CN111944842A - 构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，涉及植物基因工程技术领域，通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，利用本发明构建的载体文库混合侵染陆地棉下胚轴，通过遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，用高通量的检测方法对突变体材料进行检测获得基因编辑情况，针对棉花抗虫性状结合抗虫鉴定结果筛选有表型的抗感虫陆地棉基因。该构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，本发明一次性快速构建了包含968个sgRNA覆盖502个基因的混合载体文库用于棉花遗传转化，本发明创建了包含五千多份愈伤两千多份再生植株的棉花基因编辑突变体文库，突变体库覆盖度高达82.07％。

Description

构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体为构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法。
背景技术
基因组学主要研究基因组图谱制作、基因组测序及注释、进行基因定位与鉴定基因功能，又分结构基因组学与功能基因组学，结构基因组学以全基因组的测序及注释为主要内容，功能基因组学以基因功能的鉴定为主要内容。棉花基因组研究相对于水稻、拟南芥、烟草等植物发展落后、缓慢，随着棉花全基因测序成果的公布，相应的基因序列渐渐知晓，通过全序列分析以及基因的拼接组装，再结合转录组的数据以及生物信息学的分析，可以对基因的功能进行预测，但是预测的基因功能还必须依赖于相应突变体材料进行生物学验证，突变体是开展遗传学研究特别是功能基因组学研究中非常重要的材料，建立突变体库将加快棉花功能基因组学的研究进程。
在自然条件下生物发生突变的概率只有10-5～10-8左右，想获得自然突变的材料较为困难，对自然突变的材料进行基因定位、基因功能等方面的研究相对繁琐，随着技术的不断发展人工诱导突变体的方法主要有物理、化学途径诱导，农杆菌介导的插入突变，及基因敲除技术，物理、化学途径诱导的方向难以掌握，突变体难以集中多个理想性状，农杆菌介导的插入突变为水稻，玉米等提供了丰富的突变体资源，但插入位点随机获得有表型突变体效率不高，对于基因组复杂且组织培养周期长的棉花构建突变体库不适用。
基因敲除的原理是利用DNA修复DSBs过程中产生的错误，诱导NHEJ途径进行修复，使基因不能正常表达，从而达到阻断或者破坏某个基因的功能的效果。基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN)，类转录激活因子核酸酶(TALEN)，规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)三类，CRISPR-Cas系统工作原理简单,成为当今使用最广的基因编辑工具，CRISPR-Cas9可在多种植物中成功进行基因组定点编辑，包括小麦、番茄、大豆等，高通量基因组编辑技术最早应用在动物细胞中，且现在已成为基因筛选广泛应用的方法，高通量基因组编辑技术在植物研究相对缓慢只有水稻和玉米中突变体库，但在多倍体植物种没有相关报道。
本实验室已经初步建立起适用于棉花自身特点的相对高效的低脱靶率的基因组编辑载体系统，为我们进行棉花高通量突变体库构建提供了技术支持。常规载体构建的方法只针对一个或几个编辑位点，高通量突变体库构建设计编辑位点多，常规方法需构建相同数量载体导致工作量多，因此获得快速构建载体文库的方法有重要意义，棉花(陆地棉)基因组复杂，转化周期长，转化效率低，这些因素导致建立棉花(陆地棉)全基因组基因编辑突变体库可行性不强，但是针对某一性状建立突变体库是可行的，棉花是世界上重要的经济作物之一，种植期间容易受到多种虫害的影响，近年来，刺吸式昆虫已经成为我国大部分棉花田最具破坏性的害虫，因此针对陆地棉抗虫性状建立突变体库筛选昆虫免疫相关基因具有重要意义，对基因编辑突变体材料的基因编辑情况进行检测是重要的环节之一，利用载体文库侵染棉花获得的不同突变体材料中的编辑位点及编辑水平多不相同，利用Sanger测序的方法进行检测效率低，工作量大，费用高，因此结合高通量检测技术对基因编辑突变体材料进行检测的优势突出。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，利用本发明构建的载体文库混合侵染陆地棉下胚轴，通过遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，用高通量的检测方法对突变体材料进行检测获得基因编辑情况，针对棉花抗虫性状结合抗虫鉴定结果筛选有表型的抗感虫陆地棉基因。
本发明一次性快速构建了包含968个sgRNA覆盖502个抗虫相关陆地棉内源基因的CRISPR-Cas9基因编辑混合载体文库，通过混合侵染棉花下胚轴获得陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库材料，利用高通量的检测技术对突变体材料进行检测获得基因编辑情况并后代材料进行编辑情况检测获得遗传规律，结合抗虫鉴定结果筛选得到有表型的抗感虫的陆地棉内源基因，本发明提供如下技术方案：通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得棉花(陆地棉)基因编辑突变体库材料，包括以下步骤：
S1、一种基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体文库的方法(技术流程见如图1)，具体地，构建方法通过以下步骤获得：
(1)利用CRISPR-P 2.0软件对陆地棉抗虫基因设计及筛选特异的sgRNA序列；
(2)对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；
(3)将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；
(4)将合成后的引物全部稀释成相同的浓度，四十份引物等量混合成一个引物池用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体文库。
S2、一种能够快速检测棉花基因编辑突变体库编辑情况的高通量检测方法，及针对棉花抗虫这一性状结合抗虫鉴定结果筛选昆虫免疫相关有表型的抗感虫陆地棉内源基因(如图1所示)，经遗传转化获得棉花(陆地棉)基因编辑突变体库材料具体地构建方法通过以下步骤获得：
(1)设计44条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况，其引物序列表6所示；
(2)通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况；
(3)确定每株突变体的编辑位点后在编辑位点前后设计引物进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况；
(4)针对棉花抗虫性状通过抗虫鉴定结果寻找有抗感表型突变体株系与基因编辑结果相结合筛选昆虫免疫相关有表型的抗感虫陆地棉内源基因。
进一步优化本技术方案，所述的Barcode引物序列在序列表SEQ ID NO:2中所示。
进一步优化本技术方案，所述的抗虫相关基因编辑突变体库创建方法在陆地棉中的应用。
进一步优化本技术方案，所述的检测方法在陆地棉基因组编辑材料检测中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，具备以下有益效果：
1、本发明一次性快速构建了包含968个sgRNA覆盖502个基因的混合载体文库用于棉花遗传转化。
2、本发明创建了包含五千多份愈伤两千多份再生植株的棉花基因编辑突变体文库，突变体库覆盖度高达82.07％。
3、本发明利用高通量的检测方法在阳性棉花基因编辑突变体材料检测到发生基因编辑的概率高达97.29％，基因编辑类型主要为不同片段长度的缺失突变。
4、本发明基因编辑突变体库材料中发生基因编辑情况可在后代材料中遗传，遗传率达84.55％。
5、本发明针对棉花抗虫这一个性状建立突变体库，基因编辑突变体库材料结合抗虫鉴定可筛选到有抗感表型的棉花突变体材料的频率达10％以上。
附图说明
图1：高通量构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法的路线图，附图标记说明：其中：
图a：混合载体文库的构建，包括基因和sgRNA的筛选、引物设计、合用引物、PCR扩增。
图b：利用合并的农杆菌菌株进行棉花的遗传转化。多个小型质粒文库转化到大肠杆菌中扩繁，提取质粒等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落进行棉花转化。
图c：利用Barcode及高通量检测方法检测棉花基因编辑突变体库材料。
图d：抗虫鉴定与测序结果相结合确定候选基因。
图2为棉花突变体库获得过程中遗传转化、植株再生、棉花突变体材料的温室与田间管理图。
图3为棉花基因编辑突变体材料的编辑频率统计图。
图4为棉花基因编辑突变体的编辑特点分析图，附图标记说明：其中：
图a：插入、替换和删除的总分布统计图。
图b：删除长度的统计图。
图c：替换碱基数目统计图。
图d：不同长度片段插入情况统计。
图e：棉花基因组编辑最常见的十种类型。
图5为棉花基因编辑后代遗传率统计图。
图6为抗虫鉴定筛选抗感材料，附图标记说明：其中：
图a：新疆地区蚜虫抗性筛选。
图b：武汉温室中蚜虫抗性筛选。
图c-h：温室和田间试验中抗虫系514和昆虫敏感系96蚜虫种群数量统计。
图i：筛选到与昆虫免疫相关的潜在目标基因的信息。
图7为海南地区温室中棉花咀嚼害虫抗性筛选图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：基因编辑混合载体文库构建
1、利用本实验室前期发表的转录组及代谢组数据筛选出在棉花中差异表达可能参与抗虫免疫调节的502个目标基因，利用CRISPR-P 2.0软件对目标基因设计及筛选特异的sgRNA序列968个sgRNA序列，对筛选到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成。
2、对SEQ ID NO：1所示的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体充分酶切，酶切体系见表下，37℃酶切6小时，然后利用凝胶回收试剂盒(武汉华信阳光生物科技有限公司)将酶切产物进行纯化，酶切体系见表1。
表1 pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ酶切体系
Figure BDA0002647528780000071
3、将合成后的引物全部稀释成相同的浓度，四十份引物等量混合成一个引物池与公用引物pRGEB32-7 s:AAGCATCAGATGggcaAACAAAGCACCAGTGGTCTAG以PGTR质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件见下表2。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002647528780000072
Figure BDA0002647528780000081
PCR反应条件见表3
表3 PCR反应条件
Figure BDA0002647528780000082
Figure BDA0002647528780000091
4、将PCR产物通过ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme C112-02)连接到酶切纯化后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体文库。
In-fusion连接反应体系见表4。
表4 In-fusion连接反应体系
Figure BDA0002647528780000092
实施例2：农杆菌介导的遗传转化
A.将剥好的棉花种子(品种为Jin668，专利申请号201510833618.0)用0.1％升汞杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1天，挑去种皮，将苗扶正，在28℃，暗培养4-5d；
B.将下胚轴切成小茎段，用活化后的农杆菌文库进行侵染，弃菌液，并吹干；
C.将下胚轴平铺在放有滤纸的共培养培养基中，于20℃，暗培养1-2d；
D.将下胚轴转入到附加2,4-D的愈伤组织诱导培养基中，放入光照培养室，20-30d左右用新鲜愈伤组织诱导培养基继代培养一次；
E.当愈伤组织长成米粒状颗粒，转入分化培养基中，进一步分化成胚状体；
F.将分化出的小苗继代到生根培养基中，直至长成生根良好健康的小苗；
G.将小苗转到清水中，进行炼苗，一周左右后，转移到到温室。
转化所用的培养基组分及配比：
无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel；pH:6.1-6.2。
愈伤组织诱导培养基：MSB+24-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel；pH:5.85-5.95。
农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L+NaCl 5g/L+MgSO4.7H2O 0.1g/L+KH2PO4+0.25g/L+甘露醇5g/L+甘氨酸1.0g/L；pH:5.85-5.95。
共培养培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/l+KT 0.1mg/l+50mg/l AS+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH5.8。
选择培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L和头孢霉素400mg/L；pH:5.85-5.95。
分化培养基：分化培养基：MSB培养基中去掉NH4NO3,将KNO3用量加倍+Gln 1.0g/L+Asn 0.5g/L+IBA 0.5mg/L+KT 0.15mg/L+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH:6.1-6.2。
生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel；pH:5.90-5.95；
MSB的成分如下：MS培养基+B5维生素。
通过遗传转化获得了超过五千多愈伤两千多转基因植株的突变体库，获得过程见图2。
实施例3：检测基因编辑棉花突变体材料中sgRNA
(1)设计44条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况，其Barcode的引物序列见序列表SEQ ID NO:2。
(2)提取的棉花嫩叶组织阳性基因组DNA(天根生化(北京)科技有限公司)，通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增。将获得的全部PCR产物进行等量混合，然后用纯化试剂盒(OMEGA公司)纯化混合产物后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况。PCR反应体系及反应条件见下表5，表6。
表5 PCR反应体系
Figure BDA0002647528780000111
表6 PCR反应条件
Figure BDA0002647528780000112
Figure BDA0002647528780000121
实施例4：高通量检测基因编辑棉花突变体材料编辑情况
确定基因编辑棉花突变体材料中sgRNA后在编辑位点前后设计扩增长度在280bp以内的引物对不同突变体材料提取的DNA进行PCR扩增，将不同位点的全部PCR产物进行等量混合，然后用纯化试剂盒(OMEGA公司)纯化混合产物后进行高通量检测及利用CRISPResso2软件(Clement et al.,2019)分析获得分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况。不同材料基因编辑频率如图3所示，编辑类型统计如图4所示。
实施例5：棉花基因编辑棉花突变体材料后代遗传分析
对T0代已进行编辑情况检测且已获得T1后代的100个株系的材料进行遗传分析，对进行检测100个株系中每个株系随机选择三个样品对其对应的编辑位点进行PCR扩增及高通量检测分析。对T1代中的编辑类型进行分析，将T1代编辑类型与T0代中编辑类型一致的认定为遗传自亲本的类型，将T1遗传于亲本的编辑类型所占频率除以该样品自身的编辑频率获得后代的遗传率，棉花基因编辑棉花突变体材料后代遗传情况见图5所示。
实施例6：针对棉花抗虫性状对棉花基因编辑棉花突变体材料进行抗虫鉴定筛选对虫害有抗感表型的突变体材料
1、利用200份T1代棉花基因编辑棉花突变体材料对棉蚜虫危害的抗虫鉴定。
在湖北武汉华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的两间温室中种植突变体材料和对照材料，设置五次实验重复。经过两个月的生长期对每盆突变体材料和对照材料接种20头左右棉蚜，一周后统计全部活蚜虫数量，筛选有表型的突变体，结果见图6。
2、利用200份T1代棉花基因编辑棉花突变体材料对咀嚼式口气害虫的抗性鉴定。
200份T1代棉花基因编辑棉花突变体材料种植在海南地区的温室中，材料生长过程中受咀嚼式口器害虫危害，对田间材料的危害情况进行统计筛选极端对咀嚼式口器害虫危害产生抗感表型的材料(如图7所示)。
3、T2代棉花基因编辑棉花突变体材料在新疆地区对蚜虫危害的抗虫鉴定。
新疆地区棉田中蚜虫危害日益验证，在新疆阿拉尔地区棉田中种植T2代棉花基因编辑棉花突变体材料每五份材料设置一份对照，在田间对种植45天的材料统计全株活蚜虫数，70天的材料统计前五片叶上蚜虫数，与对照材料进行比对筛选有表型突变体(见图6)。通过蚜虫和咀嚼式害虫对棉花基因编辑棉花突变体材料危害程度的调查，筛选到有表型的基因信息如表7所示
本发明的有益效果是：
1、本发明一次性快速构建了包含968个sgRNA覆盖502个基因的混合载体文库用于棉花遗传转化。
2、本发明创建了包含五千多份愈伤两千多份再生植株的棉花基因编辑突变体文库，突变体库覆盖度高达82.07％。
3、本发明利用高通量的检测方法在阳性棉花基因编辑突变体材料检测到发生基因编辑的概率高达97.29％，基因编辑类型主要为不同片段长度的缺失突变。
4、本发明基因编辑突变体库材料中发生基因编辑情况可在后代材料中遗传，遗传率达84.55％。
5、本发明针对棉花抗虫这一个性状建立突变体库，基因编辑突变体库材料结合抗虫鉴定可筛选到有抗感表型的棉花突变体材料的频率达10％以上。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，其特征在于，通过一次性快速构建混合载体文库，经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料，包括以下步骤：
S1、一种基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体文库的方法，具体地，构建方法通过以下步骤获得：
(1)利用CRISPR-P 2.0软件对陆地棉抗虫基因设计及筛选特异的sgRNA序列；
(2)对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；
(3)将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；
(4)将合成后的引物全部稀释成相同的浓度，四十份引物等量混合成一个引物池用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体文库；
S2、经遗传转化获得陆地棉基因编辑突变体库材料具体地构建方法通过以下步骤获得：
(1)设计44条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况，其引物序列表6所示；
(2)通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况；
(3)确定每株突变体的编辑位点后在编辑位点前后设计引物进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况；
(4)针对棉花抗虫性状通过抗虫鉴定结果寻找有抗感表型突变体株系与基因编辑结果相结合筛选昆虫免疫相关有表型的抗感虫陆地棉内源基因。
2.根据权利要求1所述的构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，其特征在于，所述的Barcode引物序列在序列表SEQ ID NO:2中所示。
3.根据权利要求1所述的构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，其特征在于，所述的抗虫相关基因编辑突变体库创建方法在陆地棉中的应用。
4.根据权利要求1所述的构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法，其特征在于，所述的检测方法在陆地棉基因组编辑材料检测中的应用。
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