CN113073112A - 一种用植物介导crispr技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法 - Google Patents

一种用植物介导crispr技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，包括以下步骤：1)、2)和3)。该用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，以NtTOGT基因序列作为靶序列构建了CRISPR载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的NtTOGT基因靶标序列成功导入烟草品种岩烟97中，得到了NtTOGT基因编辑突变体材料，将该转基因烟草于温室中，用高通量的检测方法对突变体材料进行检测获得基因编辑情况，针对编辑率较高的株系进行接菌试验，通过接菌实验结果，表明经过基因编辑的烟草可以导致NtTOGT基因的表达量下调，进而影响烟草植株抗青枯病的能力，导致植株抗病性降低，说明NtTOGT基因可能与烟草抗青枯病相关。

Description

一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体为一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法。
背景技术
基因敲除的原理是利用DNA修复DSBs过程中产生的错误，诱导NHEJ途径进行修复，使基因不能正常表达，从而达到阻断或者破坏某个基因的功能的效果，基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN)，类转录激活因子核酸酶(TALEN)，规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)三类，CRISPR-Cas系统工作原理简单，成为当今使用最广的基因编辑工具，CRISPR-Cas9可在多种植物中成功进行基因组定点编辑，包括小麦、番茄、大豆等，高通量基因组编辑技术最早应用在动物细胞中，且现在已成为基因筛选广泛应用的方法。
scopoletin glucosyltransferase(NtTOGT)编码东莨菪内酯葡糖基转移酶，催化东莨菪内酯转化为东莨菪苷，并在植物抗病原菌过程中发挥着重要的生物学作用，例如在烟草对烟草花叶病毒(TMV)的过敏反应(HR)中，东莨菪素糖基转移酶大量积累，主要以其葡萄糖基化的东莨菪苷的形式积累，东莨菪素及其糖苷物质的积累，加速了HR反应，进一步加快了病害的发展，所以认为该基因可能影响植物与病原菌互作。
普通烟草是世界范围内广泛种植的一种重要的经济作物，随着种植环境的改变，在耕作的规模化和连做等因素的综合影响下，使得烟草种植的病虫害逐年增多，烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌)引起的一种细菌性的土传病害，在世界范围内对烟草、番茄、辣椒等茄科作物以及包括花生、香蕉在内的54科中的接近450种植物产量造成严重危害，青枯病属于典型的维管束病害，植物的根、茎、叶组织均可受害造成植物枯萎，但叶片枯萎后仍呈绿色，故称为“青枯病”，寄主植物发病时，顶部叶片首先萎蔫下垂，然后植株下部叶片开始萎蔫，中部叶片最后萎蔫，或是整株叶片同时萎蔫，从而影响烟草叶片的品质和产量，青枯病在我国的南部烟区的危害较为严重，但近年来，该病害在我国呈现出渐进式北移趋向，对我国烟草产量的影响越来越严重，因此急需探索出烟草青枯病的抗性机制，故而提出了一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法来解决上述所提出的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，具备利于烟草青枯病防治的优点，解决了目前不了解烟草青枯病的抗性机制，影响烟草青枯病防治的问题。
(二)技术方案
为实现上述利于烟草青枯病防治的目的，本发明提供如下技术方案：一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，包括以下步骤：
1)基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体，具体构建方法如下：
①利用CRISPR-P2.0软件对NtTOGT基因设计及筛选特异的sgRNA序列；
②对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；
③将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；
④将合成后的引物用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体。
2)载体通过使用农杆菌介导的遗传转化方法导入植物宿主细胞，具体应用步骤如下：
①将岩烟97种子消毒处理后分别播种于1/2MS固体培养基中；
②7-10天后代长出小苗单独移栽至分装的1/2MS培养基中光照培养；
③待烟苗长至5-6片真叶左右，选取长势相近的同一批烟苗，在无菌环境中，取烟草叶片切成0.5×0.5cm的小片接种于用液体MS培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染5-8min，转移至无菌滤纸吸干残留菌液并吹10min使表面稍微干燥，将烟草叶片分散布于共培养培养基上，使每片叶片均能接触到培养基，在21℃下共培养48h；
④将烟草无菌苗叶片接种到选择培养基上，每30天继代培养1次直到获得基因编辑幼苗，然后将获得的未生根的基因编辑植株转移至生根培养基上诱导生根，直到得到完整的基因编辑植株。
3)快速检测烟草基因编辑转化植株的编辑情况，具体操作步骤如下：
①对基因编辑后代进行阳性鉴定：
设计如下引物序列：
Cas9-F:5’-gctgggccgtgatcaccgacg-3’；
Cas9-R:5’-gaagaggataagaagcacgagc-3’；
PCR反应体系(20uL)：
16uL的双蒸水；2uL的10×EasyTaq Buffer；0.4uL的dNTP；0.2uL的ForwardPrimer；0.2uL的Reverse Primer；0.2uL的EasyTaq；1uL的DNA样品；
②设计10条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况；
③通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况；
④确定每株突变体的编辑位点后在编辑位点前后设计引物进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况；
⑤针对烟草抗病性状通过抗病鉴定结果寻找有抗感表型突变体株系；
⑥对基因编辑烟草做抗病鉴定。
优选的，所述表达载体包含有SEQ ID NO：2的靶标序列，所述1/2MS培养基由大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、肌醇10ml/L、蔗糖15g/L，附加7g/L的琼脂，PH调至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
优选的，所述MS液体培养基由大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、肌醇10ml/L和蔗糖15g/L，PH调至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
优选的，所述共培养培养基由大量元素50ml/L、微量元素10ml/L、铁盐10ml/L、肌醇10ml/L、NH4NO3 10ml/L、甘氨酸1ml/L、B5维生素1ml/L、1g/L的NAA 20μL/L、1g/L6-BA1ml/L和蔗糖30g/L，调pH至5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
优选的，所述筛选培养基由大量元素50ml/L、微量元素10ml/L、铁盐10ml/L、肌醇10ml/L、NH4NO3 10ml/L、甘氨酸1ml/L、B5维生素1ml/L、1g/L的NAA 20μL/L、1g/L6-BA1ml/L、蔗糖30g/L、50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素，调pH至5.85-5.95，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
优选的，所述生根培养基由大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、肌醇10ml/L、蔗糖15g/L、附加7g/L的琼脂、50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素，调pH至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，具备以下有益效果：
该用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，通过构建了NtTOGT基因的CRISPR-Cas9载体并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其成功转入烟草受体，得到了在基因编码区敲除NtTOGT基因表达的基因编辑烟草，通过温室接菌实验证明，NtTOGT基因的缺失造成烟草对青枯菌的抗性减弱，说明该基因的表达影响了植物对青枯菌的抗性，从而为烟草青枯病的防治提供一种新的思路。
附图说明
图1为含有NtTOGT基因靶标的表达载体的构建过程；
图2为本发明的表达载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ的构建图；
图3为本发明中涉及的农杆菌介导的遗传转化，进而获得基因编辑的烟草植株的图片，其中A图为烟草叶片与农杆菌共培养状况的图片；B图为选择培养阶段；C图为抗性愈伤组织形成的图片；D图为烟草细胞通过体细胞胚胎发生获得再生幼苗的图片；E图为再生植株生根过程；F图和G图为T0代再生植株移栽到营养钵中放置在温室中生长状况；
图4为基因编辑T1代筛苗及培育过程，其中A图为Kan+抗性培养基中筛苗；b图为10天后移栽至无菌土中；c图为20天后取样；d图为30-40天后待接菌；
图5为基因编辑烟草植株基因阳性检测示意图；
图6为部分基因编辑烟草株系编辑率检测结果；
图7为接青枯菌15天后NtTOGT基因编辑系与对照岩烟97的发病情况，上行为CK岩烟97，下行为NtTOGT基因编辑系。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQ ID NO：1tTOGT CDS核酸序列
ATGGGTCAGCTCCATATTTTCTTCTTTCCTGTGATGGCTCATGGCCACATGATTCCTACACTAGACATGGCGAAGCTCTTTGCTTCACGTGGTGTTAAGGCCACTATAATCACAACCCCACTCAATGAATTCGTTTTCTCCAAAGCTATTCAAAGAAACAAGCATTTGGGTATCGAAATCGAAATCCGTTTGATCAAATTCCCAGCTGTTGAAAACGGCTTACCTGAAGAATGCGAACGCCTCGATCAAATCCCTTCAGATGAGAAGCTCCCAAACTTTTTCAAAGCTGTAGCTATGATGCAAGAACCACTAGAACAGCTTATTGAAGAATGTCGCCCCGATTGTCTTATTTCAGATATGTTCCTTCCTTGGACTACTGATACTGCAGCAAAATTTAACATTCCAAGAATAGTCTTTCATGGCACAAGCTTCTTTGCTCTTTGTGTTGAGAATAGCGTCAGGCTAAATAAGCCTTTCAAGAATGTGTCCTCAGATTCTGAAACTTTTGTTGTACCGGATTTGCCTCACGAAATTAAGCTGACCAGAACCCAGGTGTCTCCGTTTGAGCGATCTGGGGAAGAGACGGCTATGACCCGGATGATAAAAACAGTCAGGGAATCAGATTCAAAGAGCTATGGAGTTGTTTTCAACAGTTTCTATGAGCTTGAAACAGATTATGTTGAGCATTATACTAAGGTGCTGGGTAGAAGAGCTTGGGCTATTGGCCCTCTATCGATGTGCAACAGGGACATTGAAGATAAAGCTGAAAGAGGAAAGAAATCCTCTATTGATAAACACGAGTGCTTGAAATGGCTTGATTCGAAGAAACCAAGTTCCGTCGTTTACATTTGTTTTGGAAGCGTAGCGAATTTCACTGCATCACAACTGCACGAACTTGCTATGGGAGTTGAAGCTTCCGGACAAGAATTCATTTGGGTTGTTAGAACAGAACTAGACAACGAAGATTGGTTGCCTGAAGGATTCGAGGAAAGAACGAAAGAGAAAGGTTTAATAATAAGAGGATGGGCACCCCAAGTACTAATTCTTGATCACGAATCTGTGGGAGCTTTTGTTACACATTGTGGTTGGAATTCAACACTAGAAGGAGTTTCAGGAGGGGTTCCAATGGTAACATGGCCTGTATTTGCTGAGCAATTTTTCAATGAGAAGTTAGTGACTGAGGTTTTGAAAACTGGAGCTGGTGTTGGTTCGATACAATGGAAGAGATCAGCTAGTGAAGGAGTGAAAAGAGAAGCAATAGCTAAGGCAATAAAGAGAGTAATGGTGAGTGAAGAAGCAGATGGATTCAGAAACAGAGCTAAAGCGTATAAGGAGATGGCAAGAAAGGCTATTGAAGAAGGAGGGTCATCTTACACTGGATTGACTACTTTGTTGGAAGATATAAGTACATATAGTTCCACTGGTCATTAA
SEQ ID NO：2
Target1:CCTTCAGATGAGAAGCTCCCAAA
Target2:TTTGTGTTGAGAATAGCGTCAGG
SEQ ID NO：3
Figure BDA0003051167810000071
序列表SEQ ID NO:1是本发明涉及的NtTOGT基因的核苷酸序列，SEQ ID NO:2是靶标序列，SEQ ID NO:3是Barcode引物序列。
实施例一：基因编辑载体文库构建
1、本实验室前期发表的转录组及代谢组数据筛选出在烟草中差异表达目标基因NtTOGT，利用CRISPR-P 2.0软件对目标基因设计及筛选特异的sgRNA序列，对筛选到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成。
2、对SEQ ID NO：1所示的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体充分酶切，酶切体系见表下，37℃酶切6小时，然后利用凝胶回收试剂盒(武汉华信阳光生物科技有限公司)将酶切产物进行纯化，酶切体系见表1。
表1 pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ酶切体系
Figure BDA0003051167810000081
3、将合成后的引物全部稀释成相同的浓度，合成引物与公用引物pRGEB32-7 s:AAGCATCAGATGggcaAACAAAGCACCAGTGGTCTAG以PGTR质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件见下表2。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0003051167810000082
PCR反应条件见表3
表3 PCR反应条件
Figure BDA0003051167810000083
Figure BDA0003051167810000091
4、将PCR产物通过ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme C112-02)连接到酶切纯化后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体文库。In-fusion连接反应体系见表4。
表4 In-fusion连接反应体系
Figure BDA0003051167810000092
实施例二：农杆菌介导的遗传转化
1.两个月大小的烟草无菌苗，在无菌条件下将叶片去除主叶脉，手术刀切为0.5*0.5mm大小的叶盘；
2.同时将转化成功的农杆菌在含有卡纳和利福平的LB中摇菌，完成3000rpm收集菌体沉淀，用MS液体培养基悬浮菌体，置于28度摇床活化20min；
3.随后将切好的叶盘浸泡于MS液体培养基重悬的菌液中，侵染5-10min，取出叶片与灭菌的滤纸上吸去菌液并吹干后，上表面接触培养基置于共培养，28度黑暗培养48h；
4.共培养之后可将叶盘转移至筛选培养基(头孢+卡那)中分化愈伤。
每隔15天继代一次；
5.待出现再生芽时将其分切至生根培养基中；
6.待植株长得健壮后，移栽至培养土中。
烟草无菌苗叶盘
转化用的培养基及其配制
1/2MS培养基：大量元素25ml/L，微量元素5ml/L，铁盐5ml/L，肌醇10ml/L，蔗糖15g/L，附加7g/L的琼脂，PH调至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L。
MS液体培养：大量元素25ml/L，微量元素5ml/L，铁盐5ml/L，肌醇10ml/L，蔗糖15g/L，PH调至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L。
共培养培养基：大量元素50ml/L，微量元素10ml/L，铁盐10ml/L，肌醇10ml/L，NH4NO310ml/L，甘氨酸1ml/L，B5维生素1ml/L，1g/L的NAA 20μL/L，1g/L6-BA1ml/L，蔗糖30g/L，调pH至5.85，补加蒸馏水定容至1L。
筛选培养基：大量元素50ml/L，微量元素10ml/L，铁盐10ml/L，肌醇10ml/L，NH4NO310ml/L，甘氨酸1ml/L，B5维生素1ml/L，1g/L的NAA 20μL/L，1g/L6-BA1ml/L，蔗糖30g/L，50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素，调pH至5.85-5.95，补加蒸馏水定容至1L。
生根培养基：大量元素25ml/L，微量元素5ml/L，铁盐5ml/L，肌醇10ml/L，蔗糖15g/L，附加7g/L的琼脂，50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素，调pH至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L。
培养基配制好后在121℃高压蒸汽下灭菌15分钟。培养基中涉及到的抗生素的灭菌采用过滤灭菌，即在超净工作台内的无菌环境下加入到冷却至60℃以下的高压灭菌后的培养基中使用。
培养物的培养条件，除愈伤组织诱导阶段(28±2℃)不需要光照外，其他的培养阶段的培养条件为28±2℃，光照强度为冷光源135μmol m-2s-1，每天光照14h(特殊需要的培养条件除外)。
4、T1代转化植株筛苗及播种
将收获的T0代的基因编辑烟草种子用50％的84消毒液消毒处理3-5分钟再将其用无菌水洗净(3-5次)后，将其浸于0.1％琼脂糖中，再用移液枪将处理的烟草种子悬浮于加入Kan+抗性的固体MS培养皿中，待3天后种子萌发出芽，10天左右长出小苗，将其分别移栽至单独的无菌土中，置于光照培养室中生长，长至苗期20天时，对每棵苗子进行取样，保存于-70℃，待提取DNA做阳性检测用，大概长至苗期40-50天，5-6片真叶时待接菌用(如图4)。
实施例三：T1代转化植株DNA的抽提及阳性检测
(1)设计10条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况，其Barcode的引物序列见序列表SEQ ID NO:2。
(2)植物基因组DNA的提取：试剂盒购自TIANGEN公司；
准备工作：钢珠，2mL离心管，冰盒，抽屉缓冲液，三氯甲烷，酚-氯仿，β-巯基乙醇，天根植物基因组DNA提取试剂盒，步骤如下：
1.取新鲜幼嫩叶片0.1g左右至2ml离心管中，置于冰盒或液氮中，冰上办好后诸葛加入钢珠和200μL抽屉缓冲液，磨样机打磨90sec，频率为60Hz(磨样机四个角最好放上样品，使得盖子平衡)，磨匀后再补加600μL抽提缓冲液，立即混匀，此时把水浴锅的温度调到65℃；
2.室温11000r/min，5min，倒掉抽提缓冲液(此时钢珠还在，避免倒出)，加入未预热的GP1裂解液800μL后摇匀(短时间手摇，在港住的作用下使得GP1与样品充分混匀即可，此时GP1未预热，DNA基本没有从细胞中裂解出来)使得样品与GP1充分接触均匀(注：使用的GP1需要计入千分之一的β-巯基乙醇)；
3.65℃水浴40-60min，每隔10min轻轻上下颠倒几次，此时及后续步骤避免剧烈震荡；
4.加800μL酚氯仿(250mLTris酚+250mL氯仿混匀，静置过夜)，轻柔摇匀抽提20min，室温11000r/min，10min，此时钢珠还在，转速不宜过大；
5.取上清之心的离心管中，加入800μL氯仿，轻柔摇匀20min，室温12000r/min，10min；
6.取上清，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀；
7.将混合的液体转入CB3吸附柱中，12000r/min，30sec，弃滤液(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心)；
8.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000r/min，离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
9.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000r/min，离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
10.重复操作步骤9；
11.将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min，离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
12.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min，离心2min，将溶液收集到离心管中；
13.重复步骤12，将离心管中的溶液重新低价到吸附膜上，12000r/min，离心2min，将溶液收集到离心管中；
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很多影响，若用ddH2O做洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5之间。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000r/min，离心2min；
(3)DNA浓度的测定
1.DNA原液稀释10倍后(吸出1μL原液加到9μLddH2O中)根据MAKER的亮度科技初步判断DNA的浓度，此外还可以看出DNA是否降解，蛋白质和多糖是否含量比较多等；
2.DNA浓度的精确测定：Nanodrop2000测定OD260可以计算出DNA的浓度；
DNA＝OD260*50*100(ng/μL)
用OD260/OD280的比值衡量DNA的质量，DNA的比值在1.8做左右为佳，大于1.8RNA和蛋白质的含量高，小于1.8则是多糖的含量高。
(4)PCR阳性检测
取适量稀释后的DNA作为模板，CRISPR敲除的基因编辑植株用载体上游和靶标下游引物进行PCR扩增，扩增产物用0.8％的1×+TBE琼脂糖凝胶电泳进行检测。以空载质粒作为阳性对照，以野生型植株DNA为模板进行PCR扩增的产物作为阴性对照。
(5)检测基因编辑烟草突变体材料中sgRNA
通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增。将获得的全部PCR产物进行等量混合，然后用纯化试剂盒(OMEGA公司)纯化混合产物后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况。PCR反应体系及反应条件见下表5，表6。
表5 PCR反应体系
Figure BDA0003051167810000131
Figure BDA0003051167810000141
表6 PCR反应条件
Figure BDA0003051167810000142
(6)高通量检测基因编辑烟草突变体材料编辑情况
确定基因编辑烟草突变体材料中sgRNA后在编辑位点前后设计扩增长度在280bp以内的引物对不同突变体材料提取的DNA进行PCR扩增，将不同位点的全部PCR产物进行等量混合，然后用纯化试剂盒(OMEGA公司)纯化混合产物后进行高通量检测及利用CRISPResso2软件(Clement et al.，2019)分析获得分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况。部分材料基因编辑频率如图6所示。
实施例四：基因编辑烟草的温室抗病鉴定
利用30份T1代烟草基因编辑烟草突变体材料对青枯菌危害的抗病鉴定。
在湖北武汉华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的温室中种植突变体材料和对照材料，设置五次实验重复。经过一个月的生长期，烟苗约长至5-6片真叶左右，选取株高和长势相近的同一批烟苗，轻轻拔出，用清水洗净根部后，在OD600＝0.1的青枯菌液中浸泡5min后取出，重新种入无菌的小钵子中，接种后自发病之日起，每隔5天观察有无的发病情况，按《GB/T23222-2008烟草病虫害分级及调查方法》标准进行不同转化后代的发病情况调查，记录各转化后代处理后首次发病的日期，以病叶数为单位记录青枯病的发生情况，共调查4次，统计不同株系的发病情况。
烟草青枯病对烟草植株危害性状统计结果表明对照烟草的病害流行曲线下面积数值显著低于基因编辑烟草，AUDPC数值越小则表明抗性越强，说明这可能是与烟草青枯病抗性相关的基因。
本发明的有益效果是：通过构建了NtTOGT基因的CRISPR-Cas9载体并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其成功转入烟草受体，得到了在基因编码区敲除NtTOGT基因表达的基因编辑烟草，通过温室接菌实验证明，NtTOGT基因的缺失造成烟草对青枯菌的抗性减弱，说明该基因的表达影响了植物对青枯菌的抗性，从而为烟草青枯病的防治提供一种新的思路。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，一次性快速构建基因编辑载体，具体构建方法如下：
①利用CRISPR-P2.0软件对NtTOGT基因设计及筛选特异的sgRNA序列；
②对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加TTCTAGCTCTAAAAC序列，下游添加TGCACCAGCCGGGAAT用于引物合成；
③将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体用BsaI进行充分酶切然后纯化；
④将合成后的引物用于PCR扩增，将PCR产物通过In-fusion连接到酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体后通过热激转化大肠杆菌提取质粒后等量混合转化农杆菌，大量收集农杆菌菌落获得载体。
2)载体通过使用农杆菌介导的遗传转化方法导入植物宿主细胞，具体应用步骤如下：
①将岩烟97种子消毒处理后分别播种于1/2MS固体培养基中；
②7-10天后代长出小苗单独移栽至分装的1/2MS培养基中光照培养；
③待烟苗长至5-6片真叶左右，选取长势相近的同一批烟苗，在无菌环境中，取烟草叶片切成0.5×0.5cm的小片接种于用液体MS培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染5-8min，转移至无菌滤纸吸干残留菌液并吹10min使表面稍微干燥，将烟草叶片分散布于共培养培养基上，使每片叶片均能接触到培养基，在21℃下共培养48h；
④将烟草无菌苗叶片接种到选择培养基上，每30天继代培养1次直到获得基因编辑幼苗，然后将获得的未生根的基因编辑植株转移至生根培养基上诱导生根，直到得到完整的基因编辑植株。
3)快速检测烟草基因编辑转化植株的编辑情况，具体操作步骤如下：
①对基因编辑后代进行阳性鉴定：
设计如下引物序列：
Cas9-F:5’-gctgggccgtgatcaccgacg-3’；
Cas9-R:5’-gaagaggataagaagcacgagc-3’；
PCR反应体系(20uL)：
16uL的双蒸水；2uL的10×EasyTaq Buffer；0.4uL的dNTP；0.2uL的Forward Primer；0.2uL的Reverse Primer；0.2uL的EasyTaq；1uL的DNA样品；
②设计10条带Barcode的引物用于检测不同基因编辑突变体材料中插入sgRNA的情况；
③通过Barcode的上下游引物间的排列组合对基因编辑突变体材料进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料sgRNA插入情况；
④确定每株突变体的编辑位点后在编辑位点前后设计引物进行PCR扩增后进行高通量检测及分析获得每株基因编辑突变体材料基因编辑情况；
⑤针对烟草抗病性状通过抗病鉴定结果寻找有抗感表型突变体株系；
⑥对基因编辑烟草做抗病鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于：所述表达载体包含有SEQ ID NO：2的靶标序列，所述1/2MS培养基由大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、肌醇10ml/L、蔗糖15g/L，附加7g/L的琼脂，PH调至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
3.根据权利要求1所述的一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于：所述MS液体培养基由大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、肌醇10ml/L和蔗糖15g/L，PH调至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
4.根据权利要求1所述的一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于：所述共培养培养基由大量元素50ml/L、微量元素10ml/L、铁盐10ml/L、肌醇10ml/L、NH4NO3 10ml/L、甘氨酸1ml/L、B5维生素1ml/L、1g/L的NAA 20μL/L、1g/L6-BA1ml/L和蔗糖30g/L，调pH至5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
5.根据权利要求1所述的一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于：所述筛选培养基由大量元素50ml/L、微量元素10ml/L、铁盐10ml/L、肌醇10ml/L、NH4NO3 10ml/L、甘氨酸1ml/L、B5维生素1ml/L、1g/L的NAA 20μL/L、1g/L6-BA1ml/L、蔗糖30g/L、50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素，调pH至5.85-5.95，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
6.根据权利要求1所述的一种用植物介导CRISPR技术挖掘烟草青枯病抗性基因的方法，其特征在于：所述生根培养基由大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、铁盐5ml/L、肌醇10ml/L、蔗糖15g/L、附加7g/L的琼脂、50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素，调pH至5.8-5.85，补加蒸馏水定容至1L配制而成。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046361A (zh) * 2021-01-30 2021-06-29 湖南大学 基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000000626A1 (fr) * 1998-06-26 2000-01-06 Aventis Cropscience S.A. Procede enzymatique de glucosylation de derives aromatiques par udp-glucose: glucosyl transferase
CN111944842A (zh) * 2020-08-24 2020-11-17 华中农业大学 构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000000626A1 (fr) * 1998-06-26 2000-01-06 Aventis Cropscience S.A. Procede enzymatique de glucosylation de derives aromatiques par udp-glucose: glucosyl transferase
CN111944842A (zh) * 2020-08-24 2020-11-17 华中农业大学 构建陆地棉抗虫相关基因编辑突变体库的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRAISSINET-TACHET L ET AL.: "NM_001326177.1", NCBI *
杨振国: "植物保卫素东莨菪内酯对烟草的诱导抗性研究进展", 现代农业科技, no. 16, pages 21 - 22 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046361A (zh) * 2021-01-30 2021-06-29 湖南大学 基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用
CN113046361B (zh) * 2021-01-30 2023-07-25 湖南大学 基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用

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