
Sonda: 5’-CGGTGAACGTGCAAAA-3!
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81/81 [0166] O mesmo experimento foi repetido com progênies R1 homozigotas para aumentar o tamanho de amostra e para prolongar o experimento inicial para demonstrar a edição de genoma no tecido de linhagem de germinação. Neste experimento, 5 de 396 plantas haploides foram observadas com expressão de GFP na raiz e na folha. Dentre estas 5 plantas haploides, 2 plantas também foram observadas com expressão de GFP no broto (tecido de linhagem de germinação). Análise adicional citológica e molecular está em progresso para confirmar que a região-alvo é editada, e o GEC e genoma do indutor são eliminados.

Claims (114)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para modificar um genoma da planta, caracterizado pelo fato de que compreende:
    fornecer uma primeira planta que compreende pelo menos um Componente de Edição de Genoma (GEC);
    cruzar a primeira planta com uma segunda planta, sendo que o pelo menos um GEC modifica um genoma da segunda planta, gerando, assim, um genoma modificado da segunda planta; e recuperar uma terceira planta resultante do cruzamento da primeira e da segunda plantas, sendo que a terceira planta compreende o genoma modificado da segunda planta e sendo que a terceira planta carece substancialmente do GEC.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira planta é um indutor de haploidia.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a primeira planta é um indutor de haploidia materno de mais.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a terceira planta carece substancialmente do genoma da primeira planta.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta é selecionado dentre o grupo que consiste em um genoma nuclear, um genoma mitocondrial e um genoma plastidial.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente:
    dobrar o genoma nuclear da terceira planta ou zigoto, gerando, assim, uma terceira planta que compreende um genoma nuclear dobrado.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado
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    2/17 pelo fato de que a dobramento do genoma nuclear resulta do uso de um agente de dobramento de cromossomos selecionado dentre o grupo que consiste em gás de óxido nitroso, colchicina, orizalina, amiprofosmetila, trifluralina, cafeína e pronamida.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente:
    gerar uma planta progenitora ou semente a partir da terceira planta ou zigoto que compreende um genoma nuclear dobrado, sendo que um genoma da planta progenitora ou semente compreende o genoma modificado da segunda planta.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende pelo menos uma modificação selecionada dentre o grupo que consiste em uma inserção, uma substituição, uma deleção, uma duplicação, uma inversão e uma translocação de um ou mais nucleotídeos.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um promotor selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível e um promotor específico de tecido.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o promotor específico de tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor específico de embrião, um promotor específico de gameta e um promotor precoce específico de zigoto.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um genoma da primeira planta compreende pelo menos um gene auxiliar.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene auxiliar é selecionado dentre o grupo que consiste em um cassete de exonuclease, um DN
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    3/17
    Ku70 e um cassete de RNAi contra pelo menos um componente de NHEJ.
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos uma recombinase ou pelo menos uma endonuclease.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma endonuclease é selecionada dentre o grupo que consiste em uma nuclease associada a CRISPR, uma nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição (TALEN), uma proteína semelhante a TALE, uma nuclease de dedo de zinco e uma meganuclease.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma recombinase é selecionada dentre o grupo que consiste em uma tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA e uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA é selecionada dentre o grupo que consiste em uma Cre recombinase, uma Gin recombinase, uma FLP recombinase e umaTnpl recombinase.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA é selecionada dentre o grupo que consiste em uma Bxb1 integrase, uma phiC31 integrase, uma R4 integrase e uma TP-901 integrase.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um modelo de polinucleotídeo doador.
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
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    4/17 pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um replicon viral.
  21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um replicon viral é um replicon de geminivírus ou um replicon de nanovírus.
  22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende pelo menos um segmento genômico de interesse que é translocado de um genoma da primeira planta para o genoma da segunda planta.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico de interesse compreende pelo menos um transgene de interesse.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um transgene de interesse confere uma característica selecionada dentre o grupo que consiste em crescimento melhorado, rendimento melhorado, tolerância à seca, tolerância à salinidade, tolerância a herbicida, resistência a inseto, resistência à praga, resistência à doença e utilização de nitrogênio melhorado.
  25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que um genoma da terceira planta ou zigoto compreende o pelo menos um transgene de interesse.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico de interesse compreende pelo menos um megalocus.
  27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico de interesse é selecionado dentre um segmento de genoma nuclear de interesse, um segmento de genoma plastidial de interesse e um segmento de genoma mitocondrial de interesse.
  28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
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    5/17 pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende pelo menos uma redisposição genômica.
  29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma redisposição genômica é selecionada dentre o grupo que consiste em uma translocação recíproca e em uma translocação não recíproca.
  30. 30. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende um segundo alelo nativo que é modificado com o uso de um primeiro alelo nativo de um genoma na primeira planta como um modelo para modificar o segundo alelo nativo de um genoma na segunda planta.
  31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a primeira planta é selecionada dentre o grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de soja, uma planta de canola, uma planta de algodão, uma planta de arroz, uma planta de cana-de-açúcar, uma planta de batata, uma planta de trigo e uma planta de alfafa, e sendo que a segunda planta é selecionada dentre o grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de soja, uma planta de canola, uma planta de algodão, uma planta de arroz, uma planta de cana-de-açúcar, uma planta de batata, uma planta de trigo e uma planta de alfafa.
  32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a primeira planta e a segunda planta são da mesma espécie.
  33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a primeira planta e a segunda planta são de espécies diferentes.
  34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a primeira planta é uma planta de milho selecionada dentre o grupo que consiste em uma planta de milho ig1 e uma
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    6/17 planta de milho derivada de Stock 6.
  35. 35. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a primeira planta é uma planta de algodão de semigamia.
  36. 36. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a terceira planta carece substancialmente do GEC enquanto a terceira planta está no estágio de vida de zigoto, embrião, muda, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 ou V12.
  37. 37. Método para modificar um genoma da planta, caracterizado pelo fato de que compreende:
    fornecer uma primeira planta que compreende pelo menos um cromossomo supranumerário, sendo que o pelo menos um cromossomo supranumerário compreende pelo menos um Componente de Edição de Gene (GEC);
    cruzar a primeira planta com uma segunda planta, sendo que o pelo menos um GEC modifica um genoma da segunda planta, gerando, assim, um genoma modificado da segunda planta; e recuperar uma terceira planta resultante do cruzamento da primeira planta e da segunda planta, sendo que a terceira planta compreende o genoma modificado da segunda planta, e sendo que a terceira planta carece substancialmente do genoma nuclear da primeira planta.
  38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o genoma da segunda planta é selecionado dentre o grupo que consiste em um genoma nuclear, um genoma plastidial e um genoma mitocondrial.
  39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a modificação do genoma da segunda planta é selecionada dentre o grupo que consiste em uma inserção, uma substi
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    7/17 tuição, uma deleção, uma duplicação, uma inversão ou uma translocação de um ou mais nucleotídeos.
  40. 40. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente:
    gerar progênie a partir da terceira planta, sendo que um genoma da progênie compreende o genoma modificado da segunda planta.
  41. 41. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a terceira planta compreende o pelo menos um cromossomo supranumerário.
  42. 42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente:
    segregar o pelo menos um cromossomo supranumerário do genoma modificado da segunda planta cruzando-se a terceira planta com si mesma ou com uma quarta planta.
  43. 43. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a terceira planta não compreende o pelo menos um cromossomo supranumerário.
  44. 44. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um cromossomo supranumerário é um cromossomo B.
  45. 45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o cromossomo B é selecionado dentre o grupo que consiste em um cromossomo B de milho e um cromossomo B de centeio.
  46. 46. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um cromossomo supranumerário é um cromossomo derivado artificialmente.
  47. 47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteri
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    8/17 zado pelo fato de que o cromossomo derivado artificialmente é um cromossomo truncado ou um cromossomo gerado de novo.
  48. 48. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um promotor selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível e um promotor específico de tecido.
  49. 49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o promotor específico de tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor específico de embrião, um promotor específico de gameta e um promotor precoce específico de zigoto.
  50. 50. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos uma recombinase ou pelo menos uma endonuclease.
  51. 51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma endonuclease é selecionada dentre o grupo que consiste em uma nuclease associada a CRISPR, uma TALEN, uma proteína semelhante a TALE, um dedo de zinco e uma meganuclease.
  52. 52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma recombinase é selecionada dentre o grupo que consiste em uma tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA e uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA.
  53. 53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA é selecionada dentre o grupo que consiste em uma Cre recombinase, uma Gin recombinase, uma FLP recombinase e umaTnpl recombinase.
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    9/17
  54. 54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA é selecionada dentre o grupo que consiste em uma Bxb1 integrase, uma phiC31 integrase, uma R4 integrase e uma TP-901 integrase.
  55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um modelo doador.
  56. 56. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um replicon viral.
  57. 57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o replicon viral é um replicon de geminivírus ou um replicon de nanovírus.
  58. 58. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende pelo menos um segmento genômico de interesse que é translocado de um genoma da primeira planta para o genoma da segunda planta.
  59. 59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico modificado de interesse compreende pelo menos um transgene de interesse.
  60. 60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um transgene confere uma característica selecionada dentre o grupo que consiste em crescimento melhorado, rendimento melhorado, tolerância à seca, tolerância à salinidade, tolerância a herbicida, resistência a inseto, resistência à praga, resistência à doença e utilização de nitrogênio melhorado.
  61. 61. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que um genoma da terceira planta compreende o pelo
    Petição 870190032426, de 04/04/2019, pág. 95/109
    10/17 menos um transgene de interesse.
  62. 62. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico de interesse compreende pelo menos um megalocus.
  63. 63. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico de interesse é selecionado dentre um segmento de genoma nuclear de interesse, um segmento de genoma plastidial de interesse e um segmento de genoma mitocondrial de interesse.
  64. 64. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende pelo menos uma redisposição genômica.
  65. 65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma redisposição genômica é selecionada dentre o grupo que consiste em uma translocação recíproca e em uma translocação não recíproca.
  66. 66. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende um segundo alelo nativo que é modificado com o uso de um primeiro alelo nativo de um genoma na primeira planta como um modelo para modificar o segundo alelo nativo de um genoma na segunda planta.
  67. 67. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a primeira planta e a segunda planta são da mesma espécie.
  68. 68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a primeira planta e a segunda planta são selecionadas dentre o grupo que consiste em plantas de milho, plantas de soja, plantas de canola, plantas de algodão, plantas de cana-de-açúcar, plantas de trigo e plantas de alfafa.
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    11/17
  69. 69. Método para modificar um genoma da planta, caracterizado pelo fato de que compreende:
    fornecer uma primeira planta que compreende pelo menos um GEC em uma molécula de DNA carreadora;
    cruzar a primeira planta com uma segunda planta, sendo que o genoma da segunda planta é suficientemente exposto a pelo menos um GEC transportado na molécula de DNA carreadora a ser modificada pelas proteínas codificadas pelo ao menos um GEC; e recuperar uma terceira planta ou zigoto resultante do cruzamento da primeira e da segunda plantas, sendo que a terceira planta compreende o genoma modificado da segunda planta e sendo que a terceira planta carece substancialmente do GEC da primeira planta.
  70. 70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a primeira planta é um indutor de haploidia.
  71. 71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira planta é um indutor de haploidia materno de mais.
  72. 72. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a terceira planta carece substancialmente do genoma da primeira planta.
  73. 73. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta é selecionado dentre o grupo que consiste em um genoma nuclear, um genoma mitocondrial e um genoma plastídial.
  74. 74. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente:
    dobrar o genoma nuclear da terceira planta ou zigoto, gerando, assim, uma terceira planta que compreende um genoma nuclear dobrado.
    Petição 870190032426, de 04/04/2019, pág. 97/109
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  75. 75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a dobramento do genoma nuclear resulta do uso de um agente de dobramento de cromossomos selecionado dentre o grupo que consiste em gás de óxido nitroso, colchicina, orizalina, ami~ profosmetila, trifluralina, cafeína e pronamida.
  76. 76. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o método compreende, ainda, gerar uma planta progenitora ou semente a partir da terceira planta ou zigoto que compreende um genoma nuclear dobrado, sendo que um genoma da planta progenitora ou semente compreende o genoma modificado da segunda planta.
  77. 77. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende pelo menos uma modificação selecionada dentre o grupo que consiste em uma inserção, uma substituição, uma deleção, uma duplicação, uma inversão e uma translocação de um ou mais nucleotídeos.
  78. 78. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um promotor selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível e um promotor específico de tecido.
  79. 79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o promotor específico de tecido é selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor específico de embrião, um promotor específico de gameta e um promotor precoce específico de zigoto.
  80. 80. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que um genoma da primeira planta compreende pelo menos um gene auxiliar.
  81. 81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene auxiliar é selecionado
    Petição 870190032426, de 04/04/2019, pág. 98/109
    13/17 dentre o grupo que consiste em um cassete de exonuclease, um DN Ku70 e um cassete de RNAi contra pelo menos um componente de NHEJ.
  82. 82. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos uma recombinase ou pelo menos uma endonuclease.
  83. 83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma endonuclease é selecionada dentre o grupo que consiste em uma nuclease associada a CRISPR, uma nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição (TALEN), uma proteína semelhante a TALE, uma nuclease de dedo de zinco e uma meganuclease.
  84. 84. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma recombinase é selecionada dentre o grupo que consiste em uma tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA e uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA.
  85. 85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a tirosina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA é selecionada dentre o grupo que consiste em uma Cre recombinase, uma Gin recombinase, uma FLP recombinase e umaTnpl recombinase.
  86. 86. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA é selecionada dentre o grupo que consiste em uma Bxb1 integrase, uma phiC31 integrase, uma R4 integrase e uma TP-901 integrase.
  87. 87. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um modelo de polinucleotídeo doador.
    Petição 870190032426, de 04/04/2019, pág. 99/109
    14/17
  88. 88. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um GEC compreende pelo menos um replicon viral.
  89. 89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um replicon viral é um replicon de geminivírus ou um replicon de nanovírus.
  90. 90. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende pelo menos um segmento genômico de interesse que é translocado de um genoma da primeira planta para o genoma da segunda planta.
  91. 91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico de interesse compreende pelo menos um transgene de interesse.
  92. 92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um transgene de interesse confere uma característica selecionada dentre o grupo que consiste em crescimento melhorado, rendimento melhorado, tolerância à seca, tolerância à salinidade, tolerância a herbicida, resistência a inseto, resistência à praga, resistência à doença e utilização de nitrogênio melhorado.
  93. 93. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que um genoma da terceira planta ou zigoto compreende o pelo menos um transgene de interesse.
  94. 94. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico de interesse compreende pelo menos um megalocus.
  95. 95. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segmento genômico de interesse é selecionado dentre um segmento de genoma nuclear de interesse, um segmento de genoma plastidial de interesse e um segmento
    Petição 870190032426, de 04/04/2019, pág. 100/109
    15/17 de genoma mitocondrial de interesse.
  96. 96. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende pelo menos uma redisposição genômica.
  97. 97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma redisposição genômica é selecionada dentre o grupo que consiste em uma translocação recíproca e em uma translocação não recíproca.
  98. 98. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o genoma modificado da segunda planta compreende um segundo alelo nativo que é modificado com o uso de um primeiro alelo nativo de um genoma na primeira planta como um modelo para modificar o segundo alelo nativo de um genoma na segunda planta.
  99. 99. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a primeira planta é selecionada dentre o grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de soja, uma planta de canola, uma planta de algodão, uma planta de arroz, uma planta de cana-de-açúcar, uma planta de batata, uma planta de trigo e uma planta de alfafa, e sendo que a segunda planta é selecionada dentre o grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de soja, uma planta de canola, uma planta de algodão, uma planta de arroz, uma planta de cana-de-açúcar, uma planta de batata, uma planta de trigo e uma planta de alfafa.
  100. 100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que a primeira planta e a segunda planta são da mesma espécie.
  101. 101. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que a primeira planta e a segunda planta são de espécies diferentes.
    Petição 870190032426, de 04/04/2019, pág. 101/109
    16/17
  102. 102. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado peto fato de que a primeira planta é uma planta de milho selecionada dentre o grupo que consiste em uma planta de milho Ig1 e uma planta de milho derivada de Stock 6.
  103. 103. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado peto fato de que a primeira planta é uma planta de algodão de semigamia.
  104. 104. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a terceira planta carece substancialmente do GEC enquanto a terceira planta está no estágio de vida de zigoto, embrião, muda, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 ou V12.
  105. 105. Planta ou parte da mesma, caracterizada peto fato de que é produzida peto método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 104.
  106. 106. Método para modificar um genoma da planta, caracterizado peto fato de que compreende:
    fornecer uma primeira planta de uma primeira espécie que compreende peto menos um Componente de Edição de Gene (GEC);
    cruzar a primeira planta com uma segunda planta de uma segunda espécie, sendo que o pelo menos um GEC modifica um genoma da segunda planta de uma segunda espécie, gerando, assim, um genoma modificado da segunda planta da segunda espécie;
    recuperar uma planta híbrida F1 resultante do cruzamento da primeira planta e da segunda planta;
    cruzar a planta híbrida F1 para obter uma planta progenitora a partir de planta híbrida F1, sendo que a planta progenitora compreende o genoma modificado da segunda planta da segunda espécie, e sendo que a planta progenitora carece substancialmente do genoma nuclear da primeira planta da primeira espécie.
    Petição 870190032426, de 04/04/2019, pág. 102/109
    17/17
  107. 107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a primeira espécie é selecionada dentre o grupo que consiste em trigo, centeio, cevada e Tripsacum, e a segunda espécie é milho.
  108. 108. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a primeira espécie é Orychophragmus e a segunda espécie é canola.
  109. 109. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a primeira espécie é Glycine tomentella e a segunda espécie é soja.
  110. 110. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a primeira espécie é Glycine soja e a segunda espécie é soja.
  111. 111. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a primeira espécie é Solanum phreja e a segunda espécie é batata.
  112. 112. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a primeira espécie é Oryza minuta e a segunda espécie é arroz.
  113. 113. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a primeira planta e a segunda planta são selecionadas dentre o grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de centeio, uma planta de trigo, uma planta de cevada, uma planta de Tripsacum, uma planta de sorgo e uma planta de milheto, e sendo que a primeira planta e a segunda planta não são da mesma espécie.
  114. 114. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que o método compreende, ainda, dobrar o genoma nuclear da planta progenitora F2, gerando, assim, uma planta progenitora F2 que compreende um genoma nuclear dobrado.
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