CN109936977A - 用于通过单倍体诱导来进行基因组编辑的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供用于使用基因编辑和单倍体诱导来改进植物育种的方法和组合物。

Description

用于通过单倍体诱导来进行基因组编辑的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月14日提交的美国临时申请号62/394,409的优先权，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
是65,536字节(在MS-中所测量)，并且于2017年9月7日创建的名为“61934WO_ST25.txt”的文件中含有的序列表随本文一起电子提交，并且以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开提供用于使用基因组编辑与单倍体诱导杂交组合来实现基因组修饰的方法和组合物。
背景技术
将适用性状递送至不同种质中在传统上涉及多轮回交以将性状从供体种质移动至目标株系中。这个过程可花费数年来完成，并且它经常需要广阔田地或温室空间来使必要植物生长。此外，对于一些天然性状，在目标性状周围的不良重组导致供体基因组的可具有非所要或甚至有害表型效应的可观部分的连锁累赘。植物育种人员可使用单倍体诱导株系和双单倍体来使所需性状向目标株系中的整合加速。
在基因组编辑技术中的新近发现已揭示可使包括基因组重排的突变靶向植物基因组内的特定基因座所采用的新系统，例如锌指、转录活化子样效应物和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)。这些新工具已显示有希望允许植物科学家有更大可能使得能够向靶标基因组内的特定靶标序列中并入特定核苷酸编辑，所述特定核苷酸编辑在先前是不可能的，或在统计上是如此不可能发生以致在高通量和/或工业环境中不能实行。
然而，这些系统的一个重要缺点是在已进行所需编辑之后，突变元件持续处于细胞中，此可进一步影响基因表达和/或在植物基因组中产生额外非所要突变。当前植物育种方法教导为在进行所需编辑之后从植物消除所述基因组编辑组分(GEC)，必须使含有序列的植物与缺乏序列的轮回亲本回交，以及选择已丧失GEC，但保留并入它们的基因组中的所需编辑的那些子代。这个过程是缓慢的，艰苦的，并且需要可观资源投资来实现。
因此，在本领域中有需要在编辑之后高效消除细胞中的GEC，以及按比例扩大GE系统以在工业或商业规模上在许多不同植物种质中高效产生不同编辑的广泛分类和/或组合，以满足现代竞争性农耕系统的要求。
本文所述的方法和组合物通过暴露供体株系中的基因编辑组分以修饰所需株系中的基因组而不需要多轮回交以及在无实质性连锁累赘下来满足本领域中的需要。
发明内容
在一个实施方案中，本发明涉及一种修饰植物基因组的方法，其包括提供包含至少一种基因组编辑组分(GEC)的第一植物，以及使所述第一植物与第二植物杂交以产生所述第二植物的经修饰基因组，其中所述第二植物的基因组通过所述至少一种GEC组分来修饰。第三植物由第一植物和第二植物的杂交产生，其中所述第三植物包含第二植物的经修饰基因组，并且其中所述第三植物大致上缺乏GEC。在一些实施方案中，第一植物是单倍体诱导植物。
在另一实施方案中，本发明涉及一种修饰植物基因组的方法，其包括提供包含至少一个超数染色体的第一植物，其中所述超数染色体包含至少一种基因组编辑组分(GEC)。使第一植物与第二植物杂交以通过GEC组分对所述第二植物的基因组的作用来产生所述第二植物的经修饰基因组。第一植物与第二植物之间的杂交产生包含第二植物的经修饰基因组，但大致上缺乏GEC的第三植物。
在另一实施方案中，本发明涉及一种修饰植物基因组的方法，其包括提供在载体DNA分子上包含至少一种基因组编辑组分(GEC)的第一植物。使第一植物与第二植物杂交，其中使所述第二植物的基因组充分暴露于至少一种GEC以通过由至少一种GEC编码的蛋白质进行修饰。第一植物和第二植物的杂交于是产生包含第二植物的经修饰基因组，但大致上缺乏GEC的第三植物。在一些实施方案中，第一植物是单倍体诱导植物。
在另一实施方案中，本发明涉及一种修饰植物基因组的方法，其包括提供第一植物物种的包含至少一种基因组编辑组分(GEC)的第一植物。使第一植物物种的第一植物与第二植物物种的第二植物杂交，其中至少一种GEC修饰所述第二植物物种的所述第二植物的基因组以产生所述第二植物的经修饰基因组。方法进一步包括回收由第一植物和第二植物的杂交获得的F1杂交植物，以及进一步使所述F1杂交植物杂交以获得包含第二植物的经修饰基因组的子代植物，但其中所述子代植物大致上缺乏第一植物的核基因组。
本发明的其他方面和实施方案将根据本文提供的描述而显而易知。应了解提供的描述和实施例仅意图出于说明目的，并且不意图限制申请人的发明的范围。
具体实施方式
除非另外定义，否则使用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。当术语以单数形式提供时，本发明者也预期通过那个术语的复数形式来描述的本公开的各个方面。当在以引用的方式并入本文的参考文献中使用的术语和定义方面存在分歧时，本申请中使用的术语将具有本文给出的定义。使用的其他技术术语具有它们的在它们所用于的领域中的普通含义，如由各种领域特异性词典所例示，所述词典例如“The AmericanScience Dictionary”(American HeritageDictionaries的编者,2011,Houghton Mifflin Harcourt,Boston and New York)、“McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms”(第6版,2002,McGraw-Hill,New York)或“Oxford Dictionary of Biology”(第6版,2008,Oxford UniversityPress,Oxford and New York)。本发明者不意图限于某一作用机理或模式。对其的提及仅出于说明目的而提供。
除非另外指示，否则本公开的实施采用生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和生物工艺学的常规技术，所述技术属于本领域的技能。参见Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)；Current ProtocolsIn Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编,(1987))；丛书Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))；Harlow和Lane编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual；AnimalCell Culture(R.I.Freshney编(1987))；Recombinant Protein Purification:Principles And Methods,18-1142-75,GE Healthcare Life Sciences；C.N.Stewart,A.Touraev,V.Citovsky,T.Tzfira编(2011)Plant Transformation Technologies(Wiley-Blackwell)；以及R.H.Smith(2013)Plant Tissue Culture.Techniques And Experiments(Academic Press,Inc.)。
本文引用的所有参考文献都以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”包括复数个(种)指示物。因此，举例来说，提及“植物”、“这个(种)植物”或“一个(种)植物”也包括复数个(种)植物；此外，视情形而定，使用术语“植物”也可包括那个植物的在遗传上类似或相同的子代；使用术语“一个(种)核酸”任选包括实际上那个核酸分子的许多拷贝；类似地，术语“探针”任选(以及通常)涵盖许多类似或相同的探针分子。
如本文所用，“植物”是指完整植物或源于植物的细胞或组织培养物，包括以下中的任一者：完整植物、其植物组分或器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或子代。子代植物可来自任何后代，例如F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7等。植物细胞是植物的生物细胞，其取自植物或通过培养来从取自植物的细胞获得。植物部分包括可收获部分和适用于子代植物的繁殖的部分。适用于繁殖的植物部分包括例如且不限于：种子；果实；扦插物；幼苗；块茎；和根茎。植物的可收获部分可为植物的任何适用部分，包括例如且不限于：花；花粉；幼苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。如本文所用的植物细胞包括原生质体和具有细胞壁的原生质体。植物细胞可为原生质体、产生配子的细胞、或可再生成完整植物的细胞或细胞集合。
如本文所用，“植物基因组”是指植物细胞的核基因组、线粒体基因组或质体(例如叶绿体)基因组。
如本文所用，“转基因性”是指植物细胞、植物、植物部分或种子的基因组已通过稳定整合外源性DNA来改变。转基因株系包括从经最初转化植物细胞再生的植物和来自经转化植物的后代或杂交物的子代转基因植物。如本文所用，“转基因”是指已通过本领域中已知的任何方法来转移至基因组中的多核苷酸。在一个方面，转基因是外源性多核苷酸。在一个方面，转基因是整合至它通常不见于其中的新基因组基因座中的内源性多核苷酸。
术语“多核苷酸”的使用不意图将本公开限于包含脱氧核糖核酸(DNA)的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸(RNA)以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。所述脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子与合成类似物两者。本公开的多核苷酸也涵盖所有序列形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎和环结构等。
本文公开的是发现用于极其不同目的的完全不同系统可与GEC系统组合以在许多不同种质之中快速产生广泛多种不同编辑以及编辑的组合(例如“性状堆叠”)。除了其他构思之外，发现也包括认识到单倍体诱导系统提供一种解决当前困扰试图采用如CRISPR-Cas9的GE系统的大规模植物育种程序的许多问题的手段。
在某些实施方案中，GEC可放置在多种载体DNA分子中的任一者上，所述载体DNA分子在已进行编辑之后自发地从细胞消除，或在已进行编辑之后可易于从细胞移除。载体DNA分子的一个重要实例是用作单倍体诱导物的植物的基因组。其他实例包括超数染色体例如B染色体。其他重要实例在本文中其他地方提供。
在某些实施方案中，产生含有包含GEC例如转化至玉米母系单倍体诱导物的基因组中的GEC的载体染色体的植物，接着这个诱导植物可作为雄性亲本用于与广泛范围的种质的许多不同杂交中。由发现这个系统所揭示的重要优势包括1)许多不同编辑(即突变)和突变的组合(即“堆叠”)可快速运用于许多不同种质而不必每次定制设计用于各种质的各编辑，以及2)在已进行编辑之后，GEC和它编码的编辑活性得以快速消除(例如通过诱导物基因组消除的常用机理自发达成)，从而最终产生除通过GEC产生的编辑之外，其基因组大致上与雌性亲本相同的单倍体细胞。举例来说，一旦玉米单倍体诱导物已用所需GEC(在某些实施方案中，其能够改变许多基因)转化，它即可接着作为亲本重复用于与广泛范围的不同种质的诱导杂交中以极其快速地，以及相比于使用当前方法所需的投资以少得多的投资在广泛范围的基因组中产生离散所需编辑。
单倍体/单倍体诱导株系/双单倍体
本公开提供适用于使用单倍体诱导技术来修饰基因组的方法和组合物。
如本文所用，“单倍体”细胞或核包含单组未配对染色体(x)。相比之下，“二倍体”细胞或核包含能够进行同源配对的两组完整染色体(2x)。单倍体染色体数目可由“n”表示，并且二倍体染色体数目可由“2n”表示。举例来说，在二倍体物种诸如玉米中，n＝x＝10，并且2n＝2x＝20。多倍体细胞或核包含超过两组完整染色体。举例来说，一些小麦株系是六倍体，这意味着它们含有三组配对染色体(2n＝6x＝42)。二倍体细胞和核与多倍体细胞和核两者均可缩减为单倍体状态。
如本文所用，“单倍体植物”描述包含多个包含单倍体核基因组的细胞的孢子体。有时，另外单倍体植物的区段可自发加倍以形成二倍体或多倍体区段。自发染色体加倍的频率视物种而变化。已报道自发染色体加倍率在大麦中多达70-90％，在小麦中多达25-70％，在稻米中多达50-60％，在黑麦中多达50-90％，并且在玉米中多达20％。
本文提供的单倍体植物可为母系单倍体植物，这意味着它已丧失它的父系核基因组而保留它的母系核基因组。或者，本文提供的单倍体植物可为父系单倍体植物，这意味着它已丧失它的母系核基因组而保留它的父系核基因组。通常，母系线粒体和质体(例如叶绿体)基因组在母系单倍体植物与父系单倍体植物两者中均得以保留。
本文提供的单倍体植物可自发地产生，或它们可通过使用各种单倍体诱导技术来产生。在一个方面，本文提供的单倍体植物通过用来自相同物种的“单倍体诱导”(HI)株系的花粉对雌性植物授粉来产生。如本文所用，“单倍体诱导(HI)植物”是能够通过消除一组染色体来诱导子代植物中的单倍体化的植物。HI株系通常在低频率(约10％)下产生母系单倍体。作为一非限制性实例，来自单倍体诱导玉米株系Stock6的植物的花粉可用于通过消除Stock 6染色体来在子代植物中产生母系单倍体。作为另一非限制性实例，在不确定配子体1(ig1)基因座中具有突变的玉米植物能够在受精后通过消除母系染色体来诱导父系单倍体；母系线粒体和质体基因组保留在ig1诱导的父系单倍体中。作为另一非限制性实例，来自在半配生殖(se)基因座中具有突变的棉花植物的花粉能够在受精后产生父系单倍体或母系单倍体。然而，单倍体棉花植物仅在母系亲本具有必要se突变时产生。参见例如Chaudhari.1978.Bulletin of the Torrey Botanical Club.105:98-103。在一个方面，本公开提供一种HI植物。作为另一非限制性实例，已显示对着丝粒特异性组蛋白CENH3操作可在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中诱导形成单倍体。参见例如Ravi和Chan.2010.Nature.464:615-619。在一个方面，本文提供的HI株系包含经修饰CENH3蛋白。作为另一非限制性实例，也发现由于导致在Msi2蛋白中引入过早终止密码子的核苷酸多态性而丧失功能性Msi2蛋白的植物能够在与包含功能性Msi2蛋白的野生型植物杂交之后诱导单倍体后代(WO 2017058023 A1)。在另一方面，本文提供的HI株系包含经修饰Msi2蛋白。作为另一非限制性实例，发现包含含有一个或多个影响CENPC蛋白的功能，但允许表达经修饰CENPC蛋白的植物存活的活性突变的所述经修饰CENPC蛋白的植物能够在与包含内源性CENPC蛋白的野生型植物杂交之后诱导单倍体后代(WO 2017058022 A1)。在另一方面，本文提供的HI株系包含经修饰CENPC蛋白。作为另一非限制性实例，发现具有沉默马铃薯块茎贮藏蛋白(patatin)样磷酸脂酶2A的植物能够诱导单倍体后代(US 9,677,082 B2)。在另一方面，本文提供的HI株系包含沉默马铃薯块茎贮藏蛋白样磷酸脂酶2A基因。
在一个方面，本文提供的HI植物属于选自由以下组成的组的物种：玉米植物、黑麦植物、小麦植物、大麦植物、摩擦禾(Tripsacum)植物、高粱植物、珍珠粟植物、大豆植物、苜蓿植物、甘蔗植物、棉花植物、加拿大油菜植物、马铃薯植物和稻米植物。
在另一方面，单倍体诱导可通过在基因内和/或种间杂交中用来自野生亲缘植物的花粉对驯化植物品种授粉来实现。在另一方面，单倍体诱导通过在“基因间杂交”中用来自第二属中第二物种的植物的花粉对来自第一属的第一物种的卵细胞授粉来实现。所述基因内和基因间杂交经常被称为“远缘杂交(wide cross/wide hybridization)”。在一个方面，本文提供的远缘杂交导致丧失父系核基因组。在另一方面，本文提供的远缘杂交导致丧失母系核基因组。本领域技术人员将认识到在一些情况下，由远缘杂交产生的杂交子代必须与包含所需核基因组的亲本物种回交以消除第二非所需物种的核基因组。在一个方面，远缘杂交中的第一物种选自由小麦、黑麦、燕麦、大麦和摩擦禾组成的组，并且第二物种是玉米。在另一方面，远缘杂交中的第一物种是摩擦禾，并且第二物种是玉米。在另一方面，远缘杂交中的第一物种是小麦，并且第二物种是玉米。在另一方面，远缘杂交中的第一物种是野生大麦物种，并且第二物种是驯化大麦物种。在另一方面，远缘杂交中的第一物种是小麦，并且第二物种选自由高粱和珍珠粟组成的组。在另一方面，远缘杂交中的第一物种是野生马铃薯物种(例如富利亚薯(Solanum phreja))，并且第二物种是驯化马铃薯物种。在另一方面，远缘杂交中的第一物种是诸葛菜属(Orychophragmus)的物种，并且第二物种是加拿大油菜。在另一方面，远缘杂交中的第一物种是短绒野大豆(Glycine tomentella)，并且第二物种是大豆。在另一方面，远缘杂交中的第一物种是微粒稻(Oryza minuta)，并且第二物种是稻米。
在一个方面，本文提供的单倍体植物通过使用经照射花粉对植物授粉来产生。在另一方面，本文提供的单倍体植物在体外产生。在另一方面，本文提供的母系单倍体植物由体外培养未授粉雌花部分(例如胚珠、胎座附着的胚珠、子房、整个花芽)产生。在另一方面，本文提供的父系单倍体植物由体外培养不成熟花药产生。
在一个方面，体外胚挽救为在单倍体诱导事件之后回收本文提供的单倍体植物所需。在另一方面，性状(例如颜色标记诸如花青素标记如R1-nj，和/或油含量标记诸如2015年9月10日提交的题为Improved Methods of Plant Breeding Using High-ThroughputSeed Sorting的PCT申请PCT/US2015/049344和相应美国专利申请14/206,238中所述的油含量标记，所述申请各自的公开内容以引用的方式整体并入本文，和/或能够区分单倍体胚与二倍体胚的形态标记)被并入本文提供的HI植物、本文提供的接受植物或两者的基因组中以有助于从二倍体胚鉴定、区分和/或分选单倍体胚。单倍体诱导可通过在种皮、糊粉、胚、胚乳或其组合中存在/不存在表型标记来确认。作为一非限制性实例，将种子糊粉的顶冠部分和胚着色为红色或紫色的玉米R-nj颜色标记(R是调节红色和紫色花青素色素沉着的基因座)可被并入HI诱导玉米株系中。当包含R-nj的HI株系作为雄性杂交于无色雌性株系上时，单倍体候选物可通过选择在胚乳中具有R-nj样式联同具有无色胚的种子来选择。单倍体诱导也可通过指示缺乏异质性的分子标记来确认。所述标记可通过本领域中已知的技术来检查，所述技术在不加限制下诸如序列分析(例如Sanger、454、Illumina、Pac-Bio)、PCR、Southern杂交、荧光原位杂交(FISH)和ELISA。
单倍体植物经常形成异常花结构，并且由于不存在一组同源染色体而不能通过减数分裂来继续前进。经常合乎需要的是在称为“单倍体加倍”或“染色体加倍”的过程中使单倍体植物转变成二倍体植物(“双单倍体”)。单倍体加倍允许产生在单代中在核基因组中的所有基因座处都是纯合的植物。在一个方面，使本文提供的单倍体植物转变成双单倍体植物。在一个方面，本文提供的一种染色体加倍方法包括使用选自由以下组成的组的染色体加倍剂：一氧化二氮(N2O)气体、秋水仙碱(colchicine)、氨磺乐灵(oryzalin)、甲基胺草磷(amiprophosmethyl)、氟乐灵(trifluralin)、咖啡因(caffeine)和拿草特(pronamide)。参见例如Doubled Haploid Production in Crop Plants:A Manual(M.Maluszynski,K.J.Kasha,B.P.Forster和I.Szarejko编(2003),Kluwer Academic Publishers)；Prigge和Melchinger,2012,Plant Cell Culture Protocols,877:161-172以及Kato和Geiger,2002,Plant Breeding,121:370-377(其各自以引用的方式整体并入本文)。在另一方面，本文提供的一种染色体加倍方法包括使用秋水仙碱。在另一方面，本文提供的一种染色体加倍方法包括使用N2O气体。在另一方面，本文提供的一种染色体加倍方法包括使用秋水仙碱或一氧化二氮气体。如本文所用，当涉及染色体计数时，“加倍”是指使染色体数目增加至两倍。举例来说，包含10个染色体的单倍体核基因组被加倍以变为包含20个染色体的二倍体核基因组。作为另一实例，包含20个染色体的二倍体核基因组被加倍以变为包含40个染色体的四倍体核基因组。对染色体加倍的确认可通过FISH或本领域中已知的其他分子生物学技术来进行。
在一个方面，本文提供的单倍体植物经受自发染色体加倍。自发染色体加倍可产生二倍体区段，其产生正常二倍体花结构。所述自发加倍区段是合乎需要的，因为由自发染色体加倍产生的二倍体花结构产生可自我授粉或用于进行与其他植物的杂交的正常卵和花粉。
基因组修饰/重组
在一个方面，本公开提供用于修饰植物基因组的方法。如本文所用，“修饰”植物基因组是指在植物基因组中进行一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失、重复、倒位或易位。在一个方面，本文提供的基因组修饰是稳定修饰。“稳定修饰”是能够转移至细胞的下一代中的修饰。
在一个方面，本文提供的核基因组是单倍体核基因组。在另一方面，本文提供的核基因组是二倍体核基因组。在另一方面，本文提供的核基因组是三倍体核基因组。在另一方面，本文提供的核基因组是四倍体核基因组。在一个方面，本文提供的核基因组包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个超数染色体。
如本文所用，术语“基因组重排”是指基因组中两个或更多个核苷酸的易位、倒位、缺失或重复。如本文所用，术语“易位”是指染色体节段在同一染色体上从第一区域向第二区域或向第二染色体的位置变化。如本文所用，术语“染色体节段”是指染色体、质体基因组或线粒体基因组的至少2、5、50、100、250、500、1000、2500、5000、10,000、25,000、50,000、100,000、250,000、500,000、1,000,000、2,500,000、5,000,000、10,000,000、25,000,000个或至少50,000,000个连续核苷酸。在一个方面，本文提供的染色体节段包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个兆碱基基因座。在另一方面，本文提供的染色体节段包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个基因。如本文所用，“基因”是指编码蛋白质的序列或编码非蛋白质编码RNA的序列。如本文所用，“蛋白质编码”是指多核苷酸编码多肽的氨基酸。如本文所用，“编码”是指多核苷酸可通过转录和/或翻译来产生功能性单元(在不加限制下例如蛋白质、微小RNA(miRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反式作用性小干扰RNA(ta-siRNA)、引导RNA(gRNA)、tracer RNA(tcRNA)、单引导RNA(sgRNA))。非蛋白质编码RNA的非限制性实例包括miRNA、miRNA前体、siRNA、小RNA(长度是18-26个核苷酸)和编码其的前体、异染色质siRNA(hcRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、tcRNA、gRNA和sgRNA。
如本文所用，“兆碱基基因座(megalocus)”(或复数形式“megaloci”)是指通常以单一单元形式遗传的在遗传上关联的转基因性状、天然性状或其组合的区块。本公开的兆碱基基因座可向植物提供一种或多种所需性状，其可包括但不限于生长增强、产量增强、干旱耐受性、盐耐受性、除草剂耐受性、昆虫抗性、害虫抗性、疾病抗性、氮利用增强等。在一些方面，兆碱基基因座包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13或15个在物理上分隔，但在遗传上关联以致它们可以单一单元形式遗传的转基因基因座(事件)。兆碱基基因座中的各转基因基因座可彼此相隔0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、5、10、15或20cM。在一方面，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个兆碱基基因座从HI株系、超数染色体或两者转移或易位至接受株系的基因组中。在不加限制下，兆碱基基因座从HI株系或超数染色体向接受株系的转移或易位可通过序列(例如Sanger、454、Illumina、Pac-Bio)分析；分子标记分析(例如FISH、PCR、ELISA、DART)；或为本领域技术人员所知的任何可适用分子生物学方法来确认。表型分析也可用于确认兆碱基基因座从HI株系或超数染色体向接受株系的转移或易位。举例来说，如果经转移或经易位兆碱基基因座包含除草剂耐受性状，那么施加除草剂可用于确认存在兆碱基基因座。
在一个方面，本文提供的易位是染色体内易位。如本文所用，“染色体内易位”是指染色体节段在同一染色体内从第一基因座向第二基因座的易位。在另一方面，本文提供的易位是染色体间易位。如本文所用，“染色体间易位”是指染色体节段从第一染色体上的第一基因座向第二染色体上的第二基因座的易位。在另一方面，本文提供的易位使染色体节段从父系染色体或基因组向母系染色体或基因组易位。在另一方面，本文提供的易位使染色体节段从母系染色体或基因组向父系染色体或基因组易位。在另一方面，本文提供的易位使染色体节段从线粒体或质体基因组向核基因组易位。在另一方面，本文提供的易位使染色体节段从核基因组向线粒体或质体基因组易位。在一个方面，本文提供的易位使染色体片段从超数染色体向A染色体、质体基因组或线粒体基因组易位。如本文所用，“A染色体”是指细胞的核基因组中的任何通常存在的染色体。在另一方面，本文提供的易位使染色体片段从A染色体向超数染色体易位。在另一方面，本文提供的易位使染色体片段从线粒体或质体基因组向超数染色体易位。
在一个方面，本文提供的基因组重排选自由相互易位和非相互易位组成的组。在一个方面，本文提供的基因组重排选自由相互易位、非相互易位、罗伯逊易位(Robertsonian translocation)、臂内倒位和臂间倒位组成的组。相互易位包括在两个非同源染色体之间交换基因组物质的无着丝粒片段以致片段基本上对换位置。非相互易位包括染色体节段从第一染色体或基因组向第二染色体或基因组单向转移。罗伯逊易位包括整个染色体臂从第一染色体向第二染色体易位，并且经常导致丧失一个或多个染色体臂。臂内倒位包括单一染色体的区域的倒位，其中着丝粒不包括在倒位区域中。臂间倒位包括单一染色体的区域的倒位，所述区域在倒位区域中包括着丝粒。
熟练技术人员可使用任何相关分子生物学技术来确认存在经修饰基因组。在不加限制下举例来说，单倍体植物、种子或细胞可通过序列(例如Sanger、454、Illumina、Pac-Bio)分析；ELISA；FISH；使用CelI或类似酶进行的DNA不匹配分析；或对含有经修饰序列的PCR扩增子的高分辨率熔解曲线分析来鉴定。
在一个方面，本文提供的基因组重排通过一种或多种本文提供的GEC来实现。
如本文所用，术语“重组”是指在两个核酸分子之间交换核苷酸。术语“同源性重组”(HR)是指在由两个核酸分子共有的保守区域处交换核苷酸。HR包括对称同源性重组和不对称同源性重组。不对称同源性重组也可意指不等重组。如本文所用，“非同源性末端接合”(NHEJ)是指在不需要同源序列来引导连接的情况下，双链DNA的两个末端的连接。对本文提供的植物基因组的修饰可包括HR或NHEJ。
基因编辑组分
如本文所用，“基因编辑组分(GEC)”是指能够引发基因组修饰的酶和/或供体多核苷酸模板。在一个方面，本文提供的GEC引发靶向基因组修饰。在另一方面，本文提供的GEC引发非靶向基因组修饰。如本文所用，“靶向基因组修饰”是指使用位点特异性酶来引导对预定靶向多核苷酸序列的编辑。在一个方面，本文提供的GEC包含能够引发植物基因组中的修饰的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种酶；0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个供体多核苷酸模板；或两者。在一个方面，本文提供的植物、植物细胞或植物基因组包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种GEC。在另一方面，本文提供的花粉细胞包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种GEC。在另一方面，本文提供的植物卵细胞包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种GEC。在一个方面，本文提供的HI植物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种GEC。在另一方面，本文提供的植物基因组通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种GEC来修饰。在一个方面，本公开提供1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种编码GEC的核酸。在一个方面，本文提供的GEC包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种位点特异性酶。在另一方面，本文提供的GEC包含编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种位点特异性酶的核酸序列。在一个方面，本文提供的GEC包含编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个供体多核苷酸模板的核酸序列。如本文所用，“供体多核苷酸模板”是指包含待插入接受株系的基因组中的所需多核苷酸序列的多核苷酸。
在一个方面，本公开中的基因组编辑组分包含至少一种病毒复制子。已开发基于RNA病毒的病毒复制子系统。病毒复制子系统包含两种必需组分：复制酶基因和复制酶蛋白的靶标序列。复制酶基因产物(“复制酶蛋白”)作用于靶标序列以扩增靶标序列和任何相关序列，总称为复制子。可以允许随后使复制子形成和扩增激活的方式将复制子前体稳定插入基因组中。在一方面，本文提供的病毒复制子前体包含至少一个编码至少一个复制酶基因的核酸序列、复制酶基因产物的至少一个靶标序列、和至少一种GEC；当得以表达或扩增时，这个核酸序列被称为“复制子”。复制酶蛋白可结合复制子的靶标序列，由此产生额外复制子。除至少一种GEC之外，至少一个复制酶基因也被包括在待扩增的序列上以使产生复制酶蛋白的额外拷贝。产生复制子和复制酶蛋白的额外拷贝允许复制子历经多次细胞分裂而持续存在，但已知复制子不持续存在于植物的整个完整生命周期中。因为复制子不实际上位于染色体上，所以在由花粉细胞对卵细胞受精之后，在丧失父系或母系核基因组之后，它们可持续存在于细胞中。在一个方面，在丧失父系核基因组或母系核基因组之后，本文提供的植物细胞包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个病毒复制子。在另一方面，本文提供的复制子存在于细胞的核中。在另一方面，本文提供的复制子存在于细胞的细胞质中。
本文提供的病毒复制子可操作地连接于用于驱动复制酶表达、后续复制子形成以及扩增的启动子。在一方面，使包含一个或多个病毒复制子的HI植物与非HI植物杂交，其中一个或多个复制子存在于受精之前、期间或之后。在一个方面，本公开提供一种包含可选择标记和病毒复制子的转化构建体。
在一个方面，本文提供的基因组包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个病毒复制子。在另一方面，本文提供的基因组包含编码0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个病毒复制子的核酸序列。在一个方面，本文提供的基因组包含位于所述基因组内多个基因座处的多个病毒复制子。在另一方面，本文提供的基因组包含位于所述基因组内一个基因座处的多个病毒复制子。在一个方面，本文提供的病毒复制子在从它的宿主基因组释放后在植物细胞中扩增。
在一方面，本文提供的病毒复制子是双粒病毒复制子或纳米病毒复制子。在双粒病毒复制子系统的情况下，前体包含两个称为LIR(在纳米病毒复制子系统的情况下称为NVR)的靶标序列，其处于正向定向，可由复制酶蛋白所作用以产生包含LIR和存在于两个LIR之间的任何序列的复制子。纳米病毒复制子系统以与双粒病毒复制子系统类似的方式起作用。或者，复制子可通过用一对位点特异性重组酶靶标序列侧接于复制酶靶标序列(例如LIR、NVR)和一种或多种GEC的单一拷贝来产生。当提供适当重组酶时，它切除可通过识别复制酶靶标序列的复制酶蛋白来复制的环状DNA分子。
在一个方面，本文提供的GEC修饰植物基因组。在另一方面，本文提供的GEC修饰选自由核基因组、线粒体基因组和质体基因组组成的组的植物基因组。在另一方面，本文提供的GEC修饰母系植物基因组或父系植物基因组。在一个方面，编码本文提供的GEC的核酸序列位于母系基因组中。在另一方面，编码本文提供的GEC的核酸序列位于父系基因组中。在一个方面，本文提供的GEC不引发HI植物或细胞的基因组中的修饰。在另一方面，本文提供的GEC引发HI植物或细胞的基因组中的修饰，前提是所述修饰对于所述HI植物或细胞不具有致死性。
在一方面，本文提供的供体多核苷酸模板由与接受株系中的靶标位点至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核酸序列侧接。如本文所用，“接受株系”是指包含待编辑的基因组的植物株系或品种。
在一个方面，本文提供的供体多核苷酸模板从HI株系基因组插入接受株系中的相应基因组区域中。在另一方面，本文提供的供体多核苷酸模板从HI株系基因组插入接受株系中的非靶向基因组区域中。在一个方面，本文提供的供体多核苷酸模板以2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个拷贝存在于HI株系基因组中。
在一个方面，供体多核苷酸模板与目标靶向基因组序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或至少99.9％同一。如本文所用，“目标靶向基因组序列”是指基因组中能够由位点特异性酶编辑的核酸序列。在一方面，除所需修饰之外，本文提供的供体多核苷酸模板与目标靶向基因组序列100％同一。所需修饰可包括相较于基因座的未修饰状态，至少1、2、5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000个或至少10,000个核苷酸的插入、缺失、重复、取代或倒位。在一个方面，供体多核苷酸模板包含目标靶向基因组序列的内源性等位基因。在另一方面，本文提供的供体多核苷酸模板是外源性核酸序列。在另一方面，本文提供的供体多核苷酸模板包含转基因。在一个方面，供体多核苷酸模板修饰至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个目标靶向基因组序列。
酶的类型
在一个方面，本文提供的酶是位点特异性酶。如本文所用，“位点特异性酶”是指可以位点特异性方式裂解核苷酸序列的任何酶。在一方面，本文提供的位点特异性酶选自由以下组成的组：核酸内切酶(在不加限制下例如兆碱基大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA引导的核酸酶(在不加限制下例如成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶)；重组酶(在不加限制下例如连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶、连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶)；转座酶(在不加限制下例如连接于DNA结合结构域的DNA转座酶)；或其任何组合。
在一个方面，本文提供的位点特异性酶识别和结合和/或裂解侧接于选自由以下组成的组的序列的核酸序列：目标靶向基因组序列、兆碱基基因座、供体多核苷酸模板、内源性基因或转基因。
在一个方面，本文提供的位点特异性酶选自由重组酶、核酸内切酶和转座酶组成的组。
在一个方面，本文提供的重组酶是连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶或连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。如本文所用，“DNA结合结构域”或“DNA识别基序”是能够识别和/或结合单链和/或双链DNA的特定序列的多肽结构域。在一个方面，本文提供的连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由Cre重组酶、Gin重组酶、FLP重组酶和Tnp1重组酶组成的组。在另一方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶栓系于锌指DNA结合结构域。在一个方面，本文提供的连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由Bxb1整合酶、phiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶组成的组。在一个方面，本文提供的重组酶栓系或以其他方式连接于DNA识别基序。
位点特异性核酸内切酶(例如兆碱基大范围核酸酶、ZFN、TALEN、Cas9核酸酶、Cpf1核酸酶)在基因组序列的靶标位点处诱导双链DNA断裂，其接着通过天然同源性重组(HR)或非同源性末端接合(NHEJ)过程来修复。序列修饰接着发生在裂解位点处，所述修饰可包括导致在NHEJ的情况下的基因破坏或通过HR达成的核酸序列整合的缺失或插入。
在一个方面，本文提供的核酸内切酶选自由CRISPR相关核酸酶、TALEN、TALE样蛋白、锌指核酸酶和兆碱基大范围核酸酶组成的组。
在一方面，本文提供的位点特异性核酸内切酶是锌指核酸酶。锌指核酸酶是由经工程改造锌指DNA结合结构域融合于FokI限制核酸内切酶的裂解结构域组成的合成蛋白质。通过对锌指DNA结合结构域进行修饰，锌指核酸酶可被设计来裂解双链DNA的几乎任何长度链段。锌指核酸酶从由FokI核酸内切酶的非特异性DNA裂解结构域融合于被工程改造来结合靶标DNA序列的锌指阵列组成的单体形成二聚体。FokI核酸酶结构域需要二聚化来使DNA裂解，因此，需要两个具有它们的C末端区域的锌指核酸酶来结合裂解位点的相对DNA链(分隔5-7bp)。
锌指核酸酶的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列组成。相对于锌指∞-螺旋的起点在位置-1、+2、+3和+6处的促进与靶标DNA的位点特异性结合的氨基酸可被改变和定制以配合特定靶标序列。其他氨基酸形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的锌指核酸酶。用于选择锌指核酸酶的靶标序列的规则在本领域中是已知的。如果两个锌指结合位点是回文的，那么锌指核酸酶单体可切割靶标位点。如本文所用的术语“锌指核酸酶”是广泛的，并且包括可在无来自另一锌指核酸酶的辅助下裂解双链DNA的单体锌指核酸酶。术语“锌指核酸酶”也用于指代被工程改造来一起在相同位点处起裂解DNA的作用的一对锌指核酸酶中的一个或两个成员。
因为锌指结构域的DNA结合特异性在原则上可使用各种方法中的一者加以重新工程改造，所以定制锌指核酸酶在理论上可被构建以靶向几乎任何基因序列。可公开获得的用于对锌指结构域进行工程改造的方法包括情形依赖性装配(CoDA)、寡聚库工程改造(OPEN)和模块装配。
在一方面，本文提供的位点特异性核酸内切酶是TALEN或TALE样核酸酶。TALEN是通过使转录活化子样效应物DNA结合结构域融合于核酸酶结构域来产生的人工限制酶。在一些实施方案中，本文提供的TALEN或TALE样核酸酶的核酸酶结构域选自由PvuII、MutH、TevI和FokI组成的组。当一对TALEN的各成员结合侧接于靶标位点的DNA位点时，核酸酶结构域单体(例如FokI)二聚化，并且在所述靶标位点处导致双链DNA断裂。如本文所用的术语“TALEN”是广泛的，并且包括可在无来自另一TALEN的辅助下裂解双链DNA的单体TALEN。术语“TALEN”也用于指代一起在相同位点处起裂解DNA的作用的一对TALEN中的一个或两个成员。
转录活化子样效应物(TALE)可被工程改造来实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白是源于黄单胞菌属(Xanthomonas)的各种植物细菌性病原体的DNA结合结构域。X病原体在感染期间将TALE分泌至宿主植物细胞中。TALE移动至核中，在其中它识别和结合宿主基因组中特定基因的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有由13-28个具有33-34个氨基酸的重复单体组成的中心DNA结合结构域。除在位置12和13处的高变氨基酸残基之外，各单体的氨基酸是高度保守的。两个可变氨基酸被称为重复可变二残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且对RVD进行调节可识别连续DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这个简单关系已允许通过选择含有适当RVD的重复节段的组合来对特定DNA结合结构域进行工程改造。
除野生型FokI裂解结构域之外，FokI裂解结构域的具有突变的变体已被设计来使裂解特异性和裂解活性改进。FokI结构域以二聚体形式起作用，从而需要两个具有适当定向和间隔的具有针对靶标基因组中的位点的独特DNA结合结构域的构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI裂解结构域之间的氨基酸残基的数目与两个个别TALEN结合位点之间的碱基的数目两者均是用于实现高活性水平的参数。PvuII、MutH和TevI裂解结构域是FokI和FokI变体的用于与TALE一起使用的适用替代物。PvuII在偶联于TALE时充当高度特异性裂解结构域(参见Yank等2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。TevI在DNA中在所靶向位点处引入双链断裂(参见Beurdeley等,2013.Nature Communications.4:1762)。
TALE结合结构域的氨基酸序列与DNA识别之间的关系允许设计蛋白质。诸如DNAWorks的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法为本领域技术人员所知。参见Doyle等,Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等,NucleicAcids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。
在一方面，本文提供的位点特异性核酸内切酶是兆碱基大范围核酸酶。通常在微生物中鉴定的兆碱基大范围核酸酶是导致对靶标DNA的位点特异性消化的具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶。天然存在的兆碱基大范围核酸酶的经工程改造形式通常具有延长的DNA识别序列(例如14至40bp)。
相比于ZFN和TALEN的工程改造，兆碱基大范围核酸酶的工程改造更具挑战，因为兆碱基大范围核酸酶的DNA识别功能和裂解功能缠结在单一结构域中。专门化诱变和高通量筛选方法已用于产生识别独特序列以及具有改进核酸酶活性的新型兆碱基大范围核酸酶变体。
在一方面，本文提供的位点特异性核酸内切酶包括Cas9或Cpf1核酸酶。在另一方面，本文提供的位点特异性核酸内切酶包括RNA引导的Cas9核酸酶或RNA引导的Cpf1核酸酶；CRISPR相关蛋白Csc1和Csc2；Cas6、Cas6e和Cas6f；以及为靶向相应核酸酶所必需的引导RNA的任何组合。
Cas9核酸酶是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式裂解外来DNA来保护它们对抗侵袭性核酸诸如病毒。免疫性通过在CRISPR基因座的近端在两个邻近重复序列之间整合侵袭性DNA的称为间隔体的短片段来获得。包括间隔体的CRISPR阵列在后续与侵袭性DNA相遇期间被转录，并且被加工成长度是约40nt的小干扰CRISPR RNA(crRNA)，其与反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)组合以活化和引导Cas9核酸酶。这裂解侵袭性DNA中称为原间隔体的同源性双链DNA序列。裂解的先决条件是在靶标DNA的下游存在保守原间隔体邻近基序(PAM)，其通常具有序列5-NGG-3，但较不常见地具有序列NAG。特异性由在PAM的上游约12个碱基处的所谓“种子序列”提供，所述种子序列在RNA与靶标DNA之间必须匹配。Cpf1以与Cas9类似的方式起作用，但Cpf1不需要tracrRNA。
本文提供的位点特异性转座酶的非限制性实例包括任何连接于DNA结合结构域的DNA转座酶，诸如TALE-piggyBac或TALE-Mutator。
启动子
在一个方面，本公开中的基因组编辑组分包含至少一个启动子。
“启动子”含有对RNA聚合酶发出信号以与DNA缔合以及启动向mRNA的转录的核苷酸碱基序列，所述转录使用一个DNA链作为模板以制备相应RNA互补链。在一个方面，本文提供的启动子可操作地连接于编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种GEC的DNA。如本文所用，“可操作地连接”意指可操作地连接的核酸序列展现它们的所需功能。举例来说，在本公开的一方面，提供的DNA启动子序列可启动可操作地连接的DNA序列向RNA的转录。本文提供的核酸序列可在物理连接或可操作地连接的核酸序列的上游或下游。在一方面，本文提供的第一核酸分子物理连接于且可操作地连接于本文提供的第二核酸分子。在另一方面，本文提供的第一核酸分子既不物理连接于也不可操作地连接于本文提供的第二核酸分子。如本文所用，“上游”意指核酸序列位于连接的核酸序列的5’末端之前。如本文所用，“下游”意指核酸序列位于连接的核酸序列的3’末端之后。
在一个方面，本文提供的GEC可操作地连接于至少一个启动子。在另一方面，编码GEC的核酸分子被短暂表达。如本文所用，“短暂表达”是指在时间上受限表达。在另一方面，编码本文提供的GEC的核酸分子被组成性表达。
在一个方面，本文提供的启动子选自由组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子组成的组。在另一方面，本文提供的启动子是组成型启动子。在另一方面，本文提供的启动子是诱导型启动子。在另一方面，本文提供的启动子是组织特异性启动子。在一个方面，本文提供的组织特异性启动子选自由胚特异性启动子、配子特异性启动子和早期接合子特异性启动子组成的组。在一个方面，本文提供的启动子在由花粉粒对胚珠受精之后在第一次细胞分裂时在接合子中具有功能性。在一个方面，本文提供的启动子在受精的48小时内在花粉细胞或卵细胞中具有功能性。
在植物细胞中具有活性的许多启动子已描述于文献中。所述启动子包括但不限于在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒上携带的胭脂碱合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒启动子诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子和增强CaMV35S启动子(e35S)。应答于环境、激素、化学和/或发育信号而得以调控的多种其他植物基因启动子也可用于使异源性基因在植物细胞中表达，所述启动子包括例如由(1)热(Callis等,Plant Physiology,(1988)88:965-968)、(2)光(例如豌豆RbcS-3A启动子，Kuhlemeier等,Plant Cell,(1989)1:471-478；玉米RbcS启动子，Schaffner等,Plant Cell(1991)3:997-1012)；(3)激素诸如脱落酸(abscisicacid)(Marcotte等,Plant Cell,(1989)1:969-976)，(4)创伤(例如Siebertz等,PlantCell,(1989)961-968)；或其他信号或化学物质调控的启动子。
在一些实施方案中，启动子能够导致足以导致产生有效量的目标基因产物的表达。描述所述启动子的实例包括不限于美国专利号6,437,217(玉米RS81启动子)、美国专利号5,641,876(稻米肌动蛋白(actin)启动子)、美国专利号6,426,446(玉米RS324启动子)、美国专利号6,429,362(玉米PR-1启动子)、美国专利号6,232,526(玉米A3启动子)、美国专利号6,177,611(组成型玉米启动子)、美国专利号5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(35S启动子)、美国专利号6,433,252(玉米L3油脂蛋白(oleosin)启动子)、美国专利号6,429,357(稻米肌动蛋白2启动子以及稻米肌动蛋白2内含子)、美国专利号5,837,848(根特异性启动子)、美国专利号6,294,714(光诱导型启动子)、美国专利号6,140,078(盐诱导型启动子)、美国专利号6,252,138(病原体诱导型启动子)、美国专利号6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)、美国专利号6,635,806(γ-薏苡辛(gamma-coixin)启动子)和美国专利申请序列号09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。可适用的额外启动子是胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Ebert等,1987)、章鱼碱合成酶(OCS)启动子(其被携带在根癌土壤杆菌的诱导肿瘤的质粒上)、花椰菜花叶病毒启动子诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等,Plant Molecular Biology(1987)9:315-324)、CaMV 35S启动子(Odell等,Nature(1985)313:810-812)、玄参花叶病毒35S启动子(美国专利号6,051,753；5,378,619)、蔗糖合成酶启动子(Yang和Russell,Proceedings of the National Academy of Sciences,USA(1990)87:4144-4148)、R基因复合物启动子(Chandler等,Plant Cell(1989)1:1175-1183)以及叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、PC1SV(美国专利号5,850,019)和AGRtu.nos(GenBank登录号V00087；Depicker等,Journal of Molecular and Applied Genetics(1982)1:561-573；Bevan等,1983)启动子。
在一些实施方案中，可构建启动子杂合物以使转录活性增强(美国专利号5,106,739)，或使所需转录活性、诱导性和组织特异性或发育特异性组合。在植物中起作用的启动子包括但不限于诱导型启动子、病毒性启动子、合成启动子、组成型启动子、在时间上调控的启动子、在空间上调控的启动子和在空间-时间上调控的启动子。其他组织增强型、组织特异性或发育调控的启动子在本领域中也是已知的，并且被设想在本公开的实施中具有效用。
如果需要，那么用于本公开的所提供核酸分子和载体中的启动子可被修饰以影响它们的控制特征。启动子可借助于用操纵子区域进行连接、随机诱变或控制诱变等来获得。此外，启动子可被改变以含有多个“增强子序列”来有助于提高基因表达。
在不加限制下，示例性组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和美国专利号6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature313:810-812)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632以及Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J 3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。
在不加限制下，示例性化学诱导型启动子包括由水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其他目标化学诱导型启动子包括类固醇应答性启动子(参见例如Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425以及McNellis等(1998)Plant J.14(2):247-257中的糖皮质素诱导型启动子)和四环素诱导型启动子(参见例如Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237以及美国专利号5,814,618和5,789,156)。可在本文中使用的额外示例性启动子是导致热调控基因表达、光调控基因表达(例如豌豆rbcS-3A；玉米rbcS启动子；见于豌豆中的叶绿素alb结合蛋白基因；或Arabssu启动子)、激素调控基因表达(例如来自小麦的Em基因的脱落酸(ABA)应答性序列；大麦和拟南芥的ABA诱导型HVA1和HVA22以及rd29A启动子)；以及创伤诱导基因表达(例如wunl的启动子)、器官特异性基因表达(例如块茎特异性贮藏蛋白基因的启动子；所描述的来自玉米的23kDa玉米蛋白基因的启动子；或法国菜豆β-菜豆蛋白(phaseolin)基因的启动子)的那些，或病原体诱导型启动子(例如PR-1、prp-1或β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导型wirla启动子、以及分别是烟草和欧芹的线虫诱导型启动子TobRB7-5A和Hmg-1)。
在不加限制下，示例性组织特异性启动子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20:181-196；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；以及Guevara-Garcia等(1993)PlantJ.4(3):495-505中公开的那些。
转化
对植物细胞进行转化的方法为本领域普通技术人员所熟知。举例来说，通过用涂布有重组DNA的粒子进行微粒轰击来对植物细胞进行转化的具体说明见于美国专利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)；6,153,812(小麦)；6,002,070(稻米)；7,122,722(棉花)；6,051,756(芸苔(Brassica))；6,297,056(芸苔)；美国专利公布20040123342(甘蔗)中，并且土壤杆菌介导的转化描述于美国专利5,159,135(棉花)；5,824,877(大豆)；5,591,616(玉米)；6,384,301(大豆)；5,750,871(芸苔)；5,463,174(芸苔)；和5,188,958(芸苔)中，所述专利全都以引用的方式并入本文。用于对其他植物进行转化的方法可例如见于Compendium of TransgenicCrop Plants(2009)Blackwell Publishing中。为本领域技术人员所知的任何适当方法都可用于用任何本文提供的核酸分子转化植物细胞。
在一个方面，本文提供的植物细胞用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种GEC稳定转化。如本文所用，“稳定转化”是指DNA向所靶向细胞的基因组中的转移允许所述所靶向细胞将经转移DNA传递至下一代中。在另一方面，本文提供的植物细胞用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种GEC短暂转化。如本文所用，“短暂转化”被定义为DNA向细胞中的转移未整合至经转化细胞的基因组中。在一个方面，本文提供的能够诱导单倍体化的植物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种稳定转化GEC。在另一方面，本文提供的能够诱导单倍体化的植物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种短暂转化GEC。在一方面，一种对本文提供的植物细胞进行转化的方法包括基因枪转化或细菌介导的转化。在一方面，一种对本文提供的植物细胞进行转化的方法包括细菌介导的转化，其进一步包括使所述植物细胞与至少一个土壤杆菌细胞接触，其中所述土壤杆菌细胞能够对所述植物细胞进行转化。
用以提供本文提供的含有稳定整合的核酸分子的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选在采用培养基以及在受控环境中进行组织培养的情况下实施。如本文所用，“培养基”是指用于使细胞在体外(也就是说在完整活生物体外部)生长的众多营养物混合物。
在一个方面，本公开提供不是繁殖性材料，并且不介导植物的天然繁殖的植物细胞。在另一方面，本公开也提供是繁殖性材料，并且介导植物的天然繁殖的植物细胞。在另一方面，本公开提供不能通过光合作用来维持它们自身的植物细胞。在另一方面，本公开提供植物体细胞。与种系细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
用于转化的接受细胞靶标包括但不限于种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、嫩芽细胞、干细胞、荚细胞、花细胞、花序细胞、茎细胞、柄细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、花丝细胞、子房细胞、胚珠细胞、果皮细胞、韧皮部细胞、芽细胞或维管组织细胞。在另一方面，本公开提供一种植物叶绿体。在另一方面，本公开提供一种表皮细胞、一种气孔细胞、一种毛状体细胞、一种根毛细胞、一种贮藏根细胞或一种块茎细胞。在另一方面，本公开提供一种原生质体。在另一方面，本公开提供一种植物愈伤组织细胞。可繁殖植物可由其再生的任何细胞都被涵盖为适用于实施本公开的接受细胞。愈伤组织可开始于各种组织来源，包括但不限于不成熟胚或胚的各部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖成愈伤组织的那些细胞可充当转化接受细胞。用于制备本公开的转基因植物的实际转化方法和材料(例如各种培养基和接受靶标细胞、不成熟胚的转化以及可繁殖转基因植物的后续再生)例如公开于美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公布2004/0216189中。
在一个方面，本公开提供一种通过任何本文提供的方法来转化的植物细胞。在一方面，本文提供的植物细胞选自由以下组成的组：金合欢(Acacia)细胞、苜蓿细胞、小茴香细胞、苹果细胞、杏细胞、洋蓟细胞、芝麻菜细胞、芦笋细胞、鳄梨细胞、香蕉细胞、大麦细胞、菜豆细胞、甜菜细胞、黑莓细胞、蓝莓细胞、西兰花细胞、抱子甘蓝(Brussels sprout)细胞、卷心菜细胞、加拿大油菜细胞、棱瓜细胞、胡萝卜细胞、木薯细胞、花椰菜细胞、芹菜细胞、大白菜细胞、樱桃细胞、芜荽细胞、柑桔细胞、细皮小柑桔细胞、咖啡细胞、玉米细胞、棉花细胞、黄瓜细胞、花旗松(Douglas fir)细胞、茄子细胞、菊苣细胞、苦苣细胞、桉树细胞、茴香细胞、无花果细胞、森林树木细胞、葫芦细胞、葡萄细胞、葡萄柚细胞、蜜瓜细胞、豆薯细胞、猕猴桃细胞、莴苣细胞、韭菜细胞、柠檬细胞、酸橙细胞、火炬松(Loblolly pine)细胞、芒果细胞、枫树细胞、甜瓜细胞、蘑菇细胞、油桃细胞、坚果细胞、燕麦细胞、秋葵细胞、洋葱细胞、橙细胞、观赏植物细胞、番木瓜细胞、欧芹细胞、豌豆细胞、桃子细胞、花生细胞、梨细胞、胡椒细胞、柿子细胞、松树细胞、菠萝细胞、大蕉细胞、李子细胞、石榴细胞、白杨细胞、马铃薯细胞、南瓜细胞、榅桲细胞、辐射松细胞、红菊苣细胞、萝卜细胞、油菜籽细胞、树莓细胞、稻米细胞、黑麦细胞、高粱细胞、南方松(Southern pine)细胞、大豆细胞、菠菜细胞、南瓜小果细胞、草莓细胞、糖用甜菜细胞、甘蔗细胞、向日葵细胞、甜玉米细胞、甜薯细胞、枫香细胞、红桔细胞、茶细胞、烟草细胞、番茄细胞、草皮细胞、藤细胞、西瓜细胞、小麦细胞、山药细胞和绿皮西葫芦细胞。在另一方面，本文提供的植物细胞选自由以下组成的组：玉米(corn/maize)细胞、大豆细胞、加拿大油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞和甘蔗细胞。
在另一方面，本文提供的植物细胞选自由以下组成的组：玉米不成熟胚细胞、玉米成熟胚细胞、玉米种子细胞、大豆不成熟胚细胞、大豆成熟胚细胞、大豆种子细胞、加拿大油菜不成熟胚细胞、加拿大油菜成熟胚细胞、加拿大油菜种子细胞、棉花不成熟胚细胞、棉花成熟胚细胞、棉花种子细胞、小麦不成熟胚细胞、小麦成熟胚细胞、小麦种子细胞、甘蔗不成熟胚细胞、甘蔗成熟胚细胞、甘蔗种子细胞。
在一个方面，植物细胞的转化通过土壤杆菌介导的方法(美国专利号6,265,638、5,731,179；美国专利申请公布2005/0183170；2003/110532)来进行。在本公开方法中用于转化的DNA构建体通常也含有在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA节段，例如大肠杆菌(Escherichia coli)复制起点诸如ori322、土壤杆菌复制起点诸如oriV或oriRi、以及可选择标记的编码区，所述可选择标记诸如编码Tn7氨基糖苷腺苷酰基转移酶(aadA)，从而赋予对壮观霉素或链霉素的抗性的Spec/Strp，或庆大霉素(Gm，Gent)可选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株经常是携带具有表达单元的转移功能的质粒的根癌土壤杆菌ABI、C58、LBA4404、AGLO、AGL1、EHA101或EHA105。为植物转化领域技术人员所知的其他菌株可在本公开中起作用。
为确认整合DNA存在于经转化细胞或基因组中，可进行多种测定。所述测定包括例如分子生物测定(例如Southern和northern印迹、PCRTM)；生物化学测定，诸如检测蛋白质产物的存在性(例如通过免疫手段(ELISA和western印迹)，或通过酶作用(例如GUS测定))；花粉组织化学；植物部分测定(例如叶或根测定)；以及通过分析完整再生植物的表型。
本公开也提供一种包含根据本文公开的方法整合至植物细胞的基因组中的目标序列的转基因植物细胞。也提供一种通过本文公开的方法产生的转基因植物。
B染色体
如本文所用，术语“超数染色体”是指除A染色体的正常互补序列之外，也得以所见的额外染色体。在一个方面，本文提供的HI株系包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个超数染色体。在另一方面，本文提供的接受株系包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个超数染色体。在一个方面，本文提供的超数染色体是B染色体。在另一方面，本文提供的超数染色体是人工获得的染色体。在另一方面，本文提供的人工获得的染色体是截短染色体或重新产生的染色体。
在一方面，本文提供的B染色体是玉米B染色体。在另一方面，本文提供的B染色体是黑麦B染色体。在一方面，本文提供的B染色体是摩擦禾B染色体。除染色体的正常二倍体互补序列之外，B染色体也见于细胞中。举例来说，在玉米中，染色体的正常二倍体互补序列数是20。B染色体是非必需的，并且不为正常植物发育所需。当两个B染色体存在于单一植物中时，两个B染色体可在减数分裂前期时彼此配对，并且可发生重组。B染色体不与A染色体配对或重组。
在一个方面，本文提供的方法包括将目标DNA并入超数染色体中。在另一方面，本文提供的方法包括修饰超数染色体上至少一个基因座。在另一方面，本文提供的方法包括使核酸分子从超数染色体向A染色体、质体基因组或线粒体基因组易位。
在一个方面，本文提供的超数染色体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种GEC。在一个方面，本文提供的超数染色体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个供体多核苷酸模板。在一个方面，本文提供的超数染色体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或至少10种位点特异性酶。在另一方面，本文提供的超数染色体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个兆碱基基因座。在一个方面，本文提供的超数染色体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个转基因。在另一方面，本文提供的超数染色体由位点特异性酶结合和/或裂解。
在一个方面，本文提供的位于A染色体、线粒体基因组或质体(例如叶绿体)基因组上的GEC修饰超数染色体的至少一个核酸序列。在另一方面，本文提供的位于超数染色体上的GEC修饰A染色体、线粒体基因组或质体(例如叶绿体)基因组的至少一个核酸。
在一个方面，使包含本文提供的超数染色体的细胞经受照射以产生1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个基因组重排。
在一方面，本文提供的超数染色体是B-A染色体或A-B染色体。B-A染色体和A-B染色体由在玉米中正常A染色体与超数B染色体之间的相互易位产生。B-A易位导致B-A染色体和A-B染色体，其中第二所列染色体表示不具有它的天然着丝粒的染色体臂。举例来说，9S-B染色体包含B染色体臂连接于染色体9的正常短臂和染色体9着丝粒；互逆B-9L染色体包含B染色体臂和着丝粒连接于正常染色体9的长臂。B-A染色体和A-B染色体可以减数分裂方式与相应正常A染色体重组。作为一非限制性实例，9S-B染色体可以减数分裂方式与正常染色体9的短臂重组。
在一个方面，本文提供的兆碱基基因座位于B-A染色体或A-B染色体上。在另一方面，本文提供的转基因位于B-A染色体或A-B染色体上。在另一方面，本文提供的GEC位于B-A染色体或A-B染色体上。在一个方面，本文提供的供体多核苷酸模板位于B-A染色体或A-B染色体上。在另一方面，本文提供的位点特异性酶位于B-A染色体或A-B染色体上。
在一个方面，本公开提供一种通过减数分裂重组来使兆碱基基因座、转基因或GEC从B-A染色体或A-B染色体向相应正常染色体易位的方法。
根据本公开的某些方面，可将一个或多个B染色体递送至不具有父系或母系基因组的其余部分的子代植物中(例如通过保留B染色体的单倍体诱导杂交)，从而允许在单次杂交中完全转变成新品种。在另一方面，B染色体可从第一植物物种转移至第二植物物种中，从而允许在其他作物中测试一种或多种转基因。举例来说，已证明B染色体向燕麦的传递，以及玉米染色体向小麦的传递(Koo等,Genome Research 21(6):908-914,2011；Comeau等,Plant Science 81(1):117-125,1992)。
在某些情况下，诸如在玉米和黑麦中，B染色体具有允许它们在大于孟德尔(Mendelian)频率的频率下进行传递的“积累机理”。举例来说，在玉米中，B染色体的姐妹染色单体未能在第二次花粉(第一次生殖)分裂期间分离。因此，两个姐妹染色单体均被递送至一个精子中，而另一精子未得到两者中的任一者。这个效应，称为不分离，意指具有仅单一B染色体的植物在用作雄性时可将零个、一个或两个B染色体递送至下一代中。这种效应在性状基因渗入过程期间可为合乎需要的，因为它允许在回交中回收就在B染色体上携带的兆碱基基因座来说是纯合的(与半合的相对比)个体，只要从花粉递送B染色体即可。
不分离效应要求存在B染色体的特定部分。需要的是在长臂的顶端的反式作用性片块和在着丝粒附近的顺式作用性片块。在B染色体的长臂的顶端的极小缺失是可恢复的，并且所得B染色体不展现不分离。在本公开的某些实施方案中，例如出于递送兆碱基基因座以获得商业性状的目的，B染色体的这种缺失变体可为需要的。在一方面，本文提供的超数染色体经受不分离。
杂交
这些方法的某些方面包括使一个亲本植物与另一亲本植物“杂交”以产生子代植物。杂交也包括“自交”，其中相同植物(或在遗传上类似的亲缘植物)用作雄性亲本与雌性亲本两者。本领域普通技术人员也将了解，经常视所选亲本的类型而定，可在本文中采用各种不同类型的杂交以产生杂交物。本领域中已知的其他方式的复杂杂交流程可进一步用于在不同组的杂交物、近交物、杂种优势指定物、种族、倍数性水平(例如单倍体、二倍体、双单倍体、三倍体、多倍体等)、物种等之内和之间产生杂交物群体，所述复杂杂交流程包括例如3元杂交、4元杂交、5元杂交等。此外，在两个植物或植物细胞之间产生后代的多种不同方式也可与产生子代细胞关联使用。
在某些方面，当花粉接触雌性繁殖性结构(例如柱头、花粉管、大配子体、胚珠等)时进行杂交。在某些方面，进行杂交的结果在于产生子代接合子细胞。接合子细胞无需含有来自两个亲本的遗传物质，例如由与单倍体诱导株系杂交产生的子代植物可不含有从诱导亲本遗传的DNA，但由所述方法产生的子代植物细胞仍然被视为诱导亲本的子代。
本发明的一个方面是使GEC足够接近于靶标基因组，以致它编码的产物能够作用于邻近的靶标基因组。举例来说，本文所述的方法的实例解释此可如何通过受精和/或配子配合以将精细胞中含有的GEC递送至使用者希望进行编辑的基因组所驻留于其中的卵细胞的核中来实现。可易于了解的是在与靶标基因组处于同一核中表达GEC可导致所需编辑。然而，本领域中也已知GEC转录和/或翻译的产物可加以跨膜运送，以致GEC无需自始至终与靶标基因组处于同一核的内部来使它编码的产物跨越核被膜进行扩散和/或运送或以其他方式迁移至它们可接着在其中产生所需编辑的靶标基因组。此外，甚至可能的是GEC不与靶标基因组在同一细胞中表达，因为本领域中也已知转录和/或翻译的产物可跨越细胞膜并进入细胞中以及从那里跨越核被膜进行扩散、迁移和/或运送以在靶标基因组中产生所需编辑。
本文公开的方法的某些方面包括在各种类型的植物之间进行杂交，已知的是所述植物的基因组不持续存在于子代的细胞中，和/或已知的是所述植物的基因组在子代中极其少许或完全不与另一亲本的基因组重组，或在两个基因组持续存在于子代的同一细胞中的时间期间完全不重组。举例来说，已描述大豆的多倍体品种(Beversdorf WD.(1979)CanJ Plant Sci.59:945-948)，因此预期替代使用玉米单倍体诱导物基因组作为载体染色体，例如可将GEC放置在二倍体大豆的基因组中，接着使那个植物与四倍体大豆植物杂交以在所述四倍体大豆植物的基因组中进行所需编辑。使两个植物杂交将产生三倍体后代；一个基因组从含有GEC的二倍体亲本遗传，并且两个基因组从四倍体亲本遗传，其中的一者或两者可为GEC的靶标。两个基因组将在彼此的编辑距离内(例如在同一细胞中)存在足够长久时间以便GEC进行所需编辑，但因为本领域中已知在2x x 4x杂交中从二倍体亲本遗传的基因组很快在后代中被消除，所以可了解的是2x亲本的染色体上的GEC也将被消除，并且将有可能最终回收仅含有从四倍体亲本遗传的基因组的二倍体子代，所述基因组中的至少一者含有所需编辑。视编辑的性质以及基因组之间的同源性而定，所需编辑可在从四倍体亲本遗传的基因组中的一者或两者中进行。预期在本公开的情况下，植物育种人员现将认识到这个理念如何不限于二倍体和四倍体，而是可在不改变异倍性间杂交的染色体消除机理可如何用于使GEC在靶标基因组的编辑距离内，和/或这个机理可如何用于从子代细胞移除GEC的基本构思下应用于在具有不同倍数性水平的植物之间进行的许多其他杂交。
因此，如本文所用的杂交是广泛术语，其包括其中使含有GEC的载体染色体足够接近于靶标基因组，以致由所述GEC表达的产物能够在靶标基因组中产生所需编辑的任何情况。本领域技术人员将了解存在使这个距离延长的方法，但原理仍然是相同的。
如本文所用，“回交(backcross/backcrossing)”是指子代植物与它的一个亲本重复向回杂交的过程。在回交流程中，“供体”亲本是指具有待渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“接受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座向其中渗入的亲本植物。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指第二次使用轮回亲本，“BC2”是指第三次使用轮回亲本，诸如此类。在一个方面，重复进行回交，其中各个连续回交世代的子代个体自身与同一亲本基因型回交。在一个方面，使本文提供的包含经修饰基因组的植物回交或自我受精以移除超数染色体。
如本文所用，“优良品种”意指已由育种以及选择优越农艺学性能所产生的任何品种。
如本文所用，在育种的情形下，“选择(selecting/selection)”是指基于某些预定准则通常从群体挑选或挑拣所需个体的行为。
在一个方面，本文提供的植物是杂交植物。杂交物可通过防止第一品种的雌性亲本植物(例如种子亲本)的自我授粉，容许来自第二品种的雄性亲本植物的花粉对雌性亲本植物进行受精，以及使F1杂交种子在雌性植物上形成来产生。杂交植物也可通过使来自两个不同物种的植物杂交来产生。
不稳定杂交物的特征在于一个亲本的染色体在减数分裂期间消除，从而产生保留仅来自一个亲本的染色体的配子。与所需目标亲本的回交的子代产生其中大致上不存在一个亲本的基因组的植物。通过转化来与所需物种形成不稳定杂交物的供体物种通过添加GEC和/或目标多核苷酸和/或基因组节段来制备。所需组分通过转化或通过基因渗入来添加。使供体物种与所需接受物种杂交以形成包含GEC的不稳定杂交物。
实施例
以下实施例提供本公开的说明性实施方案。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应了解可在不脱离本公开的构思、精神和范围下，在这些实施方案的特定方面进行许多改变。此外，明显的是在化学与生理两方面均相关的某些试剂可替代本文所述的试剂，同时将实现相同或类似结果。为本领域技术人员显而易知的所有所述类似替代物和修改都被视为在如由随附权利要求限定的本公开的精神、范围和构思内。
实施例1.使用单倍体诱导物基因组作为GEC载体染色体进行的基因组修饰。
对目标植物的基因组的修饰可通过使用母系单倍体诱导杂交以在从所述目标植物遗传的基因组的附近短暂表达基因组编辑组分(GEC)来进行。
举例来说，可使用本领域中已知的任何转化方法(例如GA de la Riva,JGonzalez-Cabrera,R Vasquez-Padron和C Ayra-Pardo,Elec J of Biotech(1998)115:12)将Cas9/gRNA构建体转化至以它能够诱导产生单倍体后代而著称的植物的基因组中，所述植物例如是包含高油表型的玉米母系单倍体诱导物如CAUHOI(X Dong,X Xu,L Li,CLiu,X Tian,W Li,S Chen(2014)Mol Breeding 34:1147-1158)。gRNA可被设计来靶向靶标玉米株系的基因组的基因或基因座，例如玉米株系B73的基因组中蜡质(Wx)基因序列的剔除突变(M Shure,S Wessler,NFedoroff,Cell(1983)35:225-233)。可使Cas9可操作地连接于启动子例如玉米Ubi-1(AH Christensen,RA Sharrock,PH Quail,Plant Mol boil(1992)18:675-689)，并且可使gRNA可操作地连接于能够在受精之前和/或期间和/或之后在花粉细胞和/或卵细胞和/或接合子细胞和/或胚细胞中使Cas9和gRNA表达的启动子(例如稻米U6启动子PU6.1)。
可接着载培包含Cas9-gRNA的经转化单倍体诱导株系以产生也包含Cas9-gRNA的花粉，并且这个花粉可用于对玉米株系B73的雌性亲本进行受精。在来自雄性单倍体诱导亲本的花粉接触雌性亲本之后，将存在从诱导亲本遗传的Cas9-gRNA序列将紧密邻近于从雌性亲本遗传的基因组而存在所处的一段时期(例如接近配子配合的时间)，因此在对卵受精之前不久和/或期间和/或之后，Cas9-gRNA将从诱导物遗传的基因组表达，并且产物将随后能够修饰从雌性亲本遗传的邻近基因组，例如通过修饰B73的Wx基因。在某些实施方案中，当诱导杂交的子代处于它的生命周期的接合子时期时，发生基因组编辑过程。在某些实施方案中，基因组编辑过程需要较长时期，有可能跨越子代植物的组织中的数轮有丝分裂。
在编辑B73基因组之后，诱导物基因组和它含有的Cas9-gRNA将通过为玉米母系单倍体诱导物所特有的一种自发基因组消除机理从某一频率的子代中的细胞丧失，由此产生相应频率的含有经编辑B73基因组的单倍体子代植物。从植物育种观点来看，因而断定，除预期在细胞分裂和/或DNA复制期间发生的各种类型的天然和/或自发(例如随机)突变之外，由Cas9-gRNA编辑以及由单倍体子代遗传的B73基因组将与单倍体子代的雌性亲本中含有的B73基因组相同。
因此，在这个实施例中，将产生某一频率的单倍体子代植物，其包含大致上与子代的雌性亲本的原始B73基因组相同的B73基因组，例外之处是具有由短暂反式作用性Cas9-gRNA产生的Wx剔除突变(Cas9-gRNA在受精期间或之后某一时间连同诱导亲本的基因组一起被消除)。
单倍体子代可使用本领域中已知的任何方法(例如可见花青素标记如R1-nj)来鉴定。如果利用高油诱导物如CAUHOI，那么自动化系统可用于使用本文所述的高油种子分选方法来从二倍体子代鉴定和分选单倍体子代种子。
明确含有经编辑B73基因组的单倍体子代可利用本领域中已知的广泛范围的方法，使用已知与编辑相关联(正性关联或以其他方式关联)的任何标记来鉴定。在某些实施方案中，可使用2005年9月26日提交以及以US20060048247公布和以美国专利号7,502,113授予的美国专利申请11/213,430中所述的方法，使单倍体种子经受种子切片和分子表征，所述专利以引用的方式整体并入本文。本领域中已知的这些和其他方法和标记可与本发明联合用于筛选和/或鉴定含有所需编辑的单倍体子代，包括但不限于检测或测定植物细胞和/或组织中产生或由植物细胞和/或组织产生的核苷酸和/或氨基酸序列的任何方法(例如表型筛选、DNA测序、蛋白质测序、使用CelI或类似酶进行的DNA不匹配分析、对含有靶标序列的PCR扩增子的高分辨率熔解曲线分析、或其他分子方法等)。
本文所述的方法不限于可在产生编辑之后对单倍体子代进行的任何活动。在某些实施方案中，使用者可需要使单倍体子代中的细胞的染色体加倍，在所述情况下，任何染色体加倍方法都可用于这个目的。举例来说，使用者可需要高度有效加倍方法，如2014年5月1日提交的美国临时专利申请61/687,260和2015年5月1日提交，并且题为Aided Deliveryof Plant Treatment Agents的相应PCT申请PCT/US2015/028955中所述的那些，所述专利以引用的方式整体并入本文。广泛范围的替代性方法也可用于使使用本文所述的方法产生的单倍体子代的细胞加倍，包括本领域中所述的任何类型的加倍剂和/或加倍技术。
本文所述的方法不限于可用于影响产生单倍体子代所伴有的频率和/或效率的任何活动。举例来说，使用者可需要使用美国临时专利申请61/987,260和2016年7月15日提交，并且题为Methods for Creating Doubled Haploid Plants的相应PCT申请PCT/US2016/042471中所述的方法来使单倍体诱导效率增加。此外，任何类型的诱导物都可在本文所述的杂交中用作亲本和/或用作GEC的载体。这些方法的使用者可由于似乎适于各种情况的任何原因选择诱导物，所述原因包括可能诱导物的基因组在子代细胞中被消除所伴有的某一频率阈值。在某些实施方案中，使用者可通过进行与相关物种的远缘杂交来在各种频率下诱导单倍性。假定在使用本文公开内容的情况下，本领域普通技术人员现时可立刻认识到可将许多不同GEC和gRNA转化至能够在目标作物中产生单倍体胚的广泛范围的植物的基因组中，例如用Cas9和编码玉米Wx基因的突变剔除的gRNA转化摩擦禾植物，接着在与B73的杂交中使用那个植物作为亲本以产生包含含有Wx基因剔除编辑的B73基因组的单倍体后代(例如通过并入由RV Sairam,C Wilber,J Franklin.等(2002)In Vitro Cell DevBiol-Plant 38:435所述的方法)。
本文方法也不以任何方式限于某些GEC或gRNA类型或序列。能够由核苷酸序列编码的任何GEC或gRNA都可与本文所述的方法联合使用，包括转基因、天然基因或改变核苷酸序列的任何其他过程(即突变)。基于本公开，植物分子生物学领域普通技术人员可与本发明联合使用甚至相对复杂的系统，例如用包含GEC的病毒复制子前体转化单倍体诱导物，所述GEC转而包含可操作地连接于适当启动子，并且由LIR双粒病毒序列侧接的复制酶基因，接着使用那个植物对B73植物授粉，接着回收包含含有由所述GEC编码的所需编辑的B73基因组的单倍体子代。
此外，预期普通技术植物育种人员将立刻认识到甚至极其大段DNA例如QTL、兆碱基基因座、跨越若干(十几)厘摩(centimorgan)的染色体间隔、乃至染色体臂的可观区段也可使用本文所述的方法来易位至靶标基因组中和/或易位出靶标基因组。在某些实施方案中，可使用2013年3月15日提交的美国临时专利申请61/787,894和/或题为Creation andTransmission of Megaloci，并且于2014年3月13日提交的相应美国专利申请14/209,731中所述的方法和组合物。在某些实施例中，在靶标基因组中产生的编辑包含可操作地连接于可用于驱动和/或控制转基因的表达的启动子的转基因核苷酸序列，所述启动子例如是可操作地连接于杀昆虫蛋白Cry1Ab的CaMV 35S启动子。
或者，携带GEC的单倍体诱导株系和携带靶标编辑的接受株系均可被加倍以产生四倍体植物。可接着使四倍体诱导株系与四倍体接受株系杂交以产生携带所需编辑的双单倍体子代。诱导物基因组和GEC均在四倍体杂交过程期间被消除。因此，方法不需要在发生基因组编辑之后进行任何进一步加倍。
实施例2.使用超数染色体作为GEC载体染色体来修饰植物基因组。
基因组编辑可通过使植物与包含超数染色体例如B染色体的单倍体诱导株系杂交来在靶标植物基因组中产生，所述超数染色体含有编码GEC诸如Cas9和相关gRNA系统的表达盒。
类似于实施例1描述的在受精之前不久和/或期间和/或之后GEC从诱导物基因组进行短暂表达，在这个实施例中，单倍体诱导物的细胞含有包含被设计来靶向靶标玉米株系的基因或基因座例如靶标B73基因组中的Wx基因的gRNA的超数染色体，例如B染色体。可使Cas9可操作地连接于启动子例如玉米Ubi-1，并且可使gRNA可操作地连接于能够在受精之前不久和/或期间和/或之后在花粉细胞和/或卵细胞和/或接合子细胞和/或胚细胞中使Cas9和gRNA表达的启动子(例如稻米U6启动子PU6.1)。
包含这个B染色体的单倍体诱导物的花粉可接着用于对玉米株系B73的雌性亲本进行受精。在来自雄性单倍体诱导亲本的花粉接触雌性亲本之后，将存在由B染色体携带以及从诱导亲本遗传的Cas9-gRNA序列将紧密邻近于从雌性亲本遗传的基因组而存在所处的一段时期(例如接近配子配合的时间)，因此在对卵受精之前不久和/或期间和/或之后，Cas9-gRNA将从诱导物遗传的B染色体表达，并且产物将随后能够修饰从雌性亲本遗传的邻近A基因组，例如通过修饰B73的Wx基因。在某些实施方案中，当诱导杂交的子代处于它的生命周期的接合子时期时，发生基因组编辑过程。
因为在作为雄性杂交时B染色体可经受不分离，所以当与含有零个B染色体的雌性植物杂交时，由具有一个B染色体的雄性亲本产生的子代可包含零个、一个、两个或更多个B染色体，甚至在诱导亲本的A基因组已在子代中被消除之后也是如此。因此，在某些实施方案中，超数染色体超过接合子时期而持续存在于子代的细胞中，例如持续数轮有丝分裂，从而为在超数染色体在子代中被消除之前发生基因组编辑过程提供延长窗口。含有至少一个从诱导亲本遗传的B染色体的子代可使用由使用者所需的任何方法来鉴定和分离，例如核苷酸测序、分子标记检测等。
在某些实施方案中，可需要和/或必要的是在进行编辑之后“育除”子代植物中含有的超数染色体，例如通过使子代植物远交或自交，以及分析和选择(例如通过分子标记和/或核苷酸和/或氨基酸序列分析和/或一些其他方法)已丧失超数染色体的那些子代。
在某些实施方案中，在编辑B73基因组之后，B染色体和它含有的Cas9-gRNA可通过为玉米超数染色体消除所特有的一种自发消除机理从某一频率的子代的细胞消除，由此产生相应频率的含有经编辑B73基因组的单倍体子代植物。
从植物育种观点来看，因而断定，除预期在细胞分裂和/或DNA复制期间发生的各种类型的天然和/或自发(例如随机)突变之外，由Cas9-gRNA编辑以及由单倍体子代遗传的B73基因组将与单倍体子代的雌性亲本中含有的B73基因组相同。
如实施例1和本文其他地方中所述，这些方法不限于可在进行编辑之前、期间或之后进行的任何方式的额外活动。视使用者的目标而定，例如也可进行染色体加倍、和/或基因型和/或表型分析和筛选、和/或用以改进单倍体诱导的步骤、和/或用以确认加倍的自交等，例如与本文实施例1中所述的那些相类似。植物遗传学领域普通技术人员将立刻了解含有包含某一特定编辑的优良基因组例如具有Wx基因座中的剔除突变的B73基因组的单倍体植物的应用。
本文所述的方法也不以任何方式限于获得含有GEC的超数染色体所采用的过程。已描述广泛范围的用于产生包含所需序列的超数染色体的可能选项。举例来说，预期可使含有B染色体的第一亲本植物与编码可操作地连接于启动子的能够将A基因组中的特定序列并入子代中的B染色体中的重组酶和/或核酸酶的第二亲本植物杂交。其他实例包括照射含有B染色体的花粉以在B染色体和/或A染色体中产生一个或多个自发(例如随机)断裂，其可在某一频率下重组以形成含有GEC和所需模板DNA序列的新B染色体。其他实例包括使用能够使DNA序列从A基因组易位至B染色体中的B-A易位机理，例如位于A基因组的染色体9的短臂上的GEC。本领域技术人员将立刻了解用于产生具有所需序列的超数(例如B)染色体的这些和其他方法可与本发明联合使用。
实施例3.单倍体诱导与将外源性核酸递送至接受株系中联合
可通过使用单倍体诱导杂交来将转基因性状递送至目标植物中。通过标准育种或植物转化技术来将编码目标转基因(“供体转基因”)和位点特异性酶的核酸序列引入HI玉米植物中。位点特异性酶可操作地连接于能够在受精之前、期间或之后在花粉细胞、卵细胞和/或接合子中使GEC表达的启动子。
使包含供体转基因和GEC的HI玉米植物作为雄性与第二玉米植物杂交，并且在受精之前不久、期间或之后，GEC被短暂表达。在父系核基因组丧失之前，GEC使供体转基因从HI玉米植物的基因组易位至卵细胞的母系基因组内的所靶向位置中。
如实施例1中所述鉴定经诱导单倍体种子。经诱导单倍体种子中对供体转基因的接收通过PCR、ELISA或为本领域技术人员所知的其他分子方法来确认。在确认供体转基因整合和单倍体诱导之后，如果需要，那么可使用本领域中已知的任何方法使单倍体种子经受染色体加倍。
实施例4.使用叶绿体基因组作为GEC载体染色体来修饰植物基因组。
根据标准分子生物学技术，对玉米叶绿体基因组进行转化以包含靶向Wx的gRNA和Cas 9，其可操作地连接于能够在受精之前、期间或之后在卵细胞和/或接合子中使GEC表达的启动子。可使转移肽可操作地连接于Cas9以允许它从叶绿体转移至核中。这种肽的一实例是whirly蛋白的一部分(Isemer R,Mulisch M,SK,Koop HU,Krupinska K.(2012)FEBS Letters 58:85-55)。使用标准分子生物学技术(例如序列分析、PCR)或表型筛选来鉴定包含经成功转化叶绿体的玉米植物。通过以下方式来将包含经转化叶绿体基因组的玉米植物育种成不确定配子体1(ig1)背景：使作为雌性的包含经转化叶绿体基因组的玉米株系和作为雄性的ig1玉米植物杂交，随后自我授粉或进一步与ig1植物回交(使用ig1作为雄性亲本)以获得就ig1来说是纯合的也包含经转化叶绿体的植物。就ig1突变来说是纯合的玉米植物能够在受精之后通过消除母系核基因组来产生父系单倍体。
使包含用靶向Wx的gRNA和Cas 9 GEC转化的叶绿体基因组的ig1植物作为雌性与例如B73的接受株系的玉米植物杂交。在受精之后，母系核基因组丧失，由此产生包含B73核基因组和经转化叶绿体基因组的单倍体子代。在受精之后以及在后续单倍体或双单倍体植物的整个发育中，靶向Wx的gRNA和Cas 9从叶绿体基因组表达，此导致对B73核基因组的修饰。在它们的父源性B73基因组中携带所需修饰的所得单倍体子代可如实施例1和本文其他地方中以及本领域中所述加以鉴定。
在某些实施方案中，靶向Wx的gRNA和Cas9组分可通过以下方式来从子代“育除”：使它们与包含第二ig1突变，但缺乏gRNA和/或Cas9序列的植物杂交，以及回收含有Wx修饰，但不含有gRNA和/或Cas9序列的后代。或者，靶向Wx的gRNA和Cas9组分可通过以下方式来从包含Wx修饰的B73子代“育除”：使它们作为雄性与B73或其他株系杂交，以及回收含有Wx修饰的后代。因为叶绿体不通过花粉来高效转移，所以缺乏gRNA和/或Cas9序列的后代得以回收。
实施例5.天然基因作为用以引导DNA修复的模板
天然基因变体(等位基因)可用于引导对所需株系中的相应基因的修饰。使用核酸酶从核基因组切除天然等位基因，接着使用来自HI株系的天然等位基因作为修复模板，通过同源性重组来修复经切除DNA。
TALEN被设计来从拟南芥切除缺陷性透明种皮无毛1(ttg1-1)等位基因，其中一个TALEN被设计来在ttg1-1等位基因中存在的突变位点处进行结合。这种设计允许TALEN结合和切除ttg1-1等位基因，而非功能性野生型TTG1等位基因。TTG1的表达对拟南芥种子提供色素沉着。
产生转化构建体，其中编码一对TALEN的核酸序列可操作地连接于经修饰形式的卵/接合子特异性启动子EC1.2en_EC1.1p。转化构建体进一步包含编码绿色荧光蛋白(GFP)和用以提供除草剂耐受性的可选择标记的核酸序列。将转化构建体转化至就CENH3基因(编码着丝粒特异性组蛋白CENH3蛋白)的无效等位基因来说是杂合的，就GFP-tailswap-CenH3转基因(参见Ravi和Chan.2010.Nature.464:615-619)来说是纯合的，以及就野生型TTG1等位基因来说是纯合的拟南芥植物中。
使用除草剂筛选所得子代；包含转化构建体的转化体对所述除草剂具有抗性。接着分析除草剂耐受性转化体的基因型以鉴定就CENH3无效等位基因来说是杂合的转基因事件。使包含转化构建体，以及就CENH3无效等位基因来说是杂合的植物自我授粉。
选择所得子代中的就CENH3无效等位基因来说是纯合的，以及就转化构建体来说是纯合的单倍体诱导个体。使所选个体生长，并且作为雌性与雄性ttg1-1突变株系杂交。筛选所得种子中的缺乏GFP表达，但在种子中具有野生型TTG1色素沉着的个体。使所述植物生长，并且使用标准分子生物学技术(例如序列分析、PCR、DART)来检查以确认ttg1-1等位基因已被转变成野生型TTG1等位基因。
实施例6.使基因组编辑元件可起在靶标基因组中产生编辑的作用所处的时期延长。
设想的是本领域中已知用于在植物中改变细胞生长、细胞分裂和/或细胞发育的任何方法都可与本文公开的方法联合使用。在某些实施方案中，使用者可使用已知用以在植物中减缓、延迟和/或停止细胞分裂的任何方法来延长含有GEC的载体分子保持足够接近于靶标基因组，以致所述GEC的产物可完成所需编辑所处的时期。这些方法包括使用各种PGR(例如细胞分裂素)和其他化学处理，以及改变植物的生长环境的其他方面。举例来说，通过使对胚进行培育所处的温度降低，可使细胞分裂速率降低。因此，预期可使用例如如实施例1中所述的被转化来在它的基因组中包含可操作地连接于启动子(例如Ubi-1)的包含Wx剔除突变的GEC的玉米单倍体诱导株系来对含有使用者需要在其中产生编辑的基因组的植物例如B73进行授粉。在由诱导物授粉之后，在低温中培育单倍体胚和/或接合子，由此使诱导物基因组和它含有的GEC在GEC能够产生所需编辑之前丧失的可能性降低。
这些方法不限于特定类型的调控序列，并且已知用以调控植物基因组的表达的任何核苷酸序列都可与这些方法联合使用，包括本领域中已知的任何转录后或翻译后调控和/或沉默序列和/或机理。这些方法的一个方面是由这些类型的序列编码的调控将未必在靶标基因组中产生遗传变化，从而容许在不进行连续回交的情况下回收除由GEC编码的编辑之外含有大致上与一个亲本相同的基因组的后代。
在某些实施方案中，可使用携带减缓细胞分裂的转基因序列的植物，例如可使用在CDKA；1(Morgan DO(1997)Annu Rev Cell DevBiol 13:261–291；E Wijnker,ASchnittger(2013)Plant Reprod 26:143-158)基因中携带突变的转基因植物。这个突变可由杂交中例如母系单倍体诱导杂交中使用的雌性或雄性植物编码。这个转基因控制可由雌性亲本的接近子代细胞的细胞编码，和/或由雄性亲本的花粉和/或由子代接合子和/或胚编码。这个转基因控制可减缓、延迟和/或停止子代植物中的细胞分裂，由此使携带GEC的诱导物基因组保持足够接近于靶标基因组以使所表达GEC产物产生所需编辑所处的窗口延长。
在某些实施方案中，产生载体染色体，其含有除GEC序列以外的序列，和/或除GEC序列之外也含有其他序列，并且这个载体染色体不仅用于在靶标基因组中产生编辑，而且也用于调控靶标基因组中某些基因的表达。
举例来说，玉米单倍体诱导株系可被转化来在它的基因组中包含可操作地连接于启动子(例如Ubi-1)的包含Wx剔除突变的GEC，例如如实施例1中所述。这个诱导物也被转化来含有可减缓/破坏植物接合子和/或胚细胞的细胞分裂和/或细胞周期的DNA序列，例如周期素依赖性激酶序列诸如CDKA；1。使用者可接着在与含有使用者希望编辑的基因组的雌性亲本例如B73的杂交中使用这个经转化单倍体诱导物作为雄性亲本。在来自雄性单倍体诱导亲本的花粉接触雌性亲本之后，将存在从诱导亲本遗传的细胞周期调控序列将紧密邻近于从雌性亲本遗传的基因组而存在所处的一段时期(例如接近配子配合的时间)，因此在对卵受精之前不久和/或期间和/或之后，GEC的基因与细胞周期基因两者均将从诱导物遗传的基因组表达，并且产物将随后能够改变从雌性亲本遗传的邻近基因组的表达，例如通过在包含CDKA:1突变的B73基因组的Wx基因中产生剔除突变。
这个实施例的一个优势是接合子和/或胚的细胞周期可被减缓，从而延迟诱导物基因组和它含有的GEC的消除，由此使载体染色体上的GEC保持接近于靶标基因组所处的窗口延长。在某些实施例中，子代接合子中的细胞分裂可被遏止许多小时或甚至许多天，从而为GEC编辑组分执行它们的产生所需编辑的功能提供长久得多的时间。
明确的是，这些方法不限于在载体染色体中编码的特定序列或某些调控机理。尽管这个实施例强调使用最终使细胞中的GEC序列的消除延迟的某些元件的效用，但本领域中的方法描述普通技术人员可如何用任何样式的DNA序列转化诱导植物的基因组。已知会影响植物的生长、发育或性能的任何基因都可被转化至诱导植物中，无论是稳定整合至诱导植物的核基因组中，稳定整合在超数染色体中，和/或还是短暂整合在诱导植物细胞中。
此外，这些方面不限于含有能够反式调控靶标基因组中的表达的DNA序列的载体染色体的类型。含有GEC的任何分子都也可含有被设计来在植物的接合子和/或胚和/或幼苗中起作用的调控元件，可与本发明联合使用。然而，调控性DNA序列不需要在同一载体染色体上，因为设想的是在一个载体分子(例如单倍体诱导物的核A基因组)上含有GEC以及在不同载体分子(例如B染色体)上含有额外调控元件的植物细胞，或反之亦然，可用于实现类似目标，而不超出本文所述的方法的范围。
此外，调控元件与GEC无需由同一亲本提供。在某些实施例中，含有使用者想要编辑的基因组的植物被转化来含有调控元件。举例来说，B73植物可用可操作地连接于接合子或胚特异性启动子的周期素依赖性激酶序列诸如CDKA；1转化，所述启动子例如来自emb5基因的5’调控区的胚特异性启动子，如2006年7月18日授予的题为“Maizeembryo-specificpromoter compositions and methods for use thereof”的美国专利号7,078,234以及以相同名称于2003年12月10日提交并以美国专利申请号US20040163144公布的相应美国专利申请10/732,721中所述。这个植物可接着由用GEC在它的基因组中转化的单倍体诱导株系受粉，所述GEC例如是可操作地连接于启动子(例如Ubi-1)的包含Wx剔除突变的GEC，如实施例1中所述。在来自雄性单倍体诱导亲本的花粉接触雌性亲本之后，将存在从诱导亲本遗传的GEC序列将在CDKA-1从遗传自雌性亲本的基因组表达的时间或大约相同时间，紧密邻近于从雌性亲本遗传的基因组加以表达所处的一段时期。因此，从雌性亲本遗传的基因组中的细胞周期基因将起减缓或停止接合子和/或胚中的细胞分裂的作用，由此也使否则可能导致含有GEC的载体染色体在GEC组分已具有足够时间来在B73基因组中完成所需编辑之前丧失的染色体消除机理延迟。
在某些实施方案中，当诱导杂交的子代处于它们的生命周期的接合子时期时，发生基因组编辑过程。在某些实施方案中，基因组编辑过程需要较长时期，有可能跨越子代植物的组织中的数轮有丝分裂。
实施例7.通过单倍体诱导进行的成功基因组编辑
胚胎发生愈伤组织由专有高油红根单倍体诱导株系的幼苗源性外植体产生，并且用于土壤杆菌介导的转化，基本上如由Sidorov等(2006)所述。简要来说，将125个成熟种子在含有几滴20作为表面活性剂的50％溶液中进行表面灭菌20分钟。在处理期间，将容器进行短暂真空浸润数次以帮助从种子移除夹带空气。在无菌水中冲洗5次之后，将种子在每个100x25mm陪替氏平板(Petri plate)6个种子下铺放于MS3或MSVS34培养基上(Sidorov等,2006)，放置至透明塑料毛衣盒中，并且在28℃下孵育，伴有由冷白色荧光灯泡提供的100μmol m-2sec-1的光强度和16:8光照期。
在萌发培养基上7天之后，制备结节切片，并且将切割表面向下铺放于MSW57或CM4C培养基上(Sidorov等,2006)。将这些板返回至透明塑料毛衣盒中，并且在如同用于萌发的28℃、100μmol m-2sec-1、16:8光照期下孵育。25天后，在解剖显微镜下检查培养物，并且将显示胚胎发生愈伤组织发育迹象的任何区域次培养于相同组成的新鲜培养基，接着返回至毛衣盒中并在黑暗中在28℃下孵育。在2周间隔下进行4次额外次培养，从而选择高品质胚胎发生愈伤组织，以增殖获得用于转化的较大数量。在最终次培养之后7天，胚胎发生愈伤组织用于转化。
具有双元载体构建体-630的源于C58的土壤杆菌菌株ABI(Koncz和Schell,1986)用于转化。构建体-630含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell等,1985)驱动的新霉素磷酸转移酶II基因(nptII；Bevan等,1983)作为植物可选择标记，以及由稻米肌动蛋白启动子(McElroy等,1990)驱动的Cre重组酶基因(Zhang等,2003)。使ABI::构建体-630土壤杆菌菌株在LB培养基(Sambrook等,1989)中生长，在具有200μM乙酰丁香酮的改良AB基本培养基(Zhang等,2003)中诱导，并且再混悬于接种培养基中(Sidorov等,2006，但直至最终OD6600.5而非1.0)。在使用之前即刻，每1ml土壤杆菌，添加1μl 10％酸溶液。
将2.77克胚胎发生愈伤组织放置至50ml离心管中，随后添加12ml土壤杆菌接种物。将管倒置数次以使混合物充分混合，接着在1270rpm下离心30分钟。将土壤杆菌溶液倾倒去除，并且将组织倾卸于无菌滤纸上并吸干液体以移除过量土壤杆菌。接着将组织放置于100x25mm陪替氏培养皿中的两张无菌Whatman#1滤纸上，用帕拉膜(parafilm)密封，并且在黑暗中在23℃下孵育。在组织变得部分干燥(Cheng等,2003)所处的4天共培养时期之后，遵循天然断裂点将组织分成直径是2-3mm的较小片块，并且转移于选择培养基上。出于这个目的，跨越四张个别9cm直径无菌Whatman#1滤纸将组织均匀拆分，所述滤纸各自被放置在两个用液体选择培养基(根据Sidorov等,2006的MSW57，但采用500mg L-1羧苄西林(carbenicillin)控制土壤杆菌生长，以及100mg L-1巴龙霉素(paromomycin)用于植物选择)饱和的无菌2cm x 2cm丙烯酸白毛毡方块的顶部上。将板于塑料毛衣盒中在黑暗中在28℃下孵育(未密封)。两周后，使用吸移器从毛毡吸出培养基，并且添加15ml新鲜液体选择培养基。一周后再次添加新鲜选择培养基以保持毛毡饱和，但在组织上不具有过量液体汇合。九天后，将组织移至如Sidorov等2006中所述的再生培养基(MS(＝Murashige和Skoog,1962)基础培养基加3.5mg L-1 6-苯甲基氨基嘌呤加250mg L-1羧苄西林)中。六天后，将组织移至具有250mg L-1羧苄西林和100mg L-1巴龙霉素的无激素MS培养基中。将在这个培养基上发育的小嫩芽转移至含新鲜无激素MS培养基的PhytatraysTM中以达成继续嫩芽生长和根发育。将生根嫩芽移至繁殖塞(International Horticultural Technologies,Hollister CA,USA)中，并且转移至生长室中。
回收总计七个植物。全都来源于同一巴龙霉素抗性愈伤组织区段，并且被假定是纯系。在这7个植物中，4个存活于向繁殖塞的转移。获取叶样品以进行DNA提取，并且通过实时Taqman来分析Cre和nptII基因的拷贝数，以及T-DNA的左侧边界序列区域。所有四个植物都含有1-2个拷贝的各测试区域。载体骨架中OriV序列的存在或不存在通过PCR来测试，并且所有四个植物都缺乏这个序列。四个植物中的三个得以成功自我授粉，并且也作为雄性于就来自构建体-133的单拷贝转基因插入物来说是纯合的雌性植物上测交。构建体-133含有由35S启动子(Kay等,1987)和胭脂碱合成酶(nos)多腺苷酸化区域(Fraley等,1983)控制的GFP基因(Pang等,1996)。它也在5’非翻译区中含有玉米hsp70内含子(Brown和Santino,1995)。由loxP位点侧接的nptII基因被插入在hsp70内含子序列内。在不存在Cre蛋白下，nptII基因保持稳定插入，并且充当植物可选择标记。存在作为nptII盒的一部分的转录终止信号，其防止GFP的转录。在暴露于活性Cre蛋白后，loxP位点重组，并且nptII编码序列和终止子被切除，从而允许GFP的转录。
产生和种植总计284个测交子代种子，并且47个未发芽。选择跨越玉米基因组加以散布，并且在诱导物基因组与测试株系之间提供信息的29个多态性标记以通过终点TaqManPCR测定来确认倍数性(表1)。就这些多态性标记来说，单倍体种子是纯合的，并且二倍体种子是杂合的。在237个发芽并产生植物的测交子代中，233个测交子代是二倍体。在233个二倍体之中，在Cre的存在与GFP表达之间存在完全关联。237个测交子代中的4个被确认是单倍体，并且不存在诱导物基因组。
在表1中，“IcM”是指以相互交配重组近交群体(syn 4)产生的IBM2 2008近邻遗传图的图距单位，相较于用于产生cM距离的典型重组实验，所述群体导致减数分裂的数目大约增加至四倍(Lee等,2002,Plant Mol Biol 48:453以及玉米遗传学和基因组学数据库(Maize Genetics and Genomics Database))。“cM”是指厘摩的经典定义，其中1cM相当于在一个遗传基因座处的性状将由于在单代中的交换而与在另一基因座处的性状分离的机会是1％(这意味着所述性状在减数分裂期间共同分离99％次)，并且这个定义在本文中用于描绘与本发明有关的图位置。
表1.用于检测倍数性的29个多态性标记的引物和探针
cM＝厘摩，IcM＝IBM2 2008近邻遗传图的图距单位。
进一步分子分析被设计来跨越切除接合部扩增DNA节段以确认NPTII被切除。遵循制造商说明书，使用DNeasy植物小型试剂盒(Qiagen)提取来自根和/或组织的DNA，并且使用Picogreen dsDNA测定试剂盒(Thermo Fisher)来定量。在内部设计两组PCR引物以扩增切除组织中的551bp和801bp片段(表2)。相反，如果切除未发生，那么预期片段是1758bp和2108bp。将约1-10ng模板DNA添加至使用DreamTaq Green混合物(Thermo Fisher)进行的50ul反应中。循环条件是95℃持续2分钟，以及30个循环的95℃(30秒)、57℃(30秒)和72℃(2分钟)，继之以在72℃下最终延伸7分钟。无菌蒸馏水用作阴性对照。在用GelGreen(Biotium)染色的1％琼脂糖凝胶电泳中分析PCR产物。Hi-lo DNA标记(Bionexus)用作参照。所有反应都使用GeneAmp 9700热循环仪(Applied Biosystems/Thermo Fisher)进行。在4个单倍体植物之中，来自1个单倍体植物的根组织被确认伴有GFP表达和NPTII盒切除。引物和探针也被设计来通过终点TaqMan PCR测定检测存在或不存在Cre(表3)。同一单倍体植物被确认不存在Cre。总之，实验证明达成成功基因组编辑(NPTII被切除)，以及在单倍体子代中消除GEC(Cre)和诱导物基因组。
表2.用于检测NPTII盒的引物
正向引物：5’-CCC GTT CAC ATC ACC ATC CA-3’
反向引物：5’-GAA CCT ACA CAG CAA TAC GAG AAA-3’
表3.用于检测Cre的引物和探针
正向引物：5’-CAAGTGACAGCAATGCTGTTTCA-3’
反向引物：5’-GTCGAAATCAGTGCGTTCGAA-3’
探针：5’-CGGTGAACGTGCAAAA-3’
用纯合R1子代重复相同实验以增加样本大小，以及延伸初始实验以证明在种系组织中的基因组编辑。在这个实验中，观察到396个单倍体植物中的5个在根和叶中具有GFP表达。在这5个单倍体植物之中，也观察到2个植物在嫩芽(种系组织)中具有GFP表达。额外细胞学和分子分析正在进行中以确认靶标区域被编辑，并且GEC和诱导物基因组被消除。

Claims (114)

1.一种修饰植物基因组的方法，所述方法包括：
提供包含至少一种基因组编辑组分(GEC)的第一植物；
使所述第一植物与第二植物杂交，其中所述至少一种GEC修饰所述第二植物的基因组，由此产生所述第二植物的经修饰基因组；以及
回收由使所述第一植物和所述第二植物杂交获得的第三植物，其中所述第三植物包含所述第二植物的所述经修饰基因组，并且其中所述第三植物大致上缺乏所述GEC。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一植物是单倍体诱导物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一植物是玉米母系单倍体诱导物。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述第三植物大致上缺乏所述第一植物的基因组。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组选自由以下组成的组：核基因组、线粒体基因组和质体基因组。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：
使所述第三植物或接合子的核基因组加倍，由此产生包含加倍核基因组的第三植物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述核基因组的所述加倍由使用选自由以下组成的组的染色体加倍剂所致：一氧化二氮气体、秋水仙碱、氨磺乐灵、甲基胺草磷、氟乐灵、咖啡因和拿草特。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述方法进一步包括：
从包含加倍核基因组的所述第三植物或接合子产生子代植物或种子，其中所述子代植物或种子的基因组包含所述第二植物的所述经修饰基因组。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含至少一个选自由以下组成的组的修饰：一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失、重复、倒位和易位。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个选自由以下组成的组的启动子：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述组织特异性启动子选自由以下组成的组：胚特异性启动子、配子特异性启动子和早期接合子特异性启动子。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述第一植物的基因组包含至少一个辅助基因。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述至少一个辅助基因选自由以下组成的组：核酸外切酶盒、DN Ku70和针对至少一种NHEJ组分的RNAi盒。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一种重组酶或至少一种核酸内切酶。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一种核酸内切酶选自由以下组成的组：CRISPR相关核酸酶、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、TALE样蛋白、锌指核酸酶和兆碱基大范围核酸酶。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一种重组酶选自由以下组成的组：连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶和连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。
17.如权利要求16所述的方法，其中连接于DNA识别基序的所述酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Gin重组酶、FLP重组酶和Tnp1重组酶。
18.如权利要求16所述的方法，其中连接于DNA识别基序的所述丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：Bxb1整合酶、phiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个供体多核苷酸模板。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个病毒复制子。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述至少一个病毒复制子是双粒病毒复制子或纳米病毒复制子。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含至少一个从所述第一植物的基因组易位至所述第二植物的所述基因组中的目标基因组节段。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述至少一个目标基因组节段包含至少一个目标转基因。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述至少一个目标转基因赋予选自由以下组成的组的性状：生长增强、产量增强、干旱耐受性、盐度耐受性、除草剂耐受性、昆虫抗性、害虫抗性、疾病抗性和氮利用增强。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述第三植物或接合子的基因组包含所述至少一个目标转基因。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述至少一个目标基因组节段包含至少一个兆碱基基因座。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述至少一个目标基因组节段选自目标核基因组节段、目标质体基因组节段和目标线粒体基因组节段。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含至少一个基因组重排。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述至少一个基因组重排选自由以下组成的组：相互易位和非相互易位。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含第二天然等位基因，其使用来自所述第一植物中的基因组的第一天然等位基因作为模板以修饰所述第二植物中的基因组的所述第二天然等位基因加以修饰。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述第一植物选自由以下组成的组：玉米植物、大豆植物、加拿大油菜植物、棉花植物、稻米植物、甘蔗植物、马铃薯植物、小麦植物和苜蓿植物，并且其中所述第二植物选自由以下组成的组：玉米植物、大豆植物、加拿大油菜植物、棉花植物、稻米植物、甘蔗植物、马铃薯植物、小麦植物和苜蓿植物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述第一植物和所述第二植物属于相同物种。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述第一植物和所述第二植物属于不同物种。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述第一植物是选自由以下组成的组的玉米植物：ig1玉米植物和Stock6衍生玉米植物。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述第一植物是半配生殖棉花植物。
36.如权利要求1所述的方法，其中当所述第三植物处于接合子、胚、幼苗、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11或V12生命阶段时，所述第三植物大致上缺乏所述GEC。
37.一种修饰植物基因组的方法，所述方法包括：
提供包含至少一个超数染色体的第一植物，其中所述至少一个超数染色体包含至少一种基因编辑组分(GEC)；
使所述第一植物与第二植物杂交，其中所述至少一种GEC修饰所述第二植物的基因组，由此产生所述第二植物的经修饰基因组；以及
回收由使所述第一植物和所述第二植物杂交获得的第三植物，其中所述第三植物包含所述第二植物的所述经修饰基因组，并且其中所述第三植物大致上缺乏所述第一植物的核基因组。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述第二植物的所述基因组选自由以下组成的组：核基因组、质体基因组和线粒体基因组。
39.如权利要求37所述的方法，其中对所述第二植物的所述基因组的所述修饰选自由以下组成的组：一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失、重复、倒位或易位。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述方法进一步包括：
从所述第三植物产生子代，其中所述子代的基因组包含所述第二植物的所述经修饰基因组。
41.如权利要求37所述的方法，其中所述第三植物包含所述至少一个超数染色体。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述方法进一步包括：
通过使所述第三植物与它自身或与第四植物杂交来使所述至少一个超数染色体从所述第二植物的所述经修饰基因组分离。
43.如权利要求37所述的方法，其中所述第三植物不包含所述至少一个超数染色体。
44.如权利要求37所述的方法，其中所述至少一个超数染色体是B染色体。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述B染色体选自由以下组成的组：玉米B染色体和黑麦B染色体。
46.如权利要求37所述的方法，其中所述至少一个超数染色体是人工获得的染色体。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述人工获得的染色体是截短染色体或重新产生的染色体。
48.如权利要求37所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个选自由以下组成的组的启动子：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述组织特异性启动子选自由以下组成的组：胚特异性启动子、配子特异性启动子和早期接合子特异性启动子。
50.如权利要求37所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一种重组酶或至少一种核酸内切酶。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述至少一种核酸内切酶选自由以下组成的组：CRISPR相关核酸酶、TALEN、TALE样蛋白、锌指和兆碱基大范围核酸酶。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述至少一种重组酶选自由以下组成的组：连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶和连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。
53.如权利要求52所述的方法，其中连接于DNA识别基序的所述酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Gin重组酶、FLP重组酶和Tnp1重组酶。
54.如权利要求52所述的方法，其中连接于DNA识别基序的所述丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：Bxb1整合酶、phiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。
55.如权利要求37所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个供体模板。
56.如权利要求37所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个病毒复制子。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述病毒复制子是双粒病毒复制子或纳米病毒复制子。
58.如权利要求37所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含至少一个从所述第一植物的基因组易位至所述第二植物的所述基因组中的目标基因组节段。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述至少一个经修饰目标基因组节段包含至少一个目标转基因。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述至少一个转基因赋予选自由以下组成的组的性状：生长增强、产量增强、干旱耐受性、盐度耐受性、除草剂耐受性、昆虫抗性、害虫抗性、疾病抗性和氮利用增强。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述第三植物的基因组包含所述至少一个目标转基因。
62.如权利要求58所述的方法，其中所述至少一个目标基因组节段包含至少一个兆碱基基因座。
63.如权利要求58所述的方法，其中所述至少一个目标基因组节段选自目标核基因组节段、目标质体基因组节段和目标线粒体基因组节段。
64.如权利要求37所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含至少一个基因组重排。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述至少一个基因组重排选自由以下组成的组：相互易位和非相互易位。
66.如权利要求37所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含第二天然等位基因，其使用来自所述第一植物中的基因组的第一天然等位基因作为模板以修饰所述第二植物中的基因组的所述第二天然等位基因加以修饰。
67.如权利要求37所述的方法，其中所述第一植物和所述第二植物属于相同物种。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述第一植物和所述第二植物选自由以下组成的组：玉米植物、大豆植物、加拿大油菜植物、棉花植物、甘蔗植物、小麦植物和苜蓿植物。
69.一种修饰植物基因组的方法，所述方法包括：
提供包含至少一种在载体DNA分子上的GEC的第一植物；
使所述第一植物与第二植物杂交，其中使所述第二植物的基因组充分暴露于所述至少一种在所述载体DNA分子上运送的GEC以通过由所述至少一种GEC编码的蛋白质进行修饰；以及
回收由所述第一植物和所述第二植物的所述杂交获得的第三植物或接合子，其中所述第三植物包含所述第二植物的经修饰基因组，并且其中所述第三植物大致上缺乏所述第一植物的所述GEC。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述第一植物是单倍体诱导物。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述第一植物是玉米母系单倍体诱导物。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述第三植物大致上缺乏所述第一植物的基因组。
73.如权利要求69所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组选自由以下组成的组：核基因组、线粒体基因组和质体基因组。
74.如权利要求69所述的方法，其中所述方法进一步包括：
使所述第三植物或接合子的核基因组加倍，由此产生包含加倍核基因组的第三植物。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述核基因组的所述加倍由使用选自由以下组成的组的染色体加倍剂所致：一氧化二氮气体、秋水仙碱、氨磺乐灵、甲基胺草磷、氟乐灵、咖啡因和拿草特。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述方法进一步包括从包含加倍核基因组的所述第三植物或接合子产生子代植物或种子，其中所述子代植物或种子的基因组包含所述第二植物的所述经修饰基因组。
77.如权利要求69所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含至少一个选自由以下组成的组的修饰：一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失、重复、倒位和易位。
78.如权利要求69所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个选自由以下组成的组的启动子：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述组织特异性启动子选自由以下组成的组：胚特异性启动子、配子特异性启动子和早期接合子特异性启动子。
80.如权利要求69所述的方法，其中所述第一植物的基因组包含至少一个辅助基因。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述至少一个辅助基因选自由以下组成的组：核酸外切酶盒、DN Ku70和针对至少一种NHEJ组分的RNAi盒。
82.如权利要求69所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一种重组酶或至少一种核酸内切酶。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述至少一种核酸内切酶选自由以下组成的组：CRISPR相关核酸酶、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、TALE样蛋白、锌指核酸酶和兆碱基大范围核酸酶。
84.如权利要求82所述的方法，其中所述至少一种重组酶选自由以下组成的组：连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶和连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。
85.如权利要求84所述的方法，其中连接于DNA识别基序的所述酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Gin重组酶、FLP重组酶和Tnp1重组酶。
86.如权利要求84所述的方法，其中连接于DNA识别基序的所述丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：Bxb1整合酶、phiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。
87.如权利要求69所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个供体多核苷酸模板。
88.如权利要求69所述的方法，其中所述至少一种GEC包含至少一个病毒复制子。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述至少一个病毒复制子是双粒病毒复制子或纳米病毒复制子。
90.如权利要求69所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含至少一个从所述第一植物的基因组易位至所述第二植物的所述基因组中的目标基因组节段。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述至少一个目标基因组节段包含至少一个目标转基因。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述至少一个目标转基因赋予选自由以下组成的组的性状：生长增强、产量增强、干旱耐受性、盐度耐受性、除草剂耐受性、昆虫抗性、害虫抗性、疾病抗性和氮利用增强。
93.如权利要求91所述的方法，其中所述第三植物或接合子的基因组包含所述至少一个目标转基因。
94.如权利要求90所述的方法，其中所述至少一个目标基因组节段包含至少一个兆碱基基因座。
95.如权利要求90所述的方法，其中所述至少一个目标基因组节段选自目标核基因组节段、目标质体基因组节段和目标线粒体基因组节段。
96.如权利要求69所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含至少一个基因组重排。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述至少一个基因组重排选自由以下组成的组：相互易位和非相互易位。
98.如权利要求69所述的方法，其中所述第二植物的所述经修饰基因组包含第二天然等位基因，其使用来自所述第一植物中的基因组的第一天然等位基因作为模板以修饰所述第二植物中的基因组的所述第二天然等位基因加以修饰。
99.如权利要求69所述的方法，其中所述第一植物选自由以下组成的组：玉米植物、大豆植物、加拿大油菜植物、棉花植物、稻米植物、甘蔗植物、马铃薯植物、小麦植物和苜蓿植物，并且其中所述第二植物选自由以下组成的组：玉米植物、大豆植物、加拿大油菜植物、棉花植物、稻米植物、甘蔗植物、马铃薯植物、小麦植物和苜蓿植物。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述第一植物和所述第二植物属于相同物种。
101.如权利要求99所述的方法，其中所述第一植物和所述第二植物属于不同物种。
102.如权利要求99所述的方法，其中所述第一植物是选自由以下组成的组的玉米植物：ig1玉米植物和Stock6衍生玉米植物。
103.如权利要求99所述的方法，其中所述第一植物是半配生殖棉花植物。
104.如权利要求69所述的方法，其中当所述第三植物处于接合子、胚、幼苗、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11或V12生命阶段时，所述第三植物大致上缺乏所述GEC。
105.一种植物或其部分，其通过如权利要求1-104中任一项所述的方法来产生。
106.一种修饰植物基因组的方法，所述方法包括：
提供第一物种的包含至少一种基因编辑组分(GEC)的第一植物；
使所述第一植物与第二物种的第二植物杂交，其中所述至少一种GEC修饰第二物种的所述第二植物的基因组，由此产生所述第二物种的所述第二植物的经修饰基因组；
回收由使所述第一植物和所述第二植物杂交获得的F1杂交植物；
使所述F1杂交植物杂交以获得来自所述F1杂交植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述第二物种的所述第二植物的所述经修饰基因组，并且其中所述子代植物大致上缺乏所述第一物种的所述第一植物的核基因组。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述第一物种选自由小麦、黑麦、燕麦、大麦和摩擦禾组成的组，并且所述第二物种是玉米。
108.如权利要求106所述的方法，其中所述第一物种是诸葛菜，并且所述第二物种是加拿大油菜。
109.如权利要求106所述的方法，其中所述第一物种是短绒野大豆，并且所述第二物种是大豆。
110.如权利要求106所述的方法，其中所述第一物种是野大豆，并且所述第二物种是大豆。
111.如权利要求106所述的方法，其中所述第一物种是富利亚薯，并且所述第二物种是马铃薯。
112.如权利要求106所述的方法，其中所述第一物种是微粒稻，并且所述第二物种是稻米。
113.如权利要求106所述的方法，其中所述第一植物和所述第二植物选自由以下组成的组：玉米植物、黑麦植物、小麦植物、大麦植物、摩擦禾植物、高粱植物和珍珠粟植物，并且其中所述第一植物和所述第二植物不是相同物种。
114.如权利要求106所述的方法，其中所述方法进一步包括使F2子代植物的核基因组加倍，由此产生包含加倍核基因组的F2子代植物。
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