CN112662692A

CN112662692A - 一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN112662692A
Application number: CN202110192197.3A
Authority: CN
Inventors: 张冲; 陈玉婷; 楚盼盼; 陈华; 蔡铁城; 杨强; 熊发前; 庄伟建
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2021-02-20
Filing date: 2021-02-20
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明公开了一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A及其超量表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程中的应用。该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。通过Gateway系统构建CaMV 35S启动子驱动的过量表达载体农杆菌介导转化感青枯病品种红花大金元，通过对转基因植株进行分子检测和青枯菌接种鉴定，其在烟草中超量表达可显著提高转基因烟草对青枯病的抗性，表明AhRD21A可能参与了植物对青枯病的抗性反应，这对植物的抗青枯病基因工程育种应用有重要基因资源。

Description

一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A及其超量表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程中的应用。

背景技术

花生是我国重要的油料作物之一，营养价值丰富。由青枯劳尔氏菌引起的青枯病是花生生产上的重要病害，该病害危害严重时常常会造成花生产量和品质的下降，给花生生产上带来了极大的经济损失。目前生产上主要通过农业防治和化学药剂的使用等策略来减轻该病的发生和蔓延，但是这种防治方法效率并不是很高并且会造成农药残留等问题，极大地威胁着食品安全以及人们的生命健康。因此，我们亟待寻找出一种绿色环保、行之有效的科学防治措施，抗病品种的培育是防治青枯病的根本技术手段，而往往品种的抗性与产量呈负相关，也就意味着培育高产、高抗、优质的花生品种是花生生产上的一个巨大的难题。

蛋白酶是一种生物酵素酶，半胱氨酸蛋白酶是蛋白酶家族的重要成员之一，其在植物种子萌发、幼苗生长、器官衰老以及植物抗逆中有着重要作用。半胱氨酸蛋白酶可广泛参与植物各种生理过程，在植物抗病中起着重要的作用。AtRD21A通过与蛋白质二硫键异构酶5（PDI5）的相互作用参与了种子内皮细胞中的PCD，RD21A还显示出对灰葡萄孢菌感染的敏感性。4E02是甜菜孢囊线虫的效应子，它可介导RD21A蛋白酶从液泡到细胞核和细胞质的重新定位，阻止蛋白酶发挥防御功能。拟南芥木质部半胱氨酸蛋白酶XCP1和XCP2可参与木质部细胞的自溶，且研究表明感青枯病菌蛋白PRN2与XCP2、RD21A和RD21B体内体外均存在互作，与对照相比，PRN2和XCP2突变体青枯菌接种后显示出更强的抵抗力。半胱氨酸蛋白酶RD19可参与RRS1-PopP2介导的抗病反应，正常情况下RD19定位于液泡，当其识别了青枯菌效应子PopP2后可与其形成复合体并重新定位到细胞核，然后激活RRS1-R介导的抗病反应，RD19突变体植株更易受青枯菌的侵染，青枯菌可在突变株体内大量繁殖，RRS1-R介导的抗性也随之消失。大量研究已证明PLCP在病原菌防御过程中起着重要的作用。

前期的研究发现，花生NBS-LRR类抗病蛋白AhRRS5参与了植物青枯病抗性信号转导，通过酵母双杂交筛选AhRRS5在花生中的互作蛋白，可以为深入研究AhRRS5的抗青枯病分子机理提供理论基础。通过双分子荧光互补实验确定了一个由半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A编码的蛋白酶与AhRRS5在植物中存在相互作用。AhRD21A基因受青枯菌侵染的的诱导上调表达，构建过量表达载体通过农杆菌介导转化烟草表现对青枯病的抗性，推测AhRD21A基因可能参与花生对青枯菌的防御反应，为植物抗青枯病的基因工程育种提供基因资源。

发明内容

本发现提供了一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A及其超量表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程，将为植物抗青枯病基因工程的提供基因资源。

本发明提供了一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因，命名为AhRD21A基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的AhRD21A基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。花生AhRD21A基因能够显著提高烟草青枯病的抗性能力，这为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。

本发明的花生半胱氨酸蛋白酶AhRD21A蛋白主要通过酵母双杂交筛选花生抗青枯病NBS-LRR类蛋白AhRRS5的互作蛋白获得，并通过双分子荧光互补实验验证，并对其编码的CDS序列进行克隆，长度为1398 bp，如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了包含所述花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A的超量表达载体；以及，所述超量表达载体的构建方法：基于Gateway系统通过BP反应构建入门载体pDONR207-AhRD21A，再经过LR反应构建CaMV 35S启动子驱动的植物表达载体pK7WG2.0-AhRD21A。

最后，本发明提供了所述的花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A或所述的超量表达载体在烟草等植物抗青枯病基因工程中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明是通过酵母双杂交筛选获得花生抗青枯病NBS-LRR类AhRRS5蛋白的互作蛋白，经过PCR克隆获得编码该蛋白的从DNA序列，该基因受青枯菌诱导表达，通过基于Gateway系统的BP和LR反应构建CaMV 35S启动子驱动AhRD21A基因植物表达载体pK7WG2.0-AhRD21A，将其转化GV3101农杆菌，通过叶盘法将其导入红花大金元烟草上，对转基因烟草进行分子鉴定和青枯菌接种，结果证明该转基因烟草对青枯菌的侵染的抗性增强。表明该基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值。

附图说明

图1为验证AhRD21A和AhRRS5相互作用，其中A为酵母双杂交检测AhRD21A和AhRRS5存在相互作用；B为双分子荧光互补实验检测AhRD21A和AhRRS5在植物体内相互作用。

图2为基于Gateway系统的花生AhRD21A超量表达载体的构建过程；

图3为花生AhRD21A在抗、感青枯病花生品种中的表达差异；*，**分别表明两两均值差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）。

图4为花生AhRD21A超量表达（AhRD21A-OE）转基因烟草中增强对青枯菌侵染的抗性。

具体实施方式

【实施例1】AhRD21A和AhRRS5相互作用验证

以抗青枯病栽培种花生粤油92的cDNA作为模板，分别将扩增得到的AhRD21A和AhRRS5（ CN104480117A）全长CDS序列连入pGADT7 (AD)和pGBKT7 (BD)载体中，共同转化酵母菌株Y2H Gold中，并用pGADT7-T和pGBKT7-p53作为阳性对照，pGADT7-T和pGBKT7-LAM作为阴性对照，在二缺培养基SD-Trp/-Leu培养获得转化阳性转化子，采用梯度稀释法点将阳性克隆子点在四缺培养基SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA上进行生长，5天后，转化的阳性克隆在10^-1、10^-2、10^-3不同稀释倍数下都能正常生长且为蓝色，阳性对照同样是蓝色克隆，阴性对照不生长，说明AhRD21A和AhRRS5存在相互作用（图1 A）。

通过Gateway系统分别将AhRD21A 和AhRRS5的PCR产物与pDONR207空载连接进行BP反应，经转化和测序获得入门载体，正确通读的克隆提取质粒，再分别将入门载体质粒和BiFC表达载体进行LR反应，分别构建BiFC-cYFP-AhRRS5、BiFC-nYFP-AhRRS5、BiFC-cYFP-AhRD21A、BiFC-nYFP-AhRD21A载体，并转化农杆菌GV3101，将携带有相应载体（BiFC-nYFP-AhRD21A和BiFC-cYFP-AhRRS5、BiFC-nYFP-AhRRS5和BiFC-cYFP-AhRD21A）的农杆菌共注射转化烟草，22℃光照培养48小时，用荧光共聚焦显微镜在520-550 nm的发射波长和514 nm的激发波长观察， BiFC-cYFP-AhRD21A+BiFC-nYFP-AhRRS5组合和BiFC-cYFP-AhRRS5+BiFC-nYFP-AhRD21A主要在细胞核检测到黄色荧光，而与空载的组合未检测到荧光，充分说明了两个蛋白的结合在植物中是存在的（图1B）。

【实施例2】AhRD21A超量表达载体构建与验证

根据AhRD21A全长基因CDS序列，设计特异性引物

AhRD21A-attB1-F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTTCATCCTTCACCATCC；

AhRD21A-attB2-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCACTGCTCACACCATTGAAG。

以抗青枯病栽培种花生粤油92的cDNA为模板进行PCR扩增，采用TAKARA公司高保真酶PrimeSTAR^®MAX进行扩增，PCR反应体系：1 µL的cDNA为模板，10 µL的 2×PrimeSTAR^®MAX mix，正反引物各0.5 µL，补水到20 µL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃ 30 s， 55℃30 s，72℃ 3 min，25个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化回收，将目的基因片段与pDONR207空载连接进行BP反应：AhRD21A产物1 μL，pDONR207空载1 μL，BP酶0.25 μL，25℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序，正确通读的克隆提取质粒，构建入门载体pDONR207-AhRD21A。将入门载体质粒和超量表达载体pK7WG2.0进行LR反应：pDONR207-AhRD21A质粒1 μL，pK7WG2.0空载1 μL，LR酶0.25 μL，25℃连接过夜，转化大肠杆菌，验证阳性克隆。其超量表达载体的构建过程示意图如图2所示。

【实施例3】AhRD21A在抗、感青枯病花生品种青枯菌侵染后的表达模式分析

为了分析AhRD21A基因在抗、感青枯病花生品种响应青枯菌侵染的表达差异，本研究采取实时荧光定量PCR方法对抗、感青枯病花生材料粤油92(YY 92）和新会小粒(XHXL)剪叶法接种青枯菌处理后，在不同时间点分析该基因的表达情况。设计该基因的荧光定量PCR引物（AhRD21A-qPCR-F：CTAAGGTTGTGAACATTGATGA，AhRD21A-qPCR-R：CACATCTTCCTGTGAATACACCA），采用CTAB法提取青枯菌侵染前后花生叶片的总RNA，根据PrimeScript™ Reverse Transcriptase逆转录酶（购自TAKARA公司）说明书将1 µg的总RNA进行逆转录合成单链cDNA，将单链cDNA稀释10倍，2 µL为模板，以Ahactin为内参基因（Ahactin-F:GAGGAGAAGCAGAAGCAAGTTG, Ahactin-R: AGACAGCATATCGGCACTCATC），采用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行定量PCR反应，按照TAKARA公司SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒方案操作，20 µL的反应体系包括10 µL 2×SYBR Premix Ex-Taq buffer，正反引物各0.5 µL，补水到20 µL。qRT-PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃ 15s， 60℃ 15 s，72℃30s，40个循环。相对表达量采用2^-△△Ct(Livak)法计算。其中△△Ct= (CT_gene - CT_actin)_处理 -(CT_gene - CT_actin)_对照。结果显示在抗病品种粤油92（YY92）上，该基因表达表现表达量在3 h内迅速增加到7.2倍，而后继续大幅上升，在12 h出现了表达高峰14倍，随后表达开始下降，48 h后表达开始趋于平缓， 120 h后表达量又开始有小幅度的上升。在感病品种中，该基因在接种3 h后开始上调表达，并在6 h达到最大至4.4倍，然后开始下调，与对照相比，接种72h后基因的表达量下调至最低仅为对照的0.49倍，而后开始回升至没有差异的水平，这表明该基因在抗感品种受青枯菌的侵染表达差异明显，尤其在抗病品种中上调显著，预测该基因可能与花生响应青枯菌侵染的抗性相关（图3）。

【实施例4】超量表达AhRD21A转基因烟草接种烟草青枯菌的表型分析

将实施例2中超标表达载体转化农杆菌GV3101，通过根癌农杆菌介导的叶盘法（Rizhsky， et al. 2002）转化感青枯病烟草红花大金元，通过卡那霉素筛选和转基因分子鉴定获得纯合的转基因株系，通过半定量RT-PCR获得提高AhRD21A基因表达水平的转基因T2株系。将T2代转基因株系的种子以及野生型成熟种子经过消毒处理后，播种含有卡那霉素的MS培养上，15 d后，移栽于育苗盘，一个月后选取大小一致的苗移栽于小花盆中培养9周接种使用。从-80℃冰箱取出保存的高致病力的青枯菌，在TTC培养基划线，28℃恒温培养箱倒置培养2 d后挑取中央粉红色、边缘乳白色的单克隆，接种于100 mL的SPA培养基中振荡培养24 h，无菌水重悬菌液至OD₆₀₀为0.5左右备用。选取倒数二、三片功能叶作为接种叶，采用叶脉注射法对转基因烟草和野生型植株进行青枯菌接种处理，置于28℃，湿度大于70%的温室条件下生长以便青枯菌发病，15 d后观察发病情况，AhRD21A基因超量表达烟草植株相对于野生型对照表现出对病原菌侵染的明显抗性，野生型烟草出现整株萎蔫甚至死亡(图4)。相同试验至少重复三次以上，均有同一趋势结果，说明AhRD21A基因参与了植物对青枯病菌侵染的抗性作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修改，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A及其表达载体和应用

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcttcat cctacaccat cctcctcttc ttcttcactc tcttcactct ttcatatgca 60

tcagacatgt ccataatctc gtacgacaaa acccactcca acacatggag aaccgatgag 120

gaagtcatgg ctatgtacga ggaatggctt gtgaagcatg gaaagaaatc aagtaacggt 180

ctcttaagtg gcgagagcaa gaatcggttc gagatcttta aggataacct ccggttcatt 240

gatgaacaga acagtttacc gaaccggact ttccagctcg gtctgaaccg gttcgccgat 300

ctgaccaacg aggagtacag ggctaagtat ttgggtacca ggatggatcc taaccgtcgg 360

atgatgaagg ctaagaccag gagcaaccga tacgcgccac gtgtcgggga caagttgccg 420

gagagtgttg attggaggaa ggaaggtgct gttgttgcag tcaaagacca aggaggatgt 480

gggagttgtt gggcattctc aacaattgct gcagtggaag gaataaacaa gatcgtaaca 540

ggggatctga tttcattatc agagcaagag cttgtggact gtgatacatc atacaacgaa 600

gggtgtagtg gtggactcat ggactatgcc tttgagttca tcatcaacaa tggtggcatt 660

gactctgaag ccgattaccc ttacactggc tttgatggca catgtgacca aaacaggaaa 720

aatgctaagg ttgtgaacat tgatgactat gaagatgttc ctgcctatga tgaattggca 780

ttgaaaaagg ccgttgcgaa tcagccagtg gcagttgcca ttgaaggagg tggcagggaa 840

ttccagttat atgtatctgg tgtattcaca ggaagatgtg gaacagcatt ggaccatgga 900

gttgctgctg tagggtatgg gacagaaggt gggcatgagt attggattgt gaggaactca 960

tggggagcta gctggggaga ggacggttac atccgaatgg agcggaatct tggtaacagc 1020

agagcaggca agtgtggaat cgccatcgag ccttcttacc ctattaagaa tggccccaat 1080

cctcctaacc ccggaccatc tccgccgtcg cctgtgaagc cgccgtccgt gtgtgataac 1140

tacttcagct gccaatctgg aaacacatgc tgctgccttt tccagtttgg aaatgcgtgc 1200

tttgattggg gatgctgccc tcttgaaggt gctacctgct gtgatgatca ctacagctgc 1260

tgccctgccg actaccccgt ttgtgacact ttcagaggtc tttgcctcaa gaacaagaac 1320

aacccattcg gagtgaaggc gttgaagaga actgcagcta aacctcactg ggccttcaat 1380

ggtgtgagca gtgcttaa 1398

<210> 2

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Ser Ser Tyr Thr Ile Leu Leu Phe Phe Phe Thr Leu Phe Thr

1 5 10 15

Leu Ser Tyr Ala Ser Asp Met Ser Ile Ile Ser Tyr Asp Lys Thr His

20 25 30

Ser Asn Thr Trp Arg Thr Asp Glu Glu Val Met Ala Met Tyr Glu Glu

35 40 45

Trp Leu Val Lys His Gly Lys Lys Ser Ser Asn Gly Leu Leu Ser Gly

50 55 60

Glu Ser Lys Asn Arg Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Leu Arg Phe Ile

65 70 75 80

Asp Glu Gln Asn Ser Leu Pro Asn Arg Thr Phe Gln Leu Gly Leu Asn

85 90 95

Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg Ala Lys Tyr Leu Gly

100 105 110

Thr Arg Met Asp Pro Asn Arg Arg Met Met Lys Ala Lys Thr Arg Ser

115 120 125

Asn Arg Tyr Ala Pro Arg Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu Ser Val Asp

130 135 140

Trp Arg Lys Glu Gly Ala Val Val Ala Val Lys Asp Gln Gly Gly Cys

145 150 155 160

Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Thr Ile Ala Ala Val Glu Gly Ile Asn

165 170 175

Lys Ile Val Thr Gly Asp Leu Ile Ser Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val

180 185 190

Asp Cys Asp Thr Ser Tyr Asn Glu Gly Cys Ser Gly Gly Leu Met Asp

195 200 205

Tyr Ala Phe Glu Phe Ile Ile Asn Asn Gly Gly Ile Asp Ser Glu Ala

210 215 220

Asp Tyr Pro Tyr Thr Gly Phe Asp Gly Thr Cys Asp Gln Asn Arg Lys

225 230 235 240

Asn Ala Lys Val Val Asn Ile Asp Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ala Tyr

245 250 255

Asp Glu Leu Ala Leu Lys Lys Ala Val Ala Asn Gln Pro Val Ala Val

260 265 270

Ala Ile Glu Gly Gly Gly Arg Glu Phe Gln Leu Tyr Val Ser Gly Val

275 280 285

Phe Thr Gly Arg Cys Gly Thr Ala Leu Asp His Gly Val Ala Ala Val

290 295 300

Gly Tyr Gly Thr Glu Gly Gly His Glu Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser

305 310 315 320

Trp Gly Ala Ser Trp Gly Glu Asp Gly Tyr Ile Arg Met Glu Arg Asn

325 330 335

Leu Gly Asn Ser Arg Ala Gly Lys Cys Gly Ile Ala Ile Glu Pro Ser

340 345 350

Tyr Pro Ile Lys Asn Gly Pro Asn Pro Pro Asn Pro Gly Pro Ser Pro

355 360 365

Pro Ser Pro Val Lys Pro Pro Ser Val Cys Asp Asn Tyr Phe Ser Cys

370 375 380

Gln Ser Gly Asn Thr Cys Cys Cys Leu Phe Gln Phe Gly Asn Ala Cys

385 390 395 400

Phe Asp Trp Gly Cys Cys Pro Leu Glu Gly Ala Thr Cys Cys Asp Asp

405 410 415

His Tyr Ser Cys Cys Pro Ala Asp Tyr Pro Val Cys Asp Thr Phe Arg

420 425 430

Gly Leu Cys Leu Lys Asn Lys Asn Asn Pro Phe Gly Val Lys Ala Leu

435 440 445

Lys Arg Thr Ala Ala Lys Pro His Trp Ala Phe Asn Gly Val Ser Ser

450 455 460

Ala

465

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggcttca tccttcacca tcc 53

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agcactgctc acaccattga ag 52

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctaaggttgt gaacattgat ga 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cacatcttcc tgtgaataca cca 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaggagaagc agaagcaagt tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agacagcata tcggcactca tc 22

Claims

1.一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述基因AhRD21A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

3.包含如权利要求1所述花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A的超量表达载体。

4.一种如权利3要求所述超量表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：基于Gateway系统通过BP反应构建入门载体pDONR207-AhRD21A，再经过LR反应构建CaMV 35S启动子驱动的植物表达载体pK7WG2.0-AhRD21A。

5.一种如权利要求1所述的花生花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21A或权利要求3所述的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。