CN111394363B

CN111394363B - 玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因、表达载体和应用

Info

Publication number: CN111394363B
Application number: CN202010201336.XA
Authority: CN
Inventors: 曹丽茹; 鲁晓民; 张前进; 郭书磊; 张新; 王振华; 魏昕; 魏良明
Original assignee: Institute Of Grain Crop Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Grain Crop Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: CN111394363A

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，涉及玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因、表达载体和应用。本申请以旱胁迫敏感性状为切入点，通过经典图位克隆技术获得的木聚糖合成关键基因ZmGXM1，利用具有特色的突变体和野生型材料及较新颖的分子生物学技术，解析木聚糖合成关键基因通过调节细胞壁形态来调控抗旱能力的作用机制，为研究木聚糖合成相关的基因、细胞壁的形成机制以及抗旱育种提供了新方向和研究材料。

Description

玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因、表达载体和应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，涉及玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因、表达载体和应用。

背景技术

在双子叶植物中(以拟南芥为例)，木聚糖合成途径中的关键基因研究的相对明确，但木聚糖侧链的合成及甲基化还未了解清楚。在玉米中，木聚糖合成的相关基因大部分与双子叶植物同源，但合成机制和基因的功能还存在很大得差别，尤其是木聚糖合成后侧链的甲基化相关基因还未被发现，更不清楚其在木聚糖合成中的作用机理。在玉米育种中，提高玉米的抗旱性是实现玉米高产稳产的重要手段。细胞壁合成相关基因在植物抗旱过程中起着关键作用，而木聚糖是细胞壁的重要组成部分，木聚糖合成相关的基因还有很多基因并未发掘，且通过调节细胞壁形态来调控抗旱的作用机制尚不十分清楚。

发明内容

本发明提出玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因、表达载体和应用，本申请以旱胁迫敏感性状为切入点，通过经典图位克隆技术获得的木聚糖合成关键基因ZmGXM1，利用具有特色的突变体和野生型材料及较新颖的分子生物学技术，解析木聚糖合成关键基因通过调节细胞壁形态来调控抗旱能力的作用机制，为研究木聚糖合成相关的基因、细胞壁的形成机制以及抗旱育种提供了新方向和研究材料。

本发明的技术方案是这样实现的：

玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因，所述关键基因为ZmGXM1，核苷酸序列如SEQID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述的玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因的扩增引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物序列如SEQ ID No.2所示、反向引物序列如SEQ ID No.3所示。

包含上述的玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因的表达载体。

包含上述的关键基因或上述的表达载体的玉米植株。

上述的关键基因或上述的表达载体在调节植物气孔状态中的应用。

上述的关键基因或上述的表达载体在调控植物次生细胞壁形成中的作用。

上述的关键基因或上述的表达载体在调控植物细胞壁的降解和修饰过程中的应用。

上述的关键基因或上述的表达载体在培育抗旱、抗倒伏(因为该基因与细胞壁相关，细胞壁跟抗倒伏密切相关)新品种中的应用。

本发明具有以下有益效果：

在双子叶植物中(以拟南芥为例)，木聚糖合成途径中的关键基因研究的相对明确，在玉米中，木聚糖合成的相关基因大部分与双子叶植物同源，但合成机制和基因的功能还存在很大得差别，尤其是木聚糖合成后侧链的甲基化相关基因还未被发现，更不清楚其在木聚糖合成相关基因在旱胁迫应答中的作用。本研究利用图位克隆技术获得与木聚糖侧联甲基化的关键基因ZmGXM1，在此基础上，验证了ZmGXM1基因在干旱胁迫过程中的抗旱性，为提高玉米的抗旱性是实现玉米稳产、降低生产风险的重要途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为wi6突变体的表型图。

图2为野生型与突变型气孔的扫描电镜图，A表示气孔处于张开状态；B表示气孔处于半关闭状态；C表示气孔处于关闭状态。

图3为野生型与突变型细胞壁光学显微镜及透射电镜观察图。

图4为野生型和突变型台盼蓝染色和DAB(甲基紫菁)显微镜观察图。

图5为wi6基因的初步定位。

图6为wi6基因的精细定位。

图7为细胞壁可溶性单糖的测定及糖代谢合成路径图。

图8为胡萝卜素及ABA合成路径。

图9为ZmGXM1组织特异性表达图。

图10为ZmGXM1在不同节间茎中的表达图。

图11为zmGXM1基因的进化树分析图。

图12为ZmGXM1基因PCR产物电泳图。

图13为ZmGXM1连接克隆载体的菌体PCR检测图，其中1泳道为空白对照(ddH2O为模板)，2泳道为阴性对照(其他基因的菌斑为模板)，3～9泳道为菌体PCR产物，M为marker5000。

图14为ZmGXM1连接过表达载体的双酶切检测验证图。

图15为农杆菌阳性克隆检测图。

图16为ZmGXM1过量表达拟南芥株系的PCR检测图。

图17为ZmGXM1过量表达拟南芥株系的表达情况图。

图18为ZmGXM1基因的抗旱性验证图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

包含上述的玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因的表达载体。

包含上述的关键基因或权利要求3所述的表达载体的玉米植株。

上述的关键基因或上述的表达载体在培育、抗倒伏(因为该基因与细胞壁相关，细胞壁跟抗倒伏密切相关)新品种中的应用。

下面结合具体实施例对本申请的实验进行进一步的解释说明：

实施例

1、wi6突变体的发现及表型鉴定

本课题组前期将含有MU转座子的自交系与综31杂交，在F2分离世代中，发现一类在正常条件或干旱胁迫下，5叶期的玉米植株均表现出萎蔫症状，随着生长发育，表型越来越明显，主要在新叶上表现尤为突出，成熟叶片症状轻微或正常，命名为wi6突变体；与野生型相比，突变体表现为植株矮小、新叶萎蔫卷曲、叶色退绿，叶片失水严重时，从叶尖开始逐渐枯死(图1)。该突变体可能受温度的影响，在高温(中午)条件下，即使水分充足，wi6也会表现出萎蔫性状，在阴雨天、早上或傍晚，突变体萎蔫症状有所减轻。

2、生理指标鉴定

胁迫下对wi6与野生型各生理生化指标进行测定，结果发现：与野生型相比，wi6叶片中的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量均显著的降低，降低幅度约50％(表1)；净光合速率(Pn)、气孔导度(Cond)、胞间二氧化碳浓度(Ci)及蒸腾速率(Tromml)都明显低于野生型，且达到差异显著或极显著水平(表2)；叶片相对含水量、渗透势显著降低，脯氨酸、POD、SOD等含量显著上升(表3)。

表1wi6与野生型色素含量测定

表2wi6与野生型光合相关指标测定

数据代表5个样品的平均值±SE,**代表突变体数据与野生型数据差异极显著(P<0.01)Pn：净光合速率Cond：气孔导度Ci：胞间二氧化碳浓度Tromml：蒸腾速率Fv/Fm:叶绿素荧光

表3wi6与野生型生理相关指标测定

3、细胞形态鉴定

旱胁迫下，扫描电镜图2发现突变型叶片中大部分气孔处于半关闭或关闭状态；光学显微镜及透射电镜观察野生型和突变体细胞壁的结构(图3)，发现突变体表皮下方厚壁细胞及维管束鞘厚壁细胞的染色明显较野生型浅，两个区域的厚壁细胞的细胞壁明显比野生型的要薄且细胞壁结构比野生型薄；图4中台盼蓝染色和DAB(甲基紫菁)染色发现在突变体叶片当中死亡细胞和H₂O₂(过氧化氢)积累量增多。以上说明了突变体与野生型细胞学结构上的差异可能是导致细胞壁表型不同产生的原因，细胞壁不仅对植物的生长发育是必需的，而且在植物抗逆、病虫害防御和环境胁迫应答方面起着至关重要的作用。

4、定位候选基因

4.1wi6基因的遗传分析

将wi6与综31、B73自交系组配F1，并构建F2、BC1分离群体，wi6、综31、B73及组配的F1各种植4行，发现除wi6表现出萎蔫性状外，其余植株均表现正常；对BC1和F2分离群体进行小群体种植，群体大小在300株左右，在表型表现比较明显的时候对分离群体中的正常植株与萎蔫植株进行调查，结果显示F2中正常植株与萎蔫植株比例接近3:1，BC1中正常植株与萎蔫植株比例接近1:1：(见表4)，后代分离比例符合孟德尔分离规律，说明该性状受单隐性核基因控制。

表4wi6基因的遗传分析

4.2wi6基因的图位克隆

以wi6和野生型为材料构建BC1作图群体，采用分池法构建正常池和突变池，利用覆盖玉米全基因组的800多对SSR引物对wi6、综31、正常池和突变池进行多态性分析，在第二条染色体上筛选出4个与目标基因紧密连锁的多态性标记，群体多态性筛选结果发现4个标记在目的基因的一侧，且向端粒走向，距离端粒约1.2Mb(图5)；在SSR28与端粒之间的序列上开发新的多态性标记，同时扩大作图群体至6000多株，并根据交换单株的数目将候选基因定位到SSR15与端粒之间，物理距离大约180kb(图6)。

5、候选基因的确定

5.1定位区间候选基因分析

MaizeGDB数据库中搜索精细定位区段180kb序列，发现位于该区段有2个单拷贝基因基因登录号分别为GRMZM2G074530、GRMZM2G172529，其中GRMZM2G074530的转录水平在突变体和野生型中没有差异，但是GRMZM2G172529在二者中表达差异达到显著水平。GRMZM2G172529是一个葡糖醛酸4-O-甲基转移酶，编码区为870bp，编码289个氨基酸，与拟南芥AtGXM1基因高度同源，该基因能够催化葡糖醛酸和甲基化葡糖醛酸在木聚糖支链的甲基化，木聚糖在植物次生细胞壁的形成过程中起着重要的作用，参与细胞壁的降解和修饰过程，因此我们初步将该基因作为候选基因序列如SEQ ID No.1所示，并命名为ZmGXM1。

5.2转录组分析突变体和野生型

对转录组测序分析，发现ZmGXM1基因在野生型中高表达，但在突变体材料中几乎不表达。进一步分析发现大量差异显著基因参与了细胞壁合成，进一步对糖代谢路径上的差异基因分析，发现这些基因通过不同程度的上调(红色)和下调(绿色)，影响多种单糖的合成与代谢，这与我们高效液相色谱对单糖含量测定的结果一致，结合扫描电镜观察的细胞壁形态结果，说明该候选基因的突变导致细胞壁内单糖含量发生变化，改变了细胞壁结构的稳定性，最终影响的水分运输，产生萎蔫表型(见图7)。

分析突变体和野生型差异基因发现，多个差异基因富集在胡萝卜素及ABA合成路径上，推测当遭遇水分胁迫时，突变体很快接收到胁迫信号，加速胡萝卜素合成途径，增加ABA的含量，当ABA含量增加时，ABA受体PYR/PYL接收胁迫信号，二者相互结合形成复合体，然后PYR/PYL与PP2C相互结合，形成三元复合体，且PYR/PYL抑制PP2C磷酸酶活性，同时被抑制的PP2C激活了SnRK2蛋白的磷酸化活性，PP2C-SnRK2复合体解离，之后SnRK2蛋白磷酸化激活了ABA响应基因ABF转录因子，最终诱导ABA响应基因表达，导致气孔关闭，以此来减少水分蒸发(见图8)，再次验证了扫描电镜观察的气孔形态的可靠性。

5.3ZmGXM1组织特异性表达模式

组织性特异表达显示该基因是一个组成型表达的基因，在玉米的根、茎、叶等组织中均有表达，但在茎中表达量比较高(图9)；另外发现该基因随着玉米的生长发育，其在茎中的表达量逐渐上升，尤其是在幼茎中表达量最高(图10)，wi6突变体萎蔫表型也是新叶表现最为明显，从侧面也说明了ZmGXM1的表达量对玉米幼茎发育至关重要。

5.4ZmGXM1基因的进化树分析

不同物种的GXM1氨基酸，通过同源性比对，发现不同物种的GXM1基因在进化上高度保守，玉米GXM1与高等植物(高粱、谷子、大麦、二穗短柄草、水稻、杨树、大豆、拟南芥、白菜)在序列上相似度比较高，相似性分别为88％、81％、74％、73％、68％、41％、40％、40％、39％(见图11)；不同物种的氨基酸序列分析表明，该基因在进化上比较保守，玉米中的该基因与甜高粱、谷子、大麦、二穗短柄草、水稻、杨树、大豆、拟南芥、白菜具有高度的同源性，但明显分为2个亚群，单子叶植物(玉米，高粱，谷子，水稻，二穗短柄草)和双子叶植物(杨树、大豆、拟南芥、白菜)。

6、过表达ZmGXM1基因的拟南芥抗旱性分析

6.1ZmGXM1基因过表达载体的构建

6.1.1ZmGXM1基因的扩增

反转录提取的玉米总RNA得到cDNA，以cDNA为模块，ZmGXM1-F-AscI(ForwardPrimer):AGGCGCGCCATGCACCTGAGCGGCGG和ZmGXM1-R-BamHI(Reverse Primer):CGGGATCCCTACAAGATGTGGACGG特异序列为引物，选择TaKaRa高保真酶(TAKARA,中国,大连)进行基因ORF扩增。扩增程序为:95℃预变性5min，95℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸2min,第三个步骤循环35次，最后72℃延伸10min，扩增体系如表5：

表5ZmGXM1基因克隆的扩增体系

所得的PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，有单一且条带大小与目的基因一致片段图12。

6.1.2ZmGXM1基因阳性克隆的鉴定

参照生工生物公司胶回收试剂盒说明书将ZmGXM1的PCR产物的进行回收，然后将产物连接到TaKaRa的T载体，采用PCR扩增法挑选阳性单克隆如图13，将条带正确的菌液送深圳华大有限公司进行测序。

6.1.3ZmGXM1基因与过表达载体连接

将测序正确的阳性单克隆质粒和目的载体(pFGC5941)用相同的两种酶(AscI和BamHI)进行双酶切，使目的基因和载体产生相同的粘性末端，使用T4连接酶16℃过夜连接然后转化大肠杆菌DH5a，挑取的阳性克隆送公司测序，并且双酶切检测正确的质粒如图14。最终将目的基因(ZmGXM1)连接到目的载体(pFGC5941)上。

6.1.4PCR鉴定农杆菌阳性克隆

挑取YEB培养板上的单克隆斑点，进行PCR菌液检测，如图15。

7、拟南芥过表达转基因阳性植株的筛选

通过拟南芥花序侵染法将目的基因过表达转入拟南芥。T3代转基因拟南芥种在千分之一草甘膦的MS培养基上，一周后将绿色转移到土壤中，继续喷洒草甘膦。挑选生长健壮的株系提取DNA，以Bar引物(Bar-Forward:5'-AAACCCACGTCATGCCAGTT-3’和Bar-Reverse:5'-CATCGAGACAAGCACGGTCA-3’)进行PCR扩增，电泳检测显示空白(8)和阴性对照(9)均没有扩增出片段，1～7泳道的片段大小与扩增片段(405bp)大小一致(图16)，初步判断ZmGXM1已经转化到拟南芥中。

提取WT和检测带有Bar条带的拟南芥株系的RNA，反转录成cDNA，检测ZmGXM1基因的表达量，转基因株系中表达量高于WT，见图17。

8、ZmGXM1过量表达拟南芥抗旱性分析

对转基因阳性植株(Bar有正确条带且ZmOSCA2.4基因表达量远高于野生型拟南芥中ZmGXM1基因的表达量)和野生型拟南芥做土壤自然干旱胁迫处理，胁迫7时，发现野生型植株严重萎蔫，近乎死亡，而ZmGXM1过表达植株长势较好(图18)，说明ZmGXM1基因的过表达可以提高拟南芥的抗旱性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南省农业科学院粮食作物研究所

<120> 玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因、表达载体和应用

<141> 2020-03-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1525

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

aggagaggag aagtcaacac ctaccagcca gcagagacaa gagcacgggg gcagagacag 60

agagcaaagc aaccccctca ccaagatccg atccatccca tctacgcagc ggaggtctcg 120

catctcagag cgggcaaatt gccgaggaag acaagatcag gaggccagta gaacacctga 180

cccgagtagt aggacaggta gagcagatca agaaaaacgg ggaggagcag cttccagatg 240

cacctgagcg gcgggggccg gatgttgccg ccgaagcagc tgctgaccat cgtcatcatc 300

atcttctcca cgctctcctt catcaagctc cttctcctca ccagctcgtc gtcctcgtca 360

gcgggcttca cctcccgcag cagcccggcg tgggacgcag acggcggcgg taacgggacg 420

gctaggagcg cgctcgcctc caaggagctc gctctgctcc gctccgtcat cgccgcgcgg 480

gcgccgtgca ggctgctggt gttcggcctg tccccgcagc tcctcgccct cgccaagctc 540

aacttcggag ctggcgcggg ggccgccacc gccttcgtca cagacagcgc cgacgacgcg 600

gacgccgcgc gccgcgcgct cctctccgac cgcggggctg ggtccaccgc cgcggcggcc 660

gttcaccaga ccaggtaccg cgacgcggcg gcggaggcgt ggccgctgct gcggcgcgcg 720

cgggggagcc cggcgtgccg gcggcccacg gggacggtgc gcaagtccgg gtgcccgttg 780

gcgctcacat cgctgccgcg ggaggtgctc gacgcgcggt gggacgtggt cgtcgtcgac 840

ggacccagcg gggcggcgcc cgaggagccc ggccggatgg ggactatcta caccgccgcg 900

gcgctggcgc gcgccatggc tggcggcgag gcagtggacg tggcggtgca cgatgtggac 960

cggacggtgg agcggtggta tgcgtgggag tacctctgcg aggacaacct cgtcgccgca 1020

aagggccgcc tctggcactt ccggatcgcc gccggtgcgg ggccgacgga cgcgttctgc 1080

tccatcggcc ccgtccacat cttgtaggac tgctggacga gcaagggcaa gattccaaga 1140

tcaccggtgg cattgccatt tctttcccaa tcggggaatg gggatgaaat tgggtgatcc 1200

acatcttttg caaagctcat gccaagaaga aagaagatca agcaattttt gcttttagga 1260

aaaagattga gctgttcata gaattatcga taaatctgtt caaatctttt gctgaactag 1320

gcagtggaga ggagcatgtt caagaagagc ccttcttcta aacaactaca ctggtatttt 1380

ttttcatgca ctgcttgatt ttagaaagaa gaaaaaggta aaagaatgga atcacttgga 1440

gatacaggag gaagactaaa ttaaattcat gttgtagttc ttaatgctat gacattgttg 1500

taaaagaatc caatcatttg gagat 1525

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggcgcgcca tgcacctgag cggcgg 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggatccct acaagatgtg gacgg 25

<210> 4

<211> 289

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 4

Met His Leu Ser Gly Gly Gly Arg Met Leu Pro Pro Lys Gln Leu Leu

1 5 10 15

Thr Ile Val Ile Ile Ile Phe Ser Thr Leu Ser Phe Ile Lys Leu Leu

20 25 30

Leu Leu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Gly Phe Thr Ser Arg Ser

35 40 45

Ser Pro Ala Trp Asp Ala Asp Gly Gly Gly Asn Gly Thr Ala Arg Ser

50 55 60

Ala Leu Ala Ser Lys Glu Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ile Ala Ala

65 70 75 80

Arg Ala Pro Cys Arg Leu Leu Val Phe Gly Leu Ser Pro Gln Leu Leu

85 90 95

Ala Leu Ala Lys Leu Asn Phe Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Ala

100 105 110

Phe Val Thr Asp Ser Ala Asp Asp Ala Asp Ala Ala Arg Arg Ala Leu

115 120 125

Leu Ser Asp Arg Gly Ala Gly Ser Thr Ala Ala Ala Ala Val His Gln

130 135 140

Thr Arg Tyr Arg Asp Ala Ala Ala Glu Ala Trp Pro Leu Leu Arg Arg

145 150 155 160

Ala Arg Gly Ser Pro Ala Cys Arg Arg Pro Thr Gly Thr Val Arg Lys

165 170 175

Ser Gly Cys Pro Leu Ala Leu Thr Ser Leu Pro Arg Glu Val Leu Asp

180 185 190

Ala Arg Trp Asp Val Val Val Val Asp Gly Pro Ser Gly Ala Ala Pro

195 200 205

Glu Glu Pro Gly Arg Met Gly Thr Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Leu Ala

210 215 220

Arg Ala Met Ala Gly Gly Glu Ala Val Asp Val Ala Val His Asp Val

225 230 235 240

Asp Arg Thr Val Glu Arg Trp Tyr Ala Trp Glu Tyr Leu Cys Glu Asp

245 250 255

Asn Leu Val Ala Ala Lys Gly Arg Leu Trp His Phe Arg Ile Ala Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Pro Thr Asp Ala Phe Cys Ser Ile Gly Pro Val His Ile

275 280 285

Leu

289

Claims

1.利用玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因或包含该关键基因的表达载体培育抗旱、抗倒伏玉米植株的方法，所述关键基因为ZmGXM1，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因或包含该关键基因的表达载体在调节玉米气孔状态中的应用，所述关键基因为ZmGXM1，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因或包含该关键基因的表达载体在调控玉米次生细胞壁形成中的作用，所述关键基因为ZmGXM1，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因或包含该关键基因的表达载体在调控玉米细胞壁的降解和修饰过程中的应用，所述关键基因为ZmGXM1，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.玉米木聚糖侧链甲基化的关键基因或包含该关键基因的表达载体在培育抗旱、抗倒伏玉米新品种中的应用，所述关键基因为ZmGXM1，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。