CN113040159A - 激酶抑制剂Reversine在提高植物青枯病抗性的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及激酶抑制剂Reversine在提高植物青枯病抗性的应用。挖掘到与青枯病抗性相关的FER基因，进而通过在模式植物拟南芥中筛选FER的激酶抑制剂，先在拟南芥中验证抑激酶制剂对于青枯病的抗性调节作用，最后在青枯病危害严重的烟草中验证相关激酶抑制剂的功能，发现激酶抑制剂Reversine能够抑制FER的激酶活性，从而提高烟草对于青枯病的抗性。

Description

激酶抑制剂Reversine在提高植物青枯病抗性的应用
技术领域
本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及激酶抑制剂Reversine在提高植物青枯病抗性的应用。
背景技术
FERONIA(FER)为植物界保守的一类受体蛋白激酶，在植物中的发现其具有响应生物胁迫和非生物胁迫的功能，包括冷热胁迫，盐胁迫，病原菌胁迫等。尤其近年来发现其配体分子RALF23能够通过FER结合抑制植物免疫系统，而在植物根部，根结线虫通过分泌RALF类似物与FER竞争结合，从而达到抑制植物免疫系统的作用，因此FER在植物免疫调控中发挥重要的作用，且主要起到抑制免疫的功能。FER作为一种类受体蛋白激酶，其发挥功能主要通过激酶区域的自磷酸化，从而影响激酶的活性，进而招募下游蛋白，完成信号的传递和功能的输出，因此FER的激酶活性对于其调控的免疫反应有重要作用。
激酶抑制剂Reversine是一种ATP-竞争性的Aurora kinase抑制剂，作用于AuroraA，Aurora B和Aurora C。
青枯病是由假单胞杆菌科(Burkholderiaceae)青枯菌属(Ralstonia)青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的一种土传细菌病害，寄主范围广，可侵染烟草、番茄、马铃薯、辣椒等百种植物。烟草青枯病主要发生在热带和亚热带等地区，是烟草生产上一大毁灭性土传病害。烟草青枯病在化学、生物防治等方面仍然存在多方面的问题，且青枯菌系变异类型多，侵染来源较为复杂，因此寻找植物中广谱的青枯病调节基因，并通过化学手段调节其抗性能力对于防治青枯病是较为有效的策略。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是：克服植物青枯病在化学、生物防治等方面仍然存在多方面的问题，提供一种新的防治方法。
本发明的整体思路为：挖掘到与青枯病抗性相关的FER基因，进而通过在模式植物拟南芥中筛选FER的激酶抑制剂，先在拟南芥中验证抑激酶制剂对于青枯病的抗性调节作用，最后在青枯病危害严重的烟草中验证相关激酶抑制剂的功能，发现激酶抑制剂Reversine能够抑制FER的激酶活性，从而提高烟草对于青枯病的抗性。
本发明的技术方案如下：
通过前期筛选发现FER基因参与到青枯病的抗性过程，并起到负调控的作用。
通过1400余种激酶活性抑制剂的筛选发现激酶抑制剂Reversine能够高效抑制FER的激酶活性，同时检测激酶抑制剂Reversine对FER同源蛋白中自磷酸化能力较强的HERK1、ANJEA和THE1的激酶活性的影响，发现该抑制剂的特异性相对较高。
激酶抑制剂Reversine在提高植物青枯病抗性的应用。
优选地，所述激酶抑制剂Reversine的有效成分为2,6-二取代嘌呤。
优选地，所述2,6-二取代嘌呤的浓度为10nM-10μM。
优选地，所述2,6-二取代嘌呤的浓度为5μM。
优选地，所述植物为易感青枯病的植物。
优选地，所述易感青枯病的植物为烟草、番茄、辣椒。
一种植物青枯病抑制剂，包含激酶抑制剂Reversine。
本发明通过在模式植物拟南芥中筛选FER的激酶抑制剂，先在拟南芥中验证激酶抑制剂对于青枯病的抗性调节作用，最后在青枯病危害严重的烟草中验证相关激酶抑制剂的功能，发现激酶抑制剂Reversine能够抑制FER的激酶活性，从而提高烟草对于青枯病的抗性。
附图说明
图1.为拟南芥野生型WT和FER功能缺失突变体fer-4接种青枯病菌后发病情况。
图2为FER激酶活性化学抑制剂的筛选结果图。
图3为拟南芥不同处理下青枯病的病情发展结果图。
图4为对照组、Reversine处理组的抗青枯病表型图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
28℃下过夜摇培青枯病菌CQPS菌株(菌株来源于文献Genome sequencingofRalstonia solanacearumCQPS-1,a phylotype I strain collected from a highlandarea with continuous cropping of tobacco)，将菌液OD600调整至0.1后接种到生长4周的拟南芥野生型WT和FER功能缺失突变体fer-4的根部，每株植物浇灌30mL青枯病菌液，以接种等量dd H2O的植物作为空白对照，于28℃下长日照培养。每天浇一次水，观察记录植物青枯病的病情发展，图1为接种6-15d植物发病的情况，拟南芥野生型WT随着时间迁移出现青枯病病情，而FER功能缺失突变体fer-4生长正常，无青枯病病情。
实施例2
基于原核表达蛋白技术，构建FER基因的原核表达载体，用体外纯化的方式得到FER胞内结构域蛋白质，具体操作步骤如下：
PCR克隆：PCR反应扩增FER基因片段。PCR反应体系(50μL)；
表1 PCR反应体系组分
Figure BDA0002925433610000031
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃继续延伸10min，完成后在4℃保存。PCR产物回收：将FER的PCR产物进行胶回收，4℃保存。FER进行PCR扩增的引物为His-FER-F/His-FER-R，引物序列如下：
His-FER-F
5'-CCACAGCCAGGATCCGGGTGCTTACCGCAGACGTA-3'(下划线为BamH I酶切位点)
His-FER-R
5'-TTTACCAGACTCGAGCTAACGTCCCTTTGGATTCATGAT-3'(下划线为Xho I酶切位点)
原核表达载体构建：利用BamH I和Xho I对pRSF-Duet载体进行双酶切，并回收载体片段，将回收的PCR产物与载体片段预混，利用同源重组的方法进行连接，转化感受态Top10，涂LB平板(含有50mg/L Kan)，37℃过夜培养后，即可获得单菌落，菌落PCR鉴定获得阳性转化子后，37℃摇菌过夜，提取质粒，并测序。将所得阳性质粒pRSF-Duet-FER和前期已构建好的质粒pGEX-4T-1-ABI2共同转入BL21感受态细胞。将携有原核表达重组质粒的BL21菌种进行IPTG诱导，16℃，110rpm，16h，0.5mM IPTG；诱导后菌体经超声破碎，和Ni柱吸附纯化，经超滤后蛋白储存于-80℃。
实施例3
FER激酶活性化学抑制剂的筛选：原核表达并纯化超滤得到FER的胞内结构域蛋白质后，使用Kinase-LumiTM化学发光法激酶活性检测试剂盒(碧云天，中国)并参照说明检测FER自磷酸化活性。室温下在含0.5μM FER的激酶体系(含50mM HEPES、10mM MgCl2、10mMMnCl2、1mM EGTA，pH＝7.48)中加入终浓度5μM的抑制剂(来自购买于上海MedChemExpress的激酶抑制剂库)处理30min，以抑制剂溶剂DMSO(0.05％)作为阴性对照，接着加入终浓度0.25μM的ATP反应10min，最后加入与反应体系等体积的含ATP依赖的荧光素酶的检测试剂反应10min并通过多功能酶标仪进行化学发光测定。以反应体系中消耗的ATP量(μM)作为指标指示激酶活性抑制效果。以65％抑制率作为最低标准，我们从1494个动物激酶小分子抑制剂中筛选得到33个小分子化合物可以高效抑制FER的自磷酸化活性，平均抑制效果达到80％(图2A)。使用FER同源蛋白中自磷酸化能力较强的HERK1、ANJEA和THE1的胞内结构域检测33个抑制剂的特异性(图2B-D)，发现抑制剂8号激酶抑制剂Reversine的特异性相对较高，对FER的抑制率分别为83.6％，而对3个同源蛋白的抑制效果均低于55％。激酶抑制剂Reversine是一种小型合成嘌呤类似物(2,6-二取代嘌呤)，是动物中Aurora A/B/C的有效抑制剂；进一步使用非同源蛋白BRI1检测Reversine的特异性，发现Reversine对BRI1自磷酸化活性的抑制率仅为47.3％。总结，我们筛选出小分子化合物Reversine可以相对特异地抑制FER的自磷酸化活性。而FER的自磷酸化活性对于其抗病性起到负调节作用，因此筛选到FER的激酶抑制剂Reversine将进一步验证其在抗青枯病中的功能。
实施例4
将一周大小的拟南芥置于含5μM激酶抑制剂Reversine的1/2MS液体培养基中培养1d后分为实验组和对照组；实验组添加抑制剂溶剂DMSO，对照组添加和实验组中抑制剂溶剂DMSO等量的ddH2O的处理，之后实验组和对照组加入青枯病菌并使其在培养液中的OD600＝0.01，于28℃下长日照培养处理后的拟南芥，每天观察记录其青枯病的病情发展，结果如图3所示，实验组发病，对照组不发病。此外10nM、10μM激酶抑制剂也能达到与上述5μM激酶抑制剂同样的效果。
实施例5
激酶抑制剂Reversine处理的表型鉴定：将每个小盆中加入110g土，每个小盆中分别放入3粒野生型云烟87种子，分别做5个重复，然后覆盖50mL土，种子萌发后将长势不齐的苗子拔出，留下一株烟草苗。待植物都长大后，用小刀往近根土壤中切一刀，实验组采用浇灌25mL含有5μM激酶抑制剂Reversine溶液，1天后，再加入5mL含有OD600＝0.1的青枯病菌CQPS；对照组采用浇灌25mLddH2O，1天后，再加入5mL含有OD600＝0.1的青枯病菌CQPS。10天后观察烟草的长势情况，比对对照组和实验组的青枯病菌侵染表型。图4说明激酶抑制剂Reversine处理有助于烟草抵抗青枯病菌。

Claims (7)

1.激酶抑制剂Reversine在提高植物青枯病抗性的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激酶抑制剂Reversine的有效成分为2,6-二取代嘌呤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述2,6-二取代嘌呤的浓度为10nM-10μM。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述2,6-二取代嘌呤的浓度为5μM。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述植物为易感青枯病的植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述易感青枯病的植物为烟草、番茄、辣椒。
7.一种植物青枯病抑制剂，其特征在于，所述植物青枯病抑制剂含有激酶抑制剂Reversine。
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