CN111926034A - 陆地棉基因组单碱基编辑(abe)系统 - Google Patents

陆地棉基因组单碱基编辑(abe)系统 Download PDF

Info

Publication number
CN111926034A
CN111926034A CN202010859115.1A CN202010859115A CN111926034A CN 111926034 A CN111926034 A CN 111926034A CN 202010859115 A CN202010859115 A CN 202010859115A CN 111926034 A CN111926034 A CN 111926034A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
vector
editing
single base
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010859115.1A
Other languages
English (en)
Inventor
金双侠
张献龙
王冠英
许忠平
王福秋
孙琳
李波
王琼琼
斯欢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202010859115.1A priority Critical patent/CN111926034A/zh
Publication of CN111926034A publication Critical patent/CN111926034A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04002—Adenine deaminase (3.5.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，涉及基因工程技术领域。能够精准编辑单个碱基的陆地棉基因组高效转化载体GhABE7.10nCas9，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，该载体通过下列步骤制备获得：获得目的序列TadA‑TadA7.10‑2linker，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，利用Ale Ⅰ和Pac Ⅰ对SEQ ID NO：1所示的GhBE3载体进行酶切，与TadA‑TadA7.10‑2linker目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：3所示的适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。该陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，本发明在棉花中的编辑效率达64.86％，本发明在棉花中有较高的特异性，该方法显示出较高的编辑效率和很高的实用性，它将成为棉花功能基因组研究新的重要的技术手段。

Description

陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统。
背景技术
用RNA指导的基因编辑技术CRISPR/Cas9自诞生以来掀起一场生物技术革命，在基因敲除、敲入、碱基修复等领域得到了广泛的应用1。与其他基因工程工具相比，这种技术更容易使用，并且更有效，因此，在其发现后的短短几年内，就已经被应用于世界各地的实验室，CRISPR/Cas9基因编辑系统由一个具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白(或其他同源蛋白)和一条单链向导RNA(single guide,sgRNA)组成。sgRNA与Cas9蛋白结合靶向到基因组特定位点，Cas9切割产生双链断裂(double strand breaks,DSB)，经过细胞自主性的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(homology-directed repair,HR)进行修复，引入突变，NHEJ是一种错配的修复机制，DNA连接时产生碱基插入或缺失突变。HR是指有同源臂供体存在的情况下，供体中的外源基因片段通过同源重组整合到靶位点，利用这一方法可以实现基因的原位矫正和遗传增强，已有研究表明，在细胞分裂的各个时期中，细胞自主发生NHEJ的频率高于HR，CRISPR/Cas9系统切割靶标位点后启动的HR介导的DNA修复在植物基因组编辑中非常低效，而且DNA修复模板如何高效地在编辑细胞中的的递送也是一个挑战，极大地限制了传统CRISPR/Cas9在高分辨率单碱基编辑中的应用。
基于传统CRISPR/Cas9发展起来的单碱基编辑器(base editor,BE)的出现则克服了这些弊端,其中,胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)能够使C·G转换为T·A,腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)能够使A·T转换为G·C,都可以在不引入双链断裂的情况下实现高效的单碱基置换,这就避免了传统的CRISPR/Cas9在进行非同源末端连接(nonhomologous end-joining,NHEJ)时引入不可控的插入或缺失突变(Indels)。单碱基编辑技术基于无核酸酶活性的Cas9(dCas9)或Cas9切口酶(nCas9)、胞嘧啶或腺嘌呤脱氨酶以及sgRNA形成的复合体，dCas9或nCas9没有切割DNA双链的核酸内切酶活性，但保留了DNA结合活性,在不断裂DNA双链和提供DNA模板的情况下，sgRNA通过与靶位点互补配对，引导融合脱氨酶蛋白中dCas9或nCas9结合到靶位点直接对靶向位点进行精准编辑，实现了在一定的活性窗口内胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)到腺嘌呤(A)的单碱基转换。单碱基编辑技术的出现促进了点突变基因编辑的有效性和使用范围。
目前，单碱基编辑系统在很多物种中被报道，但在异源四倍体的棉花中只报道了胞嘧啶单碱基编辑，棉花是重要的经济作物，棉花纤维是纺织工业重要的天然纤维，棉籽油也是重要的油料储备，仅有CBE单碱基编辑系统是不够的，还需要开发新的可行而又有效的定点编辑工具，为棉花基因组功能分析，作物遗传改良和新品种选育提供重要技术支持。
发明内容
本发明的目的在于实现陆地棉基因组中精准高效的编辑，特别是构建一种适用于陆地棉的腺嘌呤单碱基编辑方法，本发明基于GhBE311载体，构建了融合Cas9缺口酶(nCas9)，腺嘌呤脱氨酶(7.10Tad)适用于棉花遗传转化方法的单碱基编辑方法(即载体GhABE7.10n)。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，能够精准编辑单个碱基的陆地棉基因组高效转化载体GhABE7.10nCas9，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，该载体通过下列步骤制备获得：
S1、获得目的序列TadA-TadA7.10-2linker，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：
1)在如序列表SEQ ID NO：3所示的序列TadA-TadA7.10-2linker在棉花中进行密码子优化；
2)优化后的序列如序列表SEQ ID NO：4，根据序列进行核苷酸合成；
S2、利用AleⅠ和PacⅠ对SEQ ID NO：1所示的GhBE3载体进行酶切，与TadA-TadA7.10-2linker目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：3所示的适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。
进一步优化本技术方案，所述的载体GhABE7.10n在陆地棉基因组编辑中的应用。
进一步优化本技术方案，所述步骤S1中，阅读文章Programmable base editingof A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage，从中获取7.10TadA+2linker氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
进一步优化本技术方案，所述步骤S2中，使用M1UI/XbaI对GhBE3载体，其核苷酸序列序列表SEQ ID NO：1所示，进行双酶切切除片段UGI后再连接一个核定位信号NLS，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，再使用使用PacI/AleI双酶切切除片段rAPOBEC1-XTEN,公司再把切除载体上多余的序列再与步骤S1中优化后的7.10TadA+2linker目的序列一起合成连接，得到适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。
与现有技术相比，本发明提供了陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，具备以下有益效果：
1、该陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，本发明在棉花中的编辑效率达64.86％。
2、该陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，本发明在靶标序列上的编辑位点为A5(PAM远端开始计算)。
3、该陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，本发明在棉花中有较高的特异性。
附图说明
图1是对载体GhBE3改造的路线图。
图2是本发明的表达载体GhABE7.10n的构建图。
图3是对载体GhBE3切除UGI连接NLS片段后的电泳图，附图标记说明：泳道1,2,3是NLS+片段前后载体各150bp左右,泳道M是5K的marker。
图4是拼接后GhABE7.10n的电泳图，附图标记说明：泳道1是GhABE7.10n构建完成检测，泳道2是双酶切切除rAPOBEC1-XTEN的GhBE3检测图，泳道M是5K的marker。
图5是本发明sgRNA连接到GhABE7.10n的电泳图，附图标记说明：泳道1,2是目的片段连接到GhABE7.10n载体,泳道M是5K的marker。
图6为本发明GhPEBP的遗传转化图，附图标记说明：图6中的罗马字编号分别是：Ⅰ.无菌苗培养阶段；Ⅱ.共培养阶段；Ⅲ.选择培养阶段；Ⅳ.愈伤培养阶段；Ⅴ.分化培养阶段；Ⅵ-VII.生根培养；VIII.营养液培养；Ⅸ-X.转基因植株在温室生长。
图7是本发明的GhPEBP和GhCLA基因sgRNA1、sgRNA2编辑检测图，附图标记说明：图7中的a图是GhPEBP基因sgRNA1的编辑序列图；图7中的b图是GhCLA基因sgRNA2的编辑序列图；图7中的c图是GhPEBP和GhCLA基因sgRNA1、sgRNA2序列内碱基突变的色谱图。
图8是本发明的GhPEBP和GhCLA基因sgRNA1、sgRNA2深测序检测图。
附图标记说明：图8中的黄色点是每一个单株的GhPEBP基因sgRNA1序列内所有A-to-G的频率；图8中绿色点是每一单株GhCLA基因sgRNA2序列内所有A-G的频率。
图9是本发明的GhPEBP基因和阴性对照植株以及野生型植株的全基因组脱靶检测图，附图标记说明：图9中a图是在N1、N2、WT和阴性植物中鉴定出的总的DNA水平上SNV数量；图9中b图是全基因组圆环图代表N1和N2的sgRNA1的脱靶位点在染色体上分布。紫色代表N1,橙色代表N2。
图10是本发明的GhPEBP基因和阴性对照植株以及野生型植株的全转录组测序RNA脱靶检测图，附图标记说明：图9中a图是在N1、N2、WT和阴性植物中鉴定出的总的RNA水平上SNV数量；图10中b图是在N1和N2植株中，DNA和RNA之间存在7个独特的重叠的SNVs，在WT和阴性对照植株中没有。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO：1是本发明的GhBE3载体的核苷酸序列，序列长度为17412bp。
序列表SEQ ID NO：2是陆地棉基因组高效转化载体GhABE7.10n的核苷酸序列，序列长度为17568bp。
序列表SEQ ID NO：3是融合蛋白7.10TadA+2linker的氨基酸原始序列，序列长度为404aa。
序列表SEQ ID NO：4是融合蛋白7.10TadA+2linker密码子优化后核苷酸序列，序列长度为1212bp。
实施例1：7.10TadA+2linker目的序列的获得
查阅文献Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNAwithout DNA cleavage，从中获取7.10TadA+2linker氨基酸序列(序列表如SEQ ID NO：3)，然后在网站GenScript Rare Codon Analysis Tool(https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis)进行密码子优化获得优化后的核苷酸序列7.10TadA+2linker(序列表如SEQ ID NO：4)，然后经过公司(GenScript)合成。
实施例2：转化载体GhABE7.10n的构建
1.GhBE3酶切切除UGI，连接核定位信号NLS
将GhBE3(序列表见SEQ ID NO：1)进行双酶切切除UGI，酶切体系见表2。37℃酶切5小时，凝胶电泳观察酶切条带是否正确，然后利用凝胶回收试剂盒(武汉华信阳光生物科技有限公司)将酶切产物纯化，酶切体系见表2。
表2 GhBE3酶切切除UGI体系
Figure BDA0002647528690000051
在切除UGI的GhBE3载体上设计引物，正向引物为：
agaagacgcgtccaaagaagaagcggaaggtg；反向引物为：
taGGGGCCCctacaccttccgcttcttctttgg；带下划线的碱基是21bpNLS序列。将切除UGI的GhBE3载体与带有NLS序列的一对引物在95℃水浴中连接反应至常温，转化到大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆进行测序。
2.GhBE3酶切切除rAPOBEC1-XTEN，连接7.10TadA+2linker
将步骤1中阳性克隆测序正确的切除UGI载体GhBE3进行双酶切切除rAPOBEC1-XTEN,酶切体系见表3。37℃酶切5小时，凝胶电泳观察酶切条带是否正确，然后利用凝胶回收试剂盒(武汉华信阳光生物科技有限公司)将酶切产物纯化。然后公司酶切后的载体补充后与7.10TadA+2linker融合蛋白片段进行连接，转化到大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆进行测序，将序列正确的质粒命名为GhABE7.10n质粒(序列表SEQ ID NO：3)，其中双酶切反应体系见表3。
表3 GhBE3酶切切除rAPOBEC1-XTEN体系
Figure BDA0002647528690000061
实施例3：GhABE7.10n-sgRNA载体的构建
1.GhPEBP和GhCLA基因的sgRNA设计
选择磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)Gh_D07G011770和陆地棉1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(Cloroplasto alterados,CLA)Gh_D10G017610基因为验证基因。利用在线软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)13在基因外显子区域设计sgRNA靶标序列。并且在编辑窗口内A-G突变改变氨基酸功能的靶点，最终一个基因选择1个sgRNA(编号分别为sgRNA1、sgRNA2)用来构建单碱基系统植物表达载体，sgRNA的序列见表4。
表4 sgRNA的序列
Figure BDA0002647528690000062
2.sgRNA与GhABE7.10n载体的连接
插入GhABE7.10n载体的靶标序列为tRNA-sgRNA1-gRNA以及tRNA-sgRNA3-gRNA，该两个靶标片段由公司(GenScript)合成。利用BstbI和SbfI双酶切GhABE7.10n切除原本GhBE3的sgRNA,将公司合成的tRNA+sgRNA1+gRNA片段和tRNA-sgRNA3-gRNA片段通过In-fusion连接分别连接到GhABE7.10n载体的BstbI和SbfI双酶切位点处。
In-fusion连接体系见表5：
表5 In-fusion连接反应体系
Figure BDA0002647528690000071
37℃水浴30min，冰上放置5min，可-20℃保存。
实施例3：农杆菌介导的遗传转化
具体步骤如下：
A.将剥好的棉花种子(品种为Jin668，专利申请号201510833618.0)用0.1％升汞杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1天，挑去种皮，将苗扶正，在28℃，暗培养4-5d；
B.将下胚轴切成小茎段，用活化后的农杆菌侵染，弃菌液，并吹干；
C.将下胚轴平铺在放有滤纸的共培养培养基中，于20℃，暗培养1-2d；
D.将下胚轴转入到附加2,4-D的愈伤组织诱导培养基中，放入光照培养室，20-30d左右用新鲜愈伤组织诱导培养基继代培养一次；
E.当愈伤组织长成米粒状颗粒，转入分化培养基中，进一步分化成胚状体；
F.将分化出的小苗继代到生根培养基中，直至长成生根良好健康的小苗；
G.将小苗转到清水中，进行炼苗，一周左右后，转移到到温室。
转化所用的培养基组分及配比：
无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel；pH:6.1-6.2。
愈伤组织诱导培养基：MSB+24-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel；pH:5.85-5.95。
农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L+NaCl 5g/L+MgSO4.7H2O 0.1g/L+KH2PO4+0.25g/L+甘露醇5g/L+甘氨酸1.0g/L；pH:5.85-5.95。
共培养培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/l+KT 0.1mg/l+50mg/l AS+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH5.8。
选择培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L和头孢霉素400mg/L；pH:5.85-5.95。
分化培养基：分化培养基：MSB培养基中去掉NH4NO3,将KNO3用量加倍+Gln 1.0g/L+Asn 0.5g/L+IBA 0.5mg/L+KT 0.15mg/L+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH:6.1-6.2。
生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel；pH:5.90-5.95；
MSB的成分如下：MS培养基+B5维生素。
实施例5：GhABE7.10n对在转基因棉花植株中基因编辑检测中的应用
(1)Sanger测序检测编辑效率
提取的棉花嫩叶阳性基因组DNA【天根生化(北京)科技有限公司】，以阳性DNA为模板，扩增GhPEBP基因(Gh_D07G011770)和GhCLA(Gh_D10G017610)靶标序列(sgRNA2:TCCTAGTGACCCTTACCTGA,sgRNA2:CATGAGGCAAACTAATGGAT)，然后将PCR片段连入pGEM-Teasy载体(购自北京普洛麦格生物技术有限公司)，将连接产物热激转化大肠杆菌感受态TOP10，挑取的单克隆进行阳性检测并进行Sanger测序。将测序结果与靶标序列比对。每个样品送至少15个单克隆测序，统计每个靶点被编辑的效率。测序结果见图7。
(2)高通量深测序检测编辑效率
设计一对含有6个碱基的组合作为每个单株的Barcode标记。每对标记分别加到扩增靶点正反引物的5’端。分别以独立的单株DNA为模板进行PCR扩增(按常规方法)，将获得的PCR产物进行等量混合，然后用纯化试剂盒(OMEGA公司,货号D2500-02)纯化混合产物，最后进行双端150bp测序。深度测序的结果见图8。
实施例6：GhABE7.10n系统在转基因棉花植株中脱靶情况的检测中的应用
(1)全基因组分析GhABE7.10n系统在棉花DNA水平上的脱靶影响
为了评估GhABE7.10n在棉花全基因组范围内DNA水平的脱靶效应，本发明使用GhPEBP的2个转基因T0代棉花植株(植株编号为N1和N2)与1个野生型棉花植株进行50×深度的全基因组测序(WGS)。同时对1个阴性植株进行50×深度的全基因组测序(WGS)作为对照，以减少背景或种系突变或者组织培养的变异。分析发现本发明制备的GhABE7.10n载体编辑的植株以及野生型(WT)和阴性对照植株中分别鉴定出19863,16021,18892,20193个DNA SNVs，经过on-targes和背景过滤，在N1和N2编辑的棉花植株中总共存在1754和1338A-to-G SNPs，并对其余的变异进行过滤，进一步检测本发明的GhABE7.10n诱导突变。申请人将这些变异与215个潜在脱靶进行重叠，结果显示在215个潜在的脱靶位点(≤5mismatches)中没有检测到任何真正的脱靶突变。DNA脱靶检测见图9。
(2)全基因组分析GhABE7.10n系统在棉花RNA水平上的脱靶影响
为了评估GhABE7.10n编辑棉花细胞在RNA水平上的脱靶效应，本发明选择四种与WGS相同的植物进行RNA测序(RNA-seq)，平均测序深度为50X。根据RNA测序数据过滤分析得出的RNA SNVs，GhABE7.10n诱导的RNA SNVs数量高于阴性对照组和野生对照组。申请人将GhABE7.10n诱导的RNA变异与DNA变异进行重叠，结果使用IGV显示7个重叠的脱靶位点。RNA脱靶检测见图10.
本发明在棉花中首次成功建立了适应于棉花基因组特性的单碱基编辑方法，该方法显示出较高的编辑效率和很高的实用性，它将成为棉花功能基因组研究新的重要的技术手段。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，能够精准编辑单个碱基的陆地棉基因组高效转化载体GhABE7.10nCas9，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：
S1、获得目的序列TadA-TadA7.10-2linker，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：
1)在如序列表SEQ ID NO：3所示的序列TadA-TadA7.10-2linker在棉花中进行密码子优化；
2)优化后的序列如序列表SEQ ID NO：4，根据序列进行核苷酸合成；
S2、利用AleⅠ和PacⅠ对SEQ ID NO：1所示的GhBE3载体进行酶切，与TadA-TadA7.10-2linker目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：3所示的适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。
2.根据权利要求1所述的陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，其特征在于，所述的载体GhABE7.10n在陆地棉基因组编辑中的应用。
3.根据权利要求1所述的陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，其特征在于，所述步骤S1中，阅读文章Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA withoutDNA cleavage，从中获取7.10TadA+2linker氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示。
4.根据权利要求1所述的陆地棉基因组单碱基编辑(ABE)系统，其特征在于，所述步骤S2中，使用M1UI/XbaI对GhBE3载体，其核苷酸序列序列表SEQ ID NO：1所示，进行双酶切切除片段UGI后再连接一个核定位信号NLS，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，再使用使用PacI/AleI双酶切切除片段rAPOBEC1-XTEN,公司再把切除载体上多余的序列再与步骤S1中优化后的7.10TadA+2linker目的序列一起合成连接，得到适用于陆地棉的单碱基编辑的高效转化载体GhABE7.10n。
CN202010859115.1A 2020-08-24 2020-08-24 陆地棉基因组单碱基编辑(abe)系统 Pending CN111926034A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010859115.1A CN111926034A (zh) 2020-08-24 2020-08-24 陆地棉基因组单碱基编辑(abe)系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010859115.1A CN111926034A (zh) 2020-08-24 2020-08-24 陆地棉基因组单碱基编辑(abe)系统

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111926034A true CN111926034A (zh) 2020-11-13

Family

ID=73305977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010859115.1A Pending CN111926034A (zh) 2020-08-24 2020-08-24 陆地棉基因组单碱基编辑(abe)系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111926034A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113278647A (zh) * 2021-05-25 2021-08-20 华中农业大学 一种陆地棉基因组的高效定向基因调控的编辑方法
CN113832180A (zh) * 2021-08-03 2021-12-24 华中农业大学 CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法
CN116217683A (zh) * 2022-09-08 2023-06-06 深圳全棉时代科技有限公司 一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113278647A (zh) * 2021-05-25 2021-08-20 华中农业大学 一种陆地棉基因组的高效定向基因调控的编辑方法
CN113832180A (zh) * 2021-08-03 2021-12-24 华中农业大学 CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法
CN116217683A (zh) * 2022-09-08 2023-06-06 深圳全棉时代科技有限公司 一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用
CN116217683B (zh) * 2022-09-08 2024-04-16 深圳全棉时代科技有限公司 一种与棉花纤维品质相关的基因、超表达载体和敲除载体及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7170807B2 (ja) オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物
CN111926034A (zh) 陆地棉基因组单碱基编辑(abe)系统
CN114591977B (zh) 通过精准编辑内源epsps基因获得抗草甘膦水稻的方法及其所用系统
CN109234310A (zh) 快速获得无转基因基因编辑植株的重组载体及使用方法
CN113564197B (zh) 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用
CN111944842A (zh) 构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法
EP3356537B1 (en) Recombinant maize b chromosome sequence and uses thereof
US12077764B2 (en) Delivery of developmental regulators to plants for the induction of meristematic tissue with genetic alterations
CA3169636A1 (en) Methods and compositions for multiplexed editing of plant cell genomes
KR20190122595A (ko) 식물의 염기 교정용 유전자 구조체, 이를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 염기 교정 방법
CN113278647A (zh) 一种陆地棉基因组的高效定向基因调控的编辑方法
US12024711B2 (en) Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
CN113337539A (zh) 一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法
Wu et al. Targeted insertion in Nicotiana benthamiana genomes via protoplast regeneration
Geng et al. Data-driven optimization yielded a highly-efficient CRISPR/Cas9 system for gene editing in Arabidopsis
CN117025627B (zh) 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用
CN116445463B (zh) 新型植物碱基编辑器pAYBEs
CN113174401A (zh) 基因编辑介导的外源基因敲入到棉花基因组的方法及载体
Hara et al. Efficient generation of null-segregant parthenocarpic tomato by CRISPR/Cas9 editing
US20220195450A1 (en) Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
CN113122571A (zh) 一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法
CN118127073A (zh) 水稻烷基嘌呤糖基化酶及其突变体在植物A-to-K单碱基编辑中的应用
Zhang et al. Application of CRISPR-Based Technology in Plant Gene Editing and Agricultural Engineering
CN118667866A (zh) 一种杨树碱基编辑系统的构建方法及其在林木碱基编辑中的应用
CN117701584A (zh) OsGSL2基因及其突变体osgsl2-1在调控水稻雄性育性中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201113

RJ01 Rejection of invention patent application after publication