CN104480117A

CN104480117A - 花生nbs-lrr基因及其在烟草抗青枯病中的应用

Info

Publication number: CN104480117A
Application number: CN201410741491.5A
Authority: CN
Inventors: 庄伟建; 张冲; 陈华; 邓烨; 蔡铁城
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: CN104480117B

Abstract

本发明涉及一种花生青枯病抗性相关基因 AhRRS5 及其超表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。构建过量表达载体转化烟草，通过对转基因植株进行青枯菌接种鉴定和分子检测，其在烟草中超表达可显著提高转基因烟草对青枯病的抗性，表明 AhRRS5 在植物应答青枯病菌侵染中起着重要的调节作用，这对植物的抗青枯病基因工程育种应用有重要意义，将大力促进烟草抗青枯病基因工程的发展与应用。

Description

花生NBS-LRR基因及其在烟草抗青枯病中的应用

技术领域

本发明涉及一种花生青枯病抗性相关基因AhRRS5及其超表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

植物在生长发育过程中会受到诸如细菌、病毒、真菌以及昆虫等病原生物的侵扰，但是由于复杂而漫长的的生物进化过程中，植物已经形成了一套完整的，有效的防御病害侵染的机制。在植物和病原物互作过程中，一些病原物被植物的第一道防线阻止杀死，一些被植物的先天性免疫系统中的PTI抑制，但是还有一些病原物通过分泌毒性因子保持病原菌的毒力，这些毒性因子抑制PTI，引发植物感病，导致植物产生效应物引发的感病性（effector-triggered susceptibility, ETS），通常植物会产生一种由效应物引发的先天性免疫反应即ETI， ETI通常是由R蛋白介导的，R基因编码的产物能直接或间接识别病原菌的效应蛋白（无毒蛋白，avr-R），并侵染部位启动快速的防御应答机制，通常会引起植物细胞的超敏反应（HR），激发下游一系列防卫反应。

由R基因介导的植物抗病性研究早已有报道，根据Flor的“基因对基因”假说，植物细胞中的R基因能够专一性识别病原物中的无毒基因(avirulence gene，avr），并激发植物的抗病反应，只有当携带R基因的植物与带有avr基因的病原物发生作用时，植物才能表现抗病，缺少任何一方都会导致感病。这一遗传假说对于解析植物宿主-病原物的互作关系提供了理论基础。目前R蛋白和avr蛋白直接的作用的证据并不多，多数情况下抗病基因编码的R蛋白是通过植物中称之为“卫士蛋白”的其他蛋白协作与无毒Avr蛋白间接相互作用。最近，“诱饵模型”认为卫士蛋白被“诱饵蛋白”所取代，“诱饵蛋白”只是替代物而不是Avr作用的目标。大部分的R基因通常包括核苷酸结合位点（nucleotide binding site, NBS）和亮氨酸富集重复(leucine-rich repeat, LRR)结构域，NBS结构域通常由不同的保守结构域组成如P-Loop，GLPL，Kinase-2 和Kinase-3a模块，这些保守的模块在植物的信号转导中起重要作用，在病原菌侵染时这些模块通常能够通过激酶区的激活来诱导防御反应。LRR结构域通常由包含亮氨酸的24个氨基酸残基，在植物与病原菌互作起着蛋白之间的互作以及植物与病原菌的识别作用。NBS-LRR类抗病基因根据N端的结构差异分为两大亚类：TIR-NBS-LRR类抗病基因和CC/LZ-NBS-LRR类抗病基因。

目前已经在单双子叶植物中克隆得到了70多个抗病基因，大量的R基因通过图位克隆和转座子标签等方法已经在农作物上克隆和鉴定。由于大多数植物的抗青枯病基因并不是单个基因控制的，而是由数量遗传性状控制的，而这种数量性状控制青枯病抗性的位点在很多植物上如番茄，茄子，烟草，苜蓿等被鉴定，由单基因控制的青枯病抗性目前只有拟南芥上两个基因RRS1-R和ERECTA，拟南芥上通过图位克隆获得的一个抗青枯病基因RRS1-R是一类典型TIR-NB-LRR类抗病基因，而且在其C端具有一个可以激活下游防御基因表达的转录因子WRKY，青枯菌的PopP2是抗病基因RRS1-R对应的无毒基因，在其N端有一个便于向核内转运的细胞核定位信号(nuclear located signal，NLS)；RRS1-R基因的N端的LRR结构域能够识别并结合无毒蛋白PopP2，在PopP2核定位信号NLS使得RRS1-R蛋白导向细胞核内，在核内会通过WRKY转录因子结构域活化下游信号的传导，进而引发下游防御相关基因的表达，从而产生对青枯菌的抗性。而ERECTA是拟南芥另外一个抗青枯病的基因是LRR-RLK类基因，并不是严格意义上的NBS-LRR类基因，但是ERECTA基因是通过胞外激酶区磷酸化调控下游基因对青枯病的防御反应。

花生(Arachis hypogaea.L)是世界上四大油料作物之一，是我国重要的出口作物，在我国国民生产中占据重要的地位。而由青枯雷尔氏(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病严重影响着花生的产量、品质、生产和加工，有些地区由青枯病引起的花生产量会减产10%-50%不等，有些地区则会绝收。目前还没有有效的防治手段解决青枯病问题。花生青枯病的分子生物学机制尚无人研究，严重影响着花生抗青枯病的分子育种。随着大规模测序和功能基因组学的发展，越来越多的R基因将会被发现，这些R基因将会通过反向遗传学的方法确定其功能，而了解这些R基因与病原菌互作的分子机制将为植物的抗病分子机制以及分子育种提供理论基础，具有重要的研究价值和意义。

本发明针对以上背景技术，根据花生抗感青枯病品种接种青枯菌后mRNA与花生生物非生物胁迫测序构建的基因芯片杂交结果在抗病品种上获得一个受青枯菌诱导上调表达2倍的NBS-LRR基因，通过RACE技术获得其全长cDNA序列，具有典型的R基因的特征保守结构域，亚细胞定位于细胞核上，在抗感花生品种接种青枯菌后抗、感青枯病品种都能能够上调表达，而感病品种则上调较多，构建过量表达载体通过农杆菌介导转化烟草表现对青枯病的抗性。通过对转基因烟草接种青枯菌后防御相关基因的分析，推测AhRRS5可能参与花生对青枯菌的防御反应。这就为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。

发明内容

本发现提供了一种受青枯菌诱导上调表达花生NBS-LRR类抗病基因AhRRS5及其在烟草抗青枯病基因工程中的应用，将大力促进烟草抗青枯病基因工程的发展与应用。

本发明提供了一种花生NBS-LRR基因，命名为AhRRS5基因，该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。所述的AhRRS5基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。花生AhRRS5基因能够显著提高烟草青枯病的抗性能力，这为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。

本发明的花生AhRRS5基因主要通过抗青枯病花生品种在接种青枯菌和非接种的mRNA与其杂交获得了大量的基因表达差异的信息，对青枯菌诱导差异表达上调2倍的NBS-LRR类抗病基因进行全长cDNA的克隆，克隆全长基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了包含所述花生NBS-LRR基因的超表达载体；以及，所述超表达载体的构建方法：酶切连接替换植物表达载体pBI121-GUSA中的GUS基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRRS5基因的植物表达载体pBI121-AhRRS5-OE。

最后，本发明提供了所述的花生NBS-LRR基因或所述的超表达载体在烟草等植物抗青枯病基因工程中的应用。

本发明的花生AhRRS5基因功能鉴定是通过酶切连接替换植物表达载体pBI121-GUSA中的GUS基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRRS5基因植物表达载体pBI121-AhRRS5-OE，将其转化EHA105 农杆菌，通过叶盘法将其导入翠碧一号烟草上，对转基因烟草进行青枯菌的接种，进而对其进行抗性鉴定，结果证明提高了该转基因对烟草的抗青枯病性。

本发明的花生AhRRS5基因超表达烟草相比野生型烟草对青枯病抗病能力显著提高，表明该基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值。

附图说明

图1为RACE获得AhRRS5基因的3’未知序列和5’未知序列以及全长cDNA的电泳图；

图2为AhRRS5过量表达载体的构建及验证；

图3为AhRRS5亚细胞定位结果；

图4为AhRRS5在抗、感青枯病花生品种中的表达差异；*，**分别表明两两均值差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）。

图5为AhRRS5在转基因烟草中超表达对青枯病侵染的抗性。

具体实施方式

【实施例1】RACE获得AhRRS5基因3’未知序列和5’未知序列

根据花生非生物和生物胁迫454测序的转录组合成花生的表达谱基因芯片（罗氏公司合成），利用抗青枯病品种接种前后芯片杂交筛选青枯菌诱导前后基因的差异表达获得候选基因片段，设计一对基因引物PRRS _5_F（5’- GCTTTGTAGAGGCAAATCAAGGCTG -3’）和PRRS_5-R（5’- TGAAGAGAAGGCATCCAATCAGGTAAG -3’）；再根据模板单链cDNA合成过程所加的接头序列RACE-F（AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT）和RACE-R（ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N-3'），利用PRRS_5-R引物和RACE-F引物以及PRRS _5_F引物和RACE-R引物配对分别进行5′和3′- RACE反应，5′-RACE反应条件是94℃ 5min→(94℃ 30s→57℃ 30s→72℃ 2min)30 cycles→72℃10min；3′-RACE反应条件是94℃ 5min→(94℃ 30s→72℃ 2min)5cycles →(94℃ 30s→64℃ 30s→72℃ 2min)30 cycles→72℃10min；根据生物信息学预测的目的条带基因的大小对PCR产物有目的的回收连接进行T-A克隆，阳性克隆送华大基因有限公司测序。将获得的5′和3′未知序列经拼接后获得其全长cDNA序列，根据全长cDNA序列设计全长cNDA引物AhRRS5- FL-F（5’-CATATAACTAAGTGTGGGCCATTTCGAGAGG -3’）和AhRRS5-FL-R（5’- TGGGTTTATTGAGCAATATTTACACTATTTAC-3’）引物从单链cDNA扩增获得全长cDNA序列，对PCR产物有目的的回收连接进行T-A克隆，阳性克隆送华大基因有限公司测序并保存质粒。AhRRS5基因的3’未知序列和5’未知序列以及全长cDNA克隆的电泳图如图1所示；其全长cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

【实施例2】AhRRS5超表达载体构建与验证

通过AhRRS5-OE-F（5’- ATTAGGATCCACCATGGCTGAGAGTGCCATAGCCT-3’）和AhRRS5-OE-R（5’- ATTTAGGCGCGCCTACACCTTTGAGAGAGTGCTGCGT-3’）这对引物从具有完整读码框的质粒中扩增得到包括终止密码的AhRRS5基因cDNA开放阅读框，5′端3′端分别带有BamH1和Asc1酶切位点，对本实验室构建的由2×CaMV 35S启动子驱动的pBI121-GUSA和扩增得到的AhRRS5目的片段同时用BamH1（购自NEB公司）和Asc1（购自NEB公司）双酶切，回收目的片段，用T4连接酶16℃过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株，构建p35S::AhRRS5-OE超表达载体，经过PCR验证以及酶切验证确定其载体构建的正确性，其载体图如图2所示。通过液氮冻融法转化农杆菌EHA105以备烟草转基因用。

【实施例3】AhRRS5基因表达产物的亚细胞定位

对于亚细胞定位载体，通过AhRRS5-SL-F（5’-ATTAGGATCCACCATGGCTGAGAGTGCCATAGCCT-3’）和AhRRS5-SL-R（5’-ATTAGGCGCGCCACACCTTTGAGAGAGTGCTGCGT-3’）这对引物从具有完整读码框的质粒中扩增得到不包括终止密码的AhRRS5基因cDNA，5′端3′端分别带有BamH1和Asc1酶切位点，对本实验室构建的pBI-GFP和扩增得到的AhRRS5基因同时用BamH1和Asc1双酶切，经过连接和转化构建p35S::AhRRS5::GFP载体。鉴定成功的重组质粒用基因枪轰击洋葱表皮细胞，导入洋葱表皮后，将平板放入组培室避光培养24-36h，使质粒编码的GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内充分表达。然后将洋葱表皮置于双蒸水中浸泡，随后在荧光显微镜上进行观察，观察条件为蓝色激发光，并进行图象采集。结果显示AhRRS5基因的编码产物定位在细胞核上（图3所示）。

【实施例4】AhRRS5在抗、感青枯病花生青枯菌处理后的表达模式分析

为了分析AhRRS5基因在抗、感青枯病花生品种接种青枯菌表达上的差异，本研究采取实时荧光定量PCR方法对抗、感青枯病花生材料粤油92(YY 92）和新会小粒(XH)剪叶法接种青枯菌处理后，在不同时间点分析该基因的表达情况。采用CTAB法提取花生和烟草叶片的总RNA，根据PrimeScript Reverse Transcriptase逆转录酶（购自TAKARA公司）说明书进行逆转录合成单链cDNA，将单链cDNA稀释10倍，2μL为模板，以Ahactin，Ntactin为内参基因，采用Eppendorf Mastercycler ep realplex 实时荧光定量PCR仪进行定量PCR反应，按照TAKARA公司SYBR? Premix Ex Taq20μL的反应体系包括10 μL 2×SYBR Premix Ex-Taq buffer，正反引物各0.5μL，补水到20μL。qRT-PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃ 15s， 60℃ 15 s，72℃ 30s，40个循环。相对表达量采用2^-△△Ct(Livak)法计算。其中△△Ct= (CT_gene - CT_actin)_处理 - (CT_gene - CT_actin)_对照。结果显示在抗病品种粤油92（YY92）上，该基因表达表现先上调后恢复的情况，接种后24h后该基因表达上调2.5倍左右；而在感病品种新会小粒（XH）中，AhRRS5基因的表达量在接种青枯菌后整体表现上调的趋势，接种后24h该基因相对表达量上调最大，达到3.75倍，随着接种时间的推移，该基因的相对表达量略有减少的趋势。

【实施例5】烟草的遗传转化和转基因烟草的PCR鉴定

采取根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，把分别带有质粒p35S::AhRRS5-OE超表达载体的农杆菌通过叶盘法转化烟草品种翠碧一号（CB-1），用100mg/L 卡那霉素（Kan）筛选叶芽及根系生长，在培养过程中用500 mg/L头孢霉素（Cef）来抑制农杆菌的生长，培养条件温度25℃±2℃，光照每天14h白天/10h黑夜。共培养培养基：MS培养基+0.1mg/L NAA（a-萘乙酸）+ 1mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤），诱导筛选培养基：MS培养基+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+ 100 mg/L kan +500mg/L Cef，生根培养基：MS培养基+50mg/L Kan +500mg/L Cef。NAA，6-BA，kan和Cef购自Sigma公司。

根据35S启动子和AhRRS5基因序列设计一对引物引物35S-F(5’-TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3’)和AhRRS5-R（5’-TCTATACCCACTAGGTCAGTGTTC-3’），CTAB法提取转基因与非转基因烟草DNA，以两种转基因植株的DNA为模板，未转化烟草DNA为对照，利用设计的35S-F和AhRRS5-R进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer 2.0μl，dNTP 1.5μl，35S-F 0.5μl，AhRRS5-R 0.5μl，Taq酶0.1μl，ddH2O 14.4μl，模板DNA 1.0μl，总体积为20μl。反应程序为：94 ℃ 5 min→（94 ℃ 30 s→58℃ 30 s→72 ℃ 60 s）40 cycles→72 ℃ 10min→ hold at 4℃。

【实施例6】AhRRS5超表达转基因烟草的青枯病抗性鉴定

将获得的转基因烟草T0代抗病株系进行套袋自交收获T1代转基因种子，利用T2代转基因种子进行转基因烟草表型分析与功能鉴定。将T2代转基因株系的种子以及野生型成熟种子分别种子无菌水浸泡24h，75%酒精30s，10%过氧化氢 10min,无菌水清洗5-6次，播种MS培养上，十五天后，移栽于育苗盘，一个月后选取大小一致的苗移栽于小花盆中培养9周后，对烟草种子进行青枯菌叶脉注射接种处理，处理15后，AhRRS5超表达烟草植株相对于野生型对照表现出对病原菌侵染的明显抗性，野生型烟草出现整株萎蔫甚至死亡。相同试验至少重复三次以上，均有同一趋势结果。结果发现，AhRRS5转基因烟草对青枯病菌明显强于野生型对照(图4)，说明AhRRS5参与了植物对青枯病菌的抗性作用。

<110> 福建农林大学

<120> 花生NBS-LRR基因及其在烟草抗青枯病中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3152

<212> DNA

<213> 花生（Arachis hypogaea）

<400> 1

catataacta agtgtgggcc atttcgagag gaaaatcagg actaacagag aatatgtgac 60

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caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3152

<210> 2

<211> 943

<212> PRT

<213> 花生（Arachis hypogaea）

<400> 2

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His Leu Lys Gly His Leu Gly Val Ile Arg Ala Phe Leu Arg Val Ala

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Asp Ala Lys Gln Glu Ser Asp Glu Glu Leu Lys Val Cys Ile Lys Gln

50 55 60

Leu Arg Asp Ile Ala His Asp Ala Glu Asp Leu Leu Asp Glu Leu Glu

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Leu Val Gln Ala Tyr Asp His Thr Asn Gly Phe Ser Val Ile Leu Ser

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100 105 110

Ser Asp Leu Lys Gly Ile Asn Ser Arg Met Arg Thr Ile Leu Gly Val

115 120 125

Leu Ala Lys Phe Asp Thr Ala Ser Gln Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Lys

130 135 140

Ala Trp His Asp Gln Arg Gly Asp Ala Leu Leu Leu Glu Asn Thr Asp

145 150 155 160

Leu Val Gly Ile Glu Glu Pro Lys Lys Gln Leu Ile Ser Trp Leu Ile

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Lys Gly Cys Pro Gly Arg Lys Val Ile Ser Val Thr Gly Met Gly Gly

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Met Gly Lys Thr Thr Val Val Lys Lys Val Tyr Asp Asp Pro Glu Val

195 200 205

Ile Lys His Phe Lys Ala Cys Val Trp Val Thr Val Ser Gln Ser Phe

210 215 220

Lys Thr Glu Glu Leu Leu Arg Asp Leu Val Gln Lys Ile Phe Ser Glu

225 230 235 240

Ile Arg Arg Pro Val Pro Asp Gly Leu Glu Ser Met Arg Ser Asp Lys

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Leu Lys Leu Ile Ile Lys Asp Met Leu Gln Arg Arg Arg Tyr Leu Val

260 265 270

Val Phe Asp Asp Val Trp His Met His Glu Trp Glu Ala Val Lys Tyr

275 280 285

Ala Leu Pro Asp Asn Asn Cys Gly Ser Arg Val Met Ile Thr Thr Arg

290 295 300

Lys Ser Asp Leu Ala Ser Ala Cys Ser Ile Gln Ser Lys Gly Lys Val

305 310 315 320

Tyr Asn Leu Gln Pro Leu Lys Glu Asp Glu Val Trp Asp Leu Phe Thr

325 330 335

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340 345 350

Cys Lys Cys Ile Leu Arg Lys Cys Glu Gly Leu Pro Leu Ala Ile Val

355 360 365

Ala Ile Ser Ser Val Leu Ala Met Lys Asp Lys Cys Arg Ile Glu Glu

370 375 380

Trp Asp Met Ile Cys His Ser Leu Gly Ala Glu Ile Gln Asp Asn Asp

385 390 395 400

Lys Leu Gly Asn Leu Lys Thr Val Leu Gly Leu Ser Ile Asn Asp Leu

405 410 415

Pro Tyr Tyr Leu Lys Tyr Cys Phe Leu Tyr Leu Ser Ile Phe Pro Glu

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Asp Tyr Leu Lys Glu Leu Leu Asn Arg Asn Leu Ile Gln Val Ala Gly

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Thr Thr Thr Asp Gly Arg Val Lys Thr Leu Arg Ile His Asp Leu Ile

485 490 495

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Asp Ala Pro Leu Gln Lys Phe Pro Val Ala Ile Gly Gly Leu Tyr Cys

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Lys Ile Leu Gly Lys Leu Lys Asn Leu Glu Thr Leu Asp Leu Lys Lys

610 615 620

Thr Ser Ile Thr Glu Leu Pro Ala Asp Ile Leu Asn Leu Lys Lys Leu

625 630 635 640

Arg His Leu Leu Val Tyr Gln Val Lys Val Lys Gly Tyr Gly Glu Phe

645 650 655

His Ser Lys Leu Gly Phe Lys Ala Pro Ser Glu Ile Gly Tyr Leu Gln

660 665 670

Ser Leu Gln Lys Leu Cys Phe Val Glu Ala Asn Gln Gly Cys Gly Lys

675 680 685

Ile Ile Arg Gln Leu Ala Glu Leu Cys Gln Leu Arg Arg Leu Gly Ile

690 695 700

Arg Asn Leu Arg Glu Glu Asp Gly Lys Ala Phe Cys Leu Ser Ile Glu

705 710 715 720

Arg Leu Val Asn Leu Cys Ala Leu Ser Val Thr Ser Glu Gly Glu Asn

725 730 735

Lys Val Ile Ala Leu Glu Phe Leu Ser Ser Pro Pro Pro Tyr Leu Gln

740 745 750

Arg Leu Tyr Leu Ser Gly Arg Leu Leu Asp Leu Pro Asp Trp Met Pro

755 760 765

Ser Leu His Asn Leu Ala Lys Leu Phe Leu Lys Trp Ser Cys Leu Glu

770 775 780

Gln Asp Pro Leu Glu Tyr Leu Gln Asp Leu Pro Asn Leu Ser His Leu

785 790 795 800

Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Thr Gly Asp Thr Leu His Phe Gln Cys Gly

805 810 815

Lys Phe Lys Lys Leu Lys Ile Leu Gly Leu Asp Arg Phe Val Glu Leu

820 825 830

Lys Gln Val Ile Leu Gly Lys Asp Ala Met Pro Cys Leu Glu Lys Leu

835 840 845

Ile Ile Gln Arg Cys Gln Leu Leu Lys Asn Val Pro Ser Gly Val Glu

850 855 860

Leu Leu Thr Lys Leu Lys Val Leu Glu Leu Phe Asp Met Pro Asp Glu

865 870 875 880

Leu Met Lys Thr Ile Cys Pro Gln Gly Pro Gly Lys Asp Tyr Trp Lys

885 890 895

Val Ala His Ile Pro Glu Val Phe Ser Thr Tyr Trp Arg Asp Gly Ala

900 905 910

Trp Asp Val Tyr Pro Leu Glu Ser Phe Lys Asp Cys Ser Pro Arg Ser

915 920 925

Gly Thr Val Met Arg Ser Asp Glu Arg Ser Thr Leu Ser Lys Val

930 935 940

Claims

1.一种花生NBS-LRR基因，命名为AhRRS5基因，该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的花生NBS-LRR基因，其特征在于：所述的AhRRS5基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

3.包含如权利要求1所述花生NBS-LRR基因的超表达载体。

4.一种如权利3要求所述超表达载体的构建方法，其特征在于：酶切连接替换植物表达载体pBI121-GUSA中的GUS基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRRS5基因的植物表达载体pBI121-AhRRS5-OE。

5.一种如权利要求1所述的花生NBS-LRR基因或权利要求3所述的超表达载体在烟草等植物抗青枯病基因工程中的应用。