CN108004250B

CN108004250B - 小麦条锈菌pstg_13661基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法

Info

Publication number: CN108004250B
Application number: CN201810108044.4A
Authority: CN
Inventors: 吴佳洁; 黄德华; 张会飞; 刘强; 倪飞; 付道林
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: CN108004250A

Abstract

本发明提供了小麦条锈菌PSTG_13661基因在小麦条锈病防治中的应用，所述PSTG_13661基因的序列如Seq ID No.5所示；所述的PSTG_13661基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，将PSTG_13661基因作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_13661基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。

Description

小麦条锈菌PSTG_13661基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法

技术领域

本发明属于基因工程和作物分子育种技术领域，具体涉及小麦条锈菌PSTG_13661基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法。

背景技术

小麦是我国第二大粮食作物，年均播种面积约为3.6亿亩。小麦产量的稳定与提高关系国计民生。然而多年来，真菌病害对小麦生产构成严重威胁，如锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病等病害的发生，严重影响小麦的产量和品质。其中，小麦条锈病俗称"黄疸"，是由专性寄生的条锈菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici)引起。在我国，小麦条锈发病猖獗，常年受害面积达6,000～8,000万亩(农业部文件：农农发2006-9)；发病严重年份造成大幅减产(20～30％)，威胁粮食安全。条锈菌存在有性生殖，毒性变异快，近年来新的优势小种持续出现，导致条锈病控制难度加大。小麦主要产区黄淮海麦区的条锈病发生面积有逐渐增加的趋势，2017年5月统计河南、山东、安徽等7省市累计发生面积超过4,000万亩(中国农业科技推广，2017)。因此，有效防治条锈病对于我国粮食安全具有重要意义。

培育和种植抗病品种，是防治小麦条锈病经济、有效的重要措施。当前，我国多省的小麦品种审定已把是否具有条锈病抗性列为关键指标。提高抗性水平、培育持久抗性也已成为小麦新品种培育的重要目标。抗病品种的培育主要是通过抗条锈病基因的挖掘与利用，然而由于条锈菌生理小种毒性的快速变异，抗病基因大面积利用后可能会在短期内丧失抗病性。例如小麦育种上曾广泛使用的碧蚂一号、“洛类”、“繁6”衍生系等抗源，均已对当前流行小种失去抗性。对我国当前501份主栽和后备品种的检测表明，不足30％的品种对当前流行小种表现抗病，而且其抗源主要集中在Yr26/Yr24等少数基因(韩德俊等，西北-华北-长江中下游条锈病流行区系当前小麦品种(系)抗条锈病评价，中国农业科学，2010(43))。因此，拓宽小麦抗条锈病的抗源，开发新的条锈病防治策略，对于降低小麦条锈病大面积流行的风险具有重要意义。

小麦条锈菌由于其活体营养型及专性寄生特性，遗传转化困难；而且小麦本身同样难以开展遗传转化，因此小麦-条锈菌互作的遗传学研究困难很大，进展较慢。目前在小麦条锈菌中鉴定的侵染或致病关键基因数量较少，而且目前尚未有基因有效应用于小麦抗病育种。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小麦条锈菌基因在条锈病防治中的应用以及一种利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：小麦条锈菌PSTG_13661基因在小麦条锈病防治中的应用，所述小麦条锈菌PSTG_13661基因的序列如SeqIDNo.5所示。

优选的，所述PSTG_13661基因作为转录抑制的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_13661基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。

优选的，所述应用为将携带所述PSTG_13661基因的沉默表达载体导入麦类作物中获得抗条锈菌的麦类作物。

优选的，所述应用为通过喷施所述PSTG_13661基因的转录抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

优选的，所述转录抑制剂为能够抑制所述PSTG_13661基因转录的dsRNA溶液。

优选的，所述应用为通过喷施所述PSTG_13661基因的编码蛋白活性抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

本发明还提供了一种抗条锈菌小麦的培育方法，包括以下步骤：1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得PSTG_13661基因片段；2)利用步骤1)所述的PSTG_13661基因片段构建小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体；所述PSTG_13661基因沉默表达载体的构建采用GATEWAY克隆技术；3)采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。

优选的，步骤1)中所述PCR扩增用引物为CQM13661-F2和CQM13661-R2引物；所述CQM13661-F2的序列如Seq ID No.7所示；所述CQM13661-R2引物的序列如Seq ID No.8所示。

优选的，步骤2)中所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体从T-DNALeftBoarder到RightBoarder区段包括潮霉素抗性基因Hyg、除草剂抗性基因Bar、PSTG_13661基因片段的正向序列和PSTG_13661基因片段的反向序列。

优选的，所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体从T-DNALeft Boarder到RightBoarder区段的序列如序列表SeqID No.9所示。

本发明的有益效果：本发明首次发现所述的PSTG_13661基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，丰富了小麦条锈菌中侵染或致病的关键基因；将所述PSTG_13661基因应用于小麦条锈病防治中，可具体的将PSTG_13661基因作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_13661基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。

附图说明

图1为实施例1中沉默表达PSTG_13661的阳性转基因小麦除草剂筛选结果图；

图2为实施例1中抗条锈菌小麦PCR筛选检测结果；

图3为实施例2中抗条锈菌小麦温室接种条锈菌后叶片发病情况图；

图4为实施例2中抗条锈菌小麦人工气候箱接种条锈菌后叶片发病图；

图5为实施例3中抗条锈菌小麦接种条锈菌后PSTG_13661基因的荧光定量表达分析结果图。

具体实施方式

本发明提供了小麦条锈菌PSTG_13661基因及其在在小麦条锈病防治中的应用。

在本发明中，基因PSTG_13661在小麦条锈菌参考基因组(生理小种PST-78)中的序列如Seq ID No.1所示，其编码氨基酸序列如Seq ID No.2所示，GenBank登录号KNE92947.1。本发明中所述PSTG_13661基因由小麦条锈菌生理小种CRY29中分离获得，具体的序列如Seq ID No.5所示，基因序列长度为825bp。本发明中所述PSTG_13661基因编码氨基酸序列具有CE4_MrCDA_Like结构域(cd10952)，具体序列如Seq ID No.6所示。

在本发明中，所述PSTG_13661基因优选的作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_13661基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。在本发明具体实施过程中，优选的通过以下三种方法来沉默PSTG_13661基因，以实现所述PSTG_13661基因在小麦条锈病防治中的应用：(一)将携带所述PSTG_13661基因的沉默表达载体导入麦类作物中，获得抗条锈菌的麦类作物；(二)通过喷施所述PSTG_13661基因的转录抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖；所述转录抑制剂优选的为能够抑制所述PSTG_13661基因转录的dsRNA溶液；(三)通过喷施所述PSTG_13661基因编码蛋白的活性抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

本发明还提供了一种抗条锈菌小麦的培育方法，包括以下步骤：1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得PSTG_13661基因片段；2)利用步骤1)所述的PSTG_13661基因片段构建小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体；所述PSTG_13661基因沉默表达载体的构建采用GATEWAY克隆技术；3)采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈病小麦。

本发明在分离PSTG_13661基因片段前，优选的对PSTG_13661基因的注释结构进行了PCR扩增及测序验证。在本发明中，优选的以小麦条锈菌的全基因组序列为参考，以假定功能蛋白基因PSTG_13661(GenBank:KNE92947.1)的序列为模板设计PCR引物；更优选的以小麦条锈菌生理小种PST-78全基因组序列为参考(GenBank登录号AJIL00000000.1或BROAD下载链接ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/annotation/fungi/puccinia/genomes/pucciniastriifor mispst-78/)。本发明中，所述PCR扩增引物设计的方法采用本领域常规方法即可，具体的可采用引物设计软件来实现。在本发明中所述PCR扩增引物优选的为CQM13661-F1和CQM13661-R1；所述CQM13661-F1的序列如Seq ID No.3所示：5’-CACAAGAAGGAATGGGTTTTACTC-3’；所述CQM13661-R1引物的序列如Seq ID No.4所示:5’-CTCCAGGCCTAGCGAAGTCC-3’。CQM13661-F1/R1扩增基因的全长编码区，在参考基因组(生理小种PST-78)中的扩增片段长度为861bp。

本发明中，以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得PSTG_13661基因片段。在本发明中，优选的采用感染条锈菌生理小种CRY29后发病的小麦叶片制备cDNA；所述制备cDNA的方法优选的采用常规TRIZOL法制备纯化RNA，并反转录获得cDNA。在本发明中，所述制备纯化RNA并反转录获得cDNA分别采用RNA纯化试剂盒和反转录试剂盒。在本发明具体实施过程中，所述制备纯化RNA优选的采用天根生化科技(北京)有限公司，货号DP405的试剂盒实现；所述反转录获得cDNA优选的采用北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒，货号AT311-03。

在本发明中所述PCR扩增使用的酶优选的为高保真酶，更优选的为Phusion高保真酶(Thermo Scientific公司，货号F-530S)；所述述PCR扩增的体系和程序采用本领域常规的PCR扩增体系和程序即可，具体的在本发明实施过程中，所述PCR体系为：5X Phusion HFBuffer:10μl，Phusion DNA Polymerase:0.5μl，CQM13661-F1:1.5μl，CQM13661-R1:1.5μl，10mM dNTPs:1μl，Template DNA:1μl，ddH₂O:34.5μl；所述PCR程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 30s 35循环；72℃ 10min。

在本发明中所述CQM13661-F1/R1引物的PCR扩增产物委托测序公司完成测序。本发明中所述扩增产物测序获得的序列如Seq ID No.5所示；与参考基因组(生理小种PST-78)中注释的基因结构PSTG_13661相比，CRY29扩增得到的同源基因在3’端最后一个外显子上游存在75bp的插入，在倒二外显子上存在一个SNP(Single nucleotidepolymorphism)。CRY29扩增得到的同源基因序列如序列表SEQ ID No.5所示，命名为PSTG_13661m；预测编码蛋白序列如序列表SEQNo.6所示。

本发明在验证PSTG_13661基因在生理小种CRY29中的基因结构及基因序列后，优选的以PSTG_13661m序列为模板设计PCR引物，进行PCR扩增获得PSTG_13661基因片段。扩增模板为感染条锈菌CRY29后发病的小麦叶片cDNA。在本发明中所述PCR扩增引物优选的为CQM13661-F2和CQM13661-R2；所述CQM13661-F2的序列如序列表SEQ ID No.7所示：5`-caagcggccgcACACAAATGATATCCGCACCTT-3`；所述CQM13661-R2的序列如SEQ ID No.8所示：5`-tcaggcgcgccAATGGCCGTTGTTGAATCTTT-3`。扩增区段长度243bp。

本发明在设计获得PCR扩增引物后，优选的对所述PCR扩增引物的扩增区段进行验证。所述验证具体的为用扩增区段的序列与小麦条锈菌PST-78全基因组数据和NCBI数据库中的小麦条锈菌序列进行比对，查看所述扩增区段的序列是否能够特异性靶标PSTG_13661基因。本发明中所述扩增区段的序列长度为243bp。在本发明中上述PCR扩增区段的序列，有3段序列与PSTG_13662的转录本序列相似性100％，分别为Seq ID No.14、Seq ID No.15和Seq ID No.16；具体序列如下Seq ID No.14：GATCTTTTGCACTCACATTTGACGATGG(28bp)、SeqID No.15：AGCAAATGCCAAAGGAAGCTTCTT(24bp)、Seq ID No.16：CAAAACTGGGGATGCATTTA(20bp)；除此之外，未发现有其它基因与目标区段存在大于20bp的100％一致序列,表明利用CQM13661-F2/R2引物扩增片段构建RNAi沉默表达载体，可以特异靶标PSTG_13661基因。

本发明在获得PSTG_13661基因片段后，利用GATEWAY克隆技术构建小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体。在本发明中，所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体的构建方法参见参考文献(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)，具体的包括以下步骤：(A)将所述PSTG_13661基因片段与入门载体连接后转入大肠杆菌感受态细胞获得阳性克隆质粒；(B)将所述阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架PC336进行LR反应，同时将PSTG_13661基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336获得RNAi沉默表达载体。

在本发明中，优选的将所述PSTG_13661基因片段与入门载体连接；所述入门载体优选的为实验室改造的PC414C，与常规入门载体pENTR-D-TOPO相比，PC414C插入了多克隆位点，可通过酶切、连接的方法实现定向克隆。具体连接PC414C与目标片段的方法参见参考文献(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)的材料与方法部分内容。本发明为利用GATEWAY克隆技术，优选的在CQM_13661-F2/R2引物序列上增加保护碱基和酶切位点获得改良后引物。优选的所述保护碱基连接在引物序列5’末端；所述保护碱基的数目优选的为2～4个；在本发明具体实施过程中，所述CQM13661-F2上的保护碱基优选的为CAA和CQM13661-R2上的保护碱基优选的为TCA。在本发明中，所述酶切位点优选的为NotI酶切位点和AscI酶切位点，所述CQM13661-F2引物序列连接NotI酶切位点，所述CQM13661-R2引物序列连接AscI酶切位点。

在本发明具体实施过程中，所述PSTG_13661基因片段与入门载体连接前，优选的将上述改良后引物扩增获得的包括PSTG_13661基因片段PCR扩增产物和入门载体PC414C进行NotI、AscI双酶切获得酶切产物，然后利用T4-DNA连接酶将纯化后的酶切产物(即PSTG_13661基因片段和入门载体)进行连接获得连接产物。

本发明在获得连接产物后，优选的将所述连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选纯化后获得阳性克隆质粒DNA。在本发明中，筛选转化后的大肠杆菌感受态细胞获得所述阳性克隆质粒。本发明中所述筛选的方法优选的为菌落PCR；所述菌落PCR的引物优选的为CQM13661-F2/R2；所述纯化阳性克隆质粒DNA优选的采用质粒DNA试剂盒完成。

本发明在获得阳性克隆的质粒DNA后，利用阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架PC336(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)进行LR反应，将PSTG_13661基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336获得RNAi沉默表达载体。本发明中，所述载体构建采用本领域常规的载体构建方法和程序，无其他特殊要求，能够获得RNAi沉默表达载体即可。

本发明中获得的小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体编号为PC922，所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体上从T-DNALB(Left Boarder)到RB(RightBoarder)区段的序列优选的如Seq IDNo.9所示，所述T-DNALB(LeftBoarder)到RB(RightBoarder)区段的序列为包含顺次连接的潮霉素抗性基因Hyg、除草剂抗性基因Bar及PSTG_13661基因片段的正向序列和PSTG_13661基因片段的反向序列的表达盒。

本发明在获得小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体后，采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。本发明中受体材料优选的为高感小麦条锈病的品系CB037。本发明中所述转化的具体技术流程如王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[D].山东农业大学,2012.)。在此不再赘述。

本发明在所述转化完成后，优选的将转化后的材料在诱愈培养基上进行愈伤组织诱导，愈伤组织的分化培养获得再生幼苗，将所述再生幼苗生根培养后获得可移栽到土壤中的小麦苗。在本发明中所述转化后培养获得小麦苗的具体步骤和参数参考王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[D].山东农业大学,2012.)。

下面结合实施例对本发明提供的小麦条锈菌PSTG_13661基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(一)PCR扩增获得PSTG_13661基因片段

以小麦条锈菌生理小种PST-78全基因组序列为参考(GenBank登录号AJIL00000000.1或BROAD下载链接ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/annotation/fungi/puccinia/genomes/puccinia_striifo rmis_pst-78/)，以假定功能蛋白(hypothetical protein)基因PSTG_13661(GenBank:KNE92947.1)的序列为模板设计PCR引物。正向引物CQM13661-F1序列如Seq ID No.3所示：5`-CACAAGAAGGAATGGGTTTTACTC-3`；反向引物CQM13661-R1序列如Seq ID No.4所示：5`-CTCCAGGCCTAGCGAAGTCC-3`，CQM13661-F1/R1扩增扩增基因的全长编码区，在参考基因组(生理小种PST-78)中的扩增片段长度为861bp。

与参考基因组PST-78中注释的基因结构PSTG_13661相比，CRY29扩增得到的同源基因在3’端最后一个外显子上游存在75bp的插入，在倒二外显子上存在一个SNP(Singlenucleotide polymorphism)。CRY29扩增得到的同源基因序列如序列表Seq ID No.5所示，命名为PSTG_13661m；预测编码蛋白序列如序列表SeqIDNo.6所示。

为分离基因片段构建RNAi沉默表达载体，以PSTG_13661m序列为模板设计正向引物CQM-13661-F2，序列如序列表SeqID No.7所示：

5`-caagcggccgcACACAAATGATATCCGCACCTT-3`；

反向引物序列CQM-13661-R2如SeqID No.8所示：

5`-tcaggcgcgccAATGGCCGTTGTTGAATCTTT-3`；

扩增区段长度243bp。

利用扩增区段的序列比对小麦条锈菌PST-78全基因组数据(https:// genome.jgi.doe.gov/Pucst_PST78_1/Pucst_PST78_1.home.html)及NCBI数据库小麦条锈菌序列(Pucciniastriiformis f.sp.tritici，taxid:168172)，有3段序列与PSTG_13662的转录本序列相似性100％，分别为Seq ID No.14、Seq ID No.15和Seq ID No.16；具体序列如下Seq ID No.14：GATCTTTTGCACTCACATTTGACGATGG(28bp)、Seq ID No.15：AGCAAATGCCAAAGGAAGCTTCTT(24bp)、Seq ID No.16：CAAAACTGGGGATGCATTTA(20bp)；除此之外，未发现有其它基因与目标区段存在大于20bp的100％一致序列,表明利用CQM13661-F2/R2引物扩增片段构建RNAi沉默表达载体，可以特异靶标PSTG_13661基因。

(二)小麦条锈菌基因PSTG_13661沉默表达载体的构建

为利用GATEWAY克隆技术构建基因沉默表达载体，CQM_13661-F2/R2引物两端分别增加3个保护碱基(CAA、TCA)及NotI酶切位点(GCGGCCGC)或AscI酶切位点(GGCGCGCC)，以连入改造后的入门载体PC414C(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)。PCR扩增产物及载体PC414C首先进行NotI、AscI双酶切，酶切产物纯化后利用T4-DNA连接酶进行连接。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号CD201)。利用引物CQM_13661-F2/R2进行菌落PCR来筛选携带目的基因片段的阳性克隆，并纯化质粒DNA(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP103)。

利用阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架PC336(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)进行LR反应，同时将PSTG_13661基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336以构建RNAi沉默表达载体。

LR反应体系：目的载体(150ng/μl)1μl；入门载体PC414C(50-150ng)1μl，水7μl；LRClonase^TM II Enzyme Mix(Invitrogen公司，货号11791)2μl；25℃反应1h；加入1μlProteinase K，37℃灭活10min。反应液转化Trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号CD201)，挑取菌落纯化质粒DNA，利用CQM13661-F2/R2引物进行菌落PCR筛选(PCR体系：2x Buffer 10ul,CQM13661-F20.5ul，CQM13661-R20.5ul,ddH₂O 9ul,单菌落；PCR程序：94℃ 5min；94℃ 30s，58°30s，72°30s 35循环；72°10min)。

小麦条锈菌基因PSTG_13661沉默表达载体上从T-DNA LB(Left Boarder)到RB(RightBoarder)区段的序列如序列表Seq ID No.9。其中包含潮霉素抗性基因(Hyg)、除草剂抗性基因(Bar)和PSTG_13661基因片段的正向序列和PSTG_13661基因片段的反向序列的表达盒。

(三)普通小麦的遗传转化及后代筛选

小麦遗传转化采用基因枪介导转化法，受体材料选用高感小麦条锈病的品系CB037。技术流程如王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[D].山东农业大学,2012.)。小麦授粉后15天左右，挑选幼胚直径为1.5mm大小的幼胚剪取穗子剥取种子，表面消毒灭菌后剥取幼胚放置于高渗培养基上用基因枪轰击，再在诱愈培养基上23℃暗培养四周，每两周继代一次。四周后从诱愈培养基转到分化培养基，从分化培养基上愈伤开始放在光照培养(23℃，16hlight，8hdark)。两周后从分化培养基上再转到分化培养基上，直到再生出幼苗。把分化出的苗取出放在生根培养基上，大约3-4周待根长壮就可以移栽到土里。

通过叶片涂抹除草剂初步筛选阳性转基因后代。除草剂为AgrEvo公司产品Finale，货号F30617006，使用浓度为0.3％。3-5天后根据叶片涂抹部位的敏感程度筛选阳性转基因后代。

如图1所示，CB037为转基因受体；17、17-1、19-1为阳性转基因单株；非转基因材料的叶片涂抹部位明显黄化或干枯坏死，而阳性转基因材料的叶片涂抹部位稍微黄化、无明显干枯坏死。

同时，取材转基因小麦的叶片制备DNA及cDNA，利用引物CQM13661-F2/R2进行PCR扩增对转基因材料进行筛选确认。如图2A所示，其中A、B为以gDNA为模板的PCR结果；A图PCR引物为CQM13661-F2/R2；H₂O为阴性对照，P为质粒DNA阳性对照；B图PCR引物为LB306F/CQM13661-R2；H₂O为阴性对照，P为质粒DNA阳性对照。如图2所示，A、B为以gDNA为模板的PCR结果；A图PCR引物为CQM13661-F2/R2；H₂O为阴性对照，P为质粒DNA阳性对照；B图PCR引物为LB306F/CQM13661-R2，其中引物LB306F(Seq ID No.17)为匹配载体框架中GUS linker片段的引物序列，位置位于CQM13661正向、反向片段中间，LB306F的引物序列为5’-GACCTCGCAAGGCATATTG-3'；H₂O为阴性对照，P为质粒DNA阳性对照。多数样品可产生与阳性对照(载体DNA)相同的扩增条带，表明来自阳性转基因材料。

实施例2抗条锈菌小麦条锈病抗性鉴定

小麦条锈菌新鲜孢子的繁殖：温室内种植感病品种辉县红，一叶一心期用注射器注射孢子水溶液接菌，然后用喷壶喷水并搭盖塑料薄膜进行保湿。为保证充分发病可重复接菌2-3次，每次间隔1周。孢子水溶液的准备：取干燥、冻存(-80℃)的孢子，用适量自来水悬浮至淡橙色，室温下置于摇床震荡混匀30min(180rpm)，然后注射接菌。接菌后约20天可见零星发病，大约30天后可见大量叶片发病，可收集大量新鲜孢子用于转基因材料的接种鉴定。

利用T_1:2世代转基因材料(收获实施例1中第一代转基因材料的种子)种子在温室大棚内种植并接种小麦条锈菌，鉴定其条锈病抗性。种植前一周温室浇水浇透，晾晒一周左右。挑选15粒健康饱满的转基因种子均匀点播，行距25cm，行长1m。每隔十行种植2行转基因受体品种CB037。待生长至一叶一心期左右，取新鲜孢子进行接菌，接种后浇水并搭盖塑料布保持高湿环境。为了保证接种成功，初次接种后每隔一周进行重复接种，重复三次，每株至少接种三个分蘖。野生型CB037充分发病后，对转基因材料进行抗病性调查并记录，每隔一周重复鉴定一次，重复三次。

利用温室鉴定的抗病材料，收获T_2:3世代种子后，在人工气候箱内进行重复鉴定。取干净的9cm培养皿，内置3层圆形滤纸，加入4mL去离子水，使滤纸浸湿。放置健康饱满的种子15～20粒/皿，盖上培养皿盖并用封口膜封口；用铝箔纸包裹避光于4℃冰箱内低温处理2～3天，打破种子休眠。于23℃光照培养箱中培养3～5d后移栽至土壤中，选取边长15cm的方形小花盆，每盆种植4棵。待植株长至一叶一心期，利用温室繁殖的条锈菌混合孢子进行接种。将孢子与滑石粉按大约1:10比例充分混匀后，用小毛刷蘸取孢子进行叶片接菌。接种后首先黑暗处理24h，温度11℃，湿度100％；然后进行正常光照培养，光照16h/温度22℃、黑暗8h/温度15℃，定期加湿，保持叶尖有水滴，至对照材料叶片充分发病(10-12天)。

转基因小麦温室接种条锈菌后叶片发病情况灰度图如图3所示，其中A为野生型CB037，B为PC922转基因材料。温室种植T_1:2材料重复接菌三次之后，野生型CB037发病充分，叶片表面有大量孢子堆；而转基因材料叶片表面未见孢子堆产生，条锈病抗性效果明显。

转基因小麦人工气候箱接种条锈菌后叶片发病灰度图如图4所示：A为野生型CB037；B为PC922转基因材料。T_2:3材料在培养箱内接菌12天后，野生型CB037充分发病，叶片表面布满孢子；而PC922转基因材料只有轻度褪绿，叶片未见有孢子产生，表明PSTG_13661基因的沉默表达可显著提高小麦对条锈菌的抗性。

实施例3抗条锈菌小麦中PSTG_13661基因的表达鉴定

小麦苗期叶片接菌12天后，野生型CB037叶片表面布满大量孢子堆。在小麦接种条锈菌后不同时期取CB037及转基因材料叶片约100mg，使用Trizol法提取RNA，制备cDNA用于实时荧光定量PCR。引物序列为CQM13661-F3和CQM13661-R3如序列表Seq ID No.10、Seq IDNo.11所示。以小麦条锈菌α微管蛋白基因为内参(黄雪玲等，农业生物技术学报，2012，20(2)：181-187)，引物TUBA-F/R序列如序列表Seq ID No.12、Seq ID No.13所示。

PCR体系为：5μl 2×SYBR GreenMaster，正向与反向引物(10μM)各1μl，1μl cDNA，2μl ddH2O，总体系为10μl。PCR反应采用两步法：95℃10min，40个循环的95℃15s，60℃1min。

利用2^－△△CT算法分析各个基因的表达，利用SigmaPlot12.5软件作图。结果如图5所示，PC922为阳性转基因小麦，CB037为小麦转基因受体。小麦叶片接种条锈后不同时期取材检测基因表达水平。定量PCR引物为CQM13661-F3/R3。

由上述实施例可知，本发明提供的PSTG_13661基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，将所述PSTG_13661基因应用于小麦条锈病防治中，通过沉默所述PSTG_13661基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 小麦条锈菌PSTG_13661基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> Puccinia striiformis PST-78

<400> 1

atgggtttta ctcgcttact aactctcgtt gtcaccgtcg cctctctttt gagattcgat 60

caagtcactg gtgcccacac aaatgatatc cgcaccttac gcgctagaca agacacggct 120

gtcccagtat acgacacctg taccgtcccc ggatcttttg cactcacatt tgacgatggg 180

ccgtacggat tcagcacaag attggactct accttgaacg cagcaaatgc caaaggaagc 240

ttcttcatca acggtcaaaa ctggggatgc atttacgact atgccgacgt cttactcgaa 300

agattcaaca acggccattt tatcgcgagt catacctggt cacatgttca catgaaccaa 360

ggtacttatg agcagctttc tcaccaattg gagctggtag agcaagctat gatcagaatt 420

ttaggagtca aaccactcta catgagaccc ccttacggcg agtacaatga cgttgtgtta 480

caagtcctac gagaccgagg atacaaagga ttgatcatgt ggaaccaaga ttccggtgat 540

acttttacac ccactccaag ctcagctcaa atcatcgaca gttatcgatc tttccctgaa 600

aaaaccatct cattgaacca tgagatcaag gatttcactg tcgaccaagt catacctgct 660

gtaatcccaa tccttcaaca aaaaggattt agcttacaaa ctgactcgtg gacttgcgag 720

gctactccgt tacccggaaa cttcgaatag 750

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> Puccinia striiformis PST-78

<400> 2

Met Gly Phe Thr Arg Leu Leu Thr Leu Val Val Thr Val Ala Ser Leu

1 5 10 15

Leu Arg Phe Asp Gln Val Thr Gly Ala His Thr Asn Asp Ile Arg Thr

20 25 30

Leu Arg Ala Arg Gln Asp Thr Ala Val Pro Val Tyr Asp Thr Cys Thr

35 40 45

Val Pro Gly Ser Phe Ala Leu Thr Phe Asp Asp Gly Pro Tyr Gly Phe

50 55 60

Ser Thr Arg Leu Asp Ser Thr Leu Asn Ala Ala Asn Ala Lys Gly Ser

65 70 75 80

Phe Phe Ile Asn Gly Gln Asn Trp Gly Cys Ile Tyr Asp Tyr Ala Asp

85 90 95

Val Leu Leu Glu Arg Phe Asn Asn Gly His Phe Ile Ala Ser His Thr

100 105 110

Trp Ser His Val His Met Asn Gln Gly Thr Tyr Glu Gln Leu Ser His

115 120 125

Gln Leu Glu Leu Val Glu Gln Ala Met Ile Arg Ile Leu Gly Val Lys

130 135 140

Pro Leu Tyr Met Arg Pro Pro Tyr Gly Glu Tyr Asn Asp Val Val Leu

145 150 155 160

Gln Val Leu Arg Asp Arg Gly Tyr Lys Gly Leu Ile Met Trp Asn Gln

165 170 175

Asp Ser Gly Asp Thr Phe Thr Pro Thr Pro Ser Ser Ala Gln Ile Ile

180 185 190

Asp Ser Tyr Arg Ser Phe Pro Glu Lys Thr Ile Ser Leu Asn His Glu

195 200 205

Ile Lys Asp Phe Thr Val Asp Gln Val Ile Pro Ala Val Ile Pro Ile

210 215 220

Leu Gln Gln Lys Gly Phe Ser Leu Gln Thr Asp Ser Trp Thr Cys Glu

225 230 235 240

Ala Thr Pro Leu Pro Gly Asn Phe Glu

245

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacaagaagg aatgggtttt actc 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctccaggcct agcgaagtcc 20

<210> 5

<211> 861

<212> DNA

<213> Puccinia striiformis CRY29

<400> 5

cacaagaagg aatgggtttt actcgcttac taactctcgt tgtcaccgtc gcctctcttt 60

tgagattcga tcaagtcact ggtgcccaca caaatgatat ccgcacctta cgcgctagac 120

aagacacggc tgtcccagta tacgacacct gtaccgtccc cggatctttt gcactcacat 180

ttgacgatgg gccgtacgga ttcagcacaa gattggactc taccttgaac gcagcaaatg 240

ccaaaggaag cttcttcatc aacggtcaaa actggggatg catttacgac tatgccgacg 300

tcttactcga aagattcaac aacggccatt ttatcgcgag tcatacctgg tcacatgttc 360

acatgaacca aggtacttat gagcagcttt ctcaccaatt ggagctggta gagcaagcta 420

tgatcagaat tttaggagtc aaaccactct acatgagacc cccttacggc gagtacaatg 480

acgttgtgtt acaagtccta cgagaccgag gatacaaagg attgatcatg tggaaccaag 540

attccggtga tacttttaca cccactccaa gctcagctca aatcatcgac agttatcgat 600

ctttccctga aaaaaccatc tcattgaacc atgagatcaa ggatttcact gtcgaccaag 660

tcatacctgc tgtaatccca atccttcaac aaaaaggatt cagcttacaa actgtccctg 720

agtgcttagg cttaagctcc gacccggctg attggtatgt cagagttcaa gaacccggaa 780

ccagggatga ctcgtggact tgcgaggcta ctccgttacc cggaaacttc gaatagaaat 840

gggacttcgc taggcctgga g 861

<210> 6

<211> 274

<212> PRT

<213> Puccinia striiformis CRY29

<400> 6

Met Gly Phe Thr Arg Leu Leu Thr Leu Val Val Thr Val Ala Ser Leu

1 5 10 15

Leu Arg Phe Asp Gln Val Thr Gly Ala His Thr Asn Asp Ile Arg Thr

20 25 30

Leu Arg Ala Arg Gln Asp Thr Ala Val Pro Val Tyr Asp Thr Cys Thr

35 40 45

Val Pro Gly Ser Phe Ala Leu Thr Phe Asp Asp Gly Pro Tyr Gly Phe

50 55 60

Ser Thr Arg Leu Asp Ser Thr Leu Asn Ala Ala Asn Ala Lys Gly Ser

65 70 75 80

Phe Phe Ile Asn Gly Gln Asn Trp Gly Cys Ile Tyr Asp Tyr Ala Asp

85 90 95

Val Leu Leu Glu Arg Phe Asn Asn Gly His Phe Ile Ala Ser His Thr

100 105 110

Trp Ser His Val His Met Asn Gln Gly Thr Tyr Glu Gln Leu Ser His

115 120 125

Gln Leu Glu Leu Val Glu Gln Ala Met Ile Arg Ile Leu Gly Val Lys

130 135 140

Pro Leu Tyr Met Arg Pro Pro Tyr Gly Glu Tyr Asn Asp Val Val Leu

145 150 155 160

Gln Val Leu Arg Asp Arg Gly Tyr Lys Gly Leu Ile Met Trp Asn Gln

165 170 175

Asp Ser Gly Asp Thr Phe Thr Pro Thr Pro Ser Ser Ala Gln Ile Ile

180 185 190

Asp Ser Tyr Arg Ser Phe Pro Glu Lys Thr Ile Ser Leu Asn His Glu

195 200 205

Ile Lys Asp Phe Thr Val Asp Gln Val Ile Pro Ala Val Ile Pro Ile

210 215 220

Leu Gln Gln Lys Gly Phe Ser Leu Gln Thr Val Pro Glu Cys Leu Gly

225 230 235 240

Leu Ser Ser Asp Pro Ala Asp Trp Tyr Val Arg Val Gln Glu Pro Gly

245 250 255

Thr Arg Asp Asp Ser Trp Thr Cys Glu Ala Thr Pro Leu Pro Gly Asn

260 265 270

Phe Glu

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caagcggccg cacacaaatg atatccgcac ctt 33

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaggcgcgc caatggccgt tgttgaatct tt 32

<210> 9

<211> 8207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat 300

cccggtcggc atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca 360

ctatcggcga gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt 420

tgtgtacgcc cgacagtccc ggctccggat cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc 480

caagctgcat catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg 540

cggagcatat acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag 600

tagcgcgtct gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc 660

tcgtattggg aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca 720

ttgtccgtca ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg 780

cagtcctcgg cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg 840

tcgtccatca cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca 900

cgccatgtag tgtattgacc gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg 960

ctaagatcgg ccgcagcgat cgcatccata gcctccgcga ccggttgtag aacagcgggc 1020

agttcggttt caggcaggtc ttgcaacgtg acaccctgtg cacggcggga gatgcaatag 1080

gtcaggctct cgctaaactc cccaatgtca agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat 1140

gcaaagtgcc gataaacata acgatctttg tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc 1200

aggacatatc cacgccctcc tacatcgaag ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag 1260

agctgcatca ggtcggagac gctgtcgaac ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc 1320

gcggtgagtt caggcttttt catatctcat tgccccccgg gatctgcgaa agctcgagag 1380

agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact 1440

tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca 1500

gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc 1560

acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga 1620

acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact 1680

gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt 1740

accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc 1800

ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa 1860

gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg 1920

ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat 1980

ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa 2040

tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg 2100

tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg 2160

ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 2220

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2280

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2340

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2400

acgaattccc gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg 2460

cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa 2520

acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc 2580

aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt 2640

tattgccaaa tgtttgaacg atcggggaaa ttcgggtcat cagatctcgg tgacgggcag 2700

gaccggacgg ggcggtaccg gcaggctgaa gtccagctgc cagaaaccca cgtcatgcca 2760

gttcccgtgc ttgaagccgg ccgcccgcag catgccgcgg ggggcatatc cgagcgcctc 2820

gtgcatgcgc acgctcgggt cgttgggcag cccgatgaca gcgaccacgc tcttgaagcc 2880

ctgtgcctcc agggacttca gcaggtgggt gtagagcgtg gagcccagtc ccgtccgctg 2940

gtggcggggg gagacgtaca cggtcgactc ggccgtccag tcgtaggcgt tgcgtgcctt 3000

ccaggggccc gcgtaggcga tgccggcgac ctcgccgtcc acctcggcga cgagccaggg 3060

atagcgctcc cgcagacgga cgaggtcgtc cgtccactcc tgcggttcct gcggctcggt 3120

acggaagttg accgtgcttg tctcgatgta gtggttgacg atggtgcaga ccgccggcat 3180

gtccgcctcg gtggcacggc ggatgtcggc cgggcgtcgt tctgggctca tggtagatcc 3240

ccggggatcc tctagagtcc cccgtgttct ctccaaatga aatgaacttc cttttccact 3300

atcttcacaa taaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tccggatatt 3360

accctttgtt gaaaagtctc aattgccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattt 3420

ttggagtaga caagtgtgtc gtgctccacc atgttgacga agattttctt cttgtcattg 3480

agtcgtaaga gactctgtat gaactgttcg ccagtcttta cggcgagttc tgttaggtcc 3540

tctatttgaa tctttgactc catggccttt gattcagtgg gaactacctt tttagagact 3600

ccaatctcta ttacttgcct tggtttgtga agcaagcctt gaatcgtcca tactggaata 3660

gtacttctga tcttgagaaa tatatctttc tctgtgttct tgatgcagtt agtcctgaat 3720

cttttgactg catctttaac cttcttggga aggtatttga tttcctggag attattgctc 3780

gggtagatcg tcttgatgag acctgctgcg taagcctctc taaccatctg tgggttagca 3840

ttctttctga aattgaaaag gctaatctgg ggacctgcag gcatgcaagc ttgcatgcct 3900

gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag 3960

ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc 4020

tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata 4080

tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt 4140

attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt 4200

ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt 4260

ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag 4320

cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata 4380

aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa 4440

ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg 4500

agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg 4560

gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac 4620

ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg 4680

caggcggcct cctcctcctc tcacggcacg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct 4740

ccttcgcttt cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc 4800

cccaacctcg tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc 4860

gtcggcacct ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc ccccccccct ctctaccttc 4920

tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg 4980

tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg 5040

tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat 5100

ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg 5160

gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc 5220

ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 5280

atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt 5340

gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg 5400

ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc 5460

ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa 5520

tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca 5580

tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 5640

gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct 5700

aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga 5760

tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat 5820

acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt 5880

acttctgcag gtcgactcta gaggatcccc cgggggtacc gggccccccc tcgaggtcat 5940

caccactttg tacaagaaag ctgggtcggc gcgccaatgg ccgttgttga atctttcgag 6000

taagacgtcg gcatagtcgt aaatgcatcc ccagttttga ccgttgatga agaagcttcc 6060

tttggcattt gctgcgttca aggtagagtc caatcttgtg ctgaatccgt acggcccatc 6120

gtcaaatgtg agtgcaaaag atccggggac ggtacaggtg tcgtatactg ggacagccgt 6180

gtcttgtcta gcgcgtaagg tgcggatatc atttgtgtgc ggccgcggag cctgcttttt 6240

tgtacaaact tgtgatgacg gtatcgataa gcttgatatc tacccgcttc gcgtcggcat 6300

ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac 6360

tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt gcgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat 6420

ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta 6480

cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga 6540

aactgctgct gtcggcttta acctctcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc 6600

gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc 6660

gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc 6720

caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc 6780

aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc 6840

tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg 6900

gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc 6960

ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc 7020

cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga 7080

tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt 7140

cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt 7200

cactcgatcg aattcctgca gcccggggga tccactagat gcatgctcga gcggccgcca 7260

gtgtgatgga tatctgcaga attcgccctt atcacaagtt tgtacaaaaa agcaggctcc 7320

gcggccgcac acaaatgata tccgcacctt acgcgctaga caagacacgg ctgtcccagt 7380

atacgacacc tgtaccgtcc ccggatcttt tgcactcaca tttgacgatg ggccgtacgg 7440

attcagcaca agattggact ctaccttgaa cgcagcaaat gccaaaggaa gcttcttcat 7500

caacggtcaa aactggggat gcatttacga ctatgccgac gtcttactcg aaagattcaa 7560

caacggccat tggcgcgccg acccagcttt cttgtacaaa gtggtgataa gggcgaattc 7620

cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc cgagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca 7680

tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat 7740

aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta 7800

tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca 7860

aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc 7920

gggaattcga tatcaagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 7980

cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 8040

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgc 8100

tagagcagct tgagcttgga tcagattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa actatcagtg 8160

tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgttta 8207

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcaccgtcg cctctcttt 19

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctttggcat ttgctgcg 18

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaggacccac gctgccaata acta 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggagtcccg aacaattatc cgct 24

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Puccinia striiformis CRY29

<400> 14

gatcttttgc actcacattt gacgatgg 28

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Puccinia striiformis CRY29

<400> 15

agcaaatgcc aaaggaagct tctt 24

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Puccinia striiformis CRY29

<400> 16

caaaactggg gatgcattta 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gacctcgcaa ggcatattg 19

Claims

1.小麦条锈菌PSTG_13661基因在小麦条锈病防治中的应用，其特征在于，所述小麦条锈菌PSTG_13661基因的序列如Seq ID No.5所示；

所述应用为将携带所述PSTG_13661基因的沉默表达载体导入小麦中获得抗条锈菌的小麦；

所述应用包括以下步骤：

1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得PSTG_13661基因片段；

2)利用步骤1)所述的PSTG_13661基因片段构建小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体；所述PSTG_13661基因沉默表达载体的构建采用GATEWAY克隆技术；

3)采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦；

所述小麦条锈菌PSTG_13661基因的序列如Seq ID No.5所示；

所述小麦条锈菌PSTG_13661基因沉默表达载体从T-DNA LeftBoarder到RightBoarder区段的序列如序列表Seq ID No.9所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述PCR扩增用引物为CQM13661-F2和CQM13661-R2引物；所述CQM13661-F2的序列如Seq ID No.7所示；所述CQM13661-R2引物的序列如Seq ID No.8所示。