CN105132441B

CN105132441B - 版纳甜龙竹NiR基因及其应用

Info

Publication number: CN105132441B
Application number: CN201510630594.9A
Authority: CN
Inventors: 林新春; 朱龙飞; 姬丽粉; 臧巧路; 王晓芹
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2035-09-29
Also published as: CN105132441A

Abstract

版纳甜龙竹NiR基因及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明一方面提供了版纳甜龙竹NiR基因序列以及该基因序列编码的蛋白质氨基酸序列，另一方面提供了该版纳甜龙竹NiR基因的应用。本发明的有益效果：转化的水稻经筛选得到含有NiR基因的转基因水稻，实验证明该基因能够提高植物的再生能力，转重组质粒pCambia1301‑DhNiR和pCambia1301空载质粒水稻在绿点愈伤率和分化苗时间上都表现出差异。本发明提供的版纳甜龙竹NiR基因为基因工程改良植物的再生能力提供了一种技术手段，具有广泛的应用价值。

Description

版纳甜龙竹NiR基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及版纳甜龙竹NiR基因及其应用。

背景技术

硝态氮(NO₃ ^-)是旱田作物可利用氮素的主要形式。亚硝酸还原酶(nitrite reductase, NiR)是氮素同化途径的关键控制酶，与硝酸还原酶（NR）偶联完成NO₃ ^-的无机同化。前人研究表明，细胞色素C 亚硝酸还原酶(ccNiR) 在氮代谢循环中起着关键的作用。而通过对水稻的研究表明，水稻的再生能力中硝酸盐代谢途径是一个非常重要的过程。Ozawa和Kawahigashi等（2006）克隆了水稻Konansou的NiR基因，并将该基因在一个商业水稻品种Koshihikari中过表达。结果表明与野生型相比，导入的外源NiR基因使植物生长情况良好，愈伤组织再生能力明显提高。除水稻外，目前已在烟草、玉米、水稻、小麦、甜菜、大麦等重要作物中克隆到NiR基因编码序列，但未见对相关基因功能的深入研究。

竹子开花周期长、难以预测，且开花后通常死亡，给杂交育种工作带来了困难。转基因是有效的育种手段，高效再生体系的建立是转基因的前提和基础。由于竹子高效再生体系很难建立，竹子转基因研究刚刚起步。提高竹子的再生能力，对竹子转基因育种工作具有重要作用。版纳甜龙竹（Dendrocalamus hamiltonii )属于禾本科竹亚科牡竹属，是世界三大甜龙竹之一，为优良的笋材两用竹种。本课题组建立了版纳甜龙竹的高效再生体系，并发现该竹种再生能力较强（Zhang et al.,2010）。本发明从再生能力较强的版纳甜龙竹中克隆出NiR同源基因DhNiR，研究其功能，发现在水稻遗传转化过程中包含该基因的基因克隆载体较作为对照的空载体具有更高的愈伤组织分化率和更快的分化成苗能力。因此，DhNiR基因可以应用于水稻的遗传转化，并有可能应用于再生比较困难的竹子以及其它禾谷类作物的遗传改良。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供涉及版纳甜龙竹NiR基因及其应用的技术方案。

所述的版纳甜龙竹NiR基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

所述的版纳甜龙竹NiR基因的编码蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的版纳甜龙竹NiR基因的扩增引物，其特征在于包括引物 DhNiR-F和引物DhNiR-R，所述的引物 DhNiR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，所述的引物DhNiR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的包含权利要求1 所述的版纳甜龙竹NiR基因的植物表达载体。

所述的版纳甜龙竹NiR基因在提高植物再生能力的应用。

所述的版纳甜龙竹NiR基因在提高水稻再生能力的应用。

本发明的有益效果：转化的水稻经筛选得到含有NiR基因的转基因水稻，实验证明该基因能够提高植物的再生能力，转重组质粒pCambia1301-DhNiR和pCambia1301空载质粒水稻在绿点愈伤率和分化苗时间上都表现出差异。本发明提供的版纳甜龙竹NiR基因为基因工程改良植物的再生能力提供了一种技术手段，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1 为表达载体pCambia1301-DhNiR转化水稻后部分转基因水稻PCR鉴定图。

图2转DhNiR和空载水稻转化率图。

图3转DhNiR和空载水稻绿点愈伤率图。

图4转DhNiR基因和空载的日本晴和中花11的分化情况图；

图4中：a 空载（中花11）； b转DhNiR（中花11）；c空载（日本晴）； d转DhNiR（日本晴）。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：版纳甜龙竹NiR基因（DhNiR）的克隆及分析

（1）以版纳甜龙竹新叶为材料，提取其总RNA，采用M-MLV反转录酶（TaKaRa公司）逆转录合成cDNA第一链。

(2) 以水稻NiR基因序列为参照序列，在毛竹转录组数据库中进行筛选，得到了一个毛竹NiR基因序列，再根据毛竹NiR序列，设计DhNiR-F和DhNiR-R引物；以版纳甜龙竹逆转录合成的cDNA为模板进行扩增，将扩增的PCR产物进行胶回收并与pMD-18T载体16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌后挑选单克隆送往生物公司测序。

引物 DhNiR-F：ATGACATCCTCAGCCTCCCTGC（如SEQ ID NO.3 所示）；

DhNiR-R：CTATTCCTCATCCTCCTCCCTCTCC（如SEQ ID NO.4 所示）

(3)将测序结果用生物软件DNAMAN分析可得，DhNiR 基因ORF全长1779bp（如SEQID NO.1 所示），编码593个氨基酸（如SEQ ID NO.2所示）。

实施例2：农杆菌介导的水稻转化

(1)将DhNiR 基因的ORF区通过同源重组技术连入植物表达载体pCAMBIA1301中，构建重组质粒pCambia1301-DhNiR；利用电转化法将重组质粒和pCambia1301空载质粒转入农杆菌EH105。

(2) 水稻愈伤组织的诱导：取水稻成熟种子脱壳，挑选饱满干净无斑的种子，用70%酒精先给种子表面消毒1min左右；然后倒去酒精，加入3% NaClO溶液，再加吐温-20（每50 mL加1滴）后真空抽滤30 min；倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5次。

诱导与继代培养（需要无菌操作条件）：种子放在灭过菌的滤纸上在超净工作台上吹干，将成熟胚放在诱导培养基中（胚紧贴培养基），每皿20颗左右；操作完毕用封口膜封好，在30℃恒温培养箱暗培养15天；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的淡黄色的且致密的呈球状的胚性愈伤组织，在26℃条件下暗培养，继代培养2周，继代2次。

(3) 预培养：将继代2次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。

(4) 农杆菌的培养：把-70℃保存的菌种首先在含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平的YEP固体培养基上活化，在28℃培养箱内培养2天。在愈伤预培养的第2天，用含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种活化后的农杆菌菌株（1个菌落划一环，共3环），28 ℃静止培养2 天。用钥匙将农杆菌（1环-1环半）刮入30 ml含100-200 µmol/L As的AAM培养基（提前配置，灭菌），使菌液 OD600的终浓度为 0.01。

(5) 感菌与共同培养：将预培养后的良好的水稻愈伤组织接入100 mL锥形瓶中，加入重悬好的农杆菌悬浮液侵染30分钟左右，期间不停摇动菌液；倒去菌液，将愈伤组织取出后置于灭过菌的滤纸上吸干表面菌液；然后将愈伤组织放置在共培养基上，且共培养基上表面垫上一层灭过菌滤纸上，26℃条件下暗培养3天。

(6) 愈伤组织的抗生素筛选: 共培养后的愈伤组织开盖无菌风吹10min左右，然后直接转入第一轮筛选培养基。一皿30颗愈伤，无菌风吹20 min左右，封盖暗培。第一轮筛选：将愈伤转入含500 mg/L羧苄青霉素（Cn）和40 mg/L潮霉素选择培养基上，26℃条件下暗培养14天；然后将愈伤组织转到含有500 mg/L羧苄青霉素（Cn）和50 mg/L潮霉素的培养基上进行选择，26℃条件下暗培养，2周筛选一次，共筛选培养2次。

(7) 水稻的抗性愈伤组织诱导分化和生根: 将通过筛选培养后的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，26℃条件下暗培养6天。然后将预分化培养后的抗性愈伤转到分化培养基中，26℃条件下，光照强度2400Lx培养，分化出转基因植株。待小苗长到5cm高左右，直接转入生根培养基上生根。将根系健壮的植株经炼苗移栽后，然后移到自然条件下生长，直至成熟。

实施例3：转基因植株的分子鉴定

取转化DhNiR并分化成苗的水稻植株的叶片，采取改良的CTAB法提取基因组DNA。采用TaKaRa的rTaq酶，利用DhNiR-F和DhNiR-R引物参照试剂说明书进行PCR扩增。反应体系如下：F引物1ul、R引物1ul、DNA模板1ul、10xbuffer 2ul、dNTP1.6ul、酶0.4ul，加水至20ul。扩增程序如下：94℃预变性3min、94℃变性30s、60℃退火 30s、72℃延伸2min、30个循环、72℃最终延伸 7min、4℃保存。

如图1所示，DhNiR成功转入水稻植株中。

实施例4： DhNiR转基因水稻再生能力分析

通过农杆菌介导法将带有DhNiR基因的载体和空载转入水稻（日本晴和中花11）愈伤组织中。将转化DhNiR基因和转化空载的愈伤组织在光下进行分化，对愈伤组织绿点率和转化率进行统计。利用excel进行数据分析，以此来分析其对水稻再生能力的影响，如图2和3所示。

愈伤组织绿点率=变绿的愈伤组织数/实验的愈伤组织数×100%

转化率=转化成功的水稻植株数/转化的总植株数×100%

DhNiR表达载体和空载分别转入水稻愈伤组织（日本晴和中花11），转入分化培养基30d后，对结果进行统计表明，转DhNiR和空载的日本晴绿点愈伤率分别为27%和17%，转DhNiR和空载的中花11绿点愈伤率分别为37%和30%；转DhNiR基因的日本晴和中花11植株转化成功率分别为60%和48%，转空载的日本晴和中花11植株转化成功率分别为20%和25%。转DhNiR的日本晴和中花11的愈伤比空载提前1周左右分化出苗，如图4所示。说明DhNiR在水稻的再生能力提高方面发挥积极作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江农林大学

<120> 版纳甜龙竹NiR基因及其应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1779

<212> DNA

<213> 版纳甜龙竹

<400> 1

atgacatcct cagcctccct tcagcgcttc ctccccccct ccgcccacgc ggcgtcgtcc 60

cgccggcgcc ccggccgcgc ccgccccgtg cagagctcga ccgtgtccgc gccgacgtcc 120

tcgccgccgg cggagggcgt ctcgacggag cggctggaac cgagggtgga ggagcgggac 180

ggcgggtact gggtgctcaa ggagaagtac cgcacggggc tgaacccgca ggagaaggtg 240

aagctggcca aggagcccat ggcgctgttc atggagggcg gcatcaacga cctcgccaag 300

ctgaccatgg aggacatcga cgccgacaag ctctccaagg aggacgtcga cgtacggctc 360

aagtggctcg gcctcttcca ccgccgcaag caccagtatg gccgcttcat gatgcggctg 420

aagctgccga acggcgtgac gacgagcgag cagacgaggt acctggcgag cgtcatcaag 480

aggtacggca aggacggctg cggcgacgtg accacccggc agaactggca gatccgcggc 540

gtcacgctcc cggacgtgcc ggccatcctg gacgggctcc gcgccgtcgg cctcaccagc 600

ctgcagagcg gcatggacaa cgtgcgcaac ccggtcggca accctctcgc cggcatcgac 660

cccgacgaga tcgtcgacac gcgcccctac accgacctgc tctcgtcctt catcaccaac 720

aactcccatg gaaacccggc cgtcaccaac ctgccaagga aatggaacgt ctgtgtgatt 780

ggctctcacg atctgtacga gcacccgcac atcaacgacc tcgcctacat gccggcggtg 840

aagcacggca agttcggctt caaccttctc gtcggtggat tcatcagccc gaagaggtgg 900

gccgaggcct tgccactcga cgcttgggtc cccggggacg acatcatccc agtgtgcaag 960

gcaattcttg aggcgtaccg cgacctcggc accaggggca accggcagaa gacgcgcatg 1020

atgtggctca tcgacgaact tggaatggaa gtgttccggt cagaggtgga gaagaggatg 1080

ccgtatggag tgctcgagcg cgccgcgccg gaagacctca ttgacaagaa atggaagagg 1140

cgggactacc tcggcgtgca cccgcagaag caggaaggcc tgtcctatgt cggcctgcac 1200

gtgcccgtgg gccggctgca ggccgcggac atgttcgagc tggcccacct cgccgacgag 1260

tacagctccg gcgagctccg cctcaccgtg gagcagaaca tcgtcctccc gaacgtcaag 1320

aacgagaagg tggacgcgct gctcgccgag ccgctgctgc agaagttctc cccgcagccg 1380

tcgctgctga tgaagggcct ggtcgcttgc accggcaacc agttctgcgg gcaggcgatc 1440

atcgagacga aggcgcgggc gctgcaggtg acgcaggagg tggagaagcg cgtgtcggtg 1500

ccccggacgg tgcgcatgca ctggaccggc tgccccaaca gttgcggcca ggtgcaggtg 1560

gccgacattg gcttcatggg ctgcctgacc aaggacagcg acggcaagat cgtcgagggg 1620

gcggacatct tcgtcggcgg ccgcgtcggc agcgactcgc acctggcaga tgtgtacaag 1680

aagtccgtgc cgtgcaagga cctggtgcca atcgtcgctg acctcctggt ggagcggttc 1740

ggcgccgtgc cgagggagag ggaggaggat gaggaatag 1779

<210> 2

<211> 592

<212> PRT

<213> 版纳甜龙竹

<400> 2

Met Thr Ser Ser Ala Ser Leu Gln Arg Phe Leu Pro Pro Ser Ala His

1 5 10 15

Ala Ala Ser Ser Arg Arg Arg Pro Gly Arg Ala Arg Pro Val Gln Ser

20 25 30

Ser Thr Val Ser Ala Pro Thr Ser Ser Pro Pro Ala Glu Gly Val Ser

35 40 45

Thr Glu Arg Leu Glu Pro Arg Val Glu Glu Arg Asp Gly Gly Tyr Trp

50 55 60

Val Leu Lys Glu Lys Tyr Arg Thr Gly Leu Asn Pro Gln Glu Lys Val

65 70 75 80

Lys Leu Ala Lys Glu Pro Met Ala Leu Phe Met Glu Gly Gly Ile Asn

85 90 95

Asp Leu Ala Lys Leu Thr Met Glu Asp Ile Asp Ala Asp Lys Leu Ser

100 105 110

Lys Glu Asp Val Asp Val Arg Leu Lys Trp Leu Gly Leu Phe His Arg

115 120 125

Arg Lys His Gln Tyr Gly Arg Phe Met Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn

130 135 140

Gly Val Thr Thr Ser Glu Gln Thr Arg Tyr Leu Ala Ser Val Ile Lys

145 150 155 160

Arg Tyr Gly Lys Asp Gly Cys Gly Asp Val Thr Thr Arg Gln Asn Trp

165 170 175

Gln Ile Arg Gly Val Thr Leu Pro Asp Val Pro Ala Ile Leu Asp Gly

180 185 190

Leu Arg Ala Val Gly Leu Thr Ser Leu Gln Ser Gly Met Asp Asn Val

195 200 205

Arg Asn Pro Val Gly Asn Pro Leu Ala Gly Ile Asp Pro Asp Glu Ile

210 215 220

Val Asp Thr Arg Pro Tyr Thr Asp Leu Leu Ser Ser Phe Ile Thr Asn

225 230 235 240

Asn Ser His Gly Asn Pro Ala Val Thr Asn Leu Pro Arg Lys Trp Asn

245 250 255

Val Cys Val Ile Gly Ser His Asp Leu Tyr Glu His Pro His Ile Asn

260 265 270

Asp Leu Ala Tyr Met Pro Ala Val Lys His Gly Lys Phe Gly Phe Asn

275 280 285

Leu Leu Val Gly Gly Phe Ile Ser Pro Lys Arg Trp Ala Glu Ala Leu

290 295 300

Pro Leu Asp Ala Trp Val Pro Gly Asp Asp Ile Ile Pro Val Cys Lys

305 310 315 320

Ala Ile Leu Glu Ala Tyr Arg Asp Leu Gly Thr Arg Gly Asn Arg Gln

325 330 335

Lys Thr Arg Met Met Trp Leu Ile Asp Glu Leu Gly Met Glu Val Phe

340 345 350

Arg Ser Glu Val Glu Lys Arg Met Pro Tyr Gly Val Leu Glu Arg Ala

355 360 365

Ala Pro Glu Asp Leu Ile Asp Lys Lys Trp Lys Arg Arg Asp Tyr Leu

370 375 380

Gly Val His Pro Gln Lys Gln Glu Gly Leu Ser Tyr Val Gly Leu His

385 390 395 400

Val Pro Val Gly Arg Leu Gln Ala Ala Asp Met Phe Glu Leu Ala His

405 410 415

Leu Ala Asp Glu Tyr Ser Ser Gly Glu Leu Arg Leu Thr Val Glu Gln

420 425 430

Asn Ile Val Leu Pro Asn Val Lys Asn Glu Lys Val Asp Ala Leu Leu

435 440 445

Ala Glu Pro Leu Leu Gln Lys Phe Ser Pro Gln Pro Ser Leu Leu Met

450 455 460

Lys Gly Leu Val Ala Cys Thr Gly Asn Gln Phe Cys Gly Gln Ala Ile

465 470 475 480

Ile Glu Thr Lys Ala Arg Ala Leu Gln Val Thr Gln Glu Val Glu Lys

485 490 495

Arg Val Ser Val Pro Arg Thr Val Arg Met His Trp Thr Gly Cys Pro

500 505 510

Asn Ser Cys Gly Gln Val Gln Val Ala Asp Ile Gly Phe Met Gly Cys

515 520 525

Leu Thr Lys Asp Ser Asp Gly Lys Ile Val Glu Gly Ala Asp Ile Phe

530 535 540

Val Gly Gly Arg Val Gly Ser Asp Ser His Leu Ala Asp Val Tyr Lys

545 550 555 560

Lys Ser Val Pro Cys Lys Asp Leu Val Pro Ile Val Ala Asp Leu Leu

565 570 575

Val Glu Arg Phe Gly Ala Val Pro Arg Glu Arg Glu Glu Asp Glu Glu

580 585 590

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgacatcct cagcctccct gc 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctattcctca tcctcctccc tctcc 25

Claims

1.版纳甜龙竹NiR基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

2.如权利要求1所述的版纳甜龙竹NiR基因的编码蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.版纳甜龙竹NiR基因的扩增引物，其特征在于包括引物 DhNiR-F和引物DhNiR-R，所述的引物 DhNiR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，所述的引物DhNiR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.包含权利要求1 所述的版纳甜龙竹NiR基因的植物表达载体。

5.如权利要求1所述的版纳甜龙竹NiR基因在提高植物再生能力的应用。

6.如权利要求1所述的版纳甜龙竹NiR基因在提高水稻再生能力的应用。