CN108103073B - 棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用 - Google Patents

棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用。所述GhVLN4基因，与植物的黄萎病抗性相关。发明人发现在植物受到黄萎病菌侵染时，该基因表达量明显的升高，而在采用部分类型的激素处理时，该基因的表达量则又出现了表达量升高的明显变化。进一步将该基因沉默后，植物的抗黄萎病抗性降低，而该基因超量表达后，植物对抗黄萎病的抗性增加。基于上述特性，可以培育或者筛选GhVLN4超表达植株，可为获得黄萎病抗性较好植物新品种提供较好借鉴和参考，从而在植物新品种培育方面具有较好地应用价值。

Description

棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及陆地棉基因GhVLN4在抗黄萎病中的应用。
背景技术
棉花是全球重要的经济作物之一，在国民经济中占有重要地位。但棉花黄萎病在我国各棉区爆发成灾，已成为我国自枯萎病得到有效控制之后棉花生产上的第一大病害，是棉花可持续生产的主要障碍之一。目前常规的防治手段可以局部控制但不能有效防治，采用传统的抗病育种策略培育抗病品种成效缓慢，因此，从基因功能上进行分析，研究棉花抗黄萎病的机制，从分子水平上选育抗病品种是解决棉花黄萎病最有效的途径。
在经过长期进化和自然选择后，植物形成了自己的一套抵御外界侵害的各种机制，包括植物所固有的先天性的抗性和受病原菌诱导所产生的各种防御机制。病原菌侵染植物后，病原菌的无毒基因所编码的无毒蛋白被植物的抗病基因识别而诱发抗病反应，其中的一个典型的症状是植物会发生超敏性的反应，引起侵染部位的细胞和组织坏死，从而阻止病原菌的扩散。这其中包括了氧爆发、细胞壁木质化、病程相关蛋白诱导表达以及植物抗毒素产生等；局部抗病反应的产生进而激活信号分子如水杨酸、茉莉酸、乙烯、脱落酸等介导的抗病反应，最终激发整个组织或植株的防卫反应。这些反应共同构成了植物抗病信号传导的几个主要途径：植物先天免疫系统信号路径，依赖R基因的信号传导路径，依赖水杨酸(SA)的系统获得性抗性信号路径和依赖茉莉酸(JA)和乙烯(ET)的诱导系统抗性信号路径。
随着对微丝骨架的研究逐渐深入，越来越多的证据表明微丝骨架能够精确地调控植物对病原菌的防御反应。植物微丝骨架是一种高度动态变化的三维网络结构，它是由肌动蛋白单体(G-actin)多聚化形成纤维型肌动蛋白(F-actin)，再经过交联捆绑形成的高级结构。微丝结合蛋白通过调节微丝骨架不同形态之间的相互转换，参与植物应答病原菌侵染过程。拟南芥的加帽蛋白(capping protein,CP)参与拟南芥对多种病原相关分子模式(Pathogen or microbe-associated molecular patterns,PAMPs/MAMPs)的应答过程。小麦微丝解聚因子TaADF7通过调节微丝骨架动化变化，影响ROS积累和过敏性坏死来抵抗小麦条锈病。棉花微丝结构调控蛋白GhPFN2通过改变微丝骨架的高级结构以及增加微丝密度参与棉花应答大丽轮枝菌的侵染过程。但是关于微丝骨架与植物抗病之间的关系及其微丝结合蛋白质基因在植物抗病中的研究和应用都非常少。
发明内容
本发明目的在于提供陆地棉基因GhVLN4在抗黄萎病中的新应用，利用该新途径，可培育新的抗黄萎病的棉花新品种，从而为棉花黄萎病的预防和控制提供新的抗性基因资源。
绒毛蛋白(villin)是一种肌动蛋白结合蛋白，对微丝具有成核、切割、加帽、捆绑成束的作用。对于从肌动蛋白纤维丝形成更高级的形式并在真核细胞中的肌动蛋白动力学调控中起关键作用。水稻绒毛蛋白对于水稻株型其重要调控作用，但是目前还没有认识到其抗逆作用。发明人从棉花纤维中发现并克隆了一个绒毛蛋白编码基因，该蛋白除了促进植物细胞伸长之外，还发现该基因与棉花黄萎病抗性相关。沉默GhVLN4降低了棉花对大丽轮枝菌的抗性，在拟南芥中过表达可以提高对大丽轮枝菌侵染的耐受性。深入的探索棉花绒毛蛋白GhVLN4在抵抗大丽轮枝菌侵染过程中的作用机理，揭示了植物微丝骨架在植物免疫反应中的作用，不仅为棉花抗黄萎病分子机理研究提高新认识，同时该基因还可以应用于棉花抗黄萎病分子育种。
本发明采用的技术方案详述如下。
棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GhVLN4基因，其全长cDNA序列为2886bp，GenBank ID:KY112594，该基因与植物的黄萎病抗性相关；所述的植物天然含有GhVLN4基因。
在受黄萎病菌侵染时，植物中GhVLN4基因的表达量发生升高。使植物中GhVLN4基因超表达，植物对黄萎病的抗性增强。
植物在受到大丽轮枝菌和激素处理时，GhVLN4基因的表达量发生提高；所述的激素为SA水杨酸、ABA脱落酸、GA赤霉素和ET乙烯。在将GhVLN4基因沉默后，植物的黄萎病抗性降低，而将GhVLN4基因超表达后，植物对黄萎病抗性增加。
具体地，棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，所述GhVLN4基因，GenBank ID:KY112594.1，其ORF全长为2886bp，编码961个氨基酸，蛋白序列分析表明，其含有6个gelsolin结构域和1个VHP结构域。
该基因在棉花的根、茎、叶、胚珠和纤维等组织中均有表达，但在茎和纤维中优势表达；同时该基因还受大丽轮枝菌V991，水杨酸，脱落酸，茉莉酸和乙烯利诱导上调表达，表明该基因与植物黄萎病抗性相关。
亚细胞定位结果表明，该基因定位于微丝骨架。
病毒介导的基因沉默(VIGS)实验表明：将GhVLN4基因沉默后，棉花对黄萎病抗性降低，发病率和病情指数升高；而将GhVLN4基因超表达后，植物对黄萎病的抗性增强，发病率和病情指数降低，所述植物为拟南芥等。
本发明首先克隆获得了陆地棉GhVLN4基因，并对该基因及其编码的蛋白相关特性进行了深入研究。在对该基因与植物黄萎病相关研究时，发明人发现在植物受到黄萎病菌侵染时，该基因表达量显著升高，通过将该基因沉默后，植物对黄萎病抗性降低，而将该基因超表达后，植物对黄萎病抗性显著提高。基于上述研究结论，通过超表达GhVLN4基因，可以提高植物对黄萎病的抗性，为培育抗黄萎病新品种提供了新的抗病基因资源，因此，对于培育抗黄萎病植物新品种有重要的应用价值。
附图说明
图1为棉花GhVLN4基因菌液PCR检测的电泳图，其中M表示Marker，1和2表示2个单菌落；
图2为棉花GhVLN4基因启动子序列顺式调控元件(图A)，基因结构(图B)，蛋白结构域(图C)以及蛋白质三级结构预测(图D)示意图；
图3为棉花GhVLN4基因与拟南芥，水稻及百合VLN基因的进化树和结构域分析；其中GhVLN4，(KY112594)；AtVLN1，NP_029567(At2g29890)；AtVLN2，NP_565958(At2g41740)；AtVLN3，NP_567048(At3g57410)；AtVLN4，NP_194745(At4g30160)；AtVLN5，NP_200542(At5g57320)；LiABP135，AAD54660；LiABP115，BAC77209；OsVLN1，Os05g06110；OsVLN2，Os03g24220；OsVLN3，Os06g44890；OsVLN4，Os04g51440；和OsVLN5，Os08g14230；
图4植物表达载体pBINPLUS-GhVLN4的PCR验证结果；其中M为Marker，1-5为菌液PCR检测，N为阴性对照，P为阳性对照；
图5为GhVLN4在烟草叶片细胞的亚细胞定位结果，ABD2-mcherry为微丝骨架Maker；
图6为GhVLN4在不同组织(根、茎、叶、胚珠、纤维)表达模式分析；
图7为GhVLN4受黄萎病菌诱导时基因的表达变化情况；
图8为激素诱导情况下基因的表达变化情况；
图9为VIGS干扰植株对黄萎病的抗性分析结果，其中A:VIGS沉默棉花基因GhCLA1后的表型；B:TRV:00与TRV:GhVLN4沉默植株对黄萎病抗性表型，图为接种大丽轮枝菌20天表型观察；C:半定量检测GhVLN4基因沉默水平；D:病情指数分析结果；E：棉花黄萎病菌恢复实验；F：组织化着色实验，左侧为DAB着色实验，右侧为台盼蓝着色实验；
图10为GhVLN4超表达拟南芥植株的抗黄萎病菌分析，其中A为转基因拟南芥PCR鉴定结果，M:marker DL5000；WT:阴性对照；P:阳性对照；1-5:转基因拟南芥阳性株系；B为转基因拟南芥中GhVLN4的相对表达量；C为转基因拟南芥接种大丽轮枝菌后的表型观察；D为转基因拟南芥接种大丽轮枝菌后的病情指数统计情况。
具体实施方式
下面对于本专利申请中的实验材料和具体过程做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，首先对下述实施例中所涉及部分生物材料及实验试剂等情况简要介绍如下。
生物材料：
棉花材料包括：陆地棉徐州142，无长绒突变体Li-1，陆地棉遗传标准系TM-1；
黄萎病菌株：强致病性落叶型棉花黄萎病菌Vd991；
拟南芥材料：拟南芥野生型(Columbia-0)，培养条件21℃，16h光照/8h黑暗；
烟草材料为本氏烟(Nicotiana benthamiana)，种子为本实验室保存；
其它生物材料：大肠杆菌菌种DH5α、农杆菌菌种EHA105和GV3101；
植物超表达载体：pBI121；
基因亚细胞定位载体：pBINPLUS-GFP4；
VIGS干涉技术载体pTRV2和pTRV1；
实验试剂：
SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit，反转录试剂盒，pMD-18T，T4-DNA连接酶，限制性核酸内切酶Sma I，荧光定量PCR试剂盒等购自TaKaRa公司；
质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒，ExnaseTM同源重组酶购自诺维赞生物科技有限公司；
RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物科技有限公司；
所用培养基及溶液：LB培养基、YEB培养基、MS培养基、查氏(Czapek)培养基、PDA培养基等，参照《分子克隆实验》制备；
其它生长素、激素等试剂为分子实验室常用试剂，不作详细说明。
实施例1
陆地棉绒毛蛋白GhVLN4基因是本发明的基础，因而首先就该基因的克隆与获得过程简要介绍如下。
一、棉花GhVLN4基因克隆
本研究以Li-1纤维不伸长突变体与野生型WT为材料，比较-3、0、4、8DPA蛋白质组差异及其质谱分析结果。本文根据质谱鉴定匹配的EST序列(DW488595)，进行3’RACE-PCR得到基因全长序列。
首先采用CTAB法提取棉花总RNA，具体步骤为：向10mL离心管中加入加4mLCTAB缓冲液，取适量胚珠样品，液氮研末后加入上述管中，震荡混匀，冰浴10min，65℃水浴15min，中间颠倒混匀3次。加4mL氯仿充分混匀，冰浴静置10min。4℃，10000rpm离心15min，将上清液转至另一新的10mL管。加1/3体积8mol/L LiCl，混匀，-20℃冰浴1-2h。4℃10000rpm离心15min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，转至2mL管(70％可保存)。
按照SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit合成3’RACE-ready cDNA，该cDNA样本保存于-20℃。
将EST(DW488595)序列进行网上blast比对，发现预测的ORF框5’端已经完整，因此利用3’RACE技术和基因步移技术扩增3’端序列。第一次步移的引物为：GSP1 5’-CACAGGGGATTCCTATGTTATTTTG-3’
UPM 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’
用第一次步移的PCR产物的测序结果进行NCBI搜索比对，然后在保守区内再次设计巢式引物扩增，第二次步移所用引物为：
GSP2 5’-AGATGGTCTTGCACTGTTCCGAGTA-3’
NUP 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’
将两次测序结果进行分析，在拼接所得序列的可读框的两端设计引物，引物序列为：GhVLN4-ORF-F 5’-ATGGCGGTTTCCATGAGAGATTTA-3’
GhVLN4-ORF-R 5’-GGACTTAGAACAGTTGAAGAGCCATTTTTA-3’
扩增序列进行验证，得到2886bp的目标片段(图1)。
扩增体系均设计如下：
Figure GDA0001580574810000061
PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸4min,35个循环延；72℃延伸10min。
PCR扩增产物经1％的琼脂糖电泳分离，片段回收采用Genebase凝胶回收试剂盒，回收的DNA连接载体选用TAKARA公司的pMD19-T vector载体。
连接反应体系为：
Figure GDA0001580574810000062
16℃连接过夜。转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行菌液PCR检测，挑取检测条带与回收基因大小一致的样品送南京金斯瑞公司测序。
二、棉花GhVLN4基因序列特性分析
克隆的GhVLN4基因CDS序列全长为2886bp，编码961个氨基酸。通过棉花基因组数据库(https://www.cottongen.org/)查询棉花GhVLN4基因的染色体位置信息，可知GhVLN4基因位于D08(+):2225237-2232116染色体上。基因组注释文件分析结果表明，GhVLN4基因含有22个外显子和21个内含子(图2B)。
利用PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare)在线网站,预测顺式作用元件，含有乙烯和水杨酸调控元件(图2A)。
利用在线网站ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)预测棉花GhVLN4基因蛋白质的分子质量和等电点，可知GhVLN4基因蛋白质的分子量为107.37KD，等电点为6.34。
利用在线网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)进行功能域鉴定，分析表明，棉花GhVLN4基因含有6个gelsolin-like结构域和1个VHP结构域(图2C)。
蛋白质三级结构同源建模在线网站(https://swissmodel.expasy.org)分析结果表明，棉花GhVLN4的蛋白质三级结构主要为α螺旋和β折叠(图2D)。
三、棉花GhVLN4基因系统进化分析
使用Clustal X软件对棉花GhVLN4基因与水稻，百合，拟南芥的VLN基因进行氨基酸序列比对，序列联配结果通过MEGA5软件构建系统发育进化树，选用邻接法(Neighbor-Joining algorithm)，参数设置：poission correction，pairwise dlection，bootstrap重复1000次。参考拟南芥VLN基因家族的亚组分类结果对系统发育进化树中的棉花GhVLN4基因进行命名。分析结果表明，该基因编码的蛋白与拟南芥AtVLN4的遗传距离最近，因此将该基因命名为GhVLN4(图3)。四、棉花GhVLN4基因亚细胞定位载体构建与烟草叶片瞬时表达
观察pBINPLUS-GFP4载体序列，发现可以用的酶切位点有4个：KpnⅠ，SmaⅠ，SalⅠ和BamHⅠ，可以利用SmaⅠ位点，采用基于ExnaseTM的同源重组的方法构建载体。根据目的基因GhVLN4的全长cDNA序列，设计带有15bp载体序列(含SmaⅠ位点)的一对特异性引物，引物为：
pBIN-GhVLN4-F5’-GAACGATAGGGTACCCCCGGGATGGCGGTTTCCATG-3’
pBIN-GhVLN4-R5’-CATGGATCCGTCGACCCCGGGGAACAGTTGAAGAGC-3’
扩增GhVLN4基因(去除终止子)，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段正确后回收PCR产物；用Sma I单酶切pBINPLUS-GFP4质粒，琼脂糖凝胶电泳检测酶切正确后回收线性化质粒；同源重组酶连接片段获得pBINPLUS-GhVLN4重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态，菌液均匀涂布于含有卡那霉素(Kan50mg/l)的平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆摇菌进行PCR验证(图4)，阳性克隆进行测序验证，测序结果与cDNA序列一致，表明植物表达载体pBINPLUS-GhVLN4构建成功。
植物表达载体pBINPLUS-GFP4含有双CaMV 35S启动子，可强力启动下游目的基因表达；含有绿色荧光蛋白GFP，可特异性标记目的基因。ABD2为微丝结合蛋白，可特异性结合微丝；mCherry为红色荧光蛋白，ABD2-mCherry可特异性标记微丝骨架。
将构建好的植物表达载体pBINPLUS-GhVLN4转化农杆菌EHA105感受态，抗性筛选后挑取单克隆进行菌液PCR验证，选取阳性克隆摇菌待用。将ABD2-mCherry与GhVLN4-GFP用注射法共转化烟草叶片细胞。激光共聚焦显微镜观察烟草叶片下表皮，发现两种颜色荧光重合，说明GhVLN4在细胞骨架中表达，是微丝结合蛋白(图5)。
实施例2
在前述实施例中对于基因GhVLN4基本特性了解基础上,发明人进一步对这个基因在棉花组织中的表达模式、及受胁迫后组织表达情况进行了具体分析,相关实验简要介绍如下。
一、棉花GhVLN4基因在不同组织(根、茎、叶、胚珠、纤维)中的表达分析
实时定量PCR分析GhVLN4在野生型TM-1和短绒突变体Li-1不同组织(根、茎、叶、0DPA胚珠、3和6DPA纤维)中的表达情况。从三叶龄的棉花幼苗上收集根，茎，叶，盛花期时收集0d胚珠，3d和6d的纤维。使用北京百泰克生物科技有限公司植物多糖多酚RNATIQU试剂盒提取棉花总RNA，使用TaKaRa公司反转录试剂盒PrimeScriptTM1st Strand cDNASynthesisKit反转录合成cDNA。使用软件Primer Premier 5.0设计qPCR特异性引物，
引物为：
GhVLN4-qRT-F 5’-AACCAAAATGATTGAATCTATGAAGTTCCAGGATA-3’
GhVLN4-qRT-R 5’-CCTTGTACTCGGAACAGTGCAAGACCAT-3’
以陆地棉GhTUB3作为内参基因，引物为：
Tublin-qRT-F5’-CTCCCGCGGTTCCCAGCAGTA-3’
Tublin-qRT-R5’-TCGCCTTCCTCGTCAGCGGTA-3’
利用实时荧光定量PCR进行验证。采用TaKaRa公司的SYBR Premix ExTaqTM反应试剂，使用罗氏lightCycler480II定量PCR仪。(2)进行Real Time PCR反应，扩增程序：预变性95℃，30秒钟(Ramp Rate 4.4℃/秒)，1cycle；PCR分析模式：95℃，5秒钟(Ramp Rate 4.4℃/秒)，60℃，30秒钟(Ramp Rate 2.2℃/秒，Acquisition Mode:Single)，40cycles；分析模式：95℃，5秒钟(Ramp Rate 4.4℃/秒)，60℃，1分钟(Ramp Rate 2.2℃/秒)，95℃(RampRate 0.11℃/秒，Acquisition Mode:Continuous，Acquisitions:5per℃)，1cycle；降温:50℃，30秒钟(Ramp Rate 2.2℃/秒)，1cycle。以2-△△Ct方法计算每个GhVLN4基因的相对表达量。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。结果分析发现，GhVLN4在根、茎、叶、胚珠、纤维中均有表达，其中在6d的纤维和茎中优势表达(图6)。二、棉花GhVLN4基因受GA赤霉素，ABA脱落酸，SA水杨酸，ET乙烯以及大丽轮枝菌Vd991诱导的表达分析
选取饱满的种子于无菌瓶中，以适量灭菌水清洗种子1次，70％乙醇浸泡种子30s，弃乙醇，无菌水洗涤一次，加入30％H2O2振荡2～3h，弃H2O2，以无菌水冲洗3～5次，留少量无菌水浸泡种子过夜至露白。将露白的种子剥去种皮，置于含头孢噻肟钠(400μg·mL-1)且不含蔗糖的MS培养基中，置于25℃、光照16h/黑暗8h条件下培养，约7～8天后至真叶出现时，选取长势及大小一致的棉花幼苗接种大丽轮枝菌和激素诱导处理。分别配制浓度为100μM/L GA，100μM/LABA,2.5mM/L SA的液体MS培养基，将无菌苗置于含有不同激素处理的MS培养基中，置于25℃、光照16h/黑暗8h条件下培养。处理后，于0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h收集棉苗根部挑取大丽轮枝菌Vd991菌丝于Czapek’s液体培养基中，25℃，220rpm培养5～7天，四层灭菌纱布过滤后用血球计数板计数，以液体Czapek’s培养基稀释孢子悬浮液至浓度为5×106cfu·mL-1。在无菌条件下，用镊子轻轻拨起棉苗并将其根部全部浸入孢子悬浮液中，浸泡约30s，对照组以无菌水代替孢子液进行接种。接种后将棉苗移入无头孢有蔗糖的MS培养基中，置于25℃、光照16h/黑暗8h条件下培养。处理后，于0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h，96h收集棉苗根部。所有样品收集后置于液氮中迅速冷冻，-80℃保存备用。提取RNA后并反转录成cDNA进行表达模式分析。
结果分析发现，棉花GhVLN4受大丽轮枝菌诱导后表达量出现显著性变化并于24小时达到最大值(图7)；棉花GhVLN4受ABA诱导后在3小时表达量达到最大值，随后表达量开始降低；棉花GhVLN4受GA3诱导后在1小时表达量达到最大值；棉花GhVLN4受SA诱导后表达量持续升高并于24小时达到最大值(图8)。棉花幼苗可作为其它含有棉花GhVLN4基因的植物的代表，其也受大丽轮枝菌和激素的诱导。
实施例3
发明人使用VIGS技术对棉花植株内的GhVLN4基因进行了沉默,并进行黄萎病接种,借此来研究GhVLN4基因与黄萎病的关系,相关实验过程介绍如下。一、构建含有GhVLN4基因的VIGS载体
首先，设计引物序列，并进行PCR扩增，获得GhVLN4基因序列，引物序列具体为：
pTRV2-GhVLN4-F：5’-GCTCTAGAGCTAGAAACCTTTCTACTCCGCCAC-3’
pTRV2-GhVLN4-R：5’-CGGGATCCGAACAGTTGAAGAGCCATTTTTAGC-3’
其次，将TRV2空载体和PCR扩增获得的GhVLN4基因序列片段分别用BamHI和Xba I进行双酶切，分别回收纯化酶切产物，采用T4连接酶对上述酶切产物进行连接,以构建重组质粒。
将上述连接产物转化DH5α感受态细胞,涂板筛选并进行菌液鉴定,对鉴定正确的阳性克隆质粒进一步进行测序鉴定,获得构建正确的重组质粒载体，将构建正确的重组质粒载体转化农杆菌GV3101，备用。
所述连接产物转化感受态细胞的具体过程为：100μL感受态细胞在冰上解冻后加入2-5μL连接产物，轻轻混匀，在冰上静置30min，42℃水浴锅中热激90s，冰上放置2min，
加入800μL空白LB液体培养基，37℃，200-250rpm振荡培养90min，4000rpm离心3min，弃掉700μL上清液，悬浮管内菌体，均匀涂布在含Amp+的LB固体培养基上，37℃培养过夜12-16h，可出现菌落。
所述重组质粒载体转化农杆菌的具体过程为：取出-70℃冻存的GV3101农杆菌感受态细胞，置于冰上融化，加入0.5-1μg，带有目的片段的pTRV2重组质粒，冰上静止30min，液氮中速冻1min，然后在37℃水浴5min，加入lmL空白YEB培养基，28℃，200rpm，振荡培养2-4h，5000rpm离心1min以浓缩菌液，用100μL YEB重悬菌体，将菌液均匀涂布于含Rif 25μg/mL，Kan 50μg/mL的YEB平板上，28℃培养2-3d。挑取单菌落，通过PCR扩增检测，选取阳性克隆测序。
二、转化棉花
取pTRV2-GhVLN4，pTRV2(空载体)和pTRV2-GhCLA1农杆菌，用YEB液体培养基(Kan50μg/mL，Rif 50μg/mL)在28℃220转/min培养14h至菌液OD600为1.0左右。以适当体积的重悬液(MgCl 10mmol/L，MES 10mmol/L，乙酰丁香酮200umol/L)重悬液至浓度为OD600＝0.8；将重悬液于室温下静置3h以上，含有pTRV1和目的基因片段的pTRV2的重悬液按体积比1:1混匀，注射棉花子叶。
当棉花幼苗的两片子叶展平时，用注射器将菌悬液注射到子叶中，避光培养24h后，再恢复正常条件光照黑暗培养。
半定量RT-PCR检测结果表明，GhVLN4基因被高效干涉掉(图9C)
在确认GhVLN4基因被沉默掉后，将大丽轮枝菌菌株Vd991-GFP涂布于固体土豆培养基表面，23℃培养3～4d，转移到Czapek’s液体培养基中，150rpm振动培养3～5d；用无菌蒸馏水将孢子洗脱下，将孢子浓度调节到1×107cfu·mL-1个，用茎注射法接种沉默后棉花植株。
实验结果表明,用大丽轮枝菌处理20天左右后,棉花植株开始表现出相应的黄萎病，但GhVLN4基因沉默后的棉花植株发病较为明显(图9B),并且病情指数显著升高(图9D)。
进一步进行真菌恢复实验，大丽轮枝菌接种15天后，将黄萎病侵染的实验组和对照组的棉花幼苗的茎分别剪成0.5cm长，并用70％的酒精中清洗1min，然后再用0.1％的HgCl2清洗1min，最后用无菌水冲洗4次，将上述处理过的茎段放置于PDA培养基上，25℃培养5天后观察(图9E)。
利用二联基联苯胺(DAB)对植株内H2O2进行染色观察，将接种大丽轮枝菌12天的实验组和对照组的棉花叶片浸入DAB溶液中抽气15min，然后在室温下放置8h，之后放入用95％乙醇溶液对其进行煮沸脱色，待到叶片基本褪色完全即取出，放入饱和水合氯醛中透明过夜，脱色后的叶片用蒸馏水漂洗10min，最后将脱色后的叶片放入50％的甘油中保存。结果显示沉默GhVLN4基因的植株活性氧高于对照(图9F)。
利用台盼蓝染色对其叶片的死细胞进行观察，将接种大丽轮枝菌12天的实验组和对照组的棉花叶片置入台盼蓝溶液中煮沸2min，台盼蓝由苯酚，乳酸，甘油，1mg/ml的台盼蓝按1:1:1:1的比例配成，需现配现用。煮沸后取出的叶片置于饱和水合氯醛中透明过夜，脱色后用蒸馏水漂洗10min，然后放入50％的甘油中保存备用。结果显示沉默GhVLN4基因植株的死细胞高于对照(图9F)。实例4
为了更好的研究GhVLN4基因的相关功能，发明人借助拟南芥这一植物中的模式植物，通过在拟南芥中超量表达该基因,以研究GhVLN4基因超表达后植株的黄萎病抗性。相关实验介绍如下。
一、棉花GhVLN4基因超表达载体的构建以及植物转化
观察pBI121载体序列，发现可以用的酶切位点有三个：Sma I，Xba I和BamH I，其中目的基因的ORF中有XbaI的识别序列，剩下的两个酶切位点Sma I和BamH I的识别序列有部分重合，因此不能用传统的双酶切方法构建载体，所以采用基于ExnaseTM的同源重组的方法构建载体。用各带有15bp载体序列的一对引物扩增目的基因，再在同源重组酶作用下与单酶切的线性化载体相连，使用的一对引物序列如下pBI121-GhVLN4-F:5’-GGCTGATATCGGATCCATGGCGGTTTCCATGAGAGATT-3，
pBI121-GhVLN4-R:5‘-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGGAACAGTTGAAGAG-3’。
重组载体转化杆菌DH5α，获得阳性单菌落克隆后送测序图(10A)，测序正确的阳性克隆提取重组用液氮冻融法转化农杆菌GV3101，泡花法转化拟南芥，收获成熟的拟南芥转基因T0代种子，经充分干燥后，灭菌处理后，将种子均匀铺在MS固体培养基(含Kan 50mg/L)上，人工培养箱中生长15d，移栽生长正常的拟南芥幼苗。CTAB法提取拟南芥叶片DNA，检测是否为真正阳性转基因植株。将鉴定为阳性苗的拟南芥T0代植株分单株收种子，收到的种子即为T1代种子。将T1代种子铺在含卡那霉素的MS平板上，挑选正常生长的绿苗种到人工土壤中，继续收种子直到得到纯系种子。纯系种子用于后续基因功能研究(图10B)。
二、超表达GhVLN4基因拟南芥抗病性鉴定
选择相对表达量较高的株系2和5进行抗病性鉴定。将收获的已经充分干燥的拟南芥种子加上水4℃春化2-3d，用75％酒精和5％NaClO依次对种子进行灭菌，用灭菌水洗种子4-5次，再将灭好的种子均匀地铺到MS固体培养基上。将平板置于黑暗条件下2-3d，使种子萌发。再将平板转入人工培养箱，23℃长日照(16h光照/8h黑暗)条件下培养10天左右长出2真叶。将在MS平板上生长的拟南芥幼苗移栽于人工土壤中，保鲜膜覆盖4天左右放在23℃长日照(16h光照/8h黑暗)下培养2周。挑取大丽轮枝菌Vd991菌丝于Czapek’s液体培养基中，25℃，220rpm培养5～7天，四层灭菌纱布过滤后用血球计数板计数，以液体Czapek’s培养基稀释孢子悬浮液至浓度为1×106cfu·mL-1。诱导方法为蘸根法，将拟南芥的根部浸入大丽轮枝菌孢子悬浮液，2min,对照组将拟南芥的根部浸入无菌水中2min。处理后的拟南芥分别移入单个盆钵，每个株系16棵，三个生物学重复。接种后10天和15天统计病情指数，病情指数统计标准为，0系：无病植株；1级：1％～25％叶片发病的植株；2级：25％～50％叶片发病的植株；3级：50％～75％叶片发病的植株；4级：75％以上叶片发病的植株。鉴定结果表明，GhVLN4超表达拟南芥株系2和5在接种病原菌后10天和15天的病情指数均显著低于野生型拟南芥(图10C、D)。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用
<130> xhx2017121801
<141> 2017-12-18
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 1
cacaggggat tcctatgtta ttttg 25
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 2
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 3
agatggtctt gcactgttcc gagta 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 4
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 5
atggcggttt ccatgagaga ttta 24
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 6
ggacttagaa cagttgaaga gccattttta 30
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 7
gaacgatagg gtacccccgg gatggcggtt tccatg 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 8
catggatccg tcgaccccgg ggaacagttg aagagc 36
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 9
aaccaaaatg attgaatcta tgaagttcca ggata 35
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 10
ccttgtactc ggaacagtgc aagaccat 28
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 11
ctcccgcggt tcccagcagt a 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 12
tcgccttcct cgtcagcggt a 21
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 13
gctctagagc tagaaacctt tctactccgc cac 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 14
cgggatccga acagttgaag agccattttt agc 33
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 15
ggctgatatc ggatccatgg cggtttccat gagagatt 38
<210> 16
<211> 56
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 16
acggagctcg aattcggatc cttagtgatg atgatgatga tggaacagtt gaagag 56

Claims (6)

1.棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GhVLN4基因，其全长cDNA序列为2886bp，GenBank ID: KY112594，该基因与植物的黄萎病抗性相关；所述的植物天然含有GhVLN4基因。
2.如权利要求1所述棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，在受黄萎病菌侵染时，植物中GhVLN4基因的表达量发生升高。
3.如权利要求1所述棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，使植物中GhVLN4基因超表达，植物对黄萎病的抗性增强。
4.如权利要求1所述棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，植物在受到大丽轮枝菌和激素处理时，GhVLN4基因的表达量发生提高；所述的激素为SA水杨酸、ABA脱落酸、GA赤霉素和ET乙烯。
5.如权利要求1所述棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，将GhVLN4基因超表达后，植物对黄萎病抗性增加。
6.如权利要求1所述棉花GhVLN4基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，GhVLN4基因编码的蛋白质位于植物的微丝骨架。
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GhVLN4 is involved in cell elongation via regulation of actin organization;Fenni Lv et al.;《Planta》;20170624;第246卷;第687-700页 *

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