CN106811472B - NtRRS2基因及其在烟草抗青枯病中的应用 - Google Patents

NtRRS2基因及其在烟草抗青枯病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了烟草CC‑NBS‑LRR类抗病基因NtRRS2及其在烟草抗青枯病中的应用，属于植物基因工程领域。本发明首先提供了从烟草抗青枯病品种岩烟97中克隆得到的NtRRS2基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明进一步将上述NtRRS2基因转入到烟草中进行功能验证。结果表明，超表达NtRRS2基因能显著增强感病品种对青枯菌的抗性。本发明分离的NtRRS2基因是调控烟草对青枯菌抗性的重要基因，可提高烟草对青枯病的抗性，在烟草抗青枯病分子育种等方面具有重要应用前景。

Description

NtRRS2基因及其在烟草抗青枯病中的应用
技术领域
本发明涉及NtRRS2基因及其在烟草抗青枯病中的应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物。烟草青枯病是烟草的重要病害之一，该病害属土传性细菌性病害，从根部或伤口侵入，导致植株枯萎死亡，在中国俗称“烟瘟”。该病分布较为广泛，主要分布于高温高湿的热带及亚热带地区。近年来表现出逐渐向高纬度、高海拔寒带地区扩展的趋势。该病害严重危害我国长江流域及南方的烟叶产区，给烟农造成巨大的损失，造成严重产量损失的有福建、广东、广西等多个省份的烟区。目前尚未有经济有效的防治烟草青枯病手段，而从根本上解决的有效途径是培育抗病品种，与传统育种方法相比，利用基因工程育种手段培育出优质高产的抗青枯病品种可更有效的解决烟草青枯病问题。
目前我国已开展了烟草基因组的测序工作，并完成了两个野生原始种的基因组测序，但栽培种的基因组序列尚在组装过程中。这将有利于烟草抗青枯病基因的克隆和鉴定，促进烟草抗青枯病分子育种。细菌性青枯病为害寄主范围很广，但除了拟南芥，尚未从正向遗传学手段获得抗青枯病基因。目前在拟南芥上获得的TIR-NB-LRR类抗青枯基因RRS1-R和LRR-RLK类抗青枯基因ERECTA。而NBS-LRR类抗性基因常包含核苷酸结合位点（NBS）和富亮氨酸重复（LRR）结构域。NBS的保守结构域包含了多个在植物信号转导过程中起关键作用的保守功能区，如P-Loop，Kinase-2，Kinase-3a和GLPL等。LRR结构域则介导病原相关分子模式引发的免疫反应（PTI）中。植物遭到病原菌入侵后，通常会在侵染部位通过产生过敏反应，来抵御病原菌的扩散和繁殖，进而激活下游一系列的相关防卫反应。植物的防御反应过程是复杂的信号转导调控网络作用的结果，该调控网络由抗性通道或SA，ET，JA等植物激素参与的信号转导通路交叉形成。目前烟草中NBS-LRR类抗青枯基因的报道甚少，烟草抗青枯的分子机理及其调控网络的研究甚少，这严重制约了烟草抗青枯病的分子育种进程。
本发明针对以上背景技术，研究基于实验室前期的烟草基因芯片数据分析结果，发现了一个经青枯菌诱导后在抗感品种上均上调表达的CC-NBS-LRR类抗性基因，命名为NtRRS2，作为抗青枯病关键候选基因。利用Race技术从烟草抗病品种岩烟97中克隆了该基因的全长序列，包含完整的开放阅读框，包含CC基序、NB-ARC和多个富亮氨酸基序（LRR-RI）保守结构域，符合CC-NBS-LRR类的抗病基因家族的特点。利用Gateway技术构建了超表达载体，酶切连接法构建了RNAi载体，分别转入感病品种红花大金元和抗病品种岩烟97中，进行遗传互补功能验证。对转基因烟草植株进行青枯菌接种鉴定，结果表明超量表达NtRRS2基因可显著增强烟草青枯病抗性，而RNAi沉默并未使植株完全感病，这说明该基因可能参与了抗病防御反应，但与岩烟97抗青枯病信号通道相关，可能是通过识别受体蛋白而激活下游抗性信号通道。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。
发明内容
本发明提供了烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2基因在烟草抗青枯病中的应用。目的在于提供烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2基因的编码序列及其所编码的蛋白，提供含有上述NtRRS2基因的过表达载体以及RNAi干扰载体，并应用于提高烟草对青枯菌的抗性，进而培育抗青枯病烟草新品种（系）。为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过设计引物，从抗青枯病烟草品种岩烟97中克隆获得NtRRS2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了含有所述烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2基因的过表达载体以及RNAi载体。采用Gateway技术，将NtRRS2基因引入到过表达载体pEarleyGate 205中，由增强型启动子35S驱动，载体命名为p35S :: NtRRS2-TAP；采用酶切连接法，将NtRRS2基因的正反向插入片段插入到RNAi表达载体pGSA2285中，命名为NtRRS2-RNAi。分别将上述载体转化EHA105 农杆菌，通过叶盘法分别将其导入感青枯病品种红花大金元与抗青枯病品种岩烟97中。对转基因后代植株进行青枯菌接种鉴定，结果表明NtRRS2基因的过量表达可显著增强烟草植株对青枯菌的抗性，该基因沉默可降低烟草植株对青枯菌的抗性。
初步预测该基因可能是内源抗病基因的互作基因，抑制了烟草抗青枯病基因的表达。这将为烟草抗青枯病的分子机理提供理论基础。
本发明为研究NtRRS2基因是否与烟草抗青枯病中发挥作用，以野生型为对照，
有益效果
本发明克隆的烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2可提高烟草对青枯菌的抗性，对于烟草抗青枯病的遗传改良以及培育抗青枯病烟草新品种（系）具有重要的应用价值。
附图说明
图1 RACE获得NtRRS2基因的3’未知序列和5’未知序列以及ORF框电泳图。A：5’RACE目的片段；B：3’RACE目的片段；C：ORF框目的片段。
图2-1 NtRRS2蛋白结构域的多序列比对。
图2-2 NtRRS2蛋白结构域的多序列比对。
图2-3 NtRRS2蛋白结构域的多序列比对。
图3 NtRRS2超表达载体(A)和RNAi载体（B）的构建示意图。
图4 NtRRS2超表达转基因烟草T0代鉴定。A.DNA 水平上的鉴定；B. RNA水平上的鉴定；M1：DL15,000 DNA Marker；M2：DL2,000 DNA Marker。1：阴性对照；2：阳性对照；其余泳道为以T0代植株个体的DNA或sscDNA为模板的扩增产物。
图5NtRRS2-RNAi转基因烟草T0代鉴定。A. DNA 水平上的鉴定；B. RNA水平上的鉴定；M：DL2,000 DNA Marker；1：阳性对照；2：阴性对照；其余泳道为以T0代植株个体的DNA或sscDNA为模板的扩增产物。
图6 NtRRS2超表达转基因烟草接种青枯菌的表型及其病情指数。
图7RNAi干扰沉默NtRRS2转基因烟草接种青枯菌的表型及其病情指数。
具体实施方式
【实施例1】RACE获得NtRRS2基因3’未知序列和5’未知序列
本研究基于实验室前期的烟草基因芯片数据分析结果，发现了一个经青枯菌诱导后在抗感品种上均上调表达的CC-NBS-LRR类抗性基因的片段，命名为NtRRS-2。根据该基因片段，设计引物NtRRS2-5’race-F（5’-TTGCTAATCGAGATGTCCGACTTAG-3’）和NtRRS2-3’race-R（5’-TCTCAACTTTGAGTCAACAATATCTTC-3’），根据模板接头序列设计一对引物NtLib45-F（5’-GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTACGCGTGTAAAACGAC-3’）和NtLib39-R（5,-ACCAGGATCTCCTAGGGAAACAGCTATGACCATGTTCAC-3’），用NtRRS2-3’race-R引物和NtLib45-F引物以及NtRRS2-5’race-F引物和NtLib39-R引物配对分别进行5′和3′- RACE反应，5′-RACE反应条件是95 ℃，5 min →（95 ℃，30 s →72 ℃，2 min）5 cycles →（95 ℃，30 s →57 ℃，30s →72 ℃，30 s）30 cycles→72 ℃，10 min；3’-RACE反应条件是95 ℃，5 min →（95 ℃，30 s →72 ℃，2 min）5 cycles →（95 ℃，30 s →57 ℃，30 s →72 ℃，30 s）30 cycles→72 ℃，10 min。
PCR扩增产物用浓度为2 %的琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据生物信息学预测的目的条带大小对产物有目的的回收并连接到载体pMD18-T，然后转化感受态大肠杆菌DH5ɑ，挑取单克隆，进行PCR检测，选择阳性克隆送华大基因有限公司测序。将获得的5′和3′未知序列经拼接后获得其全长cDNA序列，根据全长cDNA序列设计扩增ORF框的特异引物NtRRS2-ORF-F（5’-ATGGCTTATGCTGCTCTGACTTCTGCTG-3’）和NtRR-2-ORF-R（5’-TCATTTCTCTACTTGCCTGGTGGAATAAG-3’），以岩烟97叶片cDNA为模板克隆获得目的基因的ORF框序列。反应条件是95 ℃，5 min →（95 ℃，30 s → 68 ℃，2 min）5 cycles →（95 ℃，30 s → 57 ℃，30 s → 72 ℃，30 s）30 cycles → 72 ℃，10 min；PCR扩增产物用浓度为1.5 %的琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据生物信息学预测的目的条带大小对产物有目的的回收并连接到载体pDONR207，然后转化感受态大肠杆菌DH5ɑ，挑取单克隆，进行PCR检测，选择阳性克隆送华大基因有限公司测序。NtRRS2基因的3’未知序列和5’未知序列以及ORF框序列的电泳图如图1所示；其完整ORF序列如SEQ ID No.1所示。该基因的cDNA序列全长3259bp，含有编码938个氨基酸残基的ORF框、长度为304 bp的5’端非翻译区、长度为112 bp的3’端非翻译区、以及26 bp的Poly（A）尾巴。利用NCBI上的CDD（Conserved DomainDatabase）软件对NtRRS2蛋白进行保守域预测，该序列包含CC基序、NB-ARC和多个富亮氨酸基序（LRR-RI）保守结构域，符合CC-NBS-LRR类的抗病基因家族的特点。
通过BlastP比对烟草NtRRS2编码的蛋白与其他作物的抗性蛋白之间的同源性，结果显示其与芝麻、番茄、马铃薯的同源性分别为42%、40%、37%。运用ClustalW软件，对NtRRS2与拟南芥、辣椒、番茄及芝麻等四种植物的CC-NBS-LRR类抗性蛋白氨基酸序列比对的结果如图2-1~图2-3所示，NtRRS2的CC-NBS-LRR结构域氨基酸序列比较保守，含有P-Loop、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL区域，而保守区域之外的氨基酸序列却差异比较大，由此可推断烟草NtRRS2基因属于CC-NBS-LRR类基因家族。
【实施例2】NtRRS2超表达载体与RNAi载体构建与验证
采用Gateway技术，通过引物对NtRRS2-OE-F（5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGCTTATGCTGCTC-3’）和NtRRS2-OE-R（5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTTCTCTACTTGCCTG-3’）扩增获得不包括终止密码的NtRRS2基因的cDNA编码区片段，经BP反应将该目的片段连接到入门载体pDONR207中，再通过LR反应将该片段从入门载体pDONR207中转移到过表达载体pEarleyGate 205中，构建p35S::NtRRS2-TAP过量表达载体（图3A），用于遗传转化烟草红花大金元。
采用酶切连接法，通过正向插入的引物对NtRRS2-RNAi-XhoI-F（5’-ATTACTCGAGCTTCATTTGGACAGCATC-3’）、NtRRS2-RNAi-NcoI-R（5’-ATTACCATGGGTCAAACAAGCAAATAAGT-3’）和反向插入的引物对NtRRS2-RNAi-PacI-F（5’-ACCTTAATTAACTTCATTTGGACAGCATC-3’）和NtRRS2-RNAi-BamHI-R（5’-ATTAGGATCCGTCAAACAAGCAAATAAGT-3’）分别从岩烟97叶片cDNA模板中扩增得到NtRRS2基因的正反向插入片段，将其插入到酶切后的RNAi表达载体pGSA2285中，构建NtRRS2-RNAi表达载体（图3B），用于遗传转化烟草岩烟97。构建好的载体通过液氮冻融法转化农杆菌EHA105以备烟草转基因用。
【实施例3】烟草的遗传转化和转基因烟草的PCR鉴定
将分别带有质粒p35S::NtRRS2-TAP过量表达载体和NtRRS-2-RNAi干扰载体的农杆菌通过叶盘法转化烟草品种红花大金元和岩烟97中，T0代转基因烟草分别经过Basta和卡那霉素的筛选。分别用100mg/L与75mg/mL的卡那霉素筛选叶芽及根系生长，在培养过程中用500 mg/L（Cef）来抑制农杆菌的生长，培养条件温度25℃±2℃，光照每天14h白天/10h黑夜。预培养培养基：1/2 MS培养基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA，共培养培养基：1/2 MS培养基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+1 mg/L AS，诱导筛选培养基：MS培养基+1.5 mg/L6-BA+0.1 mg/L IAA+500 mg/L cef+2.5 mg/L PPt，MS培养基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/LIAA +500 mg/L cef+25 mg/L Km，筛选培养基：MS培养基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+500 mg/L cef+4 mg/L PPt，MS培养基+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA +500 mg/L cef+50mg/L Km，生根培养基：MS培养基+0.5 mg/L IAA+500 mg/L cef+4 mg/L PPt，MS培养基+0.5mg/L IAA+500 mg/L cef+75 mg/L Km。
超表达转基因烟草的PCR检测：根据35S启动子和NtRRS2基因序列设计一对引物引物35S-F（5’-TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3’）和NtRRS2-R（5’-CAAGATGACGAGCTAATTTTGGTTCTTG-3’），CTAB法提取转基因与非转基因烟草DNA，以转基因植株的DNA为模板，未转化烟草DNA为对照，以35S-F和NtRRS2-R引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer 2.0µl，dNTP 1.5µl，35S-F 0.5µl，NtRRS2-R 0.5µl，Taq酶0.1µl，ddH2O14.4µl，模板DNA 1.0µl，总体积为20µl。反应程序为：94 ℃ 5 min→（94 ℃ 30 s→58℃30 s→72 ℃ 60 s）40 cycles→72 ℃ 10min→ hold at 4℃。结果显示，阳性植株PCR扩增获得了一条2453bp的条带（图4A），从96个转基因植株中获得了78株阳性植株。为了解阳性植株转基因是否表达，CTAB法提取了阳性植株的总RNA，经PrimeScript逆转录酶逆转录为单链cDNA，根据NtRRS2基因序列设计引物NtRRS2-F（5’-TGAAACCACCTGTACAAGAACC-3’）和NtRRS2-R（5’-TCTCTACTTGCCTGGTGG-3’），进行RT-PCR分析，所分析的78株阳性植株全部显示表达条带，阳性率为81%（图4B）。
RNAi干扰载体转基因植株检测：设计引物NptII-F（5’-AGATGGATTGCACGCAGGTTCTC-3’）和NptII-R（5’-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3’），CTAB法提取转基因与非转基因烟草DNA，以转基因植株的DNA为模板，未转化烟草DNA为对照，以NptII-F和NptII-R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer 2.0µl，dNTP 1.5µl，NptII-F0.5µl，NptII-R 0.5µl，Taq酶0.1µl，ddH2O 14.4µl，模板DNA 1.0µl，总体积为20µl。反应程序为：94 ℃ 5 min→（94 ℃ 30 s→55℃ 30 s→72 ℃ 30 s）40 cycles→72 ℃ 10min→hold at 4℃。结果显示，阳性植株PCR扩增获得了一条500bp的条带（图5A），从86个转基因植株中获得了67个阳性植株；为了解阳性植株转基因是否抑制表达，提取了阳性植物的总RNA，用引物对NtRRS-2-RNAi-Xho I-F（5’-ATTACTCGAGCTTCATTTGGACAGCATC-3’）和NtRRS-2-RNAi-Nco I-R（5’-ATTACCATGGGTCAAACAAGCAAATAAGT-3’）进行RT-PCR分析，所分析的67个阳性植株全部显示表达条带（图5B）。通过鉴定获得67株T0代转基因阳性植株，阳性率约78%。
【实施例4】转基因植株抗青枯病鉴定
对6叶期的野生型烟草植株、过量表达转基因烟草植株和RNAi转基因烟草植株的倒2、倒3功能叶进行接种处理，用一次性1 mL注射器沿叶脉注射烟草青枯菌菌液，进行抗性鉴定。每种处理组合设三个生物学重复。通过病情指数具体评价接种植株整体的抗病性。
接种20d后转基因植株NtRRS2-OE长势仍然正常，叶片接种部位出现明显的坏死斑，但茎部没有出现传染或仅少数出现轻度感染的现象，而对照组HD出现死亡的症状，转基因植株NtRRS2的抗性表现明显比野生型红花大金元强（图6A）。72株NtRRS2-OE转基因植株鉴定中，有21株完全没有发病，其他的显示不同程度的发病，其病情指数为21.53（图6B）。
在接种20d后转基因NtRRS2-RNAi植株叶片接种部位出现明显的坏死斑并传染叶柄，出现叶片枯死，部分植株死亡的现象，而对照组YY97仅叶片出现坏死斑而未向下传染，长势正常未出现死亡的症状，转基因NtRRS2-RNAi植株表现感病，但与对照组YY97的表型差异并不十分明显（图7A）。通过病情指数具体评价接种植株的整体抗病性，对67株NtRRS2-RNAi转基因植株鉴定中，有14株完全没有发病，其他的都有不同程度的发病，据烟草抗性鉴定病情分级标准对每株转基因植株进行病情分级，计算其病情指数为55.03（图7B）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> NtRRS2基因及其在烟草抗青枯病中的应用
<130> 22
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3259
<212> DNA
<213> NtRRS2全长cDNA序列
<400> 1
actataaaag acaagttttt ctcggaaccg atttttatat tatgttataa tatataatag 60
cacttcacta tagcagccaa aaaatatcgg aacaaacgag gctgttatag agatgtttga 120
ttgtattagg tttatgtata aatatttaat tgcgaaccag taactaagac atgtttaggt 180
tatttggcaa atttaaaact cataaacttc aaatctcggc tccgtctctt ctgagatcta 240
attgtttttg taaagcagtg gtagactgat agtttgttta atgtaatttt cagaggacga 300
agaaatggct tatgctgctc tgacttctgc tgtatgctca ctcgagctgt tcctgcaatg 360
caatcatcca ttactgaata atcttcagag gaaagaacag atcttatcac tatgcaaaag 420
aattttatct tttcaagagt tcttggcgga ttttgaaaag ctaatgcata agcatgaagg 480
gctaaaatta ttggaaggaa agatcaaaga gaaaacatat caagttgaag atattgttga 540
ctcaaagttg agaaaatatt ttttggccaa aaatgcaaag gaccgaaaaa aggcctactc 600
agttctatgt aggaggttac aggtagcaat tgaagaaatg gaattggtca aaaaagaagc 660
aatgacaatt aagggtgaca agattaggac aaggcttttt catacacgag tttcaccagc 720
taggagggat gtatcaacta gtagtccaaa tttgcaacaa caaacaccgg ttggtttcca 780
ggacgacttg gacaaaataa ttgataggct cagaggtgat tcttctgaac tagatattat 840
cactatagtc gggatggctg gtattggtaa aacaactctt gcaaaaagag catataacga 900
tccttctgtt gtttaccggt ttgatgttcg tgcttggacc actatttctc aagagtatag 960
agaaagagac acattacttg acctctttta ttcagttgtt cctccagcca gtggatccaa 1020
tcaagagagc gacaaagaag ctgctgatcg actgtatggt aggctaatga ctcaaccttc 1080
aaaagaaatg tacgaaggta gaaaccaaga aatggctgac cgattgtaca aaagtttaaa 1140
gggtaagaga tttctcattg tcgtcgatga catgtggagc actgatgctt gggacaatgt 1200
gagcatgttt cttcctaatg ataacaataa aagtcgtgtc atactaacaa gtaggctcat 1260
tgatgtcgca acttatgcta atcctaatcc aggtaggcaa cctcaccgac tgaattttct 1320
aaacaaagat gaaggttggg aactactccg tgagaaactt ttcgggaaaa gaggatgccc 1380
ttttgagttg gaagtgattg ggaaaagtat tgcagaaaaa tgccaaggac tacctctagc 1440
gattgttgtg gttgcagggc atctttccaa aatgagcaag actccggata gctggaacac 1500
tgttgctgaa agtgtgggct ccgtcgtaaa tcgtgagcca gggcagtgtt tagacatact 1560
tgctctaagt tacaactact tgcctcaaca tttaaaagcc tgcttcttgt acatgggagc 1620
atttcctgaa gattttgaga ttcccgtgtg gaagctaatt aggttgtggg ttgctgaggg 1680
cttccttaat gcaacaggac atacgaccat ggaagagata gtagaggatt gtttggagga 1740
tcttattgat agatgtttgg ttttagctgg aaagcggtct aatggaaaac tcaaaacatg 1800
taaagtccat gacatcatgc gagagttttg cttagaagaa gctagaagaa aaaactttct 1860
acatgtcttg aagagttccc ttgatgttct atcagaaagc ataacagctt tacgtcgggt 1920
tagtatcaat tgtagcacca tcttctcaag ttactctatt caaccgacgg attctactgt 1980
ttctgtttct cgttccatct tgggattcaa tatttcggaa agttcaattt tttcatacat 2040
agacttcaaa ttgctcaggg ttctagatat cactttccaa catttccctc agtttcccag 2100
tgagataatg caacttgtta atttgcgtta ccttgcagtt gccactggta gcgaattccc 2160
tccactagta tcacagtttt ggagtttgca gactttaata cttcatctgt attctagaag 2220
ctcaactttt ccttgggaga tttggacgat gccaaacctc agacatctcc atgttaaacc 2280
aagcatctgt ttgccgagtc caaccaaagt agaatgtaat agatacagtt cctgggttct 2340
aaataaccta caaacacttg tcaatattac ccttgcagat tgtacaaagg atgtcttctc 2400
aagcactcct aagttgaaga aattggggat atgtgaatcg atcgattgta cttacccagt 2460
ccaaattctc tggagtgatt ttctttacac atctgaaaaa ctgtggcctt attctagtga 2520
tacaatgtca gacttgtggt cagattgctt tagaaatctt gctctcctgc ctcaactcga 2580
ggcattaaag atttttgggt tgaaaccacc tgtacaagaa ccaaaattag ctcgtcatct 2640
tgatgcactt ccggagaatc ttaagaaatt gactttgagc ttcacttact tgccgtggga 2700
gagtatgatg tctctttgta gattgccaaa tcttgaggta ctcaaactaa aaaattatgc 2760
ctccacagga ccaaaatggg aacaagttga agaggggttc tgttctttaa aactgttgct 2820
aatcgagatg tccgacttag agcaatggag cgcctcaaat gatcattttc catgcctgga 2880
acatctagtt ctaaagggtt gccttcattt ggacagcatc cctcgcgatt tgggctttat 2940
tccaacatta cagataattg agttggataa ttcaagccaa tccgctgtgc tttcagctaa 3000
agagattcaa gaggagcagc agagttgtgg ttatgatgct ctacaagtgg gaatagagag 3060
aaattttggg agaatagttg ctgttgcaac tccttattcc accaggcaag tagagaaatg 3120
aatttactac acaagttttg attattgaac gttggaagta acaaaattag taattcctac 3180
tactagctat tttcatttgt taacaccaat aataacttat ttgcttgttt gacaaaaaaa 3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3259
<210> 2
<211> 938
<212> PRT
<213> 氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Tyr Ala Ala Leu Thr Ser Ala Val Cys Ser Leu Glu Leu Phe
1 5 10 15
Leu Gln Cys Asn His Pro Leu Leu Asn Asn Leu Gln Arg Lys Glu Gln
20 25 30
Ile Leu Ser Leu Cys Lys Arg Ile Leu Ser Phe Gln Glu Phe Leu Ala
35 40 45
Asp Phe Glu Lys Leu Met His Lys His Glu Gly Leu Lys Leu Leu Glu
50 55 60
Gly Lys Ile Lys Glu Lys Thr Tyr Gln Val Glu Asp Ile Val Asp Ser
65 70 75 80
Lys Leu Arg Lys Tyr Phe Leu Ala Lys Asn Ala Lys Asp Arg Lys Lys
85 90 95
Ala Tyr Ser Val Leu Cys Arg Arg Leu Gln Val Ala Ile Glu Glu Met
100 105 110
Glu Leu Val Lys Lys Glu Ala Met Thr Ile Lys Gly Asp Lys Ile Arg
115 120 125
Thr Arg Leu Phe His Thr Arg Val Ser Pro Ala Arg Arg Asp Val Ser
130 135 140
Thr Ser Ser Pro Asn Leu Gln Gln Gln Thr Pro Val Gly Phe Gln Asp
145 150 155 160
Asp Leu Asp Lys Ile Ile Asp Arg Leu Arg Gly Asp Ser Ser Glu Leu
165 170 175
Asp Ile Ile Thr Ile Val Gly Met Ala Gly Ile Gly Lys Thr Thr Leu
180 185 190
Ala Lys Arg Ala Tyr Asn Asp Pro Ser Val Val Tyr Arg Phe Asp Val
195 200 205
Arg Ala Trp Thr Thr Ile Ser Gln Glu Tyr Arg Glu Arg Asp Thr Leu
210 215 220
Leu Asp Leu Phe Tyr Ser Val Val Pro Pro Ala Ser Gly Ser Asn Gln
225 230 235 240
Glu Ser Asp Lys Glu Ala Ala Asp Arg Leu Tyr Gly Arg Leu Met Thr
245 250 255
Gln Pro Ser Lys Glu Met Tyr Glu Gly Arg Asn Gln Glu Met Ala Asp
260 265 270
Arg Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Lys Arg Phe Leu Ile Val Val Asp
275 280 285
Asp Met Trp Ser Thr Asp Ala Trp Asp Asn Val Ser Met Phe Leu Pro
290 295 300
Asn Asp Asn Asn Lys Ser Arg Val Ile Leu Thr Ser Arg Leu Ile Asp
305 310 315 320
Val Ala Thr Tyr Ala Asn Pro Asn Pro Gly Arg Gln Pro His Arg Leu
325 330 335
Asn Phe Leu Asn Lys Asp Glu Gly Trp Glu Leu Leu Arg Glu Lys Leu
340 345 350
Phe Gly Lys Arg Gly Cys Pro Phe Glu Leu Glu Val Ile Gly Lys Ser
355 360 365
Ile Ala Glu Lys Cys Gln Gly Leu Pro Leu Ala Ile Val Val Val Ala
370 375 380
Gly His Leu Ser Lys Met Ser Lys Thr Pro Asp Ser Trp Asn Thr Val
385 390 395 400
Ala Glu Ser Val Gly Ser Val Val Asn Arg Glu Pro Gly Gln Cys Leu
405 410 415
Asp Ile Leu Ala Leu Ser Tyr Asn Tyr Leu Pro Gln His Leu Lys Ala
420 425 430
Cys Phe Leu Tyr Met Gly Ala Phe Pro Glu Asp Phe Glu Ile Pro Val
435 440 445
Trp Lys Leu Ile Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe Leu Asn Ala Thr
450 455 460
Gly His Thr Thr Met Glu Glu Ile Val Glu Asp Cys Leu Glu Asp Leu
465 470 475 480
Ile Asp Arg Cys Leu Val Leu Ala Gly Lys Arg Ser Asn Gly Lys Leu
485 490 495
Lys Thr Cys Lys Val His Asp Ile Met Arg Glu Phe Cys Leu Glu Glu
500 505 510
Ala Arg Arg Lys Asn Phe Leu His Val Leu Lys Ser Ser Leu Asp Val
515 520 525
Leu Ser Glu Ser Ile Thr Ala Leu Arg Arg Val Ser Ile Asn Cys Ser
530 535 540
Thr Ile Phe Ser Ser Tyr Ser Ile Gln Pro Thr Asp Ser Thr Val Ser
545 550 555 560
Val Ser Arg Ser Ile Leu Gly Phe Asn Ile Ser Glu Ser Ser Ile Phe
565 570 575
Ser Tyr Ile Asp Phe Lys Leu Leu Arg Val Leu Asp Ile Thr Phe Gln
580 585 590
His Phe Pro Gln Phe Pro Ser Glu Ile Met Gln Leu Val Asn Leu Arg
595 600 605
Tyr Leu Ala Val Ala Thr Gly Ser Glu Phe Pro Pro Leu Val Ser Gln
610 615 620
Phe Trp Ser Leu Gln Thr Leu Ile Leu His Leu Tyr Ser Arg Ser Ser
625 630 635 640
Thr Phe Pro Trp Glu Ile Trp Thr Met Pro Asn Leu Arg His Leu His
645 650 655
Val Lys Pro Ser Ile Cys Leu Pro Ser Pro Thr Lys Val Glu Cys Asn
660 665 670
Arg Tyr Ser Ser Trp Val Leu Asn Asn Leu Gln Thr Leu Val Asn Ile
675 680 685
Thr Leu Ala Asp Cys Thr Lys Asp Val Phe Ser Ser Thr Pro Lys Leu
690 695 700
Lys Lys Leu Gly Ile Cys Glu Ser Ile Asp Cys Thr Tyr Pro Val Gln
705 710 715 720
Ile Leu Trp Ser Asp Phe Leu Tyr Thr Ser Glu Lys Leu Trp Pro Tyr
725 730 735
Ser Ser Asp Thr Met Ser Asp Leu Trp Ser Asp Cys Phe Arg Asn Leu
740 745 750
Ala Leu Leu Pro Gln Leu Glu Ala Leu Lys Ile Phe Gly Leu Lys Pro
755 760 765
Pro Val Gln Glu Pro Lys Leu Ala Arg His Leu Asp Ala Leu Pro Glu
770 775 780
Asn Leu Lys Lys Leu Thr Leu Ser Phe Thr Tyr Leu Pro Trp Glu Ser
785 790 795 800
Met Met Ser Leu Cys Arg Leu Pro Asn Leu Glu Val Leu Lys Leu Lys
805 810 815
Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Pro Lys Trp Glu Gln Val Glu Glu Gly Phe
820 825 830
Cys Ser Leu Lys Leu Leu Leu Ile Glu Met Ser Asp Leu Glu Gln Trp
835 840 845
Ser Ala Ser Asn Asp His Phe Pro Cys Leu Glu His Leu Val Leu Lys
850 855 860
Gly Cys Leu His Leu Asp Ser Ile Pro Arg Asp Leu Gly Phe Ile Pro
865 870 875 880
Thr Leu Gln Ile Ile Glu Leu Asp Asn Ser Ser Gln Ser Ala Val Leu
885 890 895
Ser Ala Lys Glu Ile Gln Glu Glu Gln Gln Ser Cys Gly Tyr Asp Ala
900 905 910
Leu Gln Val Gly Ile Glu Arg Asn Phe Gly Arg Ile Val Ala Val Ala
915 920 925
Thr Pro Tyr Ser Thr Arg Gln Val Glu Lys
930 935
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgctaatcg agatgtccga cttag 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctcaacttt gagtcaacaa tatcttc 27
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gattctgtgg ataaccgtat taccgcctta cgcgtgtaaa acgac 45
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
accaggatct cctagggaaa cagctatgac catgttcac 39
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggcttatg ctgctctgac ttctgctg 28
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcatttctct acttgcctgg tggaataag 29
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccatggct tatgctgctc 50
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcatttctct acttgcctg 49
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
attactcgag cttcatttgg acagcatc 28
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
attaccatgg gtcaaacaag caaataagt 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
accttaatta acttcatttg gacagcatc 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
attaggatcc gtcaaacaag caaataagt 29
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgatgtgata tctccactga cgtaag 26
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caagatgacg agctaatttt ggttcttg 28
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgaaaccacc tgtacaagaa cc 22
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tctctacttg cctggtgg 18
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agatggattg cacgcaggtt ctc 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
atcgggagcg gcgataccgt a 21
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
attactcgag cttcatttgg acagcatc 28
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
attaccatgg gtcaaacaag caaataagt 29

Claims (6)

1.烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.由权利要求1所述烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2所编码的蛋白，其特征在于：其所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2的超量表达载体，所述超量表达载体的构建方法在于：采用Gateway技术，通过引物对NtRRS2-OE-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGCTTATGCTGCTC-3’和NtRRS2-OE-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTTCTCTACTTGCCTG-3’扩增获得不包括终止密码的NtRRS2基因的cDNA编码区片段，经BP反应将该目的片段连接到入门载体pDONR207中，再通过LR反应将该片段从入门载体pDONR207中转移到过表达载体pEarleyGate 205中，构建如图3A所示的p35S::NtRRS2-TAP过量表达载体。
4.权利要求1所述烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2的RNAi干扰载体，所述RNAi干扰载体的构建方法在于：采用酶切连接法，通过正向插入的引物对NtRRS2-RNAi-XhoI-F：5’-ATTACTCGAGCTTCATTTGGACAGCATC-3’ NtRRS2-RNAi-NcoI-R：5’-ATTACCATGGGTCAAACAAGCAAATAAGT-3’和反向插入的引物对NtRRS2-RNAi-PacI-F：5’-ACCTTAATTAACTTCATTTGGACAGCATC-3’和NtRRS2-RNAi-BamHI-R：5’-ATTAGGATCCGTCAAACAAGCAAATAAGT-3’，分别从岩烟97叶片cDNA模板中扩增得到NtRRS2基因的正反向插入片段，将其插入到酶切后的RNAi表达载体pGSA2285中，构建如图3B所示的 NtRRS2-RNAi表达载体。
5.权利要求1所述的烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2或权利要求2所述的蛋白在烟草抗青枯病中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：（1）构建含有权利要求1所述的烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS2的植物表达载体；（2）将所构建的植物表达载体转到烟草中；（3）培育筛选抗青枯病的转基因烟草新品种。
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