CN115747249A - 烟草NtabCrRLK12基因在解除烟草连作障碍中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业技术领域，具体涉及NtabCrRLK12烟草突变体解除烟草连作障碍中的应用，本发明发现NtabCrRLK12基因是影响水稻根系土壤解除烟草连作障碍的关键因子，公开了NtabCrRLK12基因或含有NtabCrRLK12基因的生物材料在解除烟草连作障碍中的应用，还利用基因编辑、物理诱变或化学诱变对烟草中NtabCrRLK12基因进行定点突变，获得并应用解除烟草连作障碍优异的基因资源。通过CRISPR/Cas9编辑技术定点敲除烟草中的NtabCrRLK12基因，基因突变材料在解除烟草中具有良好的作用。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及NtabCrRLK12烟草突变体在解除烟草连作障碍中的应用。
背景技术
在拟南芥中，RLK亚家族Catharanthus roseus RLK1-like(CrRLK1L)的重要成员FERONIA(FER)的突变体在正常及缺磷条件下富集有益微生物菌群(如荧光假单胞杆菌)促进连作拟南芥生长，说明FERONIA具有调节植物根系微生物菌群，缓解植物连作障碍的潜力。
CN114292759A公开了一株具有防治烟草连作障碍作用的尖孢镰刀菌，其保藏号为GDMCC No:62066，在连作烟田中施用时，能够消除烟草土壤的连作障碍问题，增加连作烟田的烟草产量，提高经济效益。CN111892455A公开了一种抗烤烟连作障碍的炭基生物酶肥，包括有机肥、生物炭和酵素，所述有机肥由牛粪、油枯、菌包、秸秆、磷元素和有益菌，能提供给烟草生长所需的中微量元素，还能吸附土壤中的有毒有害物质，抑制土壤中有害菌群的活动，增加有益菌群的数量，提高土壤肥力，改善土壤的理化性质，使土壤变得疏松、肥沃，从而提高烟草的抗病能力和产质量。但是都是涉及采用微生物或者微生物与营养物资对土壤的处理，还未涉及到采用分子生物学手段，挖掘相关基因去解除烟草连作这一技术问题。
烟草在种植过程中会遇到连作障碍，同一块土地连年种植烟草，烟草植株的质量和产量会明显下降、生长发育迟缓，长期连作会导致土壤生态环境和理化性状改变，土壤肥力下降、微生态组成失衡，病虫害加重，对实际生产造成严重的影响。连作模式下，烟草根系菌群的变化影响着下一代植物的生长和发育，因此在烟草种植中如何解除连作障碍是一个迫切解决的问题。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是：如何利用基因工程手段编辑烟草的NtabCrRLK12基因，缓解烟草的连作障碍，增加烟草连作的时间，提高烟草的品质。
NtabCrRLK12基因或含有所述NtabCrRLK12基因的生物材料在解除烟草连作障碍中的应用，所述NtabCrRLK12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述NtabCrRLK12的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
一种解除烟草连作障碍的方法，所述方法为：利用基因编辑、物理诱变或化学诱变对烟草中NtabCrRLK12基因进行定点突变，所述NtabCrRLK12基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选地，所述基因编辑的具体方法为：以烟草NtabCrRLK12基因为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA核苷酸序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中转化烟草，实现对烟草NtabCrRLK12基因的定点编辑，得到NtabCrRLK12基因低表达或不表达的株系。
优选地，所述sgRNA核苷酸序列包括以下任一一组：(1)SEQ ID NO:3-4所示；
(2)SEQ ID NO:5-6所示。
优选地，所述物理诱变的具体方法：采用紫外线、x射线、γ射线对烟草中NtabCrRLK12基因进行定点突变。
优选地，所述化学诱变的具体方法：采用碱基类似物、羟胺化学诱导剂对烟草中NtabCrRLK12基因进行定点突变。
优选地，所述烟草为栽培烟草。
优选地，所述fer-14和fer-15烟草突变体的获得方法为：利用CRISPR/Cas9基因敲除系统构建靶标基因NtabCrRLK12载体，采用农杆菌介导的方法将表达载体转化烟草愈伤组织，对NtabCrRLK12基因进行定点敲除，获得fer-14和fer-15烟草突变体；所述NtabCrRLK12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；所述NtabCrRLK12基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
本发明的有益效果：
本发明以烟草NtabCrRLK12基因为靶标，设计了CRISPR/Cas9的gRNA序列，将含有编码上述gRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中，然后转化烟草，获得了烟草NtabCrRLK12基因的编辑材料，并发现其根系土壤对下一代烟草的生长具有明显的促进作用。
本发明人前期种植了fer-14和fer-15烟草突变体，发现生长状况与野生型烟草K326相似，生长性状没有明显差异。用fer-14和fer-15烟草根际土壤种植下一代K326烟草，发现fer-14和fer-15烟草根际土壤相对于K326的根际土壤，能明显促进连作烟草营养期的生长。说明烟草类受体激酶NtabCrRLK12是影响烟草根系土壤参与缓解烟草连作障碍的关键因子。
附图说明
图1CrRLK家族基因进化分析；
图2NtabCrRLK12基因突变材料鉴定；a，获得的6株突变体PCR鉴定；b，fer-14和fer-15的缺失位点。
图3fer突变体解除烟草连作障碍；a，K326在不同根际土和非根际土中生长表型；b，K326在不同根际土和非根际土的鲜重；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1使用CRISPR/Cas9对NtabCrRLK12基因进行编辑
烟草生态型为K326，农杆菌菌种为LBA4404，载体为pUC57 gRNA shuttle和p201N。主要试剂包括：Thermo Fisher生物公司的限制性内切酶、诺唯赞公司的DNA聚合酶、Infusion连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；天根公司的RNA提取试剂盒；天根公司的质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒；Taraka公司的定量PCR试剂；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、利福平等抗生素等试剂购自Sigma公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由北京擎科生物技术有限公司完成。
以已报道的拟南芥、番茄、马铃薯CrRLK1L基因为查询序列，从烟草K326基因组中进行序列查找，经结构域鉴定，选择含有Malectin(PF12819.7、PF11721)和Pkinase(PF00069、PF07714)结构域的基因，共在烟草中鉴定出58条NtabCrRLK基因。用多种植物中已报道的CrRLK与烟草中新鉴定的NtabCrRLK进行多重序列比对，构建系统进化树分析其进化关系，其中拟南芥的FERONIA与烟草的NtabCrRLK12、NtabCrRLK49在进化树上聚在一起，提示其可能直系同源(图1)。NtabCrRLK12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；NtabCrRLK12基因编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2所示。
根据NtabCrRLK12基因序列，使用https://crispr.dbcls.jp/和https://cctop.cos.uni-heidelberg.de/设计编辑用gRNA，综合2个网站的分析结果，共设计出2对gRNA，分别为gRNA1-1/gRNA1-2和gRNA2-1/gRNA2-2，gRNA序列见SEQ ID NO.3-6。
使用Golden Gate方法进行CRISPR/Cas9编辑载体的构建，该方法可以同时将2个gRNA构建到同一个载体上，将gRNA1-1和gRNA1-2一起构建至载体一上，命名为NtabCrRLK1；将gRNA2-1和gRNA2-2一起构建至同一个载体上，命名为NtabCrRLK2。将得到的载体通过限制性内切酶BsaⅠ酶切和T4连接酶连接克隆到二级载体pUC57 gRNA shuttle中，最后将得到的二级载体通过Gatway克隆转移到含有2x35S::Cas9-NosT的p201N载体中，PCR阳性检测后提取质粒，经测序验证后转化LBA4404农杆菌，完成CRISPR/Cas9编辑载体的构建。
(1)CRISPR/Cas9编辑载体构建
50μL PCR体系如下：20μL Nuclease-free Water，25μL Pfu PCR Mix，100μM的上下游引物各2μL，模版1μL。在PCR仪中进行94℃5min，94℃30s，50℃45s，72℃6s，循环35次。用1.5％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将电泳片段在紫外灯下切取出来，放在各自体系中进行溶胶回收，用总体积30μL的水溶解回收DNA，检测无误后与载体进行连接。
将PCR扩增的片段连接至载体上，连接体系为：8μL Nuclease-free Water，2μL 10×Buffer，4μL PCR产物，4μL酶切载体，1μL T4连接酶。16℃过夜连接。
(2)大肠杆菌的转化
取10μL连接产物加入到100μL TOP10大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。于42℃水浴中热击70s，迅速取出放置冰上冷却2min。向上述管中加入900μL LB液体培养基，摇匀后于37℃110rpm振荡培养约45min，涂相应抗生素平板进行过夜培养。挑选菌落进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序鉴定。
(3)农杆菌转化
每100μL农杆菌感受态加入1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2.5h。6000rpm离心收菌，留取100μL上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含Kan+Rif抗生素的LB固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。
(4)CrRLK编辑载体转化
挑取活化的农杆菌于50mL Kan+Rif抗性的液体LB培养基中，28℃，180rpm振荡培养至OD600接近0.6，将菌液转移到提前灭菌预冷的50mL离心管中，4000rpm离心10min，弃上清收集菌体。用20mL预冷的MS液体培养基重悬菌体，再次4000rpm离心10min，弃上清收集菌体。用预冷的MS液体培养基重悬菌体至OD600至0.6，然后加入终浓度为20mg/L的AS，准备用于侵染。在超净工作台使用剪刀将无菌叶片的边缘剪掉，沿主脉将叶片剪成1.0×1.0cm的叶盘放入农杆菌侵染液中进行侵染，侵染时间为5min。将侵染后的叶片捞出，在无菌滤纸上吸干农杆菌菌液，以叶面向下平铺到共培养培养基(G)上，放入人工气候室(温度为26℃，湿度为40％)黑暗培养3天。
S1继代培养。将共培养3天后的叶片叶面朝上转移到S1分化培养基上。外植体用含500mg/L Cef的灭菌水洗涤，用灭菌滤纸吸干后再转移至S1培养基。每皿放置5-8片，在人工气候室中黑暗培养1周左右置于光照下继续培养，至叶片边缘长出丛芽，芽长至0.5cm左右。
S2继代培养。用镊子将S1上长的丛芽转移到S2分化培养基上。丛芽可掰取的将丛芽直接接种，不能直接掰取的可以连带叶片一起接种，并去除未生丛芽的叶片部分。光培养1-2周待丛芽长成幼苗。
S3继代培养。将S2上的小苗转移至S3分化培养基上，光培养1-2周。
生根培养。对S3上的健壮小苗去除底部膨大部分和下部发黄的叶片，再接种到含有生根培养基R的组培瓶中，光培养1-2周，以使小苗尽快生根。
转基因烟草的获得。待小苗生根3-10条，根长2-3cm左右时，将培养瓶的盖子打开进行炼苗。约3d左右后，将幼苗移栽到盛有无菌土的营养钵中，并覆盖塑料薄膜进行保湿。约一周后可根据幼苗的生长状况揭去保鲜膜，使其在自然条件下快速生长。
(5)遗传转化材料的阳性检测
对载体一转化的18棵T0代转基因材料进行PCR检测，结果显示有6棵植株的NtabCrRLK12基因存在大片段缺失的编辑情况，且编辑情况为杂合(Ntfer-2-5,Ntfer-2-11,Ntfer-2-12,Ntfer-2-14,Ntfer-2-15,Ntfer-2-17)(图2a)。对载体二第一次转化的35棵T0代转基因材料进行PCR检测，结果显示所有材料的NtabCrRLK12基因都不存在大片段缺失的编辑情况。因为第一批已经得到了NtabCrRLK12的编辑材料，后续筛选只针对载体一转化的材料。对T0代检测存在突变的几棵植株进行收种并播种种植T1代，首先在实验室条件下对Ntfer-2-5,Ntfer-2-11,Ntfer-2-12,Ntfer-2-14,Ntfer-2-15,Ntfer-2-17这6棵植株每株播种了10棵T1代进行检测，结果显示Ntfer-2-5,Ntfer-2-11,Ntfer-2-12,Ntfer-2-14,Ntfer-2-15这些株系的T1代都存在纯合编辑的材料。随后将这些株系种到了大田里，先播种的Ntfer-2-14,Ntfer-2-15这两个株系，剩下四个株系下一批播的种。已对Ntfer-2-14,Ntfer-2-15这两个株系的T1代突变体总共400棵植株进行了检测，经过筛选总共得到了177棵纯合编辑的植株，包含多种不同的编辑形式，其中不含编辑载体元件的有38棵，分别选择其中Ntfer-2-14,Ntfer-2-15的一株纯合编辑植物，命名为fer-14和fer-15(图2b)。
实施例2烟草连作试验
在田间正常种植野生型烟草K326，突变植株fer-14和fer-15。第90天于田间连根拔取K326、fer-14和fer-15植物，每种植物各取3株，在同一块地中挖取未种植物的土，作为非根际土。用干净密封袋将植株和土装好后迅速带回实验室处理。在无菌操作台，抖落根系上的非根际土，随后用无菌镊子和剪刀将植物的根系及根际土取下，装至培养盆(17.0cm×11.8cm×7.0cm)中，每个培养盆约装500g植物根系土壤，装有非根际土的盆作为对照组，每组设置3个重复。在培养盆中种植催芽1周的野生型K326烟草，将其置于28℃，12h光照/12h黑暗的苗房进行培养，每周浇水一次，不施加肥料，4周后观察烟草的表型。结果(图3所示)发现K326在野生型根际土中几乎无法生长，说明烟草种植具有明显的连作障碍，但在fer-14和fer-15的根际土生长状况良好，鲜重分别增加2.5倍和4.8倍。以上结果说明fer突变体在解除烟草连作障碍具有重要潜力。
Claims (10)
1.NtabCrRLK12基因或含有所述NtabCrRLK12基因的生物材料在解除烟草连作障碍中的应用，其特征在于，所述NtabCrRLK12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NtabCrRLK12的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述烟草为栽培烟草。
5.一种解除烟草连作障碍的方法，其特征在于，所述方法为：利用基因编辑、物理诱变或化学诱变对烟草中NtabCrRLK12基因进行定点突变，所述NtabCrRLK12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因编辑的具体方法为：以烟草NtabCrRLK12基因为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中转化烟草，实现对烟草NtabCrRLK12基因的定点编辑，得到NtabCrRLK12基因低表达或不表达的株系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述sgRNA核苷酸序列包括以下任一一组：(1)SEQ ID NO:3-4所示；
(2)SEQ ID NO:5-6所示。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述物理诱变的具体方法：采用紫外线、x射线、γ射线对烟草中NtabCrRLK12基因进行定点突变。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学诱变的具体方法：采用羟胺、甲基磺酸乙酯化学诱导剂对烟草中NtabCrRLK12基因进行定点突变。
10.根据权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于，所述烟草为栽培烟草。
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