CN115029355B

CN115029355B - 一种花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2及其应用

Info

Publication number: CN115029355B
Application number: CN202210675137.1A
Authority: CN
Inventors: 张冲; 刘露; 钟鑫; 高眉佳; 马敏; 杨欢; 陈华; 庄伟建
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN115029355A

Abstract

本发明公开了一种C2结构域蛋白编码基因AhSRC2及其应用。所述AhSRC2基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。构建原核表达载体pET32a‑AhSRC2，诱导表达纯化获得融合表达蛋白，通过Gateway系统构建GFP融合表达载体并对AhSRC2基因的表达进行亚细胞定位，同时基于Gateway系统构建CaMV 35S启动子驱动的植物表达载体农杆菌介导转化感青枯病品种红花大金元，通过对转基因植株进行分子检测和青枯菌接种鉴定，AhSRC2在烟草中过表达可显著提高转基因烟草对青枯病的抗性，表明AhSRC2可能参与了植物对青枯病的抗性反应，这对植物的抗青枯病基因工程育种应用有重要意义。

Description

一种花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2及其应用。

背景技术

花生是我国重要的油料和经济作物，其营养价值丰富。由青枯劳尔氏菌引起的青枯病是花生生产上的重要病害，该病害危害严重时常常会造成花生产量和品质的下降，给花生生产上带来了极大的经济损失。目前生产上主要通过农业防治和化学药剂的使用等策略来减轻该病的发生和蔓延，但是这种防治方法效率并不是很高并且会造成农药残留等问题，极大地威胁着食品安全以及人们的生命健康。因此，我们亟待寻找出一种绿色环保、行之有效的科学防治措施，抗病品种的培育是防治青枯病的根本技术手段，因此，抗病相关基因资源的挖掘和开发利用则是解决植物青枯病的重要手段之一。

SRC2是编码一个130个氨基酸的C2结构域的蛋白，该结构域定位于质膜上，参与钙依赖性蛋白的结合。最初是在大豆中发现类冷蛋白2(SRC2-1)是调控C2结构域的。带有C2结构域的蛋白是最大的钙离子结合蛋白质家族。在细胞内，Ca²⁺是一种重要的二级信使，它影响多种细胞反应、各种刺激，如病原菌的攻击，引起胞质Ca²⁺浓度的增加，这些浓度通过Ca²⁺结合蛋白与下游信号转导通路结合。目前的研究结果表明,带有C2结构域的蛋白质主要参与信号转导和细胞膜转运。Liu等人发现SGT1参与PcINF1/SRC2-1诱导的免疫反应；SGT1通过与SRC2-1互作在SRC2-1识别和结合PcINF1激发辣椒产生HR细胞坏死和防御反应中起作用；SRC2-1的C2结构域对于SRC2-1靶向质膜和PcINF1-SRC2-1相互作用至关重要，并且在PcINF1诱导的辣椒免疫中是必需的。Kim等人从辣椒cDAN文库中，克隆了CaSRC2-1，编码一种包含C2结构域的蛋白质，它与受冷2调节的大豆基因(SRC2)具有高度同源性。他们检测了CaSRC2-1在48小时内对非寄主病原菌的响应，发现CaSRC2-1基因可以比一般植物防御基因(如CaPR-1，是非寄主抗性的一个指标，介导系统获得性抗性以应对病原菌的攻击)更早地对非寄主病原菌感染作出反应。并且CaSRC2-1在丁香假单胞杆菌(P.syringae)中也有类似的诱导，表明CaSRC2-1可能在可见HR出现之前参与了非宿主抗性反应的机制。表明SRC2可能参与植物的抗病胁迫和免疫防御反应。

根据本课题组花生转录组数据显示AhSRC2基因表达在抗青枯病花生品种中受青枯菌诱导上调表达，其可能参与了花生的青枯病防御反应。构建植物表达载体通过农杆菌介导转化烟草表现对青枯病的抗性，推测AhSRC2基因可能参与花生对青枯菌的防御反应，为植物抗青枯病的基因工程育种提供基因资源。

发明内容

本发现的目的在于提供一种花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2及其在烟草抗青枯病基因工程中的应用，以期为植物抗青枯病基因工程提供基因资源。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一种花生C2结构域蛋白编码基因，命名为AhSRC2基因，该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的AhSRC2基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。花生AhSRC2基因能够显著提高烟草青枯病的抗性能力，这为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。

本发明的花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2主要通过转录组测序获得的在花生抗青枯病品种中受青枯菌诱导上调表达的基因中获得，本发明对其编码的CDS序列进行克隆，长度为963bp，如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种包含上述花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2的原核表达载体；所述原核表达载体的构建方法为：基于一步连接法构建原核表达载体pET32a-AhSRC2。

本发明还提供了一种包含所述花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2的亚细胞定位载体和植物表达载体；所述亚细胞定位和植物表达载体的构建方法为：基于Gateway系统通过BP反应构建入门载体pDONR207-AhSRC2，再经过LR反应构建CaMV 35S启动子驱动的亚细胞定位载体pEarleyGate103-AhSRC2和植物表达载体pK7WG2.0-AhSRC2。

最后，本发明提供了上述的花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2在烟草抗青枯病中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明通过花生转录组数据筛选获得一个C2结构域蛋白编码基因AhSRC2，经过PCR克隆获得编码该蛋白的cDNA序列，通过一步连接法构建原核表达载体pET32a-AhSRC2，并诱导表达纯化获得原核表达蛋白，通过基于Gateway系统的BP和LR反应构建CaMV 35S启动子驱动AhSRC2基因的亚细胞定位载体pEarleyGate103-AhSRC2和植物表达载体pK7WG2.0-AhSRC2，将其转化GV3101农杆菌，通过叶盘法将其导入红花大金元烟草上，对转基因烟草进行分子鉴定和青枯菌接种，结果证明该转基因烟草对青枯菌的侵染的抗性增强。表明AhSRC2基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值。

附图说明

图1：基于转录组数据的花生AhSRC2基因在抗、感花生品种接种后的表达差异。YY92-CK是抗青枯病花生品种粤油92接种水对照；YY92-RS是抗青枯病花生品种粤油92接种青枯菌处理样本；XHXL-CK是感青枯病花生品种新会小粒接种水对照；XHXL-RS是花生感青枯病品种新会小粒接种青枯菌处理样本。“**”代表显著性差异(p<0.01)。

图2：基于一步连接法构建花生AhSRC2基因的原核表达载体过程和诱导纯化蛋白。A.原核表达载体构建过程；B.由IPTG诱导大肠杆菌表达花生AhSRC2基因纯化蛋白，M是蛋白分子量Marker，泳道1是IPTG诱导前蛋白，泳道2是IPTG诱导后的纯化蛋白。

图3：基于Gateway系统的花生AhSRC2基因亚细胞定位和植物表达载体的构建过程示意图。

图4：花生AhSRC2基因编码蛋白的亚细胞定位结果。

图5：转花生AhSRC2基因不同烟草株系接种青枯菌增强对青枯菌侵染的抗性表型。HD是感青枯病烟草品种红花大金元；OE-16、OE-26和OE-39指花生AhSRC2基因过表达株系；YY97是抗青枯病烟草品种岩烟97；A.接种青枯菌后单株的抗性表型差异；B.接种青枯菌后植株根茎结合部位的表型；C.接种青枯菌后三个超表达株系群体的抗性表型差异。

具体实施方式

【实施例1】花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2的序列获得根据课题组栽培种花生基因组数据库(http://peanutgr.fafu.edu.cn/Transcriptome.php)中的转录组数据分析，获得一个在抗青枯病花生品种粤油92(YY92)受青枯菌诱导上调表达而在感青枯病花生品种新会小粒(XHXL)下调表达的含有C2结构域的AhSRC2蛋白的编码基因AhSRC2(图1)，AhSRC2基因的mRNA和蛋白序列在花生基因组数据库(http://peanutgr.fafu.edu.cn/Download.php)中下载获得，经生物信息学分析发现AhSRC2基因CDS序列长度为1398bp，编码465个氨基酸。

【实施例2】AhSRC2原核表达载体构建与蛋白表达

原核表达载体构建过程示意图如图2A所示，根据AhSRC2基因的ORF序列，设计特异性引物AhSRC2-BamHI-F和AhSRC2-SalI-R(AhSRC2-BamHI-F：5’-TGGCTGATATCGGATCCATGGAATACAGAACCCTAG-3’，AhSRC2-SalI-R：5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACAAAATCGAATCCACCAGCATC-3’)，以抗青枯病栽培种花生粤油92的cDNA为模板进行PCR扩增，采用诺唯赞公司高保真酶2×Max Master Mix进行扩增，PCR反应体系为：1μL的cDNA模板，25μL的2×Max Master Mix，正反向引物各2.5μL，补水到50μL。反应条件为：94℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，28个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化回收，将pET32a载体在多克隆位点分别用限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切，酶切条件为pET32a质粒20μL(4μg)，10×QuickCut Buffer 4μL，QuickCut^TMBamHI 4μL，QuickCut^TMSalI4μL，补水至40μL，于37℃酶切1.5h后于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化。采用诺唯赞生物有限公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit一步连接试剂盒，将目的基因片段和目的载体进行一步连接反应，反应体系为5×CE II Buffer 10μL，线性化pET32a表达载体100ng，AhSRC2基因回收产物50ng，/>II 4μL，补水至20μL，置于37℃反应30min，转化大肠杆菌验证阳性克隆并提取质粒DNA。将质粒通过热激法转化大肠杆菌表达菌株BL21中鉴定阳性，分别挑取含有重组质粒的大肠杆菌BL21单菌落至2mL新鲜的LB液体培养基(含100mg/mLAmp)中，37℃摇床，180rpm培养过夜，即为种子液。将过夜种子液按照1:100的体积比转接到100mL新鲜的LB液体培养基(含100mg/mLAmp)中，37℃摇床，220rpm培养。待菌液浓度达到OD₆₀₀为0.6～0.8时(约3h)，先吸取200μL菌液(未加入IPTG诱导的)出来至干净的离心管后(记为蛋白1)，再加入IPTG至终浓度为1mM，37℃摇床，180rpm培养4～6h。将大量诱导的菌液分装至50mL离心管，4℃，4000g离心10min，弃上清，加入40～50mL浓度为20mM的PBS缓冲液(pH 7.4)，进行超声收集，超声20s，间隔10s，反应30min，超声收集期间要保持低温，置于冰上操作。超声结束后收集至离心管，4℃，4000g离心10min，沉淀用PBS洗4-5次，以除去沉淀中的可溶性蛋白，4℃，4000g离心10min，不可溶蛋白即包涵体用5～10mL的6M尿素悬浮沉淀，经过半透膜透析后进一步获取可溶性的目的蛋白。取100μL沉淀，加入25μL 5×SDS Loading Buffer，95℃变性5min。SDS-PAGE电泳分析蛋白是否有表达，如图2B所示，SDS-PAGE电泳结果显示在蛋白大小为34kDa位置有明显的条带，说明AhSRC2通过原核表达体系获得了较为纯的融合蛋白。

【实施例3】AhSRC2植物表达载体构建与验证

根据AhSRC2全长基因CDS序列，设计特异性引物AhSRC2-attB1-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAATACAGAACCCTAC-3’)和AhSRC2-attB2-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGTTAAAAATCGAATCCACCAGCATC-3’)，以抗青枯病栽培种花生粤油92的cDNA为模板进行PCR扩增，采用TAKARA公司高保真酶MAX进行扩增，PCR反应体系为：1μL的cDNA模板，10μL的2×/>MAX mix，正反向引物各0.5μL，补水到20μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，25个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化回收，将目的基因片段与pDONR207空载连接进行BP反应：AhSRC2产物1μL，pDONR207空载1μL，BP酶0.25μL，25℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序，正确通读的克隆提取质粒，构建入门载体pDONR207-AhSRC2。将入门载体质粒分别于亚细胞定位载体pEarleyGate103和植物表达载体pK7WG2.0进行LR反应：pDONR207-AhSRC2质粒1μL，pEarleyGate103/pK7WG2.0空载1μL，LR酶0.25μL，25℃连接过夜，转化大肠杆菌，验证阳性克隆。其亚细胞定位和植物表达载体的构建过程示意图如图3所示。

【实施例4】AhSRC2基因编码蛋白的亚细胞定位

将实施例3构建好的含有pEarleyGate103-AhSRC2载体转化GV3101农杆菌，经PCR验证后挑取阳性克隆，在含有50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基(10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和5g/L氯化钠)中培养24小时，菌液离心后用MES缓冲液(10mM甲烷磺酸、pH5.7、10mM氯化镁和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体至OD₆₀₀＝1.0，并稀释至OD₆₀₀＝0.8。稀释后的培养液用注射器经农杆菌渗入法注射进入本氏烟草叶片。25℃，16h光照培养2-3d。用激光扫描共聚焦显微镜观察荧光在烟草下表皮细胞中的分布，结果表明，AhSRC2基因编码蛋白定位在细胞质膜上，如图4所示。

【实施例5】过表达AhSRC2转基因烟草接种青枯菌的表型分析将实施例4中植物表达载体转化农杆菌GV3101，通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化感青枯病烟草红花大金元，通过卡那霉素筛选和转基因分子鉴定获得纯合的转基因株系，通过半定量RT-PCR获得AhSRC2基因表达水平较高的3个转基因T₂株系。分别将3个T₂代转基因株系的种子以及野生型成熟种子经过消毒处理后，播种含有卡那霉素的MS培养上，15d后，移栽于育苗盘，一个月后选取大小一致的苗移栽于小花盆中培养9周接种使用。从-80℃冰箱取出保存的高致病力的青枯菌，在TTC培养基划线，28℃恒温培养箱倒置培养2d后挑取中央粉红色、边缘乳白色的单克隆，接种于100mL的SPA培养基中振荡培养24h，无菌水重悬菌液至OD₆₀₀为0.5左右备用。选取倒数二、三片功能叶作为接种叶，采用叶脉注射法对转基因烟草和野生型植株进行青枯菌接种处理，置于高温高湿条件下生长以便青枯菌发病，15d后观察发病情况，结果发现，野生型感病对照烟草品种红花大金元(HD)出现整株萎蔫甚至死亡，3个AhSRC2基因过表达烟草株系(OE-16,OE-26和OE-39)相对于HD都表现出对病原菌侵染的明显抗性，和抗病品种岩烟97(YY97)的抗性相当(图5)。相同试验至少重复三次以上，均有同一趋势结果，说明AhSRC2基因参与了植物对青枯病菌侵染的抗性作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修改，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种花生C2结构域蛋白编码基因AhSRC2及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 花生（Arachis hypogaea）

<400> 1

atggaataca gaaccctaga cctcatgatc gtttccgcca aggatctcaa gaatgtcaat 60

ttgatatcca agatggacgt atacgccgtc gtttcactca acggcgacat ctacaacccc 120

cagaagttta aaaccagcgt cgatcgcgac ggaggaacca gccctacgtg gaattttccg 180

atgaagttca atttcagcga ctccttggcg cagcagaatc gtctctctct tgagatcaag 240

atcgtctccg accgtacact tggcgacacc ctcatcggca ccgtccacgt ccccctccgg 300

gagcttctcg acaatcccgg cggaaaagac ggcaaagaat tccgtcaggt atcttaccag 360

gtcaggaagc cctccgggaa gcccaagggc tctctgaatt tctcgtacaa agttggcggc 420

aagagttcag ctgctccggc tatggataag gcgtcgtcga cgggggcgac ggttagttac 480

gctccaccgc cgccgaagac ggcggagtat cctccaccgg cgacggcgta ccctccgcca 540

tccaaggatt caaagaatga gccagttatg gcttatcctg ctcatgctgc tggggcggca 600

ggatcaagtt ccgcgccata tgcttacccg ccgccacatc agcaatatcc tgctggacac 660

ggatatccac ccgctggata cccaccccag caaggctatg gcggctatgg gtacccgcct 720

cagcaacccg gatatgggta tcctccacaa gggtacgggt atccgggtca agctgggtat 780

ggatactcgc agcctcctca aaaaccgaag aagaacaaga acaactttgg gatgggattg 840

ggagccgggt tgcttggcgg cgcacttggt gggcttttga ttggtgacat ggtgtctgac 900

gcggctgatt atgatgctgg ctacgatgct ggatttgatg atgctggtgg attcgatttt 960

taa 963

<210> 2

<211> 320

<212> PRT

<213> 花生（Arachis hypogaea）

<400> 2

Met Glu Tyr Arg Thr Leu Asp Leu Met Ile Val Ser Ala Lys Asp Leu

1 5 10 15

Lys Asn Val Asn Leu Ile Ser Lys Met Asp Val Tyr Ala Val Val Ser

20 25 30

Leu Asn Gly Asp Ile Tyr Asn Pro Gln Lys Phe Lys Thr Ser Val Asp

35 40 45

Arg Asp Gly Gly Thr Ser Pro Thr Trp Asn Phe Pro Met Lys Phe Asn

50 55 60

Phe Ser Asp Ser Leu Ala Gln Gln Asn Arg Leu Ser Leu Glu Ile Lys

65 70 75 80

Ile Val Ser Asp Arg Thr Leu Gly Asp Thr Leu Ile Gly Thr Val His

85 90 95

Val Pro Leu Arg Glu Leu Leu Asp Asn Pro Gly Gly Lys Asp Gly Lys

100 105 110

Glu Phe Arg Gln Val Ser Tyr Gln Val Arg Lys Pro Ser Gly Lys Pro

115 120 125

Lys Gly Ser Leu Asn Phe Ser Tyr Lys Val Gly Gly Lys Ser Ser Ala

130 135 140

Ala Pro Ala Met Asp Lys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Thr Val Ser Tyr

145 150 155 160

Ala Pro Pro Pro Pro Lys Thr Ala Glu Tyr Pro Pro Pro Ala Thr Ala

165 170 175

Tyr Pro Pro Pro Ser Lys Asp Ser Lys Asn Glu Pro Val Met Ala Tyr

180 185 190

Pro Ala His Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ala Pro Tyr Ala

195 200 205

Tyr Pro Pro Pro His Gln Gln Tyr Pro Ala Gly His Gly Tyr Pro Pro

210 215 220

Ala Gly Tyr Pro Pro Gln Gln Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Pro Pro

225 230 235 240

Gln Gln Pro Gly Tyr Gly Tyr Pro Pro Gln Gly Tyr Gly Tyr Pro Gly

245 250 255

Gln Ala Gly Tyr Gly Tyr Ser Gln Pro Pro Gln Lys Pro Lys Lys Asn

260 265 270

Lys Asn Asn Phe Gly Met Gly Leu Gly Ala Gly Leu Leu Gly Gly Ala

275 280 285

Leu Gly Gly Leu Leu Ile Gly Asp Met Val Ser Asp Ala Ala Asp Tyr

290 295 300

Asp Ala Gly Tyr Asp Ala Gly Phe Asp Asp Ala Gly Gly Phe Asp Phe

305 310 315 320

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggctgatat cggatccatg gaatacagaa ccctag 36

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcggccgca agcttgtcga caaaatcgaa tccaccagca tc 42

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggaatac agaaccctac 50

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctggtta aaaatcgaat ccaccagcat c 51

Claims

1.过表达花生C2结构域蛋白编码基因在烟草抗青枯病中的应用，其特征在于：所述的花生C2结构域蛋白编码基因为AhSRC2基因，所述的AhSRC2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述的AhSRC2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。