CN113122571A - 一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，所述CRISPR/Cas9载体p7N‑EC通过下列步骤制备获得：获得目的序列EC1.2en‑1.1p，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：先获得含有目的序列EC1.2en‑1.1p的载体pHEE401E‑ccdB，以pHEE401E‑ccdB载体为模板，利用Primer5软件设计引物，通过PCR扩增获得EC1.2en‑1.1p目的序列，利用SbfⅠ、BstBⅠ两种酶对pRGEB32‑GhU6.7‑NPT Ⅱ载体进行双酶切去除Ubiquitin启动子得到线性载体，然后与获得的EC1.2en‑1.1p目的序列进行In‑fusion连接。该新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，能对棉花基因组进行有效的基因编辑，且具有一定的基因编辑效率。

Description

一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法。
背景技术
CRISPR/Cas9技术是一种RNA引导的基因组编辑技术，能对基因进行精确性敲除、敲入和替换等，从而实现探究基因功能和修复致病基因等目的，该技术凭借操作简便、价格低廉、可对基因位点进行编辑和拓展性强等优势，在近几年迅速发展完善，已成为继锌指核酸酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)之后的第三大基因组编辑技术。
用于基因组编辑的CRISPR/Cas9系统的主要组成部分包括DNA切割酶Cas9，以及由反式激活的crRNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)合成的向导RNA(sgRNA)(Jinek etal.，2012)，Cas9扫描目标基因组，首先寻找3-8-nt长的间隔邻近基序(PAM)序列，然后使用gRNA向导序列(20-nt)进行目标识别，并在PAM上游的目标序列三个核苷酸处生成位点特异性双链断裂(DSB)(Penewit et al.，2018)，这些双链断裂导致宿主细胞中DNA修复系统的激活，通常通过非同源末端连接途径(NHEJ)，由于修复路径容易出错，因此在修复过程中将引入小的缺失或插入，从而产生突变(Voytas 2013)。CRISPR/Cas9技术的一些创造性和独特的设计使该系统成为许多用户更感兴趣的工具，已被广泛用于水稻、高粱、玉米、小麦等禾本植物和许多其他重要草类植物的位点特异性诱变。
尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术应用非常广泛且基因编辑效率相对较高，但在陆地棉的应用中仍存在有大量嵌合体的现象而影响基因编辑效率，根据其工作原理可知，影响CRISPR/Cas9系统编辑效率的关键因素分别是Cas9蛋白、sgRNA和PAM序列，而这里我们想通过使用调控Cas9蛋白高效表达的启动子来提高Cas9蛋白的含量以提高该系统在陆地棉应用中的编辑效率。
有研究表明DD45/EC1.2(At2g21740)是一个卵细胞特异性基因，组织切片原位杂交显示卵细胞中有EC1.2转录本，而GUS活性和GFP信号在EC1.2p:GUS和EC1.2p:GFP转基因受精卵和早期胚胎中均有表达，携带到胚胎发生后期的信号可能是由于报告mRNA和(或)蛋白的稳定性较高所致，由EC1.2启动子驱动的Cas9在卵细胞中被特异性转录，Cas9 mRNA由于mRNA的稳定性而存在于单个细胞期胚胎中，并继续翻译Cas9蛋白，此外，新翻译的Cas9和由于Cas9蛋白稳定性而留下的残留Cas9将在单细胞期胚胎中起作用，从而允许产生拟南芥T1纯合或双等位突变体，而不是嵌合植物，而融合2个卵细胞特异性启动子产生的复合启动子EC1.2en-1.1p导致T1突变效率比单个启动子更高(Wang et al.，2015)。
发明内容
本发明的目的在于通过改造原有的CRISPR/Cas9系统以提高其对棉花基因组的编辑效率，本发明基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ(Wang et al.，2018)载体，以EC1.2en-1.1p取代原有系统中驱动Cas9蛋白表达的水稻Ubiquitin启动子，在棉花中构建新型具有基因组编辑能力的载体，分别选取棉花内源Gh_A06G0606和GhCLA为目标基因验证改造后的新系统在棉花中的编辑效率。
本发明技术方案如下所述：
一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体，包括CRISPR/Cas9载体p7N-EC。
一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体p7N-EC通过下列步骤制备获得：
(1)获得目的序列EC1.2en-1.1p，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：
1)先获得含有目的序列EC1.2en-1.1p的载体pHEE401E-ccdB；
2)以pHEE401E-ccdB载体为模板，利用Primer5软件设计引物，通过PCR扩增获得EC1.2en-1.1p目的序列；
(2)利用SbfⅠ、BstBⅠ两种酶对pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体进行双酶切去除Ubiquitin启动子得到线性载体，然后与步骤(1)中获得的EC1.2en-1.1p目的序列进行In-fusion连接，通过测序验证，得到适用于棉花的新型基因编辑载体。
优选的，所述载体p7N-EC在棉花基因组编辑中的应用。
本发明的有益效果为：
1.本发明载体是在棉花中的首次应用，并能对棉花基因组进行有效的基因编辑。
2.本发明在棉花中具有一定的基因编辑效率。
附图说明
图1是对载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ改造的过程图；
图2是本发明的新型CRISPR/Cas9基因编辑载体p7N-EC的载体图；
图3是本发明的扩增后EC1.2en-1.1p(1348bp)片段的电泳图及载体p7N-EC构建成功的序列比对图；
附图标记说明：左图泳道1，2，3是EC1.2en-1.1p片段，M是5K的marker。
图4是本发明的重叠PCR电泳图；
附图标记说明：左图为第一次PCR电泳图，两个片段的分别扩增，泳道M是5K的marker，泳道1-1，1-2，1-3是第一个片段，泳道2-1，2-2，2-3是第二个片段；右图是第二次PCR电泳图，将第一次PCR的两个片段拼接，泳道1，2，3都是将第一次PCR的两个片段拼接，泳道M是5K的marker。
图5是本发明sgRNA连接到p7N-EC的电泳图；
附图标记说明：泳道1～8是目的片段连接到p7N-EC载体后的阳性检测条带，泳道M是5K的marker。
图6本发明Gh_A06G0606基因在棉花中的遗传转化及组织培养图；
附图标记说明：图6中的罗马字编号分别是：Ⅰ、共培养阶段；Ⅱ、选择培养阶段，Ⅲ、愈伤阶段；Ⅳ、分化培养阶段；Ⅴ、生根培养阶段；Ⅵ、水培炼苗阶段；Ⅶ-Ⅷ、转基因植株在温室生长。
图7是本发明的p7N-EC载体对Gh_A06G0606基因sgRNA1、sgRNA2的基因编辑检测图；
其中a图是p7N-EC对Gh_A06G0606基因sgRNA1的编辑序列图，b图是p7N-EC对Gh_A06G0606基因sgRNA2的编辑序列图，D表示碱基缺失，I表示碱基插入，D和I前面的数字分别表示碱基缺失和插入的个数。
图8是本发明的p7N-EC载体分别对棉花中Gh_A06G0606和GhCLA基因每个靶点的基因编辑效率分析比较的箱式图；
其中，a图是p7N-EC载体对Gh_A06G0606基因每个靶点的编辑效率情况箱式图，b图是p7N-EC载体对GhCLA基因每个靶点的编辑效率情况箱式图。
具体实施方式
实施例1：EC1.2en-1.1p目的序列的获得
以pHEE401E-ccdB为模板进行PCR扩增得到目的序列EC1.2en-1.1p，PCR扩增的引物分别为：
EC1.2en-1.1p-F:5'CGCGTGCATGCCTGCA TCCGATGAGATAAACCAATACCA 3'
EC1.2en-1.1p-R:5'GGTTCTATCTCCTTCG TTCTCAACAGATTGATAAGGTCG 3'
PCR反应体系见表1：
表1扩增EC1.2en-1.1p序列的PCR反应体系
Figure BDA0003087321250000051
实施例2：转化载体p7N-EC的构建
1.pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ与EC1.2en-1.1p的连接
将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ进行双酶切，酶切体系见表2，先加2μL的SbfI酶37℃酶切30min，再加2μL的BstBI，65℃酶切30min，以未切载体为对照凝胶电泳观察酶切条带是否正确，然后用酶切产物纯化试剂盒(武汉华信阳光生物科技有限公司)对剩余酶切产物进行纯化，酶切体系见表2。
表2 pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ酶切体系
Figure BDA0003087321250000061
将酶切纯化后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ线性载体与EC1.2en-1.1p DNA片段进行In-fusion连接，然后转化到大肠杆菌感受态Top10，挑取阳性克隆进行测序，将序列正确的载体命名为p7N-EC，In-fusion连接反应体系见表3。
表3 In-fusion连接反应体系
Figure BDA0003087321250000062
37℃水浴30min，冰上放置5min，可-20℃条件下保存。
实施例3：p7N-EC-sgRNA载体的构建
1.Gh_A06G0606和GhCLA基因的sgRNA设计
利用CRISPR-P2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)(Hao et al.，2017)在线网站根据基因ID:Gh_A06G0606及其同源基因Gh_D06G0687，在AD亚组共同区域上找两个靶点：sgRNA1和sgRNA2，以及白化基因Gh_A10G2292及其同源基因Gh_D10G1640，在AD亚组共同区域上找两个靶点：sgRNA3和sgRNA4，sgRNA的序列见表4。
表4 sgRNA的序列
Figure BDA0003087321250000071
2.sgRNA与p7N-EC载体的连接
(1)用BsaI酶对p7N-EC和载体进行单酶切，37℃，5.5h，得到酶切纯化产物——即线性p7N-EC载体，以连接sgRNA。
(2)靶标插入p7N-EC载体的序列分别为
tRNA+sgRNA1+gRNA+tRNA+sgRNA2+gRNA和tRNA+sgRNA3+gRNA+tRNA+sgRNA4+gRNA，利用重叠PCR获得，现以Gh_A06G0606基因的gRNA1和sgRNA2为例进行说明。
第一次PCR的引物如下：
pRGEB32-7 S:5’AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG 3’，将sgRNA1加到反向引物的接头上，
Gh_A06G0606 1AS:5’CGTCCATGCTCTTACTTAAC tgcaccagccgggaat 3’，下划线的碱基是sgRNA1序列，以PGTR载体(Xie et al.，2015)为模板进行PCR扩增tRNA序列，获得tRNA+sgRNA1片段。
Gh_A06G0606 2S:5’GTTAAGTAAGAGCATGGACGgttttagagctagaaata 3’，下划线碱基是sgRNA1序列，将sgRNA2加到反向引物的接头上，
Gh_A06G0606 2AS:5’TTCAACTCAGGGATTGCAAGtgcaccagccgggaat 3’，带下划线的碱基sgRNA2序列，同样以PGTR载体为模板进行PCR扩增，获得gRNA+tRNA+sgRNA2片段。
第二次PCR利用重叠PCR将两个片段拼成
tRNA+sgRNA1+gRNA+tRNA+sgRNA2+gRNA片段，引物序列如下：
InfGh_A06G0606 AS:5’ttctagctctaaaacTTCAACTCAGGGATTGCAAG 3’带下划线的碱基是sgRNA2序列，
Inf pRGEB32-7 S:5’AAGCATCAGATGGGCAAACAAA 3’。
利用一步克隆试剂盒(Vazyme，C112-01/02)将
tRNA+sgRNA1+gRNA+tRNA+sgRNA2+gRNA片段和tRNA+sgRNA3+gRNA+tRNA+sgRNA4+gRNA片段分别连接到p7N-EC线性载体的BsaI酶切位点处。
表5第一次PCR条件
Figure BDA0003087321250000081
Figure BDA0003087321250000091
表6-1第二次PCR体系
Figure BDA0003087321250000092
表6-2第二次PCR条件
Figure BDA0003087321250000093
实施例3：农杆菌介导的遗传转化
具体步骤如下：
A.将剥好的棉花种子(品种为Jin668，专利申请号201510833618.0)用0.1％升汞杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1d，挑去种皮，将苗扶正，在28℃恒温培养箱，暗培养4～5d；
B.将下胚轴切成小茎段，用活化后的农杆菌侵染，弃菌液，并吹干；
C.将下胚轴平铺在放有滤纸的共培养培养基中，于20℃恒温培养箱，暗培养36～48h；
D.将下胚轴转入到附加2，4-D的愈伤组织诱导培养基中，放入光照培养室，20～30d左右用新鲜愈伤组织诱导培养基继代培养一次；
E.当愈伤组织长成米粒状颗粒，转入分化培养基，进一步分化成胚状体；
F.将分化出的小苗继代到生根培养基中，直至长成生根良好健康的小苗；
G.将小苗转到自来水中，进行炼苗，一周左右后，转移到温室。
转化所用的培养基组分及配比：
无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖，2.6g/L的Phytagel，pH:6.1～6.2。
农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L+NaCl 5g/L+MgSO4.7H2O 0.1g/L+KH2PO40.25g/L+甘露醇5g/L+甘氨酸1.0g/L。
愈伤组织诱导培养基：MSB+24-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel，pH:5.85～5.95。
共培养培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+50mg/L AS+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH:5.85～5.95。
选择培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L和头孢霉素400mg/L，pH:5.85～5.95。
分化培养基：MSB培养基中去掉NH4NO3，将KNO3用量加倍+Glu 1.0g/L+Asp 0.5g/L+IBA 0.5mg/L+KT 0.15mg/L+3％Glucose+0.26％Phytagel，pH:6.1～6.2。
生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel，pH:6.1～6.2；
MSB的成分如下：MS培养基+B5维生素。
实施例4：新型基因编辑载体p7N-EC对棉花基因组的基因编辑效率检测
(1)利用CTAB法分别提取p7N-EC:Gh_A06G0606、p7N-EC:GhCLA两个载体的愈伤组织DNA。
具体步骤如下：
A.取新鲜幼嫩叶片0.1g左右到2mL离心管中置于冰或液氮中，逐个加入钢珠和200μL抽提缓冲液，磨样机打60s，频率为60Hz；
B.加入预热的DNA抽提裂解液800μL后摇匀，使得样品与裂解液充分接触均匀；
C.65℃水浴40min，每隔10min轻轻上下颠倒几次，此时及后续步骤避免剧烈震荡；
D.加800μL氯仿，轻柔摇匀抽提20min，室温11000rpm离心10min；
E.吸取上清至1.5mL新离心管，加入等体积异丙醇后混匀，此时产生白色絮状沉淀即为DNA粗提物；
F.倒掉上清，絮状沉淀用75％酒精洗两次后吹干，用适量ddH2O溶解。
抽提缓冲液(PH＝7.5)：0.35M葡萄糖69.36g/L+0.1M Tris-HCl 12.44g/L+0.005MNa2EDTA 1.86g/L+2％(W/V)PVP K-30 20g/L+0.1％DIECA 1～2g/L，使用前加β-巯基乙醇至0.2％，PH调至7.5。
抽提裂解液(PH＝8.0)：0.1M Tris-HCl 12.44g/L+1.4M NaCl 81.816g/L+0.02MNa2EDTA 7.45g/L+2％CTAB 20g/L+0.1％DIECA 1g/L+2％PVP K-30 20g/L，加0.2％β-巯基乙醇后调PH值至8.0。
(2)对提取的愈伤组织DNA进行载体的阳性检测
设计载体的阳性检测引物：
正向引物：5’TGACCAGAAGCGACAAGAACC3’
反向引物：5’CCACCACCAGCACAGAATAGG3’
通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳进行检测。
(3)对阳性愈伤组织DNA进行
Hi-TOM(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)(Liu et al.，2017)测序检测基因编辑效率。
分别设计Gh_A06G0606和GhCLA这两个基因的靶点检测引物(如表7所示)。以阳性愈伤组织DNA为模板，体系为40μL，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测条带无误后，将剩余PCR产物密封好邮寄到杭州水稻所进行Hi-TOM测序。
表7 Hi-TOM测序基因靶点检测引物
Figure BDA0003087321250000121
Figure BDA0003087321250000131
本发明构建了新型的CRISPR/Cas9基因编辑载体并首次在棉花中成功应用，该新系统具有比原载体小的特点且能够发挥基因编辑功能具有一定的基因编辑效率，这是一种为提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的新尝试，具有重要的研究意义。
参考文献
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Claims (3)

1.一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体，包括CRISPR/Cas9载体p7N-EC。
2.一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体p7N-EC通过下列步骤制备获得：
(1)获得目的序列EC1.2en-1.1p，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：
1)先获得含有目的序列EC1.2en-1.1p的载体pHEE401E-ccdB；
2)以pHEE401E-ccdB载体为模板，利用Primer5软件设计引物，通过PCR扩增获得EC1.2en-1.1p目的序列；
(2)利用Sbf Ⅰ、BstB Ⅰ两种酶对pRGEB32-GhU6.7-NPT Ⅱ载体进行双酶切去除Ubiquitin启动子得到线性载体，然后与步骤(1)中获得的EC1.2en-1.1p目的序列进行In-fusion连接，通过测序验证，得到适用于棉花的新型基因编辑载体。
3.根据权利要求1或2所述的一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，其特征在于，所述载体p7N-EC在棉花基因组编辑中的应用。
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