CN114656532B

CN114656532B - Cbl9及其编码基因在调控植物耐盐碱中的应用

Info

Publication number: CN114656532B
Application number: CN202011525282.9A
Authority: CN
Inventors: 杨永青; 郭岩; 李钦沛
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN114656532A

Abstract

本发明公开了CBL9及其编码基因在调控植物耐盐碱中的应用。本发明提供一种培育抗盐转基因植物的方法，对目的植物中CBL9基因进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到耐盐碱性高于所述目的植物的转基因植物；本发明实例中采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术获得了盐碱敏感的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗盐植物新品种提供了基因资源，为阐明CBL9在植物盐碱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

Description

CBL9及其编码基因在调控植物耐盐碱中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及CBL9及其编码基因在调控植物耐盐碱中的应用。

背景技术

土壤盐碱化趋势在世界范围内不断扩展，严重限制了农作物的生长，已经成为制约农业生产的重要因素。盐碱胁迫对植物造成的危害在于盐碱化土壤中高浓度的Na⁺和过高的pH。随着植物细胞内盐离子的积累，将对细胞产生离子毒害效应，从而在多方面影响细胞发挥正常功能。在碱土环境中,除碱金属元素外的大部分金属元素都会形成不溶性盐,Na⁺作为自然界中含量最高的碱金属元素,则会富集在碱土中造成土壤的盐化。

随着分子生物学、基因组学、遗传学、生物化学以及基因编辑技术的快速发展，对植物抵抗盐碱胁迫的分子机制研究得以不断深入，许多新的基因或蛋白参与调控盐碱胁迫响应过程中。

发明内容

本发明一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，命名为蛋白CBL9，来源于玉米，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；

(a2)将序列表中序列2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐碱性相关的由其衍生的蛋白质；

(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物耐盐碱性相关的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1为标签的序列

编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b4)来源于玉米且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌也是本发明保护的范围。

上述的蛋白质或上述DNA分子在调控植物耐盐碱性中的应用也是本发明保护的范围。

降低上述蛋白质活性或含量的物质在降低植物耐盐碱性或培育对盐碱敏感植物中的应用也是本发明保护的范围；

或，抑制上述DNA分子表达的物质在降低植物耐盐碱性或培育对盐碱敏感植物中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述物质为CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；

所述sgRNA1的靶点为序列3第684-702位，所述sgRNA2的靶点为序列3第1546-1564位；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

本发明另一个目的是提供一种培育对盐碱敏感转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)或3)：

1)为包括如下步骤：降低目的植物中上述蛋白质活性或含量，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；

2)为包括如下步骤：抑制目的植物中上述DNA分子的表达，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；

3)为包括如下步骤：对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，所述降低目的植物中上述蛋白质活性或含量、所述抑制目的植物中上述DNA分子表达或所述对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将上述CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中。

本发明还有一个目的是提供一种CRISPR/Cas9系统。

本发明提供的CRISPR/Cas9系统，其包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为禾本科植物；所述禾本科植物具体为玉米。

本发明的实验证明，CBL9 CRISPR株系与野生型B73-329相比较，CRISPR株系表现出显著的盐碱胁迫敏感性，降低CBL9蛋白含量获得盐碱胁迫敏感株系，利用该基因的负调控作用挖掘其耐盐碱性能。

附图说明

图1为玉米野生型B73-329和CBL9CRISPR株系在含NaHCO₃处理的土壤中的表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。

下述实施例中，除特殊说明外，定量试验均设5个以上的重复实验。

玉米生态型为B73-329(以下称为野生型玉米)，记载在如下文献中：王芳,崔鹏娟,黄芸,王志文,王海峰,陈益芳.玉米磷吸收和再分配的分子机制[A],2018全国植物生物学大会论文集[C],2018年。

农杆菌菌株是EHA105。

CRISPR/Cas9载体pBUE411，记载在如下文献中：Xing HL,Dong L,Wang ZP,ZhangHY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327；A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants。

主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Takara公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。

实施例1、CBL9基因的获得及CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建和检测

一、CBL9基因的获得

利用CRISPR/Cas9技术从玉米(Zea mays L.)B73-329基因组中定向突变了CBL9基因。

玉米CBL9基因的CDS如序列表中序列1所示，基因组序列为3，其编码蛋白的氨基酸序列为序列2。

二、用于基因编辑CBL9基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

用于基因编辑CBL9基因的CRISPR载体pBCXUN-CBL9 CRISPR-Cas9，该载体表达sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1的识别区的编码序列为序列3第684-702位，sgRNA1的识别区的编码序列为序列3第1546-1564位。

选取CBL9基因中2段作为该基因的靶点，设计包含靶点信息的引物:

靶点1：CCTGGCTACGAGGACCCCG；靶点2:GGTCAGGTGGGTATACCGG；

根据靶点设计出的序列分别合成单链寡核苷酸，合成方法如下：

CAUC-BsF:

ATATATGGTCTCTGGCGCCTGGCTACGAGGACCCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

CAUC-BsR:

ATTATTGGTCTCTAAACCCGGTATACCCACCTGACCCGCTTCTTGGTGCC

该载体按照如下方法制备：

(1)PCR扩增：pCBC-MT1T2(记载在如下文献中：Xing,HL.,Dong,L.,Wang,ZP.etal.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.BMC PlantBiol 14,327(2014).)为模板，CAUC-BsF和CAUC-BsR为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物。

(2)酶切：

将上述PCR产物和pBUE411载体(该载体含有3×FLAG-NLS-zCas9-NLS表达系统和用于插入靶序列的gRNA支架)均用BsaI(NEB)酶切后，连接，得到连接产物，即为重组CRISPR载体pBCXUN-CBL9 CRISPR-Cas9，该载体表达sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1的识别区的编码序列为序列3第684-702位，sgRNA1的识别区的编码序列为序列3第1546-1564位。

(3)鉴定

取5μl步骤(2)得到的连接产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆，提取质粒送去测序。

测序结果显示，阳性克隆的质粒为重组CRISPR载体pBCXUN-CBL9 CRISPR-Cas9，该载体表达sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1的识别区的编码序列为序列3第684-702位，sgRNA1的识别区的编码序列为序列3第1546-1564位。

实施例2、CBL9基因CRISPR-Cas9植物的构建和鉴定

1、重组菌的制备

将实施例1中构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体pBCXUN-CBL9 CRISPR-Cas9突变质粒通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆，命名为EHA105/pBCXUN-CBL9 CRISPR-Cas9。

2、CBL9基因CRISPR-Cas9植物的构建

将鉴定正确的农杆菌EHA105/pBCXUN-CBL9 CRISPR-Cas9单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD₆₀₀在0.8-1.0之间。

将重组菌EHA105/pBCXUN-CBL9 CRISPR-Cas9采用农杆菌介导法转入硬秆自交系B73-329以下也称为野生型玉米)，B73-329的幼胚进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代转化苗。构建方法参考：Zhang et al.The genetic architectureof nodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018。

3、检测

提取T0代转化苗的DNA作为模板采用特异引物进行PCR扩增并测序，以B73-329玉米为对照。

测序结果表明，与野生型玉米B73-329相比，T0代转化苗的CBL9基因造成移码，导致蛋白序列改变，停止翻译，蛋白功能被破坏。

将含有该突变形式的转化苗命名为阳性T0代CRISPR-Cas9突变玉米。

阳性T0代CRISPR-Cas9突变玉米培育获得T2代CRISPR-Cas9突变玉米。

实施例3、CBL9基因CRISPR-Cas9突变玉米盐碱处理表型检测

在不含营养土的纯蛭石中播种T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-1种子、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-2种子、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-3种子和野生型玉米B73-329种子，用1/2的Hoagland's营养液浇灌。每个株系30株。

玉米生长约10天后(达到三叶期)浇灌含100mM NaHCO₃(盐碱胁迫)的1/2的Hoagland's营养液，每7-10天浇灌一次，每次每盆浇灌两升，生长约30-40天观察表型。

筛选标准：观察玉米长势以及叶片黄化程度。

结果如图1所示，在100mM NaHCO₃处理的条件下，CBL9 CRISPR株系表现出比野生型B73-329更敏感的盐碱性，叶片较黄，株高更矮。

对生长约40天的株高进行检测并统计，发现，与野生型玉米相比，T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-1株高降低了26％、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-2株高降低了22％、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-3株高降低了18％。

浇灌含100mM NaHCO₃(盐碱胁迫)的1/2的Hoagland's营养液的玉米各株系生长约50天统计各株系的存活率(存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)，可以看出，T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-1的存活率为40％、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-2的存活率为38％、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-3的存活率为35％；野生型玉米盐碱处理后的存活率为72％。

因此，抑制CBL9蛋白表达或者敲除CBL9基因能够降低玉米耐盐性。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业大学

<120>CBL9及其编码基因在调控植物耐盐碱中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 531

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 1

atgggatgct tccattccac ggccaagcgg cagcatcctg gctacgagga ccccgtggac 60

ctcgcctccc agacctcctt cagtgttagt gaggttgagg ctctattcga gctgttcaag 120

agcataagtg gttcagtgat tgacgatggc ctgatcaaca agattggagc gaggtgccat 180

atcaggttat gggctgtcat gtgggaccac cggtataccc acctgaccca tgccagggac 240

acgcagtgca cgcaggaagt gccttcgaac tacctgacag tctcgttcaa gctatatgat 300

atggatagca cagggtttat tgaacggaag gaggttaagc agatgttaat tgctcttcta 360

ggagaatcag aaatgaggct atctgatgat atcattgaga caatcctgga taagacattc 420

tctgatgctg atgcaaatca ggatgggaaa atagatagaa cagagtggga gaattttgtc 480

acaagaaatc cttccttgat gaagataatg actctgccat acctcaagta a 531

<210> 2

<211> 176

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 2

Met Gly Cys Phe His Ser Thr Ala Lys Arg Gln His Pro Gly Tyr Glu

1 5 10 15

Asp Pro Val Asp Leu Ala Ser Gln Thr Ser Phe Ser Val Ser Glu Val

20 25 30

Glu Ala Leu Phe Glu Leu Phe Lys Ser Ile Ser Gly Ser Val Ile Asp

35 40 45

Asp Gly Leu Ile Asn Lys Ile Gly Ala Arg Cys His Ile Arg Leu Trp

50 55 60

Ala Val Met Trp Asp His Arg Tyr Thr His Leu Thr His Ala Arg Asp

65 70 75 80

Thr Gln Cys Thr Gln Glu Val Pro Ser Asn Tyr Leu Thr Val Ser Phe

85 90 95

Lys Leu Tyr Asp Met Asp Ser Thr Gly Phe Ile Glu Arg Lys Glu Val

100 105 110

Lys Gln Met Leu Ile Ala Leu Leu Gly Glu Ser Glu Met Arg Leu Ser

115 120 125

Asp Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu Asp Lys Thr Phe Ser Asp Ala Asp

130 135 140

Ala Asn Gln Asp Gly Lys Ile Asp Arg Thr Glu Trp Glu Asn Phe Val

145 150 155 160

Thr Arg Asn Pro Ser Leu Met Lys Ile Met Thr Leu Pro Tyr Leu Lys

165 170 175

<210> 3

<211> 3304

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 3

atagccgcac ggtgcgctgt cgcgtgccga atcgcttgtg ccgtcgtgcg gtttcgtctc 60

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ggccgcccct gcctcccggg gccagggggc tgagctcccc gcctcgtctc ggcctggcct 240

ggttcgccct cgctccgacg cgtggtggac gcaaccagtg cgcgacgccc ccggctcctg 300

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ggctgcagcc gaaatcctca agtctccgtc gtctgacccc acctcgacgg cccagatcca 480

ctcgccctcg ccgccctcgt gcccctcagt ccctcactcc ctcgcctcct cagcggcgaa 540

gacagctgcg aacggggcca tttttaggcg ggagcgcggg cggcggtgct agcagattgg 600

ttggtttgag tggttgggcc ggctcttcga aacgccccgc ggcggcgatg ggatgcttcc 660

attccacggc caagcggcag catcctggct acgaggaccc cgtggacctc gcctcccaga 720

cctcctgtga gttcgccgat cccatctctt gccctacgcg tacgagctac tcgcgtgagt 780

tcgagttttt tttttcttat ttagttttca atgattgccg tggttggaat ggaattggag 840

aacggagatg ccagatgttt cgtctagata tcggtgtcgt ttactaggat atcttagata 900

tctgtaggag cactggatgc atgctgcatg atccttgcgt tttcggtaat ttctaaattg 960

ccctctctat atcttgctga gtacgtgctt ttcttttgct tatgtagtca gtgttagtga 1020

ggttgaggct ctattcgagc tgttcaagag cataagtggt tcagtgattg acgatggcct 1080

gatcaacaag gtatattcta ttagtcatct ctgtattcct tgctatattg tcagttttgt 1140

gtatgaacat caaatatgct cactagccat gttgtagtta gccctcattg ctgattgtac 1200

gactggaaag tgaagcttgc tatcctacgt tttgtatttt tactttcctc agctgcagaa 1260

attatgtggc actgccattt ttatgtcctt ttcgtagttg tagcttgtag gcaccaagat 1320

ttacgttcaa atgtttgttt tcattctgtt catggttgtt ccttaccaaa tgttccttat 1380

ttacaataca accctatggt acatgaagtg ctctagtttg tatgttaaat gatctctctt 1440

ctattttttt taattaatga tacaatagtc gaaacatact cataaattat ccatctagat 1500

tggagcgagg tgccatatca ggttatgggc tgtcatgtgg gaccaccggt atacccacct 1560

gacccatgcc agggacacgc agtgcacgca ggaagtgccg taagctaatg gtcaccacaa 1620

cgagaaaacc atcgtgcctc gatttgagga gcttttccat ctatgtttgt tagaaggcaa 1680

ggcatagtgc ctatttatct tttgtattcg aacacttggc aattaagcaa tagcagatta 1740

cttccccaat atcccttctt cctaatgtca cctctttcat cacagggctt ctgggaaaca 1800

atccccatgc cattacagac tgagattacg aactccgtgg ccagggtcca gctaccatga 1860

accccgatgc cctttacatg ggcgtacaac aatgaaatac ctgtccaaaa tactcataag 1920

ttatctgtct agattggagt gagatgccat ctcagattat gggcgtacaa caacaaaata 1980

ccttctcaaa aataagctat tgtatctggt gccattcata ttgtggataa gctaaatttg 2040

aactgcataa ttagaggaag tgtatggact atggagtgag atgccatctc agattatggg 2100

cgtacaacaa caaaatacct gttaaaaaac aagctattgt atccggtgcc attcatattg 2160

cggataagct aaatttgaac tgcataatta gaggaagtgt atttcggttc catatttatt 2220

tcaaacatca tgttataaaa agtttttgaa atgtcatgca gaattaccac tttatgccat 2280

tgagaaatga aattttgtgg acataaaaac caattagtga ttaatctttg ccatcattgt 2340

atattacaca ggaagaattc cagttagcat tatttaagaa tcagaggaaa gaaaatcttt 2400

tcgctaatcg ggtatgcatc tgcttgacaa ccatactcat ttgaacttca tcactactat 2460

attgtgcttt gagaactatt gtcatcagtt aaatttacat gaaactggcc tcagatattt 2520

gaccttttcg atgtcaagaa aaggggtgcc attgattttg gtgactttgt ccgagctcta 2580

aatgtgtttc atccaaatat cccaatggat gaaaaaattg attgtaggtt cttatccttt 2640

tatttcattt cattgtgatt tgttttatct catctttcta aaaagttcga actacctgac 2700

agtctcgttc aagctatatg atatggatag cacagggttt attgaacgga aggaggtaat 2760

ttttgggacc cttctgcata tattttctga actttaattt ctacatgaaa attagtaaaa 2820

tagctataaa cacgtttttt tgttgatgtt ggccgattgg ccagtggtat agacgattat 2880

ttactaatga actaataaaa atgattcacg ttgatttact gaactaagga aagctttgtg 2940

ttctttcttg gcttgctaaa acttctgtaa tccagtaatc gtcctagtgc aggttaagca 3000

gatgttaatt gctcttctag gagaatcaga aatgaggcta tctgatgata tcattgagac 3060

aatcctggat aaggttcttt taaacatttc ttcagaaatc agatggttat tgacttattg 3120

agtcataaat tgttcctgtg acgtatactg gaattaagac ttacagcaag ttatgtggtg 3180

atgacagaca ttctctgatg ctgatgcaaa tcaggatggg aaaatagata gaacagagtg 3240

ggagaatttt gtcacaagaa atccttcctt gatgaagata atgactctgc catacctcaa 3300

gtaa 3304

Claims

1.蛋白质或其编码DNA分子在减弱玉米耐碱性中的应用，

所述蛋白质的氨基酸序列为序列2；

所述应用为抑制所述蛋白质的编码DNA分子表达以降低玉米耐碱性；

所述抑制所述蛋白质的编码DNA分子表达采用的物质为CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1）或2）：

1）sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；

2）表达1）中所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

2.降低权利要求1中所述蛋白质含量的物质在降低玉米耐碱性或培育对碱敏感玉米中的应用，

或，抑制权利要求1中所述蛋白质的编码DNA分子表达的物质在降低玉米耐碱性或培育对碱敏感玉米中的应用；

所述物质为CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1）或2）：

1）sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；

2）表达1）中所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

3.一种培育对碱敏感转基因玉米的方法，为如下1）或2）或3）：

1）为包括如下步骤：降低目的玉米中权利要求1中所述蛋白质含量，得到耐碱性低于所述目的玉米的转基因玉米；

2）为包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1中所述蛋白质的编码DNA分子的表达，得到耐碱性低于所述目的玉米的转基因玉米；

3）为包括如下步骤：对目的玉米中权利要求1中所述蛋白质的编码DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到耐碱性低于所述目的玉米的转基因玉米。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述降低目的玉米中权利要求1中所述蛋白质含量、所述抑制目的玉米中权利要求1中所述蛋白质的编码DNA分子表达或所述对目的玉米中权利要求1中所述蛋白质的编码DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将权利要求2中所述CRISPR/Cas9系统导入所述目的玉米中。