CN109112135A - OsREP4基因在控制水稻抗旱性中的应用 - Google Patents

OsREP4基因在控制水稻抗旱性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及OsREP4基因在控制水稻抗旱性中的应用。本发明通过分离、克隆和生物功能验证得到一种能够控制水稻根长和抗旱能力的基因OsREP4，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的步骤包括：通过对水稻种质资源材料进行成熟期根系性状的全基因组关联分析，定位到一个调控水稻根系长度的候选基因OsREP4，该基因的超量表达可以显著提高转基因水稻的根长和抗干旱能力。本发明还公开了OsREP4基因在水稻改良中的应用方法。

Description

OsREP4基因在控制水稻抗旱性中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一个OsREP4基因在控制水稻抗旱性中的应用。本发明通过分离、克隆和功能验证试验得到一种能够调控水稻的根长和抗旱能力的基因OsREP4，通过水稻种质资源材料成熟期根系性状的全基因组关联分析，定位得到一个调控根系长度的候选基因，其超量表达可以显著提高转基因水稻的根长和耐干旱的能力，公开了该基因在水稻改良中的应用方法。
背景技术
水稻是世界三大粮食作物之首，全世界将近一半的人口以水稻为主要粮食。据联合国的预测，世界人口数量将从2009年的67亿增加到2030年的80亿，这使得世界谷物的产量到2030年时必须增加至少40％才能满足世界人口的需求。因此世界水稻的产量事关重大。另一方面，随着环境的恶化，沙漠化土地、盐碱地逐渐吞噬着农田，适合水稻正常生长的土地正在逐年减少，像低氮、干旱、高盐、铝离子毒性等非生物逆境造成了世界范围内的作物减产。在这种情况之下如何保证水稻产量？培育正常条件下的高产水稻是一种策略。而培育出能在旱地和盐碱地正常生长的水稻显得更有吸引力。
作物的抗旱机制非常复杂，主要分为逃旱性，避旱性，耐旱性以及复水抗旱性，其中根系对避旱性的贡献很大，即增加根系密度和深度来维持水分的吸收。但是近年来，通过调控根系性状来提高作物抗旱性的报道并不多见。Deep rooting 1是水稻中首次通过正向遗传学克隆到的控制根系性状的基因，该基因通过调控根系生长角度来影响水稻的深根率，并且显著提高水稻在干旱胁迫下的产量(Uga等，Control of rootsystemarchitecture by DEEPER ROOTING 1increases rice yield under droughtconditions.Nat Genet,2013)。超量表达OsERF48的转基因植株，通过调控钙调蛋白OsCML16，显著提高转基因植株的根系长度和密度，从而提高水稻抗旱性(Jung等，Overexpression of OsERF48causes regulation of OsCML16,a calmodulin-likeprotein gene that enhances root growth and drought tolerance.PlantBiotechnol J,2017)。在水稻根中超量表达OsERF71基因，能够促进根系的径向生长，使转基因植株根系中的通气组织增大，从而提高水稻的抗旱性(Lee等，Rice OsERF71-mediatedroot modification affects shoot drought tolerance.Plant Signal Behav,2017)。
发明内容
本发明的目的涉及一个OsREP4基因在控制水稻抗旱性改良中的应用。本发明通过对OsREP4基因的功能鉴定发现OsREP4是一个根系特异型表达的未知功能蛋白，超量表达OsREP4基因能使水稻的抗旱性增强。OsREP4基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列长度为270bp,它编码的蛋白质的序列如SEQ IDNO：2所示，该基因编码89个氨基酸序列。
上述分离控制水稻抗旱性的基因OsREP4是一个根特异性表达基因，利用它的超表达可以提高水稻抗逆性(尤其是抗旱性)方面发挥重要功能，对培育抗逆水稻新品种具有非常重要的意义。
鉴于OsREP4基因超量表达的转基因材料表现出抗旱性增强的能力，可使用包括本发明的OsREP4基因的超量表达载体转化宿主(包括水稻在内的多种植物)，培育抗旱植物品种。携带有本发明OsREP4基因的超量表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(转化的方法参见：Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,NewYork,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition))。
可将本发明的基因的相关核苷酸片段与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的超量表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达该基因，提高植物抗旱性。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的包含有OsREP4基因编码区的核苷酸序列，序列长度为270bp(序列的前面3个为起始密码子，最后3个为终止密码子)。
序列表SEQ ID NO:2是本发明的OsREP4基因编码的蛋白质序列，编码89个氨基酸。
图1.水稻成熟期正常条件下最大根长的全基因组关联分析的Manhattan图和Quantile-Quantile图。附图标记说明：图1中的A图是Manhattan图，图1中的A图中的箭头所示为包含OsREP4基因的区间的位点；图1中的B图是Quantile-Quantile图。
图2.OsREP4基因的组织表达谱。
图3.OsREP4基因超表达的24个独立转化单株及野生型水稻根中OsREP4基因的表达量。
图4.水稻OsREP4基因超表达植株根长表型及抗旱表型。附图标记说明：图4中的A图为超表达及对照材料成熟期正常条件下最大根长；图4中的B图为超表达及对照材料成熟期干旱胁迫条件后的最大根长；图4中的C图为超表达及对照材料孕穗期干旱胁迫表型。
图5.本发明的起始载体，即空载体pU1301的图谱。
图6.本发明构建的超表达转化载体(目标载体)OsREP4-pU1301的图谱。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有OsREP4基因完整编码区段的DNA片段，以及验证OsREP4基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
实施例1
1、目的基因的克隆
申请人对529份核心种质材料进行了成熟期的正常条件及干旱胁迫后的水稻根系性状的全基因组关联分析，在第4染色体上定位到一个控制成熟期正常条件下最大根长(MRLN)的位点(图1),在该位点的200KB范围内，大多数基因在水稻基因组注释网站TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中都被注释为转座子和反转座子，仅有少数几个基因被注释为假定蛋白或者表达蛋白。将这几个表达蛋白在表达谱数据库RiceXPRO(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)中进行分析，申请人发现有一个基因具有很强的根系特异性表达特征。因此将这个基因作为候选基因进行候选的研究，该基因被命名为OsREP4。OsREP4在水稻基因组注释网站TIGR上功能注释为expression protein，注释号为LOC_Os04g11040，该基因的完整核苷酸序列见SEQ ID NO：1所示，其编码区核苷酸长度为270bp，该核苷酸序列对应的蛋白质长度为89个氨基酸，序列见SEQ ID NO：2所示。
2、检测水稻内源OsREP4基因的表达水平
通过检索数据库的结果显示OsREP4在根系中特异性表达，为了确认这个结果，申请人用实时荧光定量PCR(常规方法)检测了OsREP4的组织表达谱，其结果见图2。具体步骤为：选用粳稻品种“中花11”(简称ZH11，来自中国农业科学院作物研究所常规品种)作为表达谱分析的材料。取水稻全生育期中有代表性的组织材料的RNA样品，总RNA的提取方法是采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(按TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶MLV(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(按Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃5min，50℃60min,70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(OsREP4RealT-F：5’-TGTTGGAAGTGGCACCTCTGT-3”和OsREP4RealT-R：5’-CACCCCCATGGTTGCTGTAC-3’)对OsREP4基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长为71bp)。同时用引物(Ubi-qRT-F：5’-GCCCAAGAAGAAGATCAAGAAC-3’和Ubi-qRT-R：5’-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3’)对水稻Ubiquitin基因做特异扩增(扩增产物长为66bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：50℃2min；95℃2min；95℃3sec，60℃30sec，共40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。检测结果显示，OsREP4在苗期根系中的表达量较高，而其他组织表达量很低甚至完全没有表达(图2)。
3、构建OsREP4基因超量表达材料
超量表达载体的构建:
为了更全面认识OsREP4基因的抗逆功能，申请人将OsREP4基因在水稻中超量表达。超量表达载体构建方法如下：
用来进行超量表达的载体是携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pU1301(pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上改造的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体，载体图见5)，根据Gibson报道的一步法连接方法(Gibson等，Enzymatic assemblyof DNA molecules up toseveral hundred kilobases.Nat Methods.2009)，将pU1301载体上KpnI酶切位点上游下游各20bp的序列作为接头序列，分别加在OsREP4全长扩增引物的F和R前面(OsREP4-OX-F:5’-TTACGAACGATAGCCGGTACCATGAAGGAGAAACTGAAGGCG-3’,OsREP4-OX-R:5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCCTAGTTGTTTGTATCACCAG-3’,其中下划线表示载体上KpnI酶切位点上下游序列)，以前述组织表达谱分析的中花11的根系cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系的总体积为50μl，cDNA模板1μl(约100ng)、10×PCR buffer反应缓冲液、10mM dNTP0.5μl、10μM引物各0.5ul、2单位LATaq酶，加双蒸水至50μl。反应程序为：95℃变性5min，95℃30s、55℃30s、72℃30s、33个循环，72℃延伸7min。反应完成之后对PCR产物进行挖胶纯化回收。同时将pU1301载体进行KpnI单酶切，酶切完成之后纯化回收再进行去磷酸化处理防止载体自连。将纯化回收的OsREP4外源片段和去磷酸化之后纯化回收的载体pU1301进行Gibson连接反应，筛选阳性质粒并测序，得到序列完全正确的OsREP4-PU1301载体(见图6)。
遗传转化步骤:
通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述构建的超表达载体OsREP4-pU1301转入到水稻品种“中花11”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium andsequence analysis of theboundaries of the T-DNA，Plant J，6:271-282，1994)基础上改良进行。本实施例的具体遗传转化步骤如下：
(1)电转化：用1800v电压，将最终超表达目标载体OsREP4-pU1301电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤组织。
(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟；0.15％氯化汞表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的诱导培养基置于黑暗处培养4周，培养温度为25±1℃。
(3)愈伤组织继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，培养温度为25±1℃。
(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于澳大利亚CAMBIA实验室，商用菌株，携带有本发明构建的的超表达载体OsREP4-pU1301)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)上，28℃摇床上培养2-3小时。
(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤组织转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD600为0.8-1.0；将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度为19-20℃。
(7)愈伤组织的洗涤和选择培养：用灭菌水洗涤愈伤组织至看不见农杆菌，然后将洗涤后的愈伤组织浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟，转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干，再转移愈伤组织至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次及以后羧苄青霉素浓度为250ppm，潮霉素浓度为250ppm)。
(8)分化：将抗性愈伤组织转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7天，转移预分化培养的愈伤组织至分化培养基上(成分见后)，在3500lux光照下培养，培养温度为26℃。
(9)生根：剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基上光照下培养2-3周，培养温度为26℃。
(10)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
培养基组分及其配方：
(1)试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。
(2)主要溶液配方
1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：
逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。
2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制
室温下溶解并定容至1000ml。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制
准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)配制
加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制
室温下溶解并定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
室温下溶解并定容至1000ml。
7)2,4-D贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取2,4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。
8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4·7H2O)2.78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水用。
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：
秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制：
秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
OsREP4超表达植株的表达量鉴定：
本发明采用荧光实时定量PCR方法对上述获得的转基因水稻T0代植株进行OsREP4基因的表达量的检测。检测步骤同实施例2。表达量的检测结果显示，大约一半以上转基因植株中的OsREP4基因的表达量相对于野生型植株(即非转基因植株)来说是显著提高的(图3)。
4、鉴定水稻超量表达材料的成熟期根系及抗旱表型
根据T0代表达量检测的结果，申请人选取了2个表达量较高且种子较多的独立的T1代水稻家系，如OX7，OX19及野生型(非转基因)中花11(ZH11)植株来鉴定超表达材料在成熟期的根系及抗旱表型。将2个超表达家系和野生型ZH11的种子去壳消毒，将超表达家系材料种子在含25mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型中花11()的种子晚一天在不含潮霉素的1/2MS培养基做平行发芽试验。发芽一周后挑选长势一致ZH11的超表达材料和野生型ZH11的对照材料移栽到盆中。待盆中的小苗长至四叶期左右，挑选长势一致的小苗移栽到盛有营养土的PVC管中，每个PVC管中种植两株水稻苗，其中一株为超表达家系材料，另一株为野生型对照(ZH11)。每个超表达家系种植共种植20株，其中10株用于正常生长并考察在正常条件下的最大根长表型，待水稻生长到种子成熟期时，收获之后洗根考察超表达家系材料与对照材料的根长表型。另外10株用于干旱胁迫试验，在水稻生长至孕穗初期时，从断水开始干旱胁迫，考察水稻对干旱的表型，之后复水恢复生长直至种子成熟期，收获之后洗根，考察干旱条件下超表达家系材料与对照材料的最大根长表型。试验结果显示，本发明的超表达OsREP4的水稻家系材料在正常条件及干旱条件下的最大根长均显著大于野生型对照材料(见图4中的A图和图4中的B图)，而且相对于野生型“中花11”，本发明选育的超表达家系材料的抗旱性增强(见图4中C图，由图4中C图可以看出，对照中花11的植株已经枯死，但是超表达植株还是绿色的，这是抗旱表型的一种表现形式)。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> OsREP4基因在控制水稻抗旱性中的应用
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(270)
<223>
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atg aag gag aaa ctg aag gcg agg ttt cag atc atc gcc gtc ttg ctc 48
Met Lys Glu Lys Leu Lys Ala Arg Phe Gln Ile Ile Ala Val Leu Leu
1 5 10 15
gcc ttc gcc atg gta gct caa gct atg gcg att cgc ggc acg ggt acg 96
Ala Phe Ala Met Val Ala Gln Ala Met Ala Ile Arg Gly Thr Gly Thr
20 25 30
acg gcg gag cag gat aac acc gga ggg agc acg agt gcg aaa cat acc 144
Thr Ala Glu Gln Asp Asn Thr Gly Gly Ser Thr Ser Ala Lys His Thr
35 40 45
ctg cct cag gct gtt gga agt ggc acc tct gtg gac aac cac cat gcc 192
Leu Pro Gln Ala Val Gly Ser Gly Thr Ser Val Asp Asn His His Ala
50 55 60
atc cct cgt gat cag tac agc aac cat ggg ggt gat gat gga ggt ggc 240
Ile Pro Arg Asp Gln Tyr Ser Asn His Gly Gly Asp Asp Gly Gly Gly
65 70 75 80
agt act ggt act ggt gat aca aac aac tag 270
Ser Thr Gly Thr Gly Asp Thr Asn Asn
85
<210> 2
<211> 89
<212> PRT
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 2
Met Lys Glu Lys Leu Lys Ala Arg Phe Gln Ile Ile Ala Val Leu Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ala Met Val Ala Gln Ala Met Ala Ile Arg Gly Thr Gly Thr
20 25 30
Thr Ala Glu Gln Asp Asn Thr Gly Gly Ser Thr Ser Ala Lys His Thr
35 40 45
Leu Pro Gln Ala Val Gly Ser Gly Thr Ser Val Asp Asn His His Ala
50 55 60
Ile Pro Arg Asp Gln Tyr Ser Asn His Gly Gly Asp Asp Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Thr Gly Thr Gly Asp Thr Asn Asn
85

Claims (2)

1.一种分离的OsREP4基因在控制水稻抗旱性中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种分离的OsREP4基因在控制水稻抗旱性中的应用，其特征在于该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。
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