CN113046361B

CN113046361B - 基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用

Info

Publication number: CN113046361B
Application number: CN202110131373.2A
Authority: CN
Inventors: 汪龙; 于峰; 伍斗生; 李晓旭; 刘红斌
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2021-01-30
Filing date: 2021-01-30
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-01-30
Also published as: CN113046361A

Abstract

本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及基于NtFER的改造在提高植物抗性中的应用。本发明以烟草NtFER基因为靶标，通过基因工程手段进行改造，下调NtFER基因的表达量，提高植物对青枯病抗性。具体以烟草NtFER基因为靶标，设计了CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中，然后转化烟草，获得了烟草NtFER基因的编辑材料，并发现其对青枯病具有明显的抗性。

Description

基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用

技术领域

本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及基于NtFER基因的改造在提高植物抗性中的应用。

背景技术

FERONIA(FER)为植物界保守的一类受体蛋白激酶，在植物中的发现其具有响应生物胁迫和非生物胁迫的功能，包括冷热胁迫，盐胁迫，病原菌胁迫等。尤其近年来发现其配体分子RALF23能够通过FERONIA抑制植物免疫系统，而在植物根部，根结线虫通过分泌RALF类似物与FERONIA竞争结合，从而达到抑制植物免疫系统的作用，因此FER在植物免疫调控中发挥重要的作用。烟草中，目前发现NtFER主要参与烟叶大小和香气物质的调控过程。

青枯病是由假单胞杆菌科(Burkholderiaceae)青枯菌属(Ralstonia)青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的一种土传细菌病害，寄主范围广，可侵染烟草、番茄、马铃薯、辣椒等百种植物。烟草青枯病主要发生在热带和亚热带等地区，是烟草生产上一大毁灭性土传病害。烟草青枯病在化学、生物防治等方面仍然存在多方面的问题，且青枯菌系变异类型多，侵染来源较为复杂，因此挖掘青枯病抗性基因、培育抗性品种是防治青枯病的有效方法。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是：如何利用基因工程手段改造NtFER基因从而用于防治植物青枯病。

本发明的技术方案为：挖掘到与烟草青枯病抗性相关的NtFER基因，以烟草NtFER基因为靶标，通过基因工程手段进行改造，设计了CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中，然后转化烟草，获得了烟草NtFER基因的编辑材料，并发现其对青枯病具有明显的抗性。

本发明解决其技术问题是通过以下技术方案具体实现的：

基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用，所述应用的具体方法为：基于NtFER基因的改造，下调NtFER基因的表达量，从而达到提高植物对青枯病的抗性。

优选地，所述植物为烟草。

所述NtFER基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述NtFER基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

基于NtFER基因的改造的具体方法：以烟草NtFER基因为靶标，通过基因工程手段进行改造。

优选地，所述基因工程手段包括诱变、基因编辑、基因沉默的至少一种方式。

优选地，基因编辑的具体方法为：以烟草NtFER基因为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中转化烟草，实现对烟草NtFER基因的基因编辑。

优选的，所述基因编辑包括碱基取代、碱基缺失、碱基增加。

优选地，所述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体的操作步骤为：

(1)退火：将SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3序列退火，反应体系：5×AnnealingBuffer for DNA Oligos 4μL，上下游引物各4μL(50μmol/μL)，Nuclease-free water补至20μL；反应程序：95℃5min，每8s下降0.1℃，直至25℃；4℃保存退火反应得到的DNA产物；

(2)载体连接：将退火反应得到的DNA产物连接到经过BsaI酶切过后的pORE-Cas9/gRNA载体上；连接体系：退火DNA产物2μL，酶切pORE-Cas9/gRNA载体3μL，10×T4 DNALigase Buffer 2μL，T4 DNA Ligase(400U/μL)1μL，无菌水补至20μL；连接产物转化DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆。

优选地，所述sgRNA序列包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示2种序列。

优选地，所述CRISPR/Cas9载体为pORE-Cas9/gRNA载体。

基于NtFER基因的改造在制备对青枯病抗性高的植物新品种中的应用。

优选地，所述植物新品种为烟草新品种。

本发明以烟草NtFER基因为靶标，通过基因工程手段进行改造，下调NtFER基因的表达量，提高植物对青枯病抗性。具体设计了CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中，然后转化烟草，获得了烟草NtFER基因的编辑材料，并发现其对青枯病具有明显的抗性。

附图说明

图1为对照组、NtFER-Cas9基因编辑突变体的抗青枯病表型分析。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

烟草生态型为云烟87；农杆菌菌种为LBA4404；载体pORE-Cas9/gRNA；主要试剂包括：Thermo Fisher生物公司的限制性内切酶、诺唯赞公司的DNA聚合酶、Infusion连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；天根公司的RNA提取试剂盒；天根公司的质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒；Taraka公司的定量PCR试剂；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、利福平等抗生素等试剂购自Sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由北京擎科生物技术有限公司完成。

首先登陆网站http://zifit.partners.org/ZiFiT/faq.aspx，依据靶位点设计原则设计引物，最终选择下列sgRNA序列作为靶点5’--3’，根据靶点设计引物，通过PCR、酶切、连接等方式，构建CRISPR/Cas9的靶点载体。

sgRNA序列如下：NtFERF:5’-GATTGGAGGGTTTAGTCAACCCAAGAA-3’，NtFERR:5’-AAACTTCTTGGGTTGACTAAACCCTCC-3’。

载体构建如下：

(1)退火：将上述引物的退火反应按照上海碧云天生物技术有限公司产品说明书(产品编号：D0251)，反应体系：5×Annealing Buffer for DNA Oligos 4μL，上下游引物各4μL(50μmol/μL)，Nuclease-free water补至20μL；反应程序：95℃5min，每8s下降0.1℃，直至25℃；4℃保存；

(2)载体连接：将退火反应得到的DNA产物连接到经过BsaI酶切过后的pORE-Cas9/gRNA载体上；连接体系：退火DNA产物2μL，酶切pORE-Cas9/gRNA载体3μL，10×T4 DNALigase Buffer 2μL，T4 DNA Ligase(400U/μL)1μL，无菌水补至20μL。连接产物转化DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆；用载体上游的通用引物：U26-F：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'和目标基因上游反向互补引物为下游鉴定引物：5’-AAACTTCTTGGGTTGACTAAACCCTCC-3’对菌斑进行菌落PCR。经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序验证；

(3)表达载体农杆菌的转化和烟草遗传转化：将测序正确的pORE-Cas9/gRNA载体提取质粒后转化LBA4404农杆菌，在含卡那霉素和利福平抗性的YEB平板上进行筛选培养，挑取菌斑进行菌落PCR验证，将阳性的菌液扩繁培养，离心菌液，用MS液体培养基重悬菌体，然后用重悬液浸染烟草叶盘，将被侵染的烟草叶盘(直径0.5cm)在含有NAA、6-BA和卡那霉素的MS固体培养基中进行筛选，最终获得愈伤组织和通过抗性筛选的阳性小芽；基因编辑的植株经过自交繁种后获得T1代进行后续实验，为了防止再次发生突变，测序后可挑出突变体进行自交，去掉Cas9背景；

(4)基因编辑材料的表型鉴定：将每个小盆中加入110g土，每个小盆中分别放入3粒野生型云烟87种子和NtFER的基因编辑突变体，分别做5个重复，然后覆盖50mL土，种子萌发后将长势不齐的苗子拔出，留下一株烟草苗。待植物都长大后，随机用小刀往土壤中切一刀，然后灌注含有30mL OD₆₀₀＝0.1青枯菌的菌液，10天后观察烟草的长势情况，比对对照组和NtFER-Cas9基因编辑材料的青枯菌侵染表型。图1说明NtFER-Cas9基因编辑材料更抗青枯菌。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 基于NtFER基因的改造在提高烟草青枯病抗性中的应用

<141> 2021-01-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3205

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum L.

<400> 1

aactcaaaag caacttatta aactaccaac ttccttcaat ttcacttctc tctttgtttc 60

tctctctagc ttaccatctc tctaaaactc aaaccctatt ctctctcttc tttgatctga 120

gcctgagctt cttcttcagc tgactgcagc ttagaattca gtgcttgtgg gtttagtcaa 180

cccaagaatg gcttaaagtt tgcttctttt tggatctctc agtttcttgc tgattcttta 240

gtgactttta ctattggcgc gtatagcatc aatgacagaa ggcagtaaat tctgttttct 300

cttggcttcc actttcctgt tgttggctgt tgtcgttaaa gtgacgttgg ctcaaaattc 360

tgcacctggt gatgatattc tgttgaactg tggaggccct gacggtctta aagatgccga 420

tggtcgaaaa tggggttcgg atattgggtc aacatatttg aagggtagta agtcgtcaac 480

ctctgatgct gctgatcaaa agccctctgt ccctcaagtc ccttttatgt ctgcccgtgt 540

tttcgagtct gagttcacct atagtttccc tgtagcacct ggtcgtaagt ttgtccgtct 600

gtatttttat ccctcgtctt acaacaagct taatgctacc aatgccattt tcagtgtgac 660

cgttggacca tattccctcc ttagaaactt cagtgcagca caaactgctg aagctctcaa 720

ctacgattac ttgacaaagg agttttcaat caatgtgcca tctgaaactt tgaacatgac 780

tttcacaccc tctccaaata cttcaaactc ctttgcgttt gtcaatggga ttgagattat 840

ttcacatcgt gacatctata atacagatga cgggactacc ttcatcgtgg gtcagactgc 900

tgctttcatt attgacaatt ctactgccct tgagaatgtt taccggctta atgttggagg 960

caatgtgatc tcaccatcag ctgatactgg tatgtttagg tcatggagtg atgactcaca 1020

gtatattttt ggagcagcca acggggttac agatactgca gatgatgaga atctcacagt 1080

aagctatcct gaaggaacgc catctgacat tgccccgctt gatgtctata agacagccag 1140

gtcaatgggt ccaactgctc aaattaacct gcaatacaat ttgacttggg ttttttcagt 1200

tgattcgggg ttctcttatc ttgttaggct ccatttctgt gaaatcacta agaatatcac 1260

aaaaatcaac caaagggtgt ttgtcatcta catgaataat cagactgcgg aacctgcagc 1320

agatgtcatt gcttggactg gaagcaatgg ggttcctttc cacaaggatt atgtggtctc 1380

tgtcaattct ggggctccac agcaggatct ttggcttgcc ctccatccaa acgttgcttc 1440

aaaatccaat tggtatgatg caattttgaa tggagtagag atttttaaag tgaatgacac 1500

caacggaaac ctcgcagggc ctaatcctgt tccagtgcca gaaccagatc atattgaccc 1560

tctgccgtcg aaaaaaggtc aatcaaaaag taataaatca gctattggtg gaggtgttgg 1620

aggtggaatt gctgccataa ttcttatcgg tttggttgta tgccttgtca cccgccgccg 1680

gaaacatggg aaggtccaaa gtccaagtga tggaccatca ggctggctcc ctttatcttt 1740

atatggaaat tcacatactt ctggttctgc taagacaaac actacaggca gttatgcttc 1800

gtccctccca tcaaaccttt gtcgtcactt ttcatttgct gagatcaagg cagccactaa 1860

taactttgat gaatctctgc ttcttggggt gggtggtttt ggcaaagtat acaagggaga 1920

aattgatggt ggcacaaaag ttgctatcaa acgtgggaat cctctctctg agcaaggtgt 1980

tcatgaattt caaactgaaa ttgaaatgct ctctaaactt cgccatcgcc accttgtttc 2040

tttgattggt tattgcgagg agaactgtga gatgatcctt gtatatgact acatggctca 2100

tggtaccctt cgcgagcatc tctacaagac ccagaagcct cctttacctt ggaagcagag 2160

gcttgatatt ggcattggtg ctgctcgggg attgcactat cttcatactg gtgccaagca 2220

tactattatc caccgtgatg tgaagaccac taatatcctc ttggatgaga agtgggtggc 2280

aaaggtttct gatttcgggt tgtctaagac aggtcctaca ttggatcaca cccatgtcag 2340

caccgtggtg aagggcagtt ttggatatct ggatccagaa tacttcagaa ggcagcaact 2400

cacagacaaa tctgatgtat actcatttgg tgtagtgctg tttgagcttt tgtgtgctcg 2460

gccagcattg aacccaactc ttcccaagga gcaagtgagc ttagctgagt gggcattcca 2520

ttgctacaag aaaggcactt ttgaccagat aattgatcca tatctgaaag ggaagattgc 2580

accagaatgc ttgaagaaat ttacagagac agcagtgaag tgtgtgtctg atgttggtgt 2640

tgacaggccc tccatgggag atgtgctttg gaaccttgaa ttcgctctgc aacttcagga 2700

gagtgcagaa gaatgtggca aaggttttgg aaagatggac attgaagaag gctttgatgt 2760

cacatgcaaa ggaaagaagg atttaaatga atccgcaggt tttgatgcaa gcatgactga 2820

ttcaagaagc agtggcatat ccatgagcat tggcggccgc agccttgcca gtgacgactc 2880

agacgggtta acacctagtg ctgttttctc tcaaatcatg aatccaaaag gacgctaaaa 2940

tctcacatct tgaaagcaaa tacatattgc cactggtcat ctatagctcg ttaaggcaat 3000

gtgctatcgc cctctttaac agcggaagtc acttttttcc tttctcgtac tgtcttattc 3060

ttttgctcac tatttatttt tatgattcat atgttatctt taaactcttt tgtaagttgt 3120

atctaccaat actccaagtg tgaaataatt tttctgttgt actattaact aatgaagagg 3180

ttgttcactg tgacattaat tctga 3205

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gattggaggg tttagtcaac ccaagaa 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacttcttg ggttgactaa accctcc 27

<210> 4

<211> 888

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum L.

<400> 4

Met Thr Glu Gly Ser Lys Phe Cys Phe Leu Leu Ala Ser Thr Phe Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ala Val Val Val Lys Val Thr Leu Ala Gln Asn Ser Ala Pro

20 25 30

Gly Asp Asp Ile Leu Leu Asn Cys Gly Gly Pro Asp Gly Leu Lys Asp

35 40 45

Ala Asp Gly Arg Lys Trp Gly Ser Asp Ile Gly Ser Thr Tyr Leu Lys

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Ser Thr Ser Asp Ala Ala Asp Gln Lys Pro Ser Val

65 70 75 80

Pro Gln Val Pro Phe Met Ser Ala Arg Val Phe Glu Ser Glu Phe Thr

85 90 95

Tyr Ser Phe Pro Val Ala Pro Gly Arg Lys Phe Val Arg Leu Tyr Phe

100 105 110

Tyr Pro Ser Ser Tyr Asn Lys Leu Asn Ala Thr Asn Ala Ile Phe Ser

115 120 125

Val Thr Val Gly Pro Tyr Ser Leu Leu Arg Asn Phe Ser Ala Ala Gln

130 135 140

Thr Ala Glu Ala Leu Asn Tyr Asp Tyr Leu Thr Lys Glu Phe Ser Ile

145 150 155 160

Asn Val Pro Ser Glu Thr Leu Asn Met Thr Phe Thr Pro Ser Pro Asn

165 170 175

Thr Ser Asn Ser Phe Ala Phe Val Asn Gly Ile Glu Ile Ile Ser His

180 185 190

Arg Asp Ile Tyr Asn Thr Asp Asp Gly Thr Thr Phe Ile Val Gly Gln

195 200 205

Thr Ala Ala Phe Ile Ile Asp Asn Ser Thr Ala Leu Glu Asn Val Tyr

210 215 220

Arg Leu Asn Val Gly Gly Asn Val Ile Ser Pro Ser Ala Asp Thr Gly

225 230 235 240

Met Phe Arg Ser Trp Ser Asp Asp Ser Gln Tyr Ile Phe Gly Ala Ala

245 250 255

Asn Gly Val Thr Asp Thr Ala Asp Asp Glu Asn Leu Thr Val Ser Tyr

260 265 270

Pro Glu Gly Thr Pro Ser Asp Ile Ala Pro Leu Asp Val Tyr Lys Thr

275 280 285

Ala Arg Ser Met Gly Pro Thr Ala Gln Ile Asn Leu Gln Tyr Asn Leu

290 295 300

Thr Trp Val Phe Ser Val Asp Ser Gly Phe Ser Tyr Leu Val Arg Leu

305 310 315 320

His Phe Cys Glu Ile Thr Lys Asn Ile Thr Lys Ile Asn Gln Arg Val

325 330 335

Phe Val Ile Tyr Met Asn Asn Gln Thr Ala Glu Pro Ala Ala Asp Val

340 345 350

Ile Ala Trp Thr Gly Ser Asn Gly Val Pro Phe His Lys Asp Tyr Val

355 360 365

Val Ser Val Asn Ser Gly Ala Pro Gln Gln Asp Leu Trp Leu Ala Leu

370 375 380

His Pro Asn Val Ala Ser Lys Ser Asn Trp Tyr Asp Ala Ile Leu Asn

385 390 395 400

Gly Val Glu Ile Phe Lys Val Asn Asp Thr Asn Gly Asn Leu Ala Gly

405 410 415

Pro Asn Pro Val Pro Val Pro Glu Pro Asp His Ile Asp Pro Leu Pro

420 425 430

Ser Lys Lys Gly Gln Ser Lys Ser Asn Lys Ser Ala Ile Gly Gly Gly

435 440 445

Val Gly Gly Gly Ile Ala Ala Ile Ile Leu Ile Gly Leu Val Val Cys

450 455 460

Leu Val Thr Arg Arg Arg Lys His Gly Lys Val Gln Ser Pro Ser Asp

465 470 475 480

Gly Pro Ser Gly Trp Leu Pro Leu Ser Leu Tyr Gly Asn Ser His Thr

485 490 495

Ser Gly Ser Ala Lys Thr Asn Thr Thr Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Leu

500 505 510

Pro Ser Asn Leu Cys Arg His Phe Ser Phe Ala Glu Ile Lys Ala Ala

515 520 525

Thr Asn Asn Phe Asp Glu Ser Leu Leu Leu Gly Val Gly Gly Phe Gly

530 535 540

Lys Val Tyr Lys Gly Glu Ile Asp Gly Gly Thr Lys Val Ala Ile Lys

545 550 555 560

Arg Gly Asn Pro Leu Ser Glu Gln Gly Val His Glu Phe Gln Thr Glu

565 570 575

Ile Glu Met Leu Ser Lys Leu Arg His Arg His Leu Val Ser Leu Ile

580 585 590

Gly Tyr Cys Glu Glu Asn Cys Glu Met Ile Leu Val Tyr Asp Tyr Met

595 600 605

Ala His Gly Thr Leu Arg Glu His Leu Tyr Lys Thr Gln Lys Pro Pro

610 615 620

Leu Pro Trp Lys Gln Arg Leu Asp Ile Gly Ile Gly Ala Ala Arg Gly

625 630 635 640

Leu His Tyr Leu His Thr Gly Ala Lys His Thr Ile Ile His Arg Asp

645 650 655

Val Lys Thr Thr Asn Ile Leu Leu Asp Glu Lys Trp Val Ala Lys Val

660 665 670

Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Thr Gly Pro Thr Leu Asp His Thr His

675 680 685

Val Ser Thr Val Val Lys Gly Ser Phe Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr

690 695 700

Phe Arg Arg Gln Gln Leu Thr Asp Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly

705 710 715 720

Val Val Leu Phe Glu Leu Leu Cys Ala Arg Pro Ala Leu Asn Pro Thr

725 730 735

Leu Pro Lys Glu Gln Val Ser Leu Ala Glu Trp Ala Phe His Cys Tyr

740 745 750

Lys Lys Gly Thr Phe Asp Gln Ile Ile Asp Pro Tyr Leu Lys Gly Lys

755 760 765

Ile Ala Pro Glu Cys Leu Lys Lys Phe Thr Glu Thr Ala Val Lys Cys

770 775 780

Val Ser Asp Val Gly Val Asp Arg Pro Ser Met Gly Asp Val Leu Trp

785 790 795 800

Asn Leu Glu Phe Ala Leu Gln Leu Gln Glu Ser Ala Glu Glu Cys Gly

805 810 815

Lys Gly Phe Gly Lys Met Asp Ile Glu Glu Gly Phe Asp Val Thr Cys

820 825 830

Lys Gly Lys Lys Asp Leu Asn Glu Ser Ala Gly Phe Asp Ala Ser Met

835 840 845

Thr Asp Ser Arg Ser Ser Gly Ile Ser Met Ser Ile Gly Gly Arg Ser

850 855 860

Leu Ala Ser Asp Asp Ser Asp Gly Leu Thr Pro Ser Ala Val Phe Ser

865 870 875 880

Gln Ile Met Asn Pro Lys Gly Arg

885

Claims

1.基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：基于NtFER基因的改造，下调NtFER基因的表达量，从而达到提高植物对青枯病的抗性；所述NtFER基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述NtFER基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草。

3.根据权利要求2所述的应用，所述基于NtFER基因的改造的具体方法：以烟草NtFER基因为靶标，通过基因工程手段进行改造。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因工程手段包括诱变、基因编辑、基因沉默的至少一种方式。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因编辑的具体方法为：以烟草NtFER基因为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中转化烟草，实现对NtFER基因的基因编辑。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因编辑包括碱基取代、碱基缺失、碱基增加。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述sgRNA序列包含SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示2种序列。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体为pORE-Cas9/gRNA载体。

9.基于NtFER基因的改造在制备对青枯病抗性高的植物新品种中的应用，其特征在于，所述NtFER基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述NtFER基因编码的氨基酸序列为SEQID NO:4所示。